JP2003525616A - マトリックス反応器および該反応器内での産物の製造方法 - Google Patents

マトリックス反応器および該反応器内での産物の製造方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、反応のためのマトリックス反応器であり、それによって低分子反応物および高分子反応物が該反応に加わるものである反応のためのマトリックス反応器に関する。反応器チャンバーＶR は、マトリックスを内包し、反応区画および供給区画からなる。マトリックスは、低分子反応物を吸着しうる多孔質材料からなる。マトリックスの排除容積Ｖ0 は反応区画として利用され、マトリックス容積ＶM は供給区画として利用される。マトリックス反応器は、酵素的方法、特にタンパク質を製造するためのインビトロ転写／翻訳共役反応に使用されうる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、低分子反応物および高分子反応物を伴う反応のためのマトリックス
反応器であり、反応器空間ＶR はマトリックスを内包（enthaelt）し、かつ反応
区画および供給区画からなり（umfasst ）、該マトリックスは、低分子反応物を
吸着（aufnehmen ）しかつ高分子反応物を排除する多孔質材料からなり（besteh
t ）、該マトリックスの排除容積Ｖ0 は反応区画として利用することができ、該
マトリックスのマトリックス容積ＶM は供給区画として利用することができる反
応器に関する。マトリックス反応器は、高分子触媒（例えば、酵素触媒反応）を
伴う合成方法、および特にタンパク質を製造するためのインビトロ転写／翻訳共
役反応に使用されうる。
【０００２】 低分子反応物および高分子反応物を伴う反応の例は、タンパク質の製造のため
のインビトロ転写／翻訳反応である。バッチ方式で操作する反応器または連続供
給法を用いる反応器であり、タンパク質の製造のためのインビトロ転写／翻訳共
役反応に特に適切である反応器が、当業者にすでに周知である（Baranov および
Spirin（1993）Meth. Enzym. 217, 123-142 ）。タンパク質の製造のためのイン
ビトロ転写／翻訳共役反応のための方法において、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼが、反応混合物中のＤＮＡ鋳型から対応するｍＲＮＡを合成するために使用さ
れ、次いで該ｍＲＮＡはリボソーム機構によりタンパク質に翻訳される。反応溶
液は、非常に複雑な組成を有する。それは、低分子成分（基質、緩衝液、塩、活
性化剤、阻害剤、安定化剤）および高分子成分（ＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラー
ゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ、酵素、調節タンパク質）を含む。いくつかの成分は
、精製された形態で添加される。いくつかの重要な翻訳成分（リボソーム、酵素
、調節タンパク質）は、例えば、大腸菌Ｓ−３０溶解物、網状赤血球溶解物また
は小麦麦芽溶解物などの細胞抽出物として直ちに系に添加される。転写／翻訳共
役反応の収量は、１ｍｇ／ｍｌの大きさのオーダーを有する。これに対する必要
条件は、基質およびエネルギー成分の連続供給、ならびに反応の最終産物の同時
分離または希釈である。この様式では、反応を長時間維持することが可能である
。かかる実験計画は、連続交換無細胞（ＣＥＣＦ）タンパク質合成または連続フ
ロー無細胞（ＣＦＣＦ）タンパク質合成の原理において実行されている（US 5,4
78,730; EPA 0 593 757;EPA 0 312 612;Baranov およびSpirin（1993）Meth. En
zym. 217, 123-142 ）。ＣＥＣＦ反応器は、互いに多孔質膜により分離されてい
る少なくとも２つの別個のチャンバーから構成される。この多孔質界面は、反応
チャンバー中に高分子成分を保持し、一方、低分子成分は、反応チャンバーと供
給チャンバーとの間で交換されうる。ＣＦＣＦ法において、供給溶液は、反応チ
ャンバーに直接ポンプで注入され、反応の最終産物は、１つまたは数個の限外濾
過膜を通して反応区画から押し出される。
【０００３】 しかしながら、これら全部の反応器および該反応器で生じる反応は、以下の一
般的な不利益を有する： ・ 反応器は膜界面および数個のチャンバーから構成され、それゆえに製造が複
雑である。 ・ バッチサイズが（実験室から製造規模へ）変更する場合、新しい反応器が設
計され、構築され、かつ最適化されなければならない。 ・ 基質の供給および最終産物の分離は膜を介して起こる。あらゆるサイズの界
面／容積比を達成することは可能でないため、構築物は得られうる交換界面に技
術的制限を課する。 ・ 膜は容易に遮断されるようになり、それは反応の供給を減ずる。 ・ 反応溶液および供給溶液は、（例えば、攪拌またはポンプ循環により）連続
的に混合し、勾配および供給不足を妨げなければならない。
【０００４】 従来技術の反応器のさらなる問題は、タンパク質の製造のためのインビトロ転
写／翻訳共役反応の場合、使用される溶解物は、大腸菌サイトゾルでの状態と比
較して非常に希釈されていることである。この理由は、１．溶解物を得るための
溶解および調製方法、ならびに２．必要な成分の全ての添加により生じる希釈、
である。これは、巨大分子複合体の平衡が解離側にシフトする（質量作用の法則
）ために、低減された生産性を生じる。
【０００５】 溶解物の活性濃度を増加させる目的でこの負の効果を妨げるためのいくつかの
方法が、従来技術ですでに記載されている。１つの方法は、水に結合し、したが
って残りの巨大分子の相互作用を促進する高分子ＰＥＧ（ポリエチレングリコー
ル）を反応混合物へ添加することである（US 5,593,856）。この方法の不都合は
、反応成分および蓄積産物が凝集および沈澱しうることである。溶解物を濃縮す
るための他の方法は、逆浸透の原理の使用である。この方法において、例えば、
ポリエチレングリコールの濃縮高分子溶液の作用により、半透膜界面（例えば、
透析チューブ）を通して、水が溶解物から除去される（Kigawa T. （1999）FEBS
Lett. 442, 15-19 ）。しかしながら、この方法の不都合は、複雑すぎることで
ある。後者はまた、限外濾過法（US 5,593,856）を適用し、溶解物は使用前に限
外濾過により濃縮される。この場合においてもまた、溶解物を調製するために追
加の工程が必要である。
【０００６】 本発明の目的は、タンパク質を製造するためのインビトロ転写／翻訳共役反応
に適切であり、従来技術の反応器の不利益を克服する反応器を提供することであ
った。さらに、タンパク質の製造のためのインビトロ転写／翻訳反応に適切であ
り、従来技術の不都合を持たない方法が提供されるべきである。さらに、本発明
の方法は、巨大分子成分の希釈を阻止するであろう。特に、大規模でのインビト
