DE10011209A1

DE10011209A1 - Matrix-Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor

Info

Publication number: DE10011209A1
Application number: DE10011209A
Authority: DE
Inventors: Bernd Buchberger; Wolfgang Mutter; Albert Roeder
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2000-03-08
Publication date: 2001-09-13
Also published as: EP1263981A2; CA2401839A1; WO2001066243A3; US20040053405A1; WO2001066243A2; JP2003525616A; US7192767B2; CN1429275A; AU4068301A; AR027973A1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Matrix-Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum V¶R¶ eine Matrix enthält und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfaßt, wobei die Matrix aus einem porösen Material besteht, welches niedermolekulare Reaktionsteilnehmer aufnehmen kann und wobei als Reaktionskompartiment das Ausschlußvolumen V¶0¶ der Matrix zur Verfügung steht und als Versorgungskompartiment das Matrixvolumen V¶M¶ zur Verfügung steht. Der Matrix-Reaktor kann für enzymatische Verfahren verwendet werden, insbesondere zur gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Matrix-Reaktor für Reaktionen, an denen nie dermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum V_R eine Matrix enthält und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfaßt, wobei die Matrix aus einem porösen Material besteht, welches niedermolekulare Reakti onsteilnehmer aufnehmen kann und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer ausschließt und wo bei als Reaktionskompartiment das Ausschlußvolumen V₀ der Matrix zur Verfügung steht und als Versorgungskompartiment das Matrixvolumen V_M der Matrix zur Verfügung steht. Der Ma trix-Reaktor kann für Syntheseverfahren mit Beteiligung hochmolekularer Katalysatoren ver wendet werden (z. B. enzymkatalysierte Reaktionen), insbesondere zur gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen.

Exemplarisch für eine Reaktion an der niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilneh mer beteiligt sind, ist die in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion zur Herstellung von Pro teinen anzuführen. Reaktorprinzipien, die nach dem Batch-Verfahren oder einem Verfahren mit kontinuierlicher Versorgung arbeiten und insbesondere geeignet sind zur gekoppelten in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen, sind dem Fachmann bereits bekannt (Baranov & Spirin (1993) Meth. Enzym. 217, 123-142). Bei der Durchführung von Ver fahren zur gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreation zur Herstellung von Protei nen wird in einem Ansatz ausgehend von einer DNA-Matrize mittels einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase die entsprechende mRNA synthetisiert, die dann durch die ribosomale Maschinerie in Protein translatiert wird. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist sehr komplex. Sie enthält niedermolekulare Komponenten (Substrate, Puffer, Salze; Aktivatoren, In hibitoren, Stabilisatoren) und hochmolekulare Komponenten (DNA-Matrize, RNA-Polymerase, Ribosomen, tRNA's, Enzyme, regulatorische Proteine). Ein Teil der Komponenten wird in ge reinigter Form zugegeben. Ein Teil, wichtige Komponenten der Translation (Ribosomen, En zyme, regulatorische Proteine), wird über Zell-Extrakte, z. B. E.coli S30-Lysat, Reticulocytenlysat oder Weizenkeimlysat in das System eingebracht. Die Ausbeuten einer gekoppelten Transkrip tion-/Translationsreaktion liegen in der Größenordnung von bis zu 1 mg/ml. Voraussetzung hierfür ist eine kontinuierliche Zuführung von Substraten und Energiekomponenten und die gleichzeitige Abtrennung oder Verdünnung der Reaktionsendprodukte. Hierdurch läßt sich die Reaktion über viele Stunden aufrecht erhalten. Eine derartige Versuchsanordnung ist in den Prinzipien der "continuous exchange cell-free" (CECF), bzw der "continuous flow cell-free" (CFCF) Proteinsynthese realisiert (Spirin Patente: US 5,478,730; EPA 0 593 757 (A1); EPA 0 312 612 A; Baranov & Spirin (1993) Meth. Enzym. 217, 123-142). CECF-Reaktoren bestehen aus mindestens zwei diskreten Kammern, welche durch eine poröse Membranen gegeneinander ab getrennt sind. Durch diese poröse Grenzfläche werden die hochmolekularen Komponenten in der Reaktionskammer zurückgehalten, während niedermolekulare Komponenten zwischen Reaktionskammer und Versorgungskammer ausgetauscht werden. Bei CFCF-Verfahren wird eine Versorgungslösung direkt in die Reaktionskammer gepumpt und die Reaktionsendprodukte werden durch eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen aus dem Reaktionskompartiment gepresst.

Alle diese Reaktoren und die darin ablaufenden Reaktionen haben jedoch generell Nachteile:

- Die Rektoren bestehen aus Membranoberflächen und mehreren Kammern und sind daher aufwendig in der Herstellung.
- Bei Veränderung der Ansatzdimension (z. B. vom Labor- in den Produktionsmaßstab) müs sen neue Reaktoren konstruiert, gebaut und optimiert werden.
- Die Versorgung mit Substraten bzw. die Abreicherung der Endprodukte erfolgt über Mem branen. Diese zur Verfügung stehende Austauschfläche ist aus konstruktionstechnischen Gründen limitiert, da nicht beliebig große Flächen/Volumen-Verhältnisse realisiert werden können.
- Die Membranen können leicht verstopfen, was die Versorgung der Reaktion beeinträchtigt.
- Reaktionslösung und Versorgungslösung müssen ständig gemischt werden (z. B. durch Rüh ren oder Umpumpen), um Gradienten und Unterversorgung entgegenzuwirken.

Des weiteren ergibt sich bei den Reaktoren des Standes der Technik das Problem, daß bei gekop pelter in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen die verwende ten Lysate verglichen mit dem Zustand im E.coli Cytosol stark verdünnt sind. Die Ursachen hier für sind 1. die Aufschluß- und Präparationsverfahren zur Gewinnung der Lysate und 2. die Ver dünnung, die mit der Zugabe aller notwendigen Komponenten einhergeht. Hieraus resultiert eine verminderte Produktivität, da sich die Gleichgewichte der makromolekularen Komplexe auf die Seite der Dissoziation verschieben (Massenwirkungsgesetz).

