KR101229849B1

KR101229849B1 - 소포제의 첨가에 의한 무세포 단백질 합성 시스템의 단백질발현 수율 개선 방법

Info

Publication number: KR101229849B1
Application number: KR1020067019493A
Authority: KR
Inventors: 알렉세이 엠. 볼로신; 제임스 로버트 스와츠
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-21
Publication date: 2013-02-05
Also published as: EA200601748A1; EA010837B1; CA2560504C; NO20064735L; DK1730313T3; MXPA06010918A; EP1730313A1; CN1934276A; EP1730313B1; EP1730313A4; KR20070011320A; AU2005230916B2; US20090042244A1; NO331586B1; WO2005098048A1; JP2007530042A; US8298759B2; AU2005230916A1; ES2394443T3; CA2560504A1

Abstract

소포제를 포함하는 반응 혼합물에서 생물학적 분자의 시험관 내 합성을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 소포제를 포함하는 반응 혼합물은, 예를 들면 약 15 ㎕ 이상의 큰 반응 부피의 규모증대된 반응일 수 있다. 반응은 교반 반응기, 기포 칼럼 반응기 등을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 반응기에서 수행할 수 있다.

소포제, 무세포 단백질 합성, 기포.

Description

소포제의 첨가에 의한 무세포 단백질 합성 시스템의 단백질 발현 수율 개선 방법{PROTEIN EXPRESSION YIELD ENHANCEMENT IN CELL-FREE PROTEIN SYNTHESIS SYSTEMS BY ADDITION OF ANTIFOAM AGENTS}

단백질 합성은 폴리펩티드 요법, 진단법 및 촉매의 개발의 기초를 이루는 근원적인 생물학적 과정이다. 재조합 DNA(rDNA) 기술의 출현으로, 세포의 촉매 장치를 이용하여 소정의 단백질을 생성하는 것이 가능하게 되었다. 이는 세포에서 유래된 추출물을 사용하여 세포 환경 또는 시험관 내에서 달성할 수 있다.

지난 10년간, 무세포(cell-free) 시스템의 생산성은 약 5 ㎍/ml-시간에서 약 500 ㎍/ml-시간으로 두자릿수를 개선시켰다. 이러한 성과는 시험관 내 단백질 합성을 실험실 규모의 연구를 위한 실제적 기술로 만들었으며, 고 처리율 단백질 발현을 위한 플랫폼 기술을 제공한다. 또한, 단백질 약제의 생체 내 대규모 생산에 대한 대안적 수단으로서 무세포 기술 사용의 실행가능성을 시사하기 시작한다.

무세포 단백질 합성은 종래의 생체 내 단백질 발현 방법보다 몇 가지 장점을 제공한다. 무세포 시스템은 세포의, 전부가 아니라면, 대부분의 물질대사 자원을 한 단백질의 배타적 생산 쪽으로 안내할 수 있다. 더욱이, 생체 내 세포 벽의 결핍은 합성 환경을 더 잘 제어할 수 있기 때문에 유리하다. 예를 들면, tRNA 레벨은 발현되는 유전자의 코돈 사용을 반영하도록 변화될 수 있다. 또한, 산화환원 포텐셜, pH 또는 이온의 세기는 세포 성장 또는 생존이 관심대상이 아니므로 생체 내보다 더 융통성있게 변경될 수 있다. 더욱이, 정제된, 적합하게 폴딩된 단백질 산물의 직접적 회수를 용이하게 달성할 수 있다.

또한, 시험관 내 번역은 인공적이고 동위원소로 표지된 아미노산을 혼입하는 이것의 능력뿐만 아니라 불안정하고, 불용성 또는 생체 내 세포독성이 있는 단백질을 생산하는 능력에 대하여 인식된다. 또한, 무세포 단백질 합성은 단백질 공학 및 단백질체 스크리닝 기술을 혁명화하는 역할을 할 수 있다. 무세포 방법은 생체 내에서 새로운 유전자 산물의 발현을 위하여 세포를 클로닝하고 형질전환하는 데 필요한 힘든 과정을 우회하며, 이 분야의 플랫폼 기술이 되고 있다.