ロ転写／翻訳反応によるタンパク質製造を可能にする反応器および方法を提供す
ることが意図される。
【０００７】 本発明は、低分子反応物および高分子反応物を伴う反応のための反応器であり
、該反応器空間はマトリックスを内包し、かつ反応区画および供給区画からなり
、 ・ 該マトリックスが、低分子反応物が十分に自由に拡散しうる多孔質材料から
なり、 ・ 高分子反応物がマトリックス内に浸透しえない、 ・ 低分子反応物が反応器空間ＶR 全体内に分配しえない、 ・ マトリックス容積ＶM が供給区画として利用されうる、および ・ マトリックスの排除容積Ｖ0 が反応区画として利用されうる、 反応器に関する。
【０００８】 本発明の反応器において、反応区画および供給区画は、反応器空間のマトリッ
クス構造の結果として、１つの反応器空間に存在しうる。この変形物が、好まし
い。しかしながら、反応区画および供給区画が１つの反応器空間（Reactrraum）
に存在し、該反応器空間に直接連結されるまたは半透膜を介して連結される追加
の供給用貯蔵器があることも考えられる。
【０００９】 多孔質物質はマトリックスとして使用され、無機材料、例えば酸化アルミニウ
ムおよび／または有機材料、例えばゲルでありうる。マトリックスは湿潤性（be
netzbar ）であるかまたは水溶液中で膨潤可能であり、分子ふるい特性を有する
であろう。本発明においては水溶液とは、５０容量％の水を含むにすぎない溶液
もいう。好ましい態様において、マトリックスは、ポリマー、架橋ポリマー（例
えば、デキストラン）、コポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）または無機
ゲルからなる。０．１〜１０００μｍの範囲の粒子サイズを有する粒子を含有す
るマトリックスが、特に好ましい。使用しようとする形態（すなわち、水和）に
関して、低い比材料密度を有するマトリックスが好ましい。比材料密度は、通常
０．５ｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは０．３ｇ／ｍｌ未満である。マトリック
ス粒子の表面（球の表面として計算される）は、好ましくは、０．００４〜４０
ｍ2 ／ｍｌベッド容積の範囲である。マトリックスはまた、巨大分子に対する排
除限界（排除分子量）により規定される。排除限界は、０．５〜３００ｋＤａの
範囲でありうる。２〜３００ｋＤａの排除限界が好ましく、１０〜１００ｋＤａ
の排除限界が特に好ましい。適切な材料が市販で入手できる（例えば、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ（登録商標）、Pharmacia ；Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（登録商標）、BIO-RAD ）
。均一なまたは異なる粒子サイズを有する材料を使用することが可能である。異
なる材料の混合物もまた使用しうる。マトリックスそれ自体は、それ自体が反応
に関与せず、触媒としても関与しない不活性材料からなる。しかしながら、物質
、例えば酵素が、必要であればこの不活性マトリックスに結合されうる。
【００１０】 反応器空間は、この多孔質マトリックス材料で完全にまたは部分的に充填され
る。マトリックスによる反応器の最小の充填は、本発明の効果を達成するために
必要なものである。２０容量％以下（ベッド容積）では、本発明の効果はもはや
期待できない。もちろん、個々の場合において、例えば、１９．９容量％のマト
リックス充填は、排除されないであろう。したがって、本発明の反応器は、少な
くとも約２０容量％、特に好ましくは少なくとも約３０容量％の多孔質マトリッ
クス材料で充填される。反応器が多孔質マトリックス材料で完全に充填される変
形物が、特に好ましい。８０〜１００容量％の範囲が、極めて好ましい。
【００１１】 マトリックスは、反応器容積を少なくとも２つの区画に分割する。１つの空間
は低分子成分によって占められうるのみであり、１つの空間はそこに低分子成分
ならびに全ての高分子成分が存在する。第１の近似としては、反応物の得られる
最終濃度は、それらが達しうる分配空間のサイズにより決定される。
【００１２】 全反応器容積ＶR は、マトリックスの実質上排除限界以下の分子量を有する成
分により占められる。これは、基質、緩衝物質、塩および低分子阻害剤、活性化
剤または安定化剤に適用される。これはまた、反応を潜在的に阻害しうる（例え
ば、産物阻害）か、またはその蓄積が一般的な反応条件（例えば、ｐＨ値）を変
化し、したがって反応を遅らせうる低分子反応最終産物にとりわけ適用される。
【００１３】 高分子成分は、マトリックスを通ることができない。それらの唯一の分布空間
は、マトリックスの粒子の間の容積、すなわち排除容積Ｖ0 である。この空間は
、全反応器容積−マトリックス容積で計算され（Ｖ0 ＝ＶR −ＶM ）、反応区画
と等しい。反応区画および供給区画は、短い拡散経路を介して、かつ極めて大き
い交換領域を介して互いにつながっている。供給区画ＶM に対する反応区画Ｖ0 の容積比は、マトリックスの性質、サイズおよび構造特性、ならびに添加される
マトリックスの量に依存する。ＶR ／ＶM の比は、広い範囲で変化しうる。
【００１４】 巨大分子の特定のフラクションに対する反応容積は、異なる排除限界（例えば
、１０ｋＤａおよび２００ｋＤａ）をもつゲル材料を混合することにより増加さ
れうる。したがって、この例において、リボソーム、ＤＮＡ鋳型およびｍＲＮＡ
に対する容積は最小化され（分子量＞２００ｋＤａ）、一方、アミノアシル−ｔ
ＲＮＡシンターゼによるｔＲＮＡ（分子量＜１００ｋＤａ）の充填は、拡大され
た反応空間（Reaktionsraum ）で生じる。これは、一部分の反応に対する条件を
最適化するために使用されうる。
【００１５】 多孔質マトリックスの構造はまた、表面または内腔の特定の改変を可能にする
。改変された酵素（制限プロテアーゼ）等の酵素機能またはエネルギー再生酵素
系が、特定の比で特別な粒子に固定化される系に導入されうる。内腔の化学的改
変は、阻害物質の特定の吸着を可能にするであろう。
【００１６】 マトリックス反応器の構造設計は、実験室から製造規模への単純な規模の増大
を可能にする。最も単純な場合では、１０ｍｌ〜１０００Ｌのサイズで利用でき
る市販のクロマトグラフィーカラムが反応器として使用されうる。一度最適化さ
れると、プロセスは、単純、迅速および経済的な様式で、より大きな規模に変更
されうる。これは、反応器および製造工場の計画、構築および評価の量をかなり
低減する。反応器の材料は、ステンレス綱からプラスチックまたはガラスに変更
しうる。しかしながら、他の材料もまた使用しうる。
【００１７】 本発明の反応器は、 − 供給区画ＶM と反応区画Ｖ0 との間の非常に大きな交換領域および２つの区
画の間の実質的に自由な基質の拡散により、 − 反応に対する効率のよい供給を確保し、かつ勾配形成の問題を除去する供給
区画ＶM と反応区画Ｖ0 との間の極めて短い拡散経路により、それは攪拌または