Um diesem negativen Effekt entgegenzuwirken wurden im Stand der Technik bereits mehrere Wege aufgezeigt, mit dem Ziel die Wirkkonzentration von Lysaten zu erhöhen. Ein Weg ist, dem Reaktionsansatz hochmolekulares PEG (Polyethylenglycol) zuzusetzen, das die Bindung von Wasser bewirkt, so daß die Wechselwirkung der verbleibenden Makromoleküle begünstigt wird (US 5,593,856). Diese Methode hat den Nachteil, daß auch Reaktionskomponenten und das akkumulierende Produkt unspezifisch aggregieren und präzipitieren können. Ein weiterer Weg, um Lysate zu konzentrieren, ist die Anwendung des Prinzips der Umkehrosmose. Hier wird dem Lysat durch Einwirkung einer konzentrierten hochmolekularen Lösung von z. B. Polyethylen glycol über eine semipermeable Oberfläche (z. B. Dialyseschlauch) Wasser entzogen (Kigawa T. (1999) FEBS Lett. 442, 15-19). Diese Methode hat jedoch den Nachteil, daß sie zu aufwendig ist. Letzteres gilt auch für die Ultrafiltrationsmehtode (US 5,593,856), bei der das Lysat vor der Ver wendung mittels Ultrafiltration konzentriert wird. Auch hier ist ein extra Schritt bei der Her stellung des Lysates erforderlich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Reaktors, der zur gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen geeignet ist und der die Nachteile der Reaktoren des Standes der Technik überwindet. Des weiteren sollen Verfahren be reit gestellt werden, die geeignet sind für die in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen und die nicht mit den Nachteilen des Standes der Technik behaftet sind. Weiterhin soll das erfindungsgemäße Verfahren einer Dissoziation der makromolekularen Komplexe entgegenwirken. Insbesondere soll ein Reaktor und ein Verfahren bereitgestellt wer den, das die in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen in großem Maßstab ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteilnehmer beteiligt sind und der Reaktorraum eine Matrix enthält und sowohl Reaktionskompartiment als auch Versorgungskompartiment umfaßt, wobei

- die Matrix aus einem porösen Material besteht, in welchem niedermolekulare Reaktionsteil nehmer frei diffundieren können,
- die hochmolekularen Reaktionsteilnehmer nicht in die Matrix eindringen können,
- die niedermolekularen Reaktionsteilnehmer sich im gesamten Reaktorraum V_R verteilen,
- das Matrixvolumen V_M als Versorgungskompartiment zur Verfügung steht und
- das Ausschlußvolumen V₀ der Matrix als Reaktionskompartiment zur Verfügung steht.

Bei dem erfindungsgemäßen Reaktor kann durch die Matrixstruktur des Reaktorraumes das Reaktionskompartiment und Versorgungskompartiment in einem Reaktorraum vorliegen. Diese Variante ist bevorzugt. Vorstellbar wäre jedoch auch, daß Reaktionskompartiment und Versor gungskompartiment in einem Reaktionsraum vorliegen und das ein zusätzliches Versorgungs reservoir existiert, welches direkt oder über eine semipermeable Membran mit dem Reaktorraum verbunden ist.

Als Matrix kommen poröse Materialien zur Anwendung, die anorganische Materialien wie z. B. Aluminiumoxyd oder organische Materialien wie z. B. Gele sein können. Die Matrix muß in wäßriger Lösung benetzbar oder quellbar sein und Molekularsiebeigenschaften besitzen. Als wäßrige Lösung werden erfindungsgemäß auch Lösungen bezeichnet, die nur 50% Vol Wasser enthalten. Sie besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus Polymeren, vernetzten Polymeren, Co-Polymeren oder anorganischen "Gelen". Insbesondere ist eine Matrix mit bevorzugt, die aus Partikeln besteht, mit einer Partikelgröße im Bereich von 0,1 bis 1000 µm. Bevorzugt sind Matrizes, die bezogen auf die Gebrauchsform (d. h. hydratisiert) eine geringe spezifische Materialdichte aufweisen (Werte? Grenzen?). Die spezifische Materialdichte ist kleiner 0,4 g/ml, bevorzugt aber kleiner 0,2 g/ml. Die Oberfläche der Matrixpartikel (definiert als Kugeloberfläche) liegt bevorzugt im Bereich von 0,004 bis 40 m²/ml Bettvolumen. Des weiteren ist die Matrix durch eine Ausschlußgrenze (Ausschlußmolekulargewicht) für Makromoleküle definiert. Die Ausschlußgrenze kann im Bereich von 2 bis 300 kDa liegen. Bevorzugt ist eine Ausschlußgrenze zwischen 10 und 100 kDa. Entsprechende Materialien sind kommerziell erhältlich (z. B Sephadex). Es kann ein Material mit einheitlichen oder unterschiedlichen Partikelgrößen eingesetzt werden. Es können auch Gemische verschiedener Materialien eingesetzt werden. Die Matrix selbst besteht aus einem inerten Material, das selbst nicht - auch nicht als Katalysator - an der Reaktion teilnimmt. An diese inerte Matrix können jedoch bei Bedarf Substanzen gebunden werden, z. B. Enzyme.

Mit diesem porösen Matrix-Material wird der Reaktorraum vollständig oder teilweise gefüllt. Um den erfindungsgemäßen Effekt zu erzielen, ist eine Mindestfüllung des Reaktors mit der Matrix notwendig. Unterhalb von 20 Vol % (Bettvolumen) ist der erfindunsgemäße Effekt nicht mehr zu erwarten. Natürlich soll in Einzelfällen nicht ausgeschlossen sein, daß die Matrixfüllung beispielsweise 19,9% Vol beträgt. Somit ist der erfindungsgemäße Reaktor bevorzugt zu mindestens ca. 20 Vol % und besonders bevorzugt zu mindestens ca. 30 Vol % mit dem porösen Matrix-Material gefüllt. Besonders bevorzugt ist die Variante, daß der Reaktor vollständig mit porösem Matrix-Material gefüllt ist. Als außerordentlich bevorzugt gilt auch ein Bereich von 80- 100% Vol.

Die Matrix teilt das Reaktorvolumen in mindestens zwei Kompartimente. Einen Raum, der nur von niedermolekularen Komponenten eingenommen werden kann und einen Raum, in dem sich sowohl niedermolekulare als auch alle hochmolekularen Komponenten aufhalten. Die resul tierenden Endkonzentrationen für die eingesetzten Reaktionsteilnehmer ergeben sich in erster Näherung aus der Größe der Verteilungsräume, die sie erreichen können.

Das gesamte Reaktorvolumen V_R wird von den Komponenten eingenommen, deren Molekular gewicht unterhalb der Ausschlußgrenze der Matrix liegt. Dies gilt für Substrate, Puffersubstan zen, Salze und niedermolekulare Inhibitoren, Aktivatoren bzw. Stabilisatoren. Dies gilt insbeson dere auch für niedermolekulare Reaktionsendprodukte, die potentiell zur Hemmung der Reaktion führen können (z. B. Produkthemmung) oder deren Anreicherung die allgemeinen Reaktionsbedingungen verändern (z. B. pH-Wert) und dadurch die Reaktion verlangsamen.