무세포 단백질 합성의 모든 유망한 특징에도 불구하고, 이것의 실제적 사용 및 대규모 실행은 몇 가지 장애물에 의하여 제한되어왔다. 이들 중 가장 큰 장애물은 단백질 생성의 낮은 수율 및 과도한 시약 비용을 야기하는 짧은 반응시간 및 낮은 단백질 생성 속도이다. 문헌(Spirin et al. (1998) Science 242:1162-1164)의 개척적인 업적은 연속 유동 시스템의 개발로 짧은 반응 시간 문제를 최초로 회피하였다. 많은 실험실에서 이 일을 반복하고 개선하였지만, 이들은 주로 반응 챔버에 기질을 일정하게 제공하는 방법을 사용하였다. 이러한 접근은 뱃치 시스템에 비하여 번역 반응의 지속기간 및 단백질 수율을 증가시킨다. 그러나, 고가의 시약의 사용은 비효율적이고, 대체로 희석 산물을 생성하며, 생성 속도에 현저한 개선을 제공하지 않았다.

종래의 뱃치 시스템은 이들 연속적 및 반연속적 설계보다 몇 가지 이점을 제공하는데, 이는 규모 증대의 용이, 재현가능성, 증가된 단백질 생성 속도, 편의성, 고 처리율 발현을 위한 다중 포맷에 대한 응용가능성 및 보다 효율적인 기질 사용을 포함한다. 이들 이점은 무세포 단백질 합성의 산업적 이용에 핵심적인 뱃치 시스템 생산성을 개선시킨다. 그러나, 특정 단백질 수율의 감소는 산화성 인산화를 위하여 산소를 필요로 하는 시스템에서 특히 심각하다. 보다 큰 반응에서 생성물 수율의 증가는 이러한 필요를 충족하는 데 필수적 요소이다.

관련 문헌

미국 특허 제6,337,191 B1, Swartz et al. Kim and Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16:385-390; Kim and Swartz (2000) Biotechnol Lett. 22:1537-1542; Kim and Choi (2000) J Biotechnol. 84:27-32; Kim et al. (1996) Eur J Biochem. 239:881-886; Tao and Levy (1993) Nature 362:755-758; Hakim et al. (1996) J Immun. 157:5503-5511; Pratt (1984) Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free systems. In: Hames BD, Higgins SJ. Ed. In transcription and translation: a practical approach. New York: IRL press: 179-209.; Davanloo et al. (1984) PNAS 81:2035-2039; Cock et al. (1999) Biochemistry 259:96-103; Gill and Hippel (1989) Anal. Biochem. 182:319-326; Kim et al. (1999) Europ. J. Biochem. 239:881-886; Davanloo et al. (1984) PNAS 81:2035-2039

발명의 개요

소포제를 포함한 반응 혼합물에서 생물학적 분자의 시험관 내 합성을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 무세포 합성 반응에 소포제를 첨가하면 무세포 시스템에서 단백질의 특정 수율을 증가시킨다. 본 발명의 한 구체예에서, 소포제를 포함한 반응 혼합물은 예를 들면 약 15 ㎕ 이상의 큰 반응 부피의 규모 증대된 반응이다. 반응은 기포 칼럼 반응기를 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 반응기에서 수행할 수 있다.

도 1은 다른 소포제를 포함한 반응에서의 단백질 수득량을 도시한 그래프이다.

도 2는 기포 반응기의 개략도이다.

도 3은 15 ㎕ 반응에 비하여, 1500 ㎕의 총 반응 부피의 기포 칼럼에서의 단백질 GMCSF-scFv의 수득량을 도시한 그래프이다.

도 4는 200 ㎕ 박막 반응 및 15 ㎕ 에펜도르프 튜브 반응에 비하여, 2000 ㎕의 반응 부피의 기포 칼럼에서의 수득량을 도시한 그래프이다. 소포제의 첨가로, 각 시스템의 특정 수득량은 비교가능하다.