混合を必要としない、 − 単純な構造および経済的な製造により、 − 小規模からより大規模への最適化された条件の単純な移転可能性により 以前から入手可能である反応器と異なっている。
【００１８】 大規模でかつ経済的な様式で、毒性タンパク質の製造またはタンパク質への非
天然アミノ酸の取り込みなどの特殊なインビトロタンパク質合成の潜在能力を開
発することが、初めて可能となる。
【００１９】 本発明の反応器の可能な態様を、以下に記載する（図１を参照のこと）。
【００２０】 １）マトリックスカラム反応器 − 反応器は、マトリックスで完全に充填されているチャンバー／カラムからな
る（全容量＝ＶR ）。 − 供給区画は、マトリックス容積（ＶM ）に相当する。 − 反応区画は、マトリックスの排除容積Ｖ0 に相当する。 − マトリックスの排除限界は、０．５〜３００ｋＤａ、好ましくは２〜３００
ｋＤａの範囲である。 − 反応器は、溶液の入口（上方）および出口（下方）を有する。 − 溶液の供給は、カラムから出口への液体の定常流を生じる。 − 反応器は恒温に保たれうる。
【００２１】 したがって、マトリックスがゲルマトリックスであるマトリックス反応器が、
特に好ましい。特に、反応器空間が円筒型を有するマトリックス反応器が好まし
い。したがって、好ましい態様は、ゲルマトリックスで充填されたクロマトグラ
フィーカラムである反応器であり、それは恒温に保たれうる。特に、マトリック
スが、２〜３００ｋＤａの範囲の排除限界を有するのが好ましい。
【００２２】 本発明の反応器の原理は、確立された反応器型（バッチ、ＣＥＣＦ、ＣＦＣＦ
）と有利に併用されうる。これにより、増加した生産性のため改良された収率を
もたらしうる。より少ない量の原料が最適濃度に達するまでに必要であるので（
例えば、ＤＮＡ鋳型、Ｔ７ポリメラーゼ、ｔＲＮＡ）、本発明の原理はまた、コ
スト低減に寄与しうる。
【００２３】 ２）マトリックスバッチ反応器 ・ 反応器は、密封しうる反応容器からなる。 ・ 反応器は、反応溶液および種々の量のゲルマトリックスを保持するために十
分な容積を有する。 ・ 反応器は、恒温に保たれうる（例えば、水浴内）。
【００２４】 ３）マトリックスを内包する（mit ）ＣＥＣＦ反応器 ・ 反応器は、１つまたは数個の半透膜により連結されている少なくとも２つの
チャンバーからなる（bestehend ）ＣＥＣＦ反応器である。 ・ 反応器は、少なくとも１つの反応チャンバーおよび少なくとも１つの供給チ
ャンバーからなる（besteht ）。 ・ 反応チャンバーは、部分的にまたは完全にゲルマトリックスで充填される。 ・ 反応器は、恒温に保持されうる（例えば、インキュベーター）。 ・ 反応器は、任意に攪拌または振盪されうる。
【００２５】 ４）マトリックスを内包するＣＦＣＦ反応器 ・ ＣＦＣＦ反応器は、入口の開口部および少なくとも１つの多孔質表面を有す
る少なくとも１つのチャンバーからなる（besteht ）。 ・ 前記チャンバーは、反応チャンバーであり、部分的にまたは完全にマトリッ
クスで充填される。 ・ 供給溶液は、開口部を介して反応チャンバーにポンプで注入しうる。消費さ
れた供給溶液は、限外濾過膜を介して反応チャンバーから押し出されうる。 ・ 反応器は、恒温に保持されうる（例えば、インキュベーター）。 ・ 反応溶液は、攪拌、振盪またはポンプ循環により、任意に攪拌されうる。
【００２６】 本発明のさらなる主題は、原料が低分子抽出物および高分子抽出物であり、 ・ 反応混合物の低分子成分、特に反応により消費される基質を、全反応器空間
ＶR で十分に均一に分配する、 ・ 反応器空間においてマトリックスの排除容積Ｖ0 のみを高分子成分、特に触
媒活性反応物に対して利用しうる、ならびに ・ マトリックスの排除容積Ｖ0 では基質の変換（反応）のみがなされうる、 ことを特徴とする、本発明の反応器内で産物を製造する方法である。
【００２７】 本発明の方法は、好ましくは、１つまたは数個の基質が、１つまたは数個の酵
素により１つまたは数個の産物に変換される、酵素法である。反応器は、特に、
タンパク質を製造するためのインビトロ転写／翻訳共役反応のための方法に使用
されうる。
【００２８】 高分子成分は、リボソーム、ｔＲＮＡ、ＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、ｍ
ＲＮＡおよび中間代謝の酵素（例えば、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ト
ランスホルミラーゼ、ピロホスファターゼ、ヌクレオチドキナーゼ）およびエネ
ルギー再生系の酵素（例えば、酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、クレアチン
キナーゼ、糖分解酵素、クエン酸サイクルの酵素）、ならびにタンパク質の折り
たたみを補佐し、かつタンパク質の改変を行なう因子である。
【００２９】 低分子成分としては、基質（２０個の天然アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ
、ＵＴＰ、例えばアセチルリン酸等の２次エネルギー基質）およびエフェクター
（緩衝物質、塩、還元性化合物、葉酸、阻害剤、安定化剤）が挙げられる。低分
子化合物は、マトリックスの排除限界よりも小さいものとして、本発明により規
定される。同様に、高分子化合物は、排除限界よりも大きい。カラム法は、 ・ ゲルマトリックスを、反応器空間に取り込み、 ・ ゲルマトリックスを、供給溶液で平衡化し、反応温度で恒温化し（それによ
り、取り込みの前またはその後に、ゲルマトリックスの平衡が生じうる）、 ・ 反応溶液を、カラムにアプライし、 ・ 反応溶液を、反応期間中カラム内で攪拌する（静的プロセス）か、またはカ
ラムを介してゆっくりポンプで注入する（動的プロセス）、ならびに ・ 反応の完了後、産物を含む反応溶液をカラムから溶出する、 ことを特徴とするものが、特に好ましい。
【００３０】 本発明の方法はまた、バッチ法および連続供給を用いる方法に対する改良を含
む。
【００３１】 バッチ法：供給溶液で平衡化されたゲルマトリックスのバッチ反応混合物への
添加は、改良された基質利用可能性のために反応時間が増加されうる。第一近似
として、ゲルマトリックスの添加は、高分子反応物のための容積の増加を生じず
、したがって反応は希釈効果により減少しない。全体的にみて、マトリックスの
添加は、溶解物に関して増加した生産性をもたらす。
【００３２】 ＣＥＣＦおよびＣＦＣＦ法：反応空間中のゲルマトリックスの存在は、全体的
にみて高分子反応物のより少ない希釈をもたらし、それは溶解物に関して生産性
を増加する。この場合、 ・ 供給溶液で平衡化されたゲルマトリックスを、ＣＥＣＦまたはＣＦＣＦ反応
器の反応チャンバーに取り込ませ、 ・ 高分子反応物を含む反応溶液を反応チャンバーに充填し、タンパク質を製造
するためのインビトロ転写／翻訳反応を開始させ、 ・ ＣＥＣＦプロセスの場合、供給チャンバーを供給溶液で充填し、 ・ ＣＦＣＦプロセスの場合、供給溶液を反応チャンバーに連続的にポンプで注