Die hochmolekularen Komponenten können nicht in die Matrix eindringen. Ihnen steht als Verteilungsraum nur das Volumen zwischen den Partikeln der Matrix, das Ausschlußvolumen zur Verfügung. Dieser Raum berechnet sich aus dem gesamten Reaktorvolumen abzüglich des Matrixvolumens (V₀ = V_R - V_M) und ist mit dem Reaktionskompartiment gleichzusetzen. Reaktions- und Versorgungskompartiment stehen über kurze Diffusionsstrecken und über eine extrem große Austauschfläche miteinander in Verbindung. Das Volumenverhätnis von Reak tionskompartiment V₀ zu Versorgungskompartiment V_M hängt von der Natur, der Größe und der strukturellen Beschaffenheit der Matrix und von der eingebrachten Matrixmenge ab. Das Verhältnis V_R/V_M kann in einem weiten Bereich variiert werden.

Durch Mischen von Gelmaterialien mit unterschiedlichen Ausschlußgrenzen (z. B. 10 kDa und 200 kDa) kann das Reaktionsvolumen für einen bestimmten Teil der Makromoleküle erhöht werden. So würde bei diesem Beispiel das Volumen für Ribosomen, DNA-Matrize und mRNA klein gehalten werden (Molekulargewicht < 200 kDa), wogegen die Beladung der tRNA's durch Aminoacyl-tRNA-Synthasen (Molekulargewicht < 100 kDa) in einem erweiterten Reaktionsraum stattfinden. Hierdurch könnten Bedingungen für Teilreaktionen optimiert werden.

Die Struktur der porösen Matrix erlaubt auch eine spezifische Modifikation von Oberfläche bzw. Lumen. Enzymatische Funktionen wie z. B. modifizierenden Enzyme (Restriktionsproteasen) oder ein energieregenerierendes Enzymsystem können immobilisiert auf gesonderte Partikel in einem bestimmten Verhältnis in das System eingebracht werden. Über chemische Modifikation des Lumens könnten inhibitorisch wirkende Substanzen spezifisch adsorbiert werden.

Das Bauprinzip des Matrix-Reaktors erlaubt einfache Hochdimensionierung vom Labor- bis in den Produktionsmaßstab. Als Reaktoren können im einfachsten Fall handelsübliche Chromato graphiesäulen eingesetzt werden, die in Größen zwischen 10 ml und 1000 Litern erhältlich sind. Einmal optimierte Prozesse lassen sich einfach, schnell und kostengünstig in höhere Dimen sionen überführen. Der Aufwand bei Planung, Bau und Erprobung von Reaktoren und Produk tionsanlagen reduziert sich erheblich. Das Reaktormaterial kann variieren von Edelstahl über Plastik bis Glas. Es sind jedoch auch andere Materialien verwendbar.

Der erfindungsgemäße Reaktor unterscheidet sich gegenüber den bisher verfügbaren Reaktoren

- durch eine sehr große Austauschfläche zwischen Versorgungskompartiment V_M und Reak tionskompartiment V₀ und weitgehend freie Diffusion der Substrate zwischen den beiden Kompartimenten,
- durch extrem kurze Diffusionswege zwischen Versorgungskompartiment V_M und Reaktions kompartiment V₀, was eine effiziente Versorgung der Reaktion gewährleistet und das Pro blem der Gradientenbildung eleminiert. Die Notwendigkeit des Rührens oder Mischens ent fällt.
- durch einfache Bauart und günstige Herstellung.
- durch einfache Übertragbarkeit der im Kleinmaßstab optimierten Bedingungen auf große Dimensionen.

Die besonderen Möglichkeiten der in vitro Proteinsynthese wie die Herstellung toxischer Proteine oder der Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine können erstmals in großen Dimen sionen und zu wirtschaftlichen Konditionen erschlossen werden.

Im folgenden sollen mögliche Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Reaktors beschrieben werden (siehe Figure 1)

1) Matrix-Säulenreaktor

- Der Reaktor besteht aus einer Kammer/Säule, die ganz mit Matrix gefüllt ist (Gesamtvolu men = V_R).
- Das Versorgungskompartiment entspricht dem Matrixvolumen (V_M).
- Das Reaktionskompartiment entspricht dem Ausschlußvolumen V₀ der Matrix.
- Die Ausschlußgrenze der Matrix liegt im Bereich von 0,5-300 kDa, bevorzugt 2 bis 300 kDa.
- Der Reaktor besitzt eine Zuleitung (oben) und Ableitung (unten) für Lösungen.
- Durch zuleiten von Lösung entsteht ein gleichmäßiger Strom der Flüssigkeitssäule in Rich tung der Ableitung.
- Der Reaktor ist thermostatisierbar

Als besonderes bevorzugt ist somit ein Matrix-Reaktor, bei dem die Matrix eine Gel-Matrix ist. Insbesondere ist ein Matrix-Reaktor bevorzugt, bei dem der Reaktorraum die Form eines Zylin ders aufweist. Eine bevorzugte Ausführungsform ist somit ein Reaktor, bei dem der Reaktor eine mit einer Gel-Matrix gefüllte, thermostatisierbare Chromatographiesäule ist. Insbesondere ist bevorzugt, daß die Matrix eine Ausschlußgrenze im Bereich von 2-300 kDa hat.

Das erfindungsgemäße Reaktor-Prinzip läßt sich auch mit etablierten Reaktor-Typen (Batch-, CECF-, CFCF-) vorteilhaft kombinieren. Hierbei kann aufgrund von gesteigerter Produktivität eine Verbesserung der Ausbeute erzielt werden. Da zur Erreichung der optimalen Konzentration geringere Mengen an Einstzstoffen benötigt werden (z. B. DNA-Template, T7-Polymerase, tRNA's) kann das erfindungsgemäße Prinzip auch zu einer Kostenreduktion beitragen.

2) Matrix-Batch-Reaktor

- Der Reaktor besteht aus einem verschließbaren Reaktionsgefäß.
- Der Reaktor hat ein ausreichendes Volumen zur Aufnahme der Reaktionslösung und einer variablen Menge Gel-Matrix.
- Der Reaktor ist termostatisierbar (z. B. im Wasserbad)

3) CECF-Reaktor mit Matrix

- Der Reaktor ist ein CECF-Reaktor bestehend aus mindetens zwei Kammern, die über eine oder mehrere semipermeable Membrane(n) miteinander in Verbindung stehen.
- Der Reaktor besteht aus mindestens einer Reaktionskammer und mindestens einer Versor gungskammer
- Die Reaktionskammer ist teilweise oder vollständig mit Gel-Matrix gefüllt.
- Der Reaktor ist termostatisierbar (z. B. Inkubator) und kann gerührt bzw. geschüttelt werden.