발명의 상세한 설명

무세포 시스템에서 합성된 단백질의 총 가용성 및 활성 수율을 증가시키는 소포제를 포함한 반응 혼합물에서의 생물학적 분자의 시험관 내 합성을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 소포제의 첨가는 소규모 반응에서 수율을 증가시킬 수 있 지만, 특히 반응기가 호기성 조건을 제공하는 대규모 반응에서 특별한 이점을 찾을 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 시험관 내 합성은 생물학적 추출물 및/또는 정의된 시약을 포함한 반응 혼합물에서 생물학적 거대분자의 무세포 합성을 의미한다. 반응 혼합물은 거대분자를 생산하기 위한 주형, 예를 들면 DNA, mRNA 등; 합성하고자 하는 거대분자의 모노머, 예를 들면 아미노산, 뉴클레오티드 등 그리고 보조인자, 효소 및 합성에 필요한 다른 시약, 예를 들면 리보솜, tRNA, 폴리머라제, 전사 인자 등을 포함할 것이다. 이러한 합성 반응 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌에 기재되어 있다. 폴리펩티드 합성을 위한 다수의 반응 화학을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응 화학은 본 명세서에서 참고 인용하는, 2002년 1월 8일 발행된 미국 특허 제6,337,191호 및 2001년 1월 2일 발행된, 미국 특허 제6,168,931호에 기재되어 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 반응 화학은 본 명세서에서 참고 인용하는, 출원 계류 중인 미국 특허 출원 제10/643,683호에 기재된 바와 같다. 산화성 인산화를 활성화시켜서 증가된 수율 및 에너지 공급원의 증가된 이용을 제공한다. 개선된 수율은 글루코스를 함유한 배지에서 성장한 박테리아에서 유래된 생물학적 추출물의 이용; 폴리에틸렌 글리콜의 부재; 및 최적화된 마그네슘 농도를 포함한 인자의 조합에 의하여 달성된다. 이는 2차 에너지원의 부재시에도 합성이 일어날 수 있는 항상성 시스템을 제공한다.

생반응기의 실행은 규모에 따라 급격하게 변화할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 증가된 시간 프레임 때문에, 큰 시스템에서의 동질성 유지, 표면 대 부피 비율의 변화 및 반응 자체에서의 변화에 어려움이 있다. 이러한 문제들 이외에, 산화성 인산화를 활성화하는 시험관 내 단백질 합성 반응은 최적의 성능을 위한 증가된 산소를 필요로 할 수 있으며, 이것의 전달은 반응 부피가 증가함에 따라 더 어려워질 수 있다.

반응기의 더 통상적 유형 중에는, 한정하는 것은 아니지만, 교반 탱크 반응기; 기포 칼럼 반응기 및 교반을 위하여 기체 살포에 의존하는 에어리프트 반응기 등이 포함된다. 기포 칼럼 반응기는 시토밈 반응 조건에 대하여 바람직할 수 있다.

상업적 발효에서 종종 마주치는 문제는 거품이 일어나는 것인데, 이는 세포를 오염시켜서 발효기로 들어가는 경로를 제공하는 것을 포함한 다양한 이유로 바람직하지 않다. 세포 배양에서의 거품은 표면 작용성 화학 제제의 첨가로 제어되어 왔지만, 이러한 소포제는 대개 K _L a 값을 저하시켜서 산소 및 다른 기체를 공급하는 반응기의 능력을 감소시키고 또한 세포 성장을 억제할 수도 있다. 시험관 내 합성의 경우, 소포제의 소수성 성분은, 단백질이 예를 들면 종래의 재조합 발현 방법에 의하여 생체 내에서 발현될 때 촉매 및 초기 산물이 세포 내에 있는 그대로 보호되지 않기 때문에 단백질 합성 및 폴딩을 방해하는 것으로 예상된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 결과는 예상하지 못한 것이다.

소포제

본 발명의 시험관 내 단백질 합성 반응은 소포제를 포함한다. 대개, 상기 제 제는 약 0.00007 중량% 이상의 농도로 존재하고, 약 0.0001 중량% 이상 및 약 0.001 중량% 이하, 대개 약 0.007 중량% 이하일 수 있다. 연속 공급 반응에서 소포제 유속을 조절하기 위하여 고정된 부분표본, 주문형 제어 및 비례, 통합 및/또는 유도 제어 또는 이들의 조합을 비롯한 다른 제어 전략을 도입할 수 있다. 소포제 첨가의 최적의 양은 반응 조건, 소포제 유형 등과 같은 매개변수에 의존한다. 소포제 첨가의 최적의 양 및 어디에서 첨가 간의 시간 간격을 적용할 수 있는 지는 시험을 진행하는 동안 경험적으로 결정할 수 있다.