入し、 ・ 反応混合物を、反応の期間中規定された温度で攪拌または振盪し、ならびに ・ 産物を含む反応溶液を、反応の終わりに反応チャンバーから取り出す。
【００３３】 本発明はまた、タンパク質の製造用のインビトロ転写／翻訳共役反応を行なう
ための製剤（Formulierungen）を包含する。これらの製剤は、本発明のマトリッ
クス反応器でタンパク質を製造するのに特に適切である。タンパク質を製造する
ためのインビトロ転写／翻訳共役反応に必要な成分の全ては、２つの溶液の間、
すなわち供給溶液と反応溶液とに分けられる。供給溶液は、緩衝液、塩、基質お
よびエフェクター等の低分子成分を含むのみである。適切な緩衝液および塩は、
例えば、Ｈｅｐｅｓまたはトリス、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよび
アンモニウムイオンである。必要な基質は、２０個の天然アミノ酸、４個のリボ
ヌクレオチド、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰまたは適切な代謝前駆体、例え
ば、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびホスホエノールピルベート、クレ
アチンリン酸もしくはアセチルリン酸等の２次エネルギー物質またはかかる物質
の適切な代謝前駆体である。エフェクターは、反応において陽性作用を有するか
または陰性効果を抑制する物質である。これらは、１つまたは数個の還元化合物
、特にジチオスレイトール、ジチオエリスロール（Dithioerythrol）、グルタチ
オン、メルカプトエタンスルホン酸等のチオール基を含む化合物、ならびに、さ
らにグリセロール、糖、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、界面
活性剤、補助因子等のタンパク質安定化化合物ならびに中間代謝物質の補酵素お
よび補助基質、例えば、葉酸、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたは
その前駆体等の活性化剤、さらにリファンピシン、ＲＮアーゼ阻害剤、プロテア
ーゼ阻害剤、アジド等の所望でない副反応を抑制するための阻害剤を含む。
【００３４】 反応溶液は、必要とする高分子成分を含み、供給溶液の低分子成分のいくつか
または全てをまた含みうる。反応溶液および多数の高分子成分の供給源の基礎は
、細胞溶解物である。この溶解物は、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細
胞（例えば、酵母、網状赤血球、小麦胚）から得られうる。かかる溶解物は、細
胞溶解および粒子画分の分離（例えば、遠心分離）により通常得られる。これら
の方法は、文献により当業者に周知である。このようにして得られた溶解物は、
反応溶液に直接添加されうるか、または最初に加工処理および／または分画され
（例えば、透析、沈降、分画遠心分離、クロマトグラフィー法、濃度段階による
）、いくつかの適切な画分の形態で添加されうる。
【００３５】 タンパク質を製造するためのインビトロ転写／翻訳共役反応は、極めて複雑で
あり、多数の細胞成分を必要とする。現在、これらの成分の完全に全てが識別さ
れているか、またはそれらの機能がすでに十分理解されていると仮定することは
不可能である。
【００３６】 溶解物により導入される高分子成分は、リボソーム、転移ＲＮＡ、調節タンパ
ク質および酵素である。調節タンパク質は、特に、翻訳の開始因子、伸長因子お
よび終結因子である。酵素成分は、例えば、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ
、エネルギー供給および変換のための酵素系（例えば、酢酸キナーゼ、ピルビン
酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ヌクレオシ
ド一リン酸キナーゼ、解糖およびクエン酸回路の酵素）およびピロホスファター
ゼ、トランスホルミラーゼ、トランスアミナーゼ等の中間代謝の酵素である。さ
らに、溶解物の他の成分が、効率のよい転写および翻訳に必要であると仮定され
うる。
【００３７】 他の高分子物質が、個々の成分として反応溶液に添加される。これらは、転移
ＲＮＡ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくは、Ｔ７−ＲＮＡポリメラー
ゼ、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ等のウイルスポリ
メラーゼを含む。さらに、エネルギー成分を再生するための酵素、および溶解物
に含まれないか、または十分な量ではない中間代謝の酵素（例えば、クレアチン
キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ）。さらに、高分子阻害剤
（例えば、ＲＮasin）。さらに、有効でかつ正確なタンパク質の折りたたみに必
要な酵素系（例えば、シャペロン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプ
チジルプロリル−シス−トランス−イソメラーゼ）。さらに、タンパク質の転写
後修飾に必要な酵素。さらに、タンパク質を安定化するか、または溶液中でそれ
を維持する巨大分子成分。
【００３８】 タンパク質が転写および翻訳される鋳型として、環状核酸（例えば、プラスミ
ド）または線状核酸（例えば、ＰＣＲ産物）が反応溶液に添加される。タンパク
質のコード（例えば、ｃＤＮＡ配列）、およびさらに正しい転写および翻訳のた
めの系により必要とされる調節配列がこの鋳型上に局在する。これらは、例えば
、プロモーター配列、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン、ポリメラ
ーゼ終止配列および翻訳エンハンサーを含む。さらに、鋳型は、クローン化、増
幅またはｍＲＮＡ安定化に必要な領域もまた含む。
【００３９】 好ましい態様において、供給溶液は、以下の組成を有する：１５０〜３００ｍ
Ｍの酢酸カリウム、４〜２０ｍＭの酢酸マグネシウム、１〜１０％のグリセロー
ル、０．５〜２．５ｍＭのＡＴＰ、０．５〜２．５ｍＭのＣＴＰ、０．５〜２．
５ｍＭのＧＴＰ、０．５〜２．５ｍＭのＵＴＰ、０．１〜２ｍＭの各アミノ酸（
全部で２０個の天然アミノ酸）、１０．８μｇ／ｍｌの葉酸、０．５〜５ｍＭの
ＥＤＴＡ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６／３０℃、１μｇ／ｍ
ｌのリファンピシン、０．０３％のアジ化ナトリウム、１０〜１００ｍＭのアセ
チルリン酸、１〜１０ｍＭのジチオスレイトール、１〜１０ｍＭのメルカプトエ
タンスルホン酸、７０ｍＭのＫＯＨ。
【００４０】 好ましい態様において、反応溶液は、以下の組成を有する：１５０〜３００ｍ