4) CFCF-Reaktor mit Matrix

- Der CFCF-Reaktor besteht aus mindetens einer Kammer mit einer Zuflußöffnung und mindestens einer porösen Oberfläche.
- Diese Kammer ist die Reaktionskammer und ist teilweise oder vollständig mit Matrix gefüllt.
- In die Reaktionskammer kann über die Öffnung Versorgungslösung gepumpt werden. Die verbrauchte Versorgungslösung wird über eine Ultrafiltrationsmembran aus der Reaktions kammer gepreßt.
- Der Reaktor ist termostatisierbar (z. B. Inkubator) und die Reaktionslösung kann durch Rüh ren, Schütteln oder Umpumpen bewegt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von Pro dukten in dem erfindungsgemäßen Reaktor, wobei die Ausgangsstoffe nieder- und hochmoleku lare Edukte sind, dadurch gekennzeichnet, daß

- sich die niedermolekularen Komponenten des Reaktionsansatzes, insbesondere die durch die Reaktion konsumierten Substrate, weitgehend homogen im gesamten Reaktorraum V_R ver teilen,
- den hochmolekularen Komponenten, insbesondere den katalytisch wirkenden Reaktionsteil nehmern, nur das Ausschlußvolumen der Matrix V₀ im Reaktorraum zur Verfügung steht und
- eine Umsetzung der Substrate (Reaktion) nur im Ausschlußvolumen der Matrix V₀ möglich ist.

Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein enzymatisches Ver fahren wobei durch ein oder mehrere Enzyme ein oder mehrere Substrate zu einem oder mehre ren Produkten umgesetzt wird. Der Reaktor kann insbesondere genutzt werden für Verfahren zur gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen.

Die hochmolekularen Komponenten sind Ribosomen, tRNA's, DNA-Matrize, RNA-Polymerase, mRNA sowie Enzyme des Intermediärstoffwechsels (z. B. Aminoacyl-tRNA-synthetasen, Transformylase, Pyrophosphatase, Nukleotidkinasen) und des energieregenerierenden Systems (z. B. Acetatkinase, Pyruvatkinase, Kreatinkinase, glycolytische Enzyme) und regulatorische Proteine (z. B. Initationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Terminationsfaktoren) und Faktoren, welche die Proteinfaltung unterstützen und Proteinmodifikationen ausführen.

Zu den niedermolekularen Komponenten gehören Substrate (die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, ATP, GTP, CTP, UTP, Acetylphosphat) sowie Effektoren (Puffersubstanz, Salze, reduzierende Verbindungen, Folinsäure, Inhibitoren, Stabilisatoren). Niedermolekulare Verbindungen werden erfindungsgemäß so definiert, daß sie kleiner sind als die Ausschlußgrenze der Matrix. Dementsprechend sind hochmolekulare Verbindungen größer als die Ausschlußgrenze. Besonders bevorzugt sind Säulenverfahren, welche dadurch gekennzeichnet sind,

- daß die Gelmatrix in den Reaktorraum eingebaut wird,
- daß die Gelmatrix mit Versorgungslösung äquilibriert und auf die Reaktionstemperatur thermostatisiert wird (wobei die Äquilibrierung der Gelmatrix vor oder nach dem Einbau erfolgen kann),
- daß die Reaktionslösung auf die Säule aufgetragen wird,
- daß die Reaktionslösung für die Dauer der Reaktion in der Säule ruht (statisches Verfahren), bzw. langsam durch die Säule gepumpt wird (dynamisches Verfahren) und
- daß nach Beendigung der Reaktion die Reaktionslösung mit dem Produkt von der Säule elu iert wird.

Zu den erfindungsgemäßen Verfahren gehören auch Verbesserungen bei Batch-Verfahren und Verfahren mit kontinuierlicher Zuführung.

Batch-Verfahren: Durch Zugabe von mit Versorgungslösung äquilibrierter Gel-Matrix zu einem normalen Batch-Ansatz läßt sich die Reaktionsdauer aufgrund verbesserter Substratverfügbarkeit erhöhen. Für die hochmolekularen Reaktionsteilnehmer resultiert aus der Aufstockung mit Gel matrix in erster Näherung keine Volumenzunahme, so dass die Reaktion durch Verdünnungsef fekte nicht negativ beeinträchtigt wird. Insgesamt führt die Zugabe von Matrix zu einer gestei gerten Produktivität bezogen auf den Lysateinsatz.

CECF- und CFCF-Verfahren: Die Anwesenheit von Gelmatrix im Reaktionsraum führt insge samt zu einer geringeren Verdünnung der hochmolekularen Reaktionsteilnehmer, was zu einer gesteigerten Produktivität bezogen auf den Lysateinsatz führt. Hierbei wird

- die mit Versorgungslösung äquilibrierte Gelmatrix in die Reaktionskammer eines CECF- bzw. CFCF-Reaktors eingebaut,
- die Reaktionslösung mit den hochmolekularen Reaktionsteilnehmern in die Reaktionskam mer eingefüllt und somit die Reaktion zur in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Protein gestartet,
- beim CECF-Verfahren die Versorgungskammer mit Versorgungslösung gefüllt,
- beim CFCF-Verfahren die Versorgungslösung kontinuierlich in die Reaktionskammer ge pumpt,
- der Reaktionsansatz bei festgelegter Temperatur für die Dauer der Reaktion gerührt bzw. geschüttelt und
- die Reaktionslösung mit dem Produkt am Ende der Reaktion aus der Reaktionskammer ent nommen.

Zur vorliegenden Erfindung gehören auch Formulierungen zur Durchführung einer gekoppelten in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen. Diese Formulierun gen sind insbesondere geeignet zur Herstellung von Proteinen im erfindungsgemäßen Matrix- Reaktor. Alle für die gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen erforderlichen Komponenten werden auf zwei Lösungen verteilt, Versorgungslösung und Reaktionslösung. Die Versorgungslösung enthält ausschließlich niedermolekulare Kompo nenten, wie Puffer, Salze, Substrate und Effektoren. Geeignete Puffer und Salze sind z. B. Hepes oder Tris, Kaliumionen, Magnesiumionen, Ammoniumionen. Die erforderlichen Substrate sind die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, die vier Ribonukleotide ATP, GTP, CTP, UTP bzw., entsprechende metabolische Vorstufen, z. B. AMP, GMP, CMP, UMP sowie ein primäres Energiesubstrat wie z. B. Phosphoenolpyruvat, Kreatinphosphat oder Acetylphosphat bzw. eine entsprechende metabolische Vorstufe derartiger Substanzen. Effektoren sind Substanzen, welche die Reaktion in positivem Sinne beeinflussen bzw. negative Einflüsse zurückdrängen. Hierzu gehören eine oder mehrere reduzierende Verbindungen, insbesondere Thiolgruppen-enthaltende Verbindungen wie z. B. Dithiothreitol, Dithioerythrol, Glutathion, Mercaptoethansulfonsäure, des weiteren porteinstabilisierende Verbindungen wie z. B. Glycerin, Zucker, Diethylenglycol, Polyethylenglycol, Detergentien, Co-Faktoren, des weiteren Aktivatoren wie Co-Enzyme und Co- Substrate des Intermediärstoffwechsels wie z. B. Folinsäure, NAD, NADP oder deren Vorstufen, des weiteren Inhibitoren zur Unterdrückung unerwünschter Nebenreaktionen wie z. B. Rifampi cin, Rnase-Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Azid.