본 명세서에 사용된 소포제는 기포 파괴 및 기체 방출을 촉진하고, 혼합, 분산 또는 교반에 의하여 야기될 수 있는 거품을 중화시키는 반응 혼합물에 첨가된 표면 작용성 화학물질이다. 소포제는 거품을 방지; 제거; 및/또는 감소시킬 수 있다. 추가적으로, 소포제는 양성 보조 표면 특성, 예를 들면 습윤, 분산, 에멀션화, 가용화, 유동 및 레벨링, 부착 및 광택을 부과할 수 있다.

많은 화학물질 화합물은 소포제로 사용될 수 있는데, 이들은, 한정하는 것은 아니지만, 알킬 폴리옥시알킬렌 글리콜 에테르; 에스테르; 알콜; 실록산; 실리콘; 아황산염; 술폰산염; 지방산 및 이들의 유도체 등을 포함한다. 이러한 다양한 제제는 공지되어 있으며, 예를 들면 Sigma Chemicals; J.T. Baker 등을 통하여 시중 구입할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 소포제는 세제와 다르다.

관심대상의 소포제 중에 거품의 공기/물 계면에 불용성 단층을 형성함으로써 탈포/소포 작용을 제공하는 블록 코폴리머가 있다. 블록 코폴리머의 탈포 활성은 코폴리머의 운점 및 사용 온도의 모두의 함수이다. 효과적인 탈포제를 선택하기 위하여, 운점이 소정의 사용 온도보다 낮은 블록 코폴리머를 선택한다. 낮은 산화에틸렌 함량을 가진 블록 코폴리머가 가장 효과적인 탈포제이다. PLURONIC^? 계면활성제는 탈포제로서 광범위하게 사용된다. 역구조 PLURONIC^? R 계면활성제 또한 탈포용으로 효과적이다. 관심대상의 다른 소포제는 실록산 폴리머; 유기 비실리콘 폴리프로필렌계 폴리에테르 분산제의 혼합물; 유기, 지방산 에스테르형 소포제 등을 포함한다.

반응 화학

무세포 단백질 합성의 주형은 mRNA 또는 DNA일 수 있다. 안정화된 mRNA의 번역 또는 조합된 전사 및 번역은 저장된 정보를 단백질로 전환한다. 대체로 대장균(E. coli) 시스템에서 사용되는 조합된 시스템은 인식가능한 프로모터가 있는 DNA 주형으로부터 mRNA를 계속적으로 생성한다. 반응 혼합물에 내생 RNA 폴리머라제가 사용되거나, 외생 파지 RNA 폴리머라제, 통상적으로 T7 또는 SP6가 직접 첨가된다. 대안적으로, mRNA는 메시지를 QB 레플리카제, RNA 의존성 RNA 폴리머라제의 주형에 삽입함으로써 연속적으로 증폭될 수 있다. 대체로, 정제된 mRNA는 그것이 반응 혼합물에 첨가되기 전에 화학적 변형에 의하여 안정화된다. 뉴클레아제는 mRNA 레벨 안정화를 돕기 위하여 추출물에서 제거될 수 있다. 주형은 관심대상의 임의의 특정 유전자에 대하여 코딩할 수 있다.

또한, 다른 염, 특히 생물학적으로 관련된 것, 예를 들면 망간을 첨가할 수 있다. 대체로, 50-250 mM의 칼륨 및 0-100 mM의 암모늄을 첨가한다. 대체로, 반응 의 pH은 pH 6 내지 9를 유지한다. 대체로, 반응의 온도는 20℃ 내지 40℃이다. 이들 범위는 확대될 수 있다.

바람직하지 않은 효소 활성에 대한 물질대사 저해제를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 바람직하지 않은 활성에 원인이 되는 효소 또는 인자를 추출물에서 직접 제거할 수 있다. 세 번째, 바람직하지 않은 효소를 코딩하는 유전자를 염색체에서 불활성화시키거나 결실시킬 수 있다.

또한, 숙주 유기체에서 정제되거나 합성된 소낭을 시스템에 첨가할 수 있다. 이들은 단백질 합성 및 폴딩을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 시토밈 기술은 산화성 인산화의 활성화하기 위한 호흡 연쇄 성분을 함유한 멤브레인 소낭을 사용하는 과정을 활성화하는 것으로 나타났다. 본 방법은 무세포 발현에 사용되어 다른 세트의 멤브레인 단백질을 활성화시킬 수 있다.