Ｍの酢酸カリウム、４〜２０ｍＭの酢酸マグネシウム、１〜１０％のグリセロー
ル、０．５〜２．５ｍＭのＡＴＰ、０．５〜２．５ｍＭのＣＴＰ、０．５〜２．
５ｍＭのＧＴＰ、０．５〜２．５ｍＭのＵＴＰ、０．１〜２ｍＭの各アミノ酸（
全部で２０個の天然アミノ酸）、１０．８μｇ／ｍｌの葉酸、０．５〜５ｍＭの
ＥＤＴＡ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６／３０℃、１μｇ／ｍ
ｌのリファンピシン、０．０３％のアジ化ナトリウム、１０〜１００ｍＭのアセ
チルリン酸、大腸菌ＭＲＥ６００由来の４８０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、１〜１０
ｍＭのジチオスレイトール、１〜１０ｍＭのメルカプトエタンスルホン酸、７０
ｍＭのＫＯＨ、０．１Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤、１〜２０μｇ／ｍｌの鋳型
、１００〜５００μｌ／ｍｌの大腸菌Ａ１９溶解物、１〜１０Ｕ／μｌのＴ７−
ＲＮＡポリメラーゼ。
【００４１】 したがって、本発明はまた、酵素反応、特にタンパク質を製造するためのイン
ビトロ転写／翻訳共役反応のための本発明の反応器の使用に関する。
【００４２】 本発明の反応器は、個々に行なわれる反応、例えば、タンパク質の製造のため
の翻訳反応のみ、またはインビトロでの転写反応のみに使用されうることもまた
考えられる。
【００４３】実施例 本発明を、さらに以下の実施例により説明する。記載した反応成分、反応器お
よびＤＦＰ測定ならびにＣＡＴ測定は、全ての記載した実施例に適用する。
【００４４】 本発明の反応器および本発明の方法を試験するために、例として、グリーン蛍
光タンパク質（ＧＦＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）の無細胞タンパク質合成を使用する。転写／翻訳共役反応として、
無細胞タンパク質合成を行なう。Ｔ７ファージプロモーターの制御下にある発現
プラスミド上にＧＦＰ−ｃＤＮＡおよびＣＡＴ−ｃＤＮＡをコードする。ｍＲＮ
Ａへの転写が、ＤＮＡ依存Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼにより同様に生じる。この
ようにインビトロで転写されたｍＲＮＡは、共役系に存在する大腸菌溶解物の助
けによりタンパク質に翻訳される。
【００４５】 Ａ）反応成分 １．プラスミド：ｐＩＶＥＸ２．１−ＧＦＰは、Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏ
ｒｉ由来のグリーン蛍光タンパク質に対する配列を変異体ＧＦＰサイクル３（２
７ｋＤａ）の形態で含む（Nature Biotechnology (1996) 14, 314-319 ）；野生
型ＧＦＰ配列の代わりにＧＦＰサイクル３変異体のコード領域をｐＴＵ５８にク
ローン化した（Science (1994) 263,802）（図７／配列番号：１を参照のこと）
。ｐＩＶＥＸ１．１−ＣＡＴは、大腸菌由来のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼのための遺伝子を含む（図８／配列番号：２を参照のこと）。
【００４６】 ２．大腸菌Ｓ３０溶解物：Ｚｕｂａｙの改変法により、大腸菌Ａ１９株を用いて
溶解物を調製した（Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267 ）。改変した溶解物緩衝
液：１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６／３０℃、１４ｍＭの酢酸マ
グネシウム、６０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭのジチオスレイトール。種々
の実験における収量の差異は、異なる溶解物調製品のためである。
【００４７】 ３．反応溶液：１８５ｍＭの酢酸カリウム、１５ｍＭの酢酸マグネシウム、４％
のグリセロール、２．０６ｍＭのＡＴＰ、１．０２ｍＭのＣＴＰ、１．６４ｍＭ
のＧＴＰ、１．０２ｍＭのＵＴＰ、２５７μＭの各アミノ酸（全２０個の天然ア
ミノ酸）、１０．８μｇ／ｍｌの葉酸、１．０３ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの
ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６／３０℃、１μｇ／ｍｌのリファンピシン、０
．０３％のアジ化ナトリウム、４０ｍＭのアセチルリン酸、４８０μｇ／ｍｌの
大腸菌ＭＲＥ６００由来ｔＲＮＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭのメ
ルカプトエタンスルホン酸、７０ｍＭのＫＯＨ、０．１Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻
害剤、１５μｇ／ｍｌのプラスミド、２２０μｌ／ｍｌの大腸菌Ａ１９溶解物、
２Ｕ／μｌのＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ。
【００４８】 ４．供給溶液：１８５ｍＭの酢酸カリウム、１５ｍＭの酢酸マグネシウム、４％
のグリセロール、２．０６ｍＭのＡＴＰ、１．０２ｍＭのＣＴＰ、１．６４ｍＭ
のＧＴＰ、１．０２ｍＭのＵＴＰ、２５７μＭの各アミノ酸（全２０個の天然ア
ミノ酸）、１０．８μｇ／ｍｌの葉酸、１．０３ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの
ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．５／３０℃、１μｇ／ｍｌのリファンピシン、０
．０３％のアジ化ナトリウム、４０ｍＭのアセチルリン酸、２ｍＭのジチオスレ
イトール、１０ｍＭのメルカプトエタンスルホン酸、７０ｍＭのＫＯＨ。
【００４９】 ５．平衡化マトリックス：セファデックスＧ２５、微細等のゲルマトリックスを
製造業者の指示にしたがい膨潤状態で洗浄した。クロマトグラフィーカラムのた
めの通常法により、空のカラムを充填した。充填したクロマトグラフィーカラム
を１〜２カラム容積の供給溶液で平衡化した。バッチおよびＣＥＣＦ反応に対し
て、ゲルマトリックスを供給溶液中で数回懸濁することによりそれを平衡化して
、軽い減圧下で吸引乾燥した。このように処理したマトリックスをバッチ混合物
に添加するか、またはＣＥＣＦ反応器に取り込んだ。
【００５０】 Ｂ）反応器 バッチ反応に、密封しうるプラスチック製の反応容器を用いた。使用したＣＥ
ＣＦ反応器は、２つのチャンバー、すなわち１ｍｌの容積を有する反応チャンバ
ーと約１０ｍｌの容積を有する供給チャンバーとからなる。チャンバーは、１０
ｋＤａの透析膜で互いに分離され、それぞれ閉鎖しうる開口部を介して充填され
うる。各チャンバーは、マグネチックスターラーバーを含む。恒温に保たれ得、