Die Reaktionslösung enthält die erforderlichen hochmolekularen Komponenten und kann auch einen Teil oder alle niedermolekularen Komponenten der Versorgungslösung enthalten. Basis der Reaktionslösung und Quelle vieler der hochmolekularen Komponenten ist ein Zell-Lysat.

Dieses Lysat kann aus prokaryontischen (z. B. E.Coli) oder aus eukaryontischen Zellen (z. B. Hefe, Reticulozyten, Weizenkeimlingen) gewonnen werden. Die Gewinnung derartiger Lysate erfolgt im allgemeinen durch Zellaufschluß und Abtrennung der partikulären Fraktion (z. B. durch Zen trifugation). Diese Verfahren sind dem Fachmann aus der Literatur hinlänglich bekannt. Derart gewonnene Lysate können direkt in die Reaktionslösung eingebracht werden oder zunächst wei ter aufbereitet und/oder fraktioniert (z. B. durch Dialyse, Fällungen, differentielle Zentrifuga tionen, chromatographische Verfahren, Konzentrierungsschritte) und in Form mehrerer geeig neter Fraktionen eingebracht werden.

Die gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen ist überaus komplex und erfordert eine große Zahl zellulärer Komponenten. Man kann derzeit nicht davon ausgehen, daß die Gesamtheit aller dieser Komponenten bekannt ist, bzw. deren Funk tionsweise voll verstanden ist.

Hochmolekulare Komponenten die durch das Lysat eingebracht werden sind Ribosomen, trans fer RNA's, regulatorische Proteine und Enzyme. Unter den regulatorisch wirkenden Proteinen sind insbesondere Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren der Trans lation zu nennen. Als Enzymkomponenten sind zu nennen die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Enzymsysteme der Energiebereitstellung und Konvertierung (z. B. Acetatkinase, Pyruvatkinase, Kretinkinase, Nukleosid-diphosphat-kinasen, Nukleosid-monophosphat-kinasen, Enzyme der Glycolyse) und Enzyme des Intermediärstoffwechsels wie z. B. Pyrophosphatase, Transformylase. Darüber hinaus ist davon auszugehen, daß weitere Komponenten des Lysates für eine effiziente Transkription und Translation erforderlich sind.

Weitere hochmolekulare Substanzen werden der Reaktionslösung als einzelne Komponenten zugesetzt. Hierzu gehören transfer RNA's, DNA-anbhänginge RNA Polymerase, bevorzugt eine virale Polymerase wie z. B. T7-RNA Polymerase, T3-RNA Polymerase, SP6 RNA Polymerase. Des weiteren Enzyme zur Regenerierung der Energiekomponenten und Enzyme des Intermediärstof fwechsels, die im Lysat nicht oder in nicht ausreichender Menge enthalten sind (wie z. B. Kreatin kinase, Pyruvatkinase, Pyrophosphatase). Des weiteren hochmolekulare Inhibitoren (wie z. B. RNasin). Des weiteren Enzymsysteme, die zur effizienten und richtigen Faltung von Proteinen erforderlich sind (z. B. Chaperone, Protein-disulfid-isomerase, Peptidyl-prolyl-cis-trans isomerase). Des weiteren Enzyme, die für post-transkriptionale Veränderungen am Protein erforderlich sind. Des weiteren makromolekulare Komponenten, die Proteine stabilisieren oder in Lösung halten.

Als Matrize für das zu transkribierende und translatierende Protein wird der Reaktionslösung eine zirkuläre (z. B. Plasmid) oder lineare Nukleinsäure zugesetzt. Auf dieser Matrize befindet sich der Code für das Protein (z. B. eine cDNA-Sequenz) und zusätzlich regulatorische Sequen zen, die für die systemgerechte Transkription und Translation erforderlich sind. Hierzu gehören z. B. Promotorsequenz, Ribosomenbindestelle, Startcodon, Stopcodon, Polymerase-Termina tionssequenz, Translationsenhancer. Des weiteren kann die Matrize auch Bereiche enthalten, die für das Klonieren oder Vervielfältigen erforderlich sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Versorgungslösung folgende Zusammensetzung: 150-300 mM Kalium-acetat, 4-20 mM Magnesium-acetat, 1-10% Glyzerin, 0,5-2,5 mM ATP, 0,5-2,5 mM CTP, 0,5-2,5 mM GTP, 0,5-2,5 mM UTP, 0,1-2 mM pro Aminosäure (alle 20 natür lich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 µg/ml Folinsäure, 0,5-5 mM EDTA, 100 mM HEPES- KOH pH 7,6/30°C, 1 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natrium-azid, 10-100 mM Acetylphosphat, 1-10 mM Dithiothreitol, 1-10 mM Mercaptoethansulfonsäure, 70 mM KOH.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Reaktionslösung folgende Zusammensetzung: 150-300 mM Kalium-acetat, 4-20 mM Magnesium-acetat, 1-10% Glyzerin, 0,5-2,5 mM ATP, 0,5-2,5 mM CTP, 0,5-2,5 mM GTP, 0,5-2,5 mM UTP, 0,1-2 mM pro Aminosäure (alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 µg/ml Folinsäure, 0,5-5 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 1 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natrium-azid, 40 mM Acetylphosphat, 480 µg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 1-10 mM Dithiothreitol, 1-10 mM Mercaptoethansulfon säure, 70 mM KOH, 0,1 U/µl Rnase-Inhibitor, 1-20 µg/ml Matrize, 100-500 µl/ml E.coli A19 Lysat, 1-10 U/µl T7-RNA Polymerase

Somit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsge mäßen Reaktoren für enzymatische Reaktionen, insbesondere für gekoppelte in vitro Transkrip tion-/Translationsreaktionen zur Herstellung von Proteinen.

Vorstellbar ist ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktors für individuell ablaufende Reaktionen wie z. B. nur die Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen. Letzteres würde die Bereitstellung einer stabilen RNA voraussetzen.

Figurenlegende Abb. 1

Mögliche Ausführungsform des Matix-Reaktors sowie Beschreibung von V_T, V_F und V_R.