관심대상의 합성 시스템은 DNA의 복제를 포함하는데, 이는 DNA의 증폭, DNA 또는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사, RNA를 폴리펩티드로 번역 및 단당으로부터 복합 탄수화물의 합성을 포함할 수 있다.

반응은 대규모, 소규모일 수 있거나, 복수의 동시 합성을 수행하기 위하여 복합화될 수 있다. 추가 시약을 도입하여 활발한 합성을 위한 시간을 연장할 수 있다. 대개, 합성 산물을 반응기에 축적하고, 그 후, 분리하여, 시스템 작동의 완료 후 단백질 정제의 통상의 방법에 따라서 정제한다.

단백질을 생산하기 위한 mRNA의 번역이 특별한 관심대상인데, 이 번역은 DNA 주형으로부터 mRNA의 시험관 내 합성과 연결될 수 있다. 이러한 무세포 시스템은 mRNA의 번역에 필요한 모든 인자, 예를 들면 리보솜, 아미노산, tRNA, 아미노아실 신테타제, 신장 인자 및 개시 인자를 함유할 것이다. 당업계에 공지된 무세포 시스템은, 예를 들면 적합한 뉴클레아제로 처리하여 활성 내생 mRNA를 제거할 수 있는 대장균 추출물을 포함한다.

무세포 추출물, 유전자 주형 및 아미노산과 같은 상기 성분 이외에 단백질 합성에 특이적으로 필요한 물질을 반응에 첨가할 수 있다. 이러한 물질은 염, 폴리머 화합물, 환형 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소에 대한 저해제, 단백질 합성의 저해제 또는 조절제, 산화/환원 조정제, 무변성 계면활성제, 완충 성분, 스페르민, 스페르미딘 등을 포함한다.

바람직하게는, 염은 아세트산 또는 황산의 칼륨, 마그네슘, 암모늄 및 망간 염을 포함하고, 이들 중 일부는 반대 음이온인 아미노산을 가질 수 있다. 폴리머 화합물은 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 디에틸 아미노에틸 덱스트란, 4차 아미노에틸 및 아미노에틸 덱스트란 등일 수 있다. 산화/환원 조정제는 디티오트레이톨, 아스코르브산, 글루타티온 및/또는 이들의 산화물일 수 있다. 또한, Triton X-100과 같은 무변성 계면활성제는 0-0.5 M의 농도로 사용할 수 있다. 스페르민 및 스페르미딘은 단백질 합성 능력을 개선하는 데 사용할 수 있고, cAMP는 유전자 발현 조절자로서 사용할 수 있다.

반응 배지의 특정 성분의 농도를 변화시키면, 다른 성분의 농도도 그에 따라서 변화될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 및 에너지원 화합물과 같은 몇 가지 성분의 농도는 다른 성분의 농도의 변화에 따라서 동시에 조절할 수 있다. 또한, 반응기 내 성분의 농도 레벨은 경시적으로 달라질 수 있다.

바람직하게는, 반응은 pH 5-10의 범위 및 20-50℃의 온도, 더 바람직하게는 pH 6-9의 범위 및 25-40℃의 온도에서 유지된다.

번역 반응에서 생산되는 단백질의 양은 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 한 방법은 번역된 특정 단백질의 활성을 측정하는 분석의 이용가능성에 의존한다. 단백질 활성을 측정하기 위한 분석의 예는 루시페라제 분석 시스템 및 클로람페니콜 아세틸 트렌스페라제 분석 시스템이다. 이들 분석은 번역 반응으로부터 생성된 기능적 활성 단백질의 양을 측정한다. 활성 분석은 부적합한 단백질 폴딩 또는 단백질 활성에 필요한 다른 번역 후 변형의 결핍에 기인하여 비활성인 전체 길이 단백질을 측정하지 않을 것이다.

조합된 시험관 내 전사 및 번역 반응에서 생성된 단백질의 양을 측정하는 다른 방법은 공지된 양의 방사성 동위원소로 표지된 아미노산, 예를 들면 ³⁵S-메티오닌 또는 ¹⁴C-루신을 사용하고, 그 다음 새롭게 번역된 단백질로 혼입된 방사성 동위원소로 표지된 아미노산의 양을 측정하여 반응을 수행하는 것이다. 혼입 분석은 절두된 단백질 산물을 포함한 시험관 내 번역 반응에서 생성된 모든 단백질 중의 방사성 동위원소로 표지된 아미노산의 양을 측정할 것이다. 방사성 동위원소로 표지된 단백질은 단백질 겔 상에서 더 분리할 수 있으며, 생성물이 적합한 크기라는 것과 2차 단백질 산물이 생성되지 않았다는 것을 자가방사선술로 확인할 수 있다.