ゲルマトリックスで充填される既製のＰＤ１０カラム（Pharmacia ）または市販
のクロマトグラフィーカラム（Pharmacia ）を、マトリックスカラム反応器とし
て使用した。全ての反応器タイプを、３０℃で操作した。バッチ反応混合物は振
盪され、ＣＥＣＦ反応器は攪拌され、マトリックスカラム反応器はポンプを用い
て充填および溶出された。
【００５１】 Ｃ）ＧＦＰ測定 ＧＦＰは、発蛍光団を形成するために、十分な量の酸素の存在を必要とする。
反応溶液に溶解した酸素の量は少なく、完全な変換に十分でない。したがって、
１１サンプルが、測定前に４℃で１２〜３２時間で「成熟」になった。Kontron
社、Tegimenta SFM-25型の蛍光分光光度計を使用して、サンプルを測定した。励
起を３９５ｎｍの波長で、発光を５１０ｎｍの波長で測定した。
【００５２】 Roche Diagnostics 、カタログ番号1814524 の組換えＧＦＰを、標準として使
用した。濃度１μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの標準溶液を用いて、較正を行な
った。
【００５３】 測定のために、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６／３０℃、１４
ｍＭの酢酸マグネシウム、６０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭのジチオスレイ
トールを有する濃度に依存して、１：５０〜１：４００にサンプルを希釈した。
【００５４】 Ｄ）ＣＡＴ測定 ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）測定を、製造業
者の指示により、ＣＡＴ ＦＡＳＴグリーン蛍光基質（分子プローブ）を用いて
酵素により行なった。
【００５５】 Ｅ）手順 実施例１ マトリックスバッチ反応器対バッチ反応器 バッチ反応混合物の組成は前記である（反応溶液と同じ）。反応を開始するた
めに、前記鋳型プラスミドを最後に混合した。１ｍｌ アリコートの前記反応溶
液を密閉可能な反応容器に添加した。２ｇの平衡化ゲルマトリックス〔セファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５、微細〕を、前記反応混合物の１つに添加し
た。前記混合物を密閉し、振盪しながら３０℃で４時間インキュベートした。Ｇ
ＦＰの収量を標準プロトコールで測定した（上記参照のこと) 。
【００５６】
【００５７】 結果：前記ゲルマトリックスを添加することは、蛍光活性ＧＦＰの収量を、標準
バッチ反応に比べて６１％まで増加させる。
【００５８】 実施例２ マトリックスを内包するＣＥＣＦ反応器対ＣＥＣＦ反応器 ０．５ｍｌの平衡化ゲルマトリックス（セファデックスＧ−１０) を、ＣＥＣ
Ｆ反応器の反応チャンバー（１ｍｌ 反応チャンバー、１０ｍｌ 供給チャンバ
ー) に取り込んだ。改変された組成の０．５ｍｌの反応溶液を前記反応チャンバ
ーに充填した。前記反応溶液の高分子成分は２倍濃度（９６０μｇ／ｍｌ Ｅ．
ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００由来ｔＲＮＡ、０．２Ｕ／μｌ Ｒｎａｓｅインヒビタ
ー、３０μｇ／ｍｌ プラスミド、４４０μｌ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ Ａ１９ラ
イゼート、４Ｕ／μｌ Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ）であり、低分子成分の濃度
は、１倍濃度（すなわち、供給溶液として）であった。１０ｍｌの供給溶液を供
給チャンバーに充填した。ＣＥＣＦ反応器における比較反応を標準条件下に行な
った。すなわち、１５μｇ ＧＦＰプラスミドを含む１ｍｌの反応溶液を、反応
チャンバーに充填し、約１０ｍｌの供給溶液を供給チャンバーに充填した。両方
の反応器を、攪拌（１５０ｒｐｍ）しながら、３０℃で２０時間インキュベート
した。各反応時間の終了時に、反応チャンバーの内容物を取り出し、合成された
ＧＦＰの収量を標準プロトコールで測定した（上記参照のこと）。
【００５９】
【００６０】 結果：ＣＥＣＦ反応器の反応チャンバーへのマトリックスの取り込みは、蛍光活
性ＧＦＰの産生を５６％まで増加させた。
【００６１】 実施例３ ＣＥＣＦ反応器に対するマトリックスカラム反応器（１／１０容量）の比較 前記ＣＥＣＦ反応を、標準条件で行なった、すなわち、１５μｇ ＧＦＰプラ
スミドを含む１ｍｌの反応溶液を前記反応チャンバーに充填し、約１０ｍｌの供
給溶液を供給チャンバーに充填した。前記反応器を攪拌（１５０ｒｐｍ）しなが
ら、３０℃で２０時間インキュベートした。セファデックスＧ２５（ファルマシ
ア）で充填した市販のＰＤ−１０カラムをマトリックスカラム反応器として用い
た。前記反応器パラメーターを、以下のように、製造者からの情報に基づき推定
した：ＶR ＝８．３ｍｌ、Ｖ0 ＝２．５ｍｌ、ＶM ＝５．６ｍｌ。前記カラムを
１０ｍｌの供給溶液で平衡化させた。１ｍｌの反応溶液（１５μｇ ＧＦＰプラ
スミド／ｍｌ）を添加した後、カラムをふさぎ、３０℃で６時間インキュベート
した。各反応時間の終了時に、ＣＥＣＦ反応器から前記反応溶液を取り出すか、
あるいは前記反応溶液をＰＤ−１０カラムから溶出させた。合成されたＧＦＰの
収量を標準プロトコールで測定した( 上記参照のこと) 。
【００６２】 結果：
【００６３】 ＰＤ−１０カラムにおいて行なわれた反応は、３６２μｇの蛍光活性ＧＦＰを
もたらした。これは、同じ容量（１ｍｌ）でのＣＥＣＦ反応に比較して７６％の
生産性をもたらす。
【００６４】 実施例４ マトリックスカラム反応器（３／１０容量、静的プロセス） １０ｍｌのセファデックスＧ２５、微細を２つのクロマトグラフ用カラムに充
填し、ついで、それぞれを、１カラム容量の供給溶液で平衡化させた。反応器パ
ラメーターを、以下のように、製造者からの情報に基づいて推定した：ＶR ＝１
０ｍｌ、Ｖ0 ＝３ｍｌ、ＶM ＝７ｍｌ。１ｍｌの反応溶液をカラム１にアプライ
し、３ｍｌの反応溶液をカラム２にアプライした。ついで、カラムをふさぎ、３
０℃で２０時間インキュベートした。対照として、１ｍｌのバッチ反応とＣＥＣ
Ｆ反応器における１ｍｌの反応とを行なった（同様に、３０℃で２０時間）。反
応時間の終了後、カラムを溶出した。それぞれ、合成されたＧＦＰの収量を標準
プロトコールにより測定した（上記参照のこと）。
【００６５】
【００６６】 結果：２つのカラム反応器実施の反応収量は、用いられた反応溶液の量に相対し
てＣＥＣＦ反応器収量に匹敵する。３倍量の反応溶液でロードされたカラム２の
場合、２．２倍まで全体の収量を増加させることができた。
【００６７】 実施例５ マトリックスカラム反応器におけるＧＦＰの合成（２０／２００容量、動的プロ
セス） セファデックスＧ２５、微細を、ジャケット付クロマトグラフィーカラム（フ