Abb. 2

Synthese von GFP in einer Batch-Reaktion mit und ohne Zusatz von äquilibrierter Matrix (Beispiel 1).

Abb. 3

Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und einem CECF-Reaktor mit Matrix in der Reak tionskammer. Beide Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 2).

Abb. 4

Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und in einem Säulenreaktor vergleichbarer Dimen sion. Beide Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 3).

Abb. 5

Synthese von GFP in einem CECF-Reaktor und in Säulenreaktoren (statisches Verfahren). Die Säulenreaktoren wurden mit 1 ml und 3 ml Reaktionslösung beladen. Alle Reaktionen wurden mit den gleichen Reagentien durchgeführt (Beispiel 4).

Abb. 6

Synthese von GFP in einem 200 ml Säulenreaktoren (dynamisches Verfahren). Aufgetragen wurden 20 ml Reaktionslösung. Zur Kontrollen wurde mit den gleichen Reagentien eine 0,1 ml Batch-Reaktion und ein 1 ml CECF-Reaktion durchgeführt (Beispiel 5).

Beispiele

Die folgend aufgelistenten Reaktionskomponenten, Reaktoren, sowie die GFP-Bestimmung gelten für alle aufgeführten Beispiele.

Der erfindungsgemäße Reaktor und das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der zellfreien Proteinsynthese am Beispiel des Green Fluorescent Proteins (GFP) getestet. Die zellfreie Pro teinsynthese wird in Form einer gekoppelten Transkription/Translationsreaktion durchgeführt. Die GFP-cDNA ist auf einem Expressionsplasmid kodiert und steht unter Kontrolle eines T7- Phagen-Promotors. Die Transkription in mRNA erfolgt dementsprechend mittels der DNA-abhängigen T7-RNA Polymerase. Die so in vitro transkribierte mRNA wird mit Hilfe des im gekop pelten System befindlichen E.coli Lysates in Protein translatiert.

A Reaktionskomponenten

1. Plasmide: pIVEX-GFP enthalten die Sequenz für das Green Fluorescent Protein aus Aequoria victori in Form einer Mutante GFPcycle3 (27 kDa) (Nature Biotechnology (1996) 14, 315- 319); die kodierende Region der GFPcycle3 Mutante wurde in pTU58 anstelle der Wild-Typ GFP-Sequenz kloniert (Science (1994) 263, 802):
2. E.coli S30 Lysat: Das Lysat wurde mit einem E.coli A19-Stamm nach einem modifizierten Verfahren nach Zubay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267) präpariert. Geänderter Lysatpuffer: 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 14 mM Magnesium-acetat, 60 mM Kalium-acetat, 0,5 mM Dithiothreitol.
3. Reaktionslösung: 185 mM Kalium-acetat, 15 mM Magnesium-acetat, 4% Glyzerin, 2,06 mM ATP, 1,02 mM CTP, 1,64 mM GTP, 1,02 mM UTP, 257 µM pro Aminosäure (alle 20 natür lich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 µg/ml Folinsäure, 1,03 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 1 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natrium-azid, 40 mM Acetylphos phat, 480 µg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM Mercaptoethansul fonsäure, 70 mM KOH, 0,1 U/µl Rnase-Inhibitor, 15 µg/ml Plasmid, 220 µl/ml E.coli A19 Lysat, 2 U/µl T7-RNA Polymerase.
4. Versorgungslösung: 185 mM Kalium-acetat, 15 mM Magnesium-acetat, 4% Glyzerin, 2,06 mM ATP, 1,02 mM CTP, 1,64 mM GTP, 1,02 mM UTP, 257 µM pro Aminosäure (alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren), 10,8 µg/ml Folinsäure, 1,03 mM EDTA, 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 1 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natrium-azid, 40 mM Acetylphos phat, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM Mercaptoethansulfonsäure, 70 mM KOH.
5. Äquilibrierte Matrix: Die Gel-Matrix, Sephadex G-25 fine, wurde gemäß den Angaben des Herstellers gequollen gewaschen. Leersäulen wurden nach den bei Chromatographiesäulen üblichen Verfahren gepackt. Die gepackten Chromatographiesäulen wurden mit 1-2 Säulenvolumen Versorgungslösung äquilibriert. Für Batch- und CECF-Reaktionen wurde die Gel-Matrix durch mehrmaliges suspendieren in Versorgungslösung äquilibriert, mit leichtem Unterdruck trockengesaugt. Die so behandelte Matrix wurde dem Batch-Ansatz zugesetzt bzw. in den CECF-Reaktor eingebaut.

B Reaktoren

Für Batch-Reaktionen wurden verschließbare Reaktionsgefäße aus Plastik verwendet. Die ver wendeten CECF-Reaktoren bestehen aus 2 Kammern, der Reaktionskammer mit einem Volumen von 1 ml und der Versorgungskammer mit einem Volumen von ca. 10 ml. Die Kammern sind durch eine 10 kDa Dialyse-Membran gegeneinander separiert und können jeweils durch ver schließbare Öffnungen beschickt werden. Jede Kammer enthält einen Magnet-Rührkern. Als Matrix-Säulen-Reaktoren werden PD10-Fertigsäulen (Pharmacia) verwendet, bzw. thermostati sierbare, kommerziell erhältliche Chromatographie-Säulen (Pharmacia), die mit Gel-Matrix ge packt wurden. Alle Reaktor-Typen wurden bei 30°C betrieben. Batch-Ansätze wurden geschüt telt, CECF-Reaktionen wurden gerührt, Matrix-Säulen-Reaktoren wurden unter Verwendung von Pumpen beladen und eluiert.

C GFP-Bestimmung

GFP benötigt zur Ausbildung des Fluorophors die Anwesenheit von ausreichenden Mengen Sauerstoffs. Die in der Reaktionslösung gelöste Menge an Sauerstoff ist gering und reicht für eine vollständige Konvertierung nicht aus. Daher wurden alle Proben vor der Messung zwischen 12 und 32 Stunden bei 4°C "gereift". Die Messung der Proben erfolgte mit einem Spektral-Fluori meter der Fa. Kontron, Typ Tegimenta SFM-25. Die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von 395 nm, die Emission wurde bei einer Wellenlänge von 510 nm bestimmt.

Als Standard wurde rekombinantes GFP von Roche Diagnostics, Katalognummer 1814 524 ver wendet. Die Kalibrierung erfolgte mit Standardlösungen der Konzentration 1 µg/ml und 2 µg/ml.

Zur Messung wurden die Proben mit 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 14 mM Magnesium acetat, 60 mM Kalium-acetat, 0,5 mM Dithiothreitol, je nach Gehalt 1 : 50 bis 1 : 400 verdünnt.

D Durchführung Beispiel 1 Batch-Reaktor mit Matrix versus Batch-Reaktor

Die Zusammensetzung des Batch-Reaktionsansatzes ist weiter oben beschrieben (identisch mit Reaktionslösung). Das Template-Plasmid wird zum Schluß zum Ansatz zugegeben, um die Reaktion zu starten. Je 1 ml der Reaktionslösung wurde in ein verschließbares Reaktionsgefäß gegeben. Zu einem der Ansätze wurden 2 g äquilibrierter Gel-Matrix (Sephadex G25,fine) zuge setzt. Die Ansätze wurden verschlossen und unter Schütteln bei 30°C vier Stunden inkubiert. Die Ausbeute an GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).

Ansatz
GFP-Ausbeute*
1 ml Batch Reaktionsansatz	72,3 µg
1 ml Batch Reaktionsansatz + 2 g äquilibrierte Matrix	116,7 µg

* Reifung nicht erforderlich da ausreichende Sauerstoffversorgung

Ergebnis

Durch Zugabe von Gel-Matrix konnte die Ausbeute an fluoreszenz-aktivem GFP im Vergleich zur Standard-Batch-Reaktion um 61% gesteigert werden.

Beispiel 2 CECF-Reaktor mit Matrix versus CECF-Reaktor

In die Reaktionskammer eines CECF-Reaktors (1 ml Reaktionskammer, 10 ml Versorgungs kammer) wurden 0,5 ml äquilibrierte Gelmatrix (Sephadex G-10) eingebaut. Es wurden 0,5 ml einer in der Zusammensetzung modifizierten Reaktionslösung in die Reaktionskammer einge füllt. Dabei war die Konzentration der hochmolekularen Komponenten der Reaktionslösung 2fach (960 µg/ml tRNA aus E.coli MRE600, 0,2 U/µl Rnase-Inhibitor, 30 µg/ml Plasmid, 440 µl/ml E.coli A19 Lysat, 4 U/µl T7-RNA Polymerase), die Konzentration der niedermolekularen Komponenten war 1fach (d. h. wie in der Versorgungslösung). In die Versorgungskammer wur den 10 ml Versorgungslösung eingefüllt. Die Vergleichsreaktion im CECF-Reaktor wurde nach Standardbedingungen durchgeführt. D. h. in die Reaktionskammer wurde 1 ml Reaktionslösung mit 15 µg GFP-Plasmid, in die Versorgungskammer ca. 10 ml Versorgungslösung gefüllt. Beide Reaktoren wurde unter Rühren (150 rpm) bei 30°C für 20 Stunden inkubiert. Jeweils am Ende der Reaktionszeit wurde der Inhalt der Reaktionskammern entnommen und die Ausbeuten an synthetisiertem GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).

Ansatz
GFP-Ausbeute*
1 ml CECF-Reaktionsansatz	208 µg
1 ml CECF-Reaktionsansatz mit Matrix	325 µg

* 36 h Reifung bei 4°C

Ergebnis

Durch den Einbau der Matrix in die Reaktionskammer des CECF-Reaktors konnte eine Steigerung der Produktivität bezogen auf Fluoreszenz-aktives GFP um 56% erzielt werden.

Beispiel 3 Vergleich Matrix-Säulen-Reaktor (1/10-Dimension) versus CECF-Reaktor

Die CECF-Reaktion wurde nach Standardbedingungen durchgeführt. D. h. in die Reaktionskammer wurde 1 ml Reaktionslösung mit 15 µg GFP-Plasmid, in die Versorgungskammer ca. 10 ml Versorgungslösung gefüllt. Der Reaktor wurde unter Rühren (150 rpm) bei 30°C für 20 Stunden inkubiert. Als Matrix-Säulen-Reaktor wurde eine handelsübliche PD-10-Säule, gefüllt mit Sephadex G25, verwendet. Die Reaktorparameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: V_R = 8,3 ml, V₀ = 2,5 ml, V_M = 5,6 ml. Die Säule wurde mit 10 ml Versorgungslösung äquilibriert. Nach Aufgabe von 1 ml Reaktionslösung (15 µg GFP- Plasmid/ml) wurde die Säule verschlossen und 6 Stunden bei 30°C inkubiert. Jeweils am Ende der Reaktionszeit wurde die Reaktionslösung aus dem CECF-Reaktor entnommen, bzw. die Reaktionslösung von der PD-10-Säule eluiert. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).

Ergebnis

Ansatz
GFP-Ausbeute*
1 ml CECF-Reaktionsansatz	477 µg
1 ml Ansatz auf PD-10-Säule	362 µg

* 20 h GFP-Reifung bei 4°C

Der Ansatz, der in der PD-10 Säule durchgeführt wurde ergab eine Ausbeut an Fluoreszenz-akti vem GFP von 362 µg. Im Vergleich zum CECF-Ansatz mit der gleichen Dimension (1 ml) ergibt sich eine Produktivität von 76%.

Beispiel 4 Matrix-Säulen-Reaktor (3/10 Dimension, statisches Verfahren)

In zwei Chromatographiesäulen wurden 10 ml Sephadex G25,fine, gepackt und anschließend jeweils mit einem Säulenvolumen Versorgungslösung äquilibriert. Die Reaktor-Parameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: V_R = 10 ml, V₀ = 3 ml, V_M = 7 ml. Auf Säule 1 wurde 1 ml Reaktionslösung, auf Säule 2 wurden 3 ml Reaktionslösung aufgetragen. Anschließend wurden die Säulen verschlossen und 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Als Kontrollen wurde eine 1 ml Batch-Reaktion und eine 1 ml Reaktion im CECF Reaktor durchgeführt (ebenfalls über 20 Stunden bei 30°C). Nach Ablauf der Reaktionszeit wurden die Säulen eluiert. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP im jeweiligen wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).

Ergebnis

Die Reaktionsausbeuten der beiden Säulenreaktor-Läufe sind bezogen auf die eingesetzte Menge an Reaktionslösung vergleichbar mit den Ausbeuten des CECF Reaktors. Bei Säule 2, die mit der dreifachen Menge an Reaktionslösung beschickt wurde, konnte eine um den Faktor 2,2 gesteigerte Gesamtausbeute erzielt werden.