반응 부피 및 구조

반응이 임의의 부피일 수 있는 경우, 상기 방법은 특히 반응 부피가 약 15 ㎕ 이상, 대체로 약 50 ㎕ 이상, 보다 대체로 약 100 ㎕ 이상이고, 500 ㎕, 1000 ㎕, 5000 ㎕ 이상일 수 있는 규모 증대된 반응에서 유리하다. 많은 경우에, 각각의 반응은 복합 반응이 병행으로 수행될 수 있다고 하더라도 약 10 ml 이하일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 1 리터, 10 리터, 100 리터 이상의 부피로 형성될 수 있는, 상업적 생반응기에서 사용되는 바와 같은, 더욱 큰 부피로 규모증대될 수 있다. 반응 혼합물이 지질, 예를 들면 역소낭을 포함하는 경우, 대체로 지질 이중층에 의하여 표면에 결합되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "소규모"는 약 15 ㎕ 이하의 부피를 가진 반응을 의미한다. 본 발명의 방법은 소규모 반응에 비하여 실질적으로 일관된 수율을 유지하는 전술한 "규모증대" 반응을 허용한다. 수율은 그것을 반응 간에 일관되게 적용하는 한, 예를 들면, 총 단백질 합성/ml 반응 혼합물; 가용성 단백질 합성/ml 반응 혼합물; 생물학적 활성 단백질 합성/ml 반응 혼합물 등 임의의 편리한 방법으로 계산할 수 있다. 비교가능한 소규모 반응(즉, 반응은 부피만 다르고 동일한 반응물을 포함한다)에 비하여, 규모증대된 반응의 수율은 대체로 약 90% 이상, 더욱 대체로 약 95% 이상이고; 약 99% 이상일 수 있다. 일부의 경우, 수율은 본 발명의 규모증대된 반응 혼합물에서 실질적으로 증가된다.

시스템은 호기성 및 혐기성 상태, 바람직하게는 호기성 하에서 수행될 수 있다. 반응의 탈수를 막기 위하여, 헤드스페이스를 대체로 작업 온도에서 약 80% 포화로, 더욱 대체로 작업 온도에서 약 90% 포화로 가습할 수 있다. 실험실 조건 하 에서, 헤드스페이스를 막는 챔버를 밀봉하면 대개 충분하다. 반응 챔버의 헤드스페이스는 산소로 채울 수 있거나 산소를 반응 혼합물에 주입할 수 있다. 산소는 계속적으로 공급할 수 있거나 반응 챔버의 헤드스페이스는 긴 반응 시간 동안 단백질 발현의 과정 동안 재충전될 수 있다. 산소뿐만 아니라, 또한 다른 전자 수용기, 예를 들면 질산염도 적합한 호흡 경로를 위하여 이미 유도된 세포 추출물에 대하여 제공될 수 있다.

폭기된 반응 조건을 기포 칼럼 설계에 제공할 수 있다. 기포 칼럼에서, 공기는 액체 충전 용기로 버블링하거나 살포된다. 기체는 칼럼에서와 같이 기체를 액상에 살포함으로써 기포로 분산될 수 있다. 기체, 예를 들면 산소 또는 산소를 포함한 혼합물은 칼럼 전체의 면적을 덮는 분배 플레이트 및 또한 에어리프트 반응기를 통하여 기포로 분산될 수 있는데, 여기에서 공기는 전반적 순환 패턴의 특정 유형을 전체 탱크에 부과하도록 설계된 루프 또는 흡출관에 의하여 채널에 가두어 진다. 다양한 칼럼 형태는 당업계에 공지되어 있고, 크기 변경, 배플, 헤드스페이스 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 참고 인용하는 문헌, 그 중에서도 특히, (Bubble Column Reactions, 1^st ed.; Wolf-Dieter Deckwer(Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig, Germany) ISBN: 0471918113; Oldshue (1983) Biotechnol Adv