ァルマシア）に充填し、ついで、１カラム容量の供給溶液により平衡化した。反
応器パラメーターを、製造者からの情報に基づき、以下のように推定した：ＶR ＝２００ｍｌ、Ｖ0 ＝６０ｍｌ、ＶM ＝１４０ｍｌ。当該カラムを、水槽により
、３０℃に調温した。１５ｌμｇ／ｍｌ ＧＦＰプラスミドで開始した２０ｍｌ
の反応溶液を、ポンプでカラムに供給した（１２０ｍｌ／ｈ）。ついで、前記反
応溶液を、１２ｍｌ／ｈの速度で、マトリックスを通して、ポンプで供給した。
溶出物を４℃で分画した。対照として、ＣＥＣＦ反応（１ｍｌ容量）とバッチ反
応（０．１ｍｌ容量）とを、同じ反応混合物を用いて行なった。画分中及び対照
混合物中の合成されたＧＦＰの収量を、標準プロトコールにより測定した( 上記
参照のこと) 。
【００６８】
【００６９】 結果：１５．２ｍｇの蛍光活性ＧＦＰが、２０ｍｌサイズのマトリックスカラム
反応器中において、１０時間以内に生産された。したがって、収量は、０．７６
ｍｇ／ｍｌ開始反応溶液であった。０．５８ｍｇ／ｍｌのＣＥＣＦ反応器におけ
る収量は、この反応器タイプで決まって得られる範囲である。したがって、前記
マトリックスカラム反応器は、ＣＥＣＦ反応器に対して匹敵する生産性（１３１
％）を有する。また、本実験は、容量が、１ｍｌのＣＥＣＦ混合物に比べて、収
量を顕著に損失することなく、２０倍まで増加されうることを示す。
【００７０】 実施例６ マトリックスカラム反応器におけるＣＡＴ合成（１２．５／１２５容量、動的プ
ロセス） セファデックスＧ２５、微細を、ジャケット付クロマトグラフィーカラム（フ
ァルマシア）に充填し、ついで、１カラム容量の供給溶液で平衡化させた（３０
ｍｌ／ｈ）。前記反応器パラメーターを、製造者からの情報に基づき、以下のよ
うに、推定した：ＶR ＝１２５ｍｌ、ＶM ＝８７．５ｍｌ、Ｖ0 ＝３７．５ｍｌ
。前記カラムを、水槽により、３０℃で調温した。１５μｇ／ｍｌ ｐＩＶＥＸ
１．１−ＣＡＴプラスミドで開始した１２．５ｍｌの反応溶液を、カラムにポン
プで供給した（１８ｍｌ／ｈ）。その後、前記反応溶液を、反応器を通して、３
．６ｍｌ／ｈの速度でポンプで供給した。溶出物を４℃で分画した。機能的に活
性なＣＡＴの収量を、酵素的蛍光試験により測定した。
【００７１】
【００７２】 結果：マトリックスカラム反応器中、６．６ｍｇ ＣＡＴ酵素が１２．５ｍｌの
反応混合物で生産された。
【００７３】 実施例７ マトリックスバッチ反応器におけるＣＡＴ合成 2 つの５０μｌのバッチ反応を、１５μｇ／ｍｌ ｐＩＶＥＸ１．１−ＣＡＴ
で開始した。最初に、前記反応物を３０℃でインキュベートした。３０分後、１
００ｍｇの平衡化マトリックス（セファデックスＧ２５、微細）を、一方のバッ
チに添加した。6 時間後、機能的に活性なＣＡＴ酵素の収量を、蛍光試験により
測定した。
【００７４】
【００７５】 結果：収量は、平衡化マトリックスの添加により７４％まで増加した。
【００７６】 実施例８ マトリックスバッチ反応器におけるマトリックスの量の変動 ５０μｌのバッチ反応を、１５μｇ／ｍｌ ｐＩＶＥＸ２．１−ＧＦＰで開始
した。前記反応物を、３０℃でインキュベートした。３０分後、種々の量（０ｍ
ｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ及び１５０ｍｇ）の平衡化マトリックス（セファデッ
クスＧ２５、微細）を前記混合物に添加した。５時間の反応時間後、前記混合物
を、生産されたＧＦＰが成熟するまで４℃で保持した。
【００７７】
【００７８】 結果：収量は、平衡化マトリックスの添加により、２５０％まで増加した。
【００７９】 実施例９ マトリックスカラム反応器（１／１０容量、動的プロセス）における種々のゲル
材料の比較 種々のゲル材料〔セファデックス、バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）〕を、製
造者の説明書にしたがって、膨潤させ、１０ｍｌカラムに充填し、１５ｍｌの供
給溶液で平衡化させた。１ｍｌの反応溶液（１５μｇ／ｍｌ ｐＩＶＥＸ２．１
−ＧＦＰ）を各カラムにアプライした。直後に、前記反応溶液を２００μｌの供
給溶液で洗浄した。供給溶液の１ｍｌ アリコートを２時間間隔で添加した（イ
ンキュベーター、３０℃）。溶出された画分を集め、４℃で保存した。それぞれ
における合成されたＧＦＰの収量は、標準プロトコールにより測定された( 上記
参照のこと) 。
【００８０】
【００８１】 結果：ポリマーの型、粒子径及び排除分子量に関して異なる種々のゲル材料をマ
トリックス反応器において用いうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マトリックスカラム反応器の可能な態様、ならびにＶR （反応器容積
）、ＶM （マトリックス容積）およびＶ0 （排除容積）の図を示す。
【図２】 図２は、平衡化されたマトリックスの添加有および添加無しでのバッチ反応に
おけるＧＦＰの合成（実施例１）を示す。
【図３】 図３は、反応チャンバーにおける、ＣＥＣＦ反応器でのＧＦＰの合成およびマ
トリックスを内包するＣＥＣＦ反応器でのＧＦＰの合成を示す。両方の反応を、
同一試薬を用いて行なった（実施例２）。
【図４】 図４は、ＣＥＣＦ反応器および同等の大きさのカラム反応器でのＧＦＰの合成
を示す。両方の反応を、同一試薬を用いて行なった（実施例３）。
【図５】 図５は、ＣＥＣＦ反応器でのＧＦＰの合成およびカラム反応器でのＧＦＰの合
成（静的プロセス）を示す。カラム反応器は１ｍｌおよび３ｍｌの反応溶液が負
荷された。全ての反応を同一試薬を用いて行なった（実施例４）。
【図６】 図６は、２００ｍｌのカラム反応器でのＧＦＰの合成（動的プロセス）を示す
。２０ｍｌの反応溶液を適用した。０．１ｍｌのバッチ反応および１ｍｌのＣＥ
ＣＦ反応を対照と同じ試薬を用いて行なった（実施例５）。
【図７】 図７は、ＧＦＰ発現ベクターｐＩＶＥＸ２．１−ＧＦＰのプラスミドマップお
よび配列（配列番号：１）を示す。
【図８】 図８は、ＣＡＴ発現ベクターｐＩＶＥＸ１．１−ＣＡＴのプラスミドマップお
よび配列（配列番号：２）を示す。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１０月７日（２００２．１０．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】 本発明のさらなる主題は、原料が低分子抽出物および高分子抽出物であり、 ・ 反応混合物の低分子成分、特に反応により消費される基質を、全反応器空間
ＶR で十分に均一に分配する、 ・ 反応器空間においてマトリックスの排除容積Ｖ0 のみを高分子成分、特に触