Beispiel 5 Matrix-Säulen-Reaktor (20/200-Dimension, dynamisches Verfahren)

In eine ummantelte Chromatographiesäule (Pharmacia) wurde Sephadex G25,fine, gepackt und anschließend mit einem Säulenvolumen Versorgungslösung äquilibriert. Die Reaktor-Parameter wurden anhand der Herstellerangaben wie folgt abgeschätzt: V_R = 200 ml, V₀ = 60 ml, V_M = 140 ml. Mittels eines Wasserbades wurde die Säule auf 30°C thermostatisiert. 20 ml Reaktionslösung, gestartet mit 15 µg/ml GFP-Plasmid, wurden auf die Säule gepumpt (120 ml/h). Danach wurde die Reaktionslösung mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/h durch die Matrix gepumpt. Das Eluat wurde bei 4°C fraktioniert. Als Kontrollen wurde mit dem gleichen Reaktionsansatz eine CECF-Reaktion (1 ml-Dimension) und eine Batch-Reaktion (0,1 ml Dimension) durchgeführt. Die Ausbeute an synthetisiertem GFP in den Fraktionen und den Kontrollansätzen wurde nach Standardprotokoll bestimmt (siehe oben).

Ergebnis

In einer 20 ml Dimension konnten innerhalb von 10 Stunden im Matrix-Säulen- Reaktor 15,2 mg Fluoreszenz-aktives GFP produziert werden. Bezogen auf Ausbeute pro einge setzter Reaktionslösung ergab sich ein Wert von 0,76 mg/ml. Die Ausbeute im CECF-Reaktor von 0,58 mg/ml liegt im Rahmrn dessen was routinemäßig in diesem Reaktor-Typ erzielt wird. Somit zeigt der Matrix-Säulen-Reaktor eine vergleichbare Produktivität wie der CECF-Reaktor (131%). Weiterhin belegt dieses Experiment, daß ein Dimensionssprung um den Faktor 20 durchgeführt werden kann, ohne nennenswerte Ausbeuteeinbuße bezogen auf einen 1 ml CECF- Ansatz.

Claims

1. Reaktor für Reaktionen, an denen niedermolekulare und hochmolekulare Reaktionsteil nehmer beteiligt sind, wobei der Reaktorraum V_R eine in wäßriger Lösung quellbare Matrix enthält,
die aus einem porösen Material besteht, welches

- niedermolekulare Reaktionsteilnehmer aufnehmen kann und
- hochmolekulare Reaktionsteilnehmer ausschließt und

wobei der Reaktor zu mindestens 20 Vol% mit der Matrix gefüllt ist.

2. Reaktor gemäß Anspruch 1 bei dem durch die Matrixstruktur des Reaktorraumes, Reak tionskompartiment und Versorgungskompartiment in einem Reaktorraum vorliegen.

3. Reaktor gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktion im Ausschlußvolumen V₀ der Ma trix stattfindet.

4. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Matrixvolumen V_M als Versor gungskompartiment für niedermolekulare Reaktionskomponenten, insbesondere Sub strate, zur Verfügung steht.

5. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Reaktionskompartiment und Versor gungskompartiment nicht durch eine Membran getrennt sind.

6. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Reaktionskompartiment und Versor gungskompartiment nicht durch eine Membran getrennt sind, jedoch ein zusätzliches Versorgungsreservoir existiert, welches direkt oder über eine semipermeable Membran mit dem Reaktorraum verbunden ist.

7. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Matrix eine Gel-Matrix ist.

8. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Reaktorraum die Form eines Zylinders aufweist.

9. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Reaktor eine mit einer Gel- Matrix gefüllte Säule ist.

10. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Matrix eine Ausschlußgrenze im Bereich von 2-300 kDa hat.

11. Verfahren zur Herstellung von Produkten in einem Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Ausgangsstoffe nieder- und hochmolekulare Edukte sind, dadurch ge kennzeichnet, daß

- sich die niedermolekularen Komponenten des Reaktionsansatzes, insbesondere die durch die Reaktion konsumierten Substrate, weitgehend homogen im gesamten Reak torraum V_R verteilen,
- den hochmolekularen Komponenten, insbesondere den katalytisch wirkenden Reak tionsteilnehmern, nur das Ausschlußvolumen der Matrix V₀ im Reaktorraum zur Verfügung steht und
- eine Umsetzung der Substrate ausschließlich im Ausschlußvolumen der Matrix V₀ möglich ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein enzymati sches Verfahren handelt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 zur gekoppelten in vitro Transkrip tion-/Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen, wobei zu den hochmolekula ren Komponenten Ribosomen, tRNA's, DNA-Matrize, RNA-Polymerase, mRNA und En zyme und regulatorische Proteine aus dem Lysat gehören und zu den niedermolekularen Komponenten Substrate sowie Effektoren, Puffersubstanzen und Salze gehören.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet,

- daß die Gel-Matrix in den Reaktorraum eingebaut wird,
- daß die Gel-Matrix mit der Versorgungslösung äquilibriert,
- daß die äquilibrierte Gel-Matrix im Reaktorraum mit der Reaktionslösung in Verbindung gebracht wird und
- daß der Reaktor temperiert wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

- daß das Verfahren in einer mit Matrix gefüllten Kammer/Säule durchgeführt wird,
- daß die Reaktionslösung auf die Säule aufgetragen wird und
- daß die Reaktionslösung für die Dauer der Reaktion in der Säule ruht.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

- daß das Verfahren in einer mit Matrix gefüllten Kammer/Säule durchgeführt wird,
- daß die Reaktionslösung auf die Säule aufgetragen wird und
- daß die Reaktionslösung für die Dauer der Reaktion kontinuierlich oder schrittweise durch die Säule gepumpt wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

- daß das Verfahren in einem Batch-Reaktor durchgeführt wird und
- daß Reaktionslösung und äquilibrierte Gel-Matrix im Reaktorraum zusammengebracht werden, wobei das zugesetzte Matrixvolumen mindestens 20 Vol% des Volumens der Reaktionslösung beträgt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

- daß das Verfahren in einem CECF-Reaktor durchgeführt wird,
- daß die Gelmatrix in das Reaktionskompartiment des CECF-Reaktors eingebaut wird und
- daß das Matrixvolumen mehr als 20 Vol% des Volumens des Reaktionskompartiments beträgt.

19. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

- daß das Verfahren in einem CFCF-Reaktor durchgeführt wird,
- daß die Gelmatrix in das Reaktionskompartiment des CFCF-Reaktors eingebaut wird und
- daß das Matrixvolumen mehr als 20 Vol% des Volumens des Reaktionskompartiments beträgt.

20. Verwendung eines Reaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 für enzymatische Reaktionen.

21. Verwendung eines Reaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 für gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktionen zur Herstellung von Proteinen.

22. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 19 für enzymatische Reaktionen.

23. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 19 für gekoppelte in vitro Transkription-/Translationsreaktionen zur Herstellung von Proteinen.

24. Formulierungen zur Durchführung einer gekoppelten in vitro Transkription- /Translationsreaktion zur Herstellung von Proteinen in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-19.

25. Formulierungen gemäß Anspruch 24 bestehend aus einer Versorgungslösung und einer Reaktionslösung.