媒活性反応物に対して利用しうる、ならびに ・ マトリックスの排除容積Ｖ0 でのみ基質の変換（反応）がなされうる、 ことを特徴とする、本発明の反応器内で産物を製造する方法である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｇ０７５ // Ｃ１２Ｎ 15/09 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レーダー，アルベルト ドイツ連邦共和国 ムエンジング 82541 ネルトリッヒェ ゼーシュトラーセ 12 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 BA80 CA04 CA11 CA12 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 4B029 AA08 AA21 BB16 BB20 CC02 GA02 4B050 CC03 DD02 EE10 FF12C FF12E LL10 4B064 AG01 CA02 CA21 CA40 CB30 CC21 CD13 CD30 CE07 DA20 4D017 AA08 BA04 CA13 CB01 DA03 EA05 EB05 4G075 AA32 AA62 BA10 BB04 BD03 BD16 CA51 EB21

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 反応器空間ＶR が、 水溶液中で膨潤することができるマトリックスであって、 − 低分子反応物を吸着することができ、かつ − 高分子反応物を排除する 多孔質材料からなるマトリックスを内包し、 マトリックスにより少なくとも２０容量％まで充填されてなる、低分子反応物お
    よび高分子反応物を伴う反応のための反応器。
  2. 【請求項２】 反応器空間のマトリックス構造の結果として、反応区画およ
    び供給区画が１つの反応器空間に存在する請求項１記載の反応器。
  3. 【請求項３】 反応がマトリックスの排除容積Ｖ0 で生じる請求項１または
    ２記載の反応器。
  4. 【請求項４】 マトリックス容積ＶM が、低分子反応成分、特に基質のため
    の供給区画として利用されうる、請求項１〜３いずれか記載の反応器。
  5. 【請求項５】 反応区画および供給区画が膜により分離されていない請求項
    １〜４いずれか記載の反応器。
  6. 【請求項６】 反応器空間に直接または半透膜を介して連結されるさらなる
    供給用貯蔵器を有するが、反応区画および供給区画が膜により分離されていない
    請求項１〜５いずれか記載の反応器。
  7. 【請求項７】 マトリックスがゲルマトリックスである請求項１〜６いずれ
    か記載の反応器。
  8. 【請求項８】 反応器空間が円筒型を有する請求項１〜７いずれか記載の反
    応器。
  9. 【請求項９】 反応器がゲルマトリックスで充填されたカラムである請求項
    １〜８いずれか記載の反応器。
  10. 【請求項１０】 マトリックスが０．５〜３００ｋＤａの範囲の排除限界を
    有する請求項１〜９いずれか記載の反応器。
  11. 【請求項１１】 マトリックスが非架橋もしくは架橋有機ポリマーまたはコ
    ポリマーおよび／または無機材料からなる請求項１〜１０いずれか記載の反応器
    。
  12. 【請求項１２】 原料が、低分子抽出物および高分子抽出物であり、 − 反応混合物の低分子成分、特に反応により消費される基質を、全反応器空間
    ＶR で十分に均一に分配する、 − 反応器空間において、マトリックスの排除容積Ｖ0 のみが高分子成分、特に
    触媒活性反応物に対して利用しうる、ならびに − マトリックスの排除容積Ｖ0 では基質の変換のみがなされうる、 請求項１〜１１いずれか記載の反応器で産物を製造する方法。
  13. 【請求項１３】 酵素法である請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 高分子成分が、リボソーム、ｔＲＮＡ、ＤＮＡ鋳型、ＲＮ
    Ａポリメラーゼ、ｍＲＮＡならびに溶解物由来の酵素および調節タンパク質を含
    み、低分子成分が、基質ならびにエフェクター、緩衝物質および塩を含む、タン
    パク質を製造するインビトロ転写／翻訳共役反応のための請求項１２または１３
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 − ゲルマトリックスを反応器空間に取り込ませる、 − ゲルマトリックスを供給溶液で平衡化する、 − 反応器空間中の平衡化されたゲルマトリックスを反応溶液と接触させる、な
    らびに − 反応器を一定温度に維持する、 請求項１２〜１４いずれか記載の方法。
  16. 【請求項１６】 − 該方法をマトリックスで充填されたチャンバーまたは
    カラムで行なう、 − 反応溶液をカラムにアプライする、および − 反応溶液を反応の期間中カラムに保つ、 請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 − 該方法をマトリックスで充填されたチャンバーまたは
    カラムで行なう、 − 反応溶液をカラムにアプライする、および − 反応溶液を、反応の期間中カラムを通して連続的にまたは段階的にポンプで
    注入する、 請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 − 該方法をバッチ反応器で行なう、ならびに − 反応溶液および平衡化ゲルマトリックスを反応器空間に共にもたらす、ここ
    で添加されるマトリックス容積が反応溶液の少なくとも２０容量％である、 請求項１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 − 該方法をＣＥＣＦ反応器で行なう、 − ゲルマトリックスをＣＥＣＦ反応器の反応区画に取り込む、ならびに − マトリックス容積が反応区画の２０容量％より大きい、 請求項１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 − 該方法をＣＦＣＦ反応器で行なう、 − ゲルマトリックスをＣＦＣＦ反応器の反応区画に取り込む、ならびに − マトリックス容積が反応区画の２０容量％より大きい、 請求項１５記載の方法。
  21. 【請求項２１】 酵素反応のための請求項１〜１１いずれか記載の反応器の
    使用。
  22. 【請求項２２】 タンパク質の製造のための請求項１〜１１いずれか記載の
    インビトロ転写／翻訳共役反応用反応器の使用。
  23. 【請求項２３】 酵素反応のための請求項１２〜２０いずれか記載の方法の
    使用。
  24. 【請求項２４】 タンパク質の製造のための請求項１１〜２０いずれか記載
    のインビトロ転写／翻訳共役反応のための方法の使用。
  25. 【請求項２５】 請求項１２〜２０いずれか記載の方法でのタンパク質の製
    造用のインビトロ転写／翻訳共役反応を行なうための製剤。
  26. 【請求項２６】 供給溶液と反応溶液とを含有してなる、請求項２５記載の
    製剤。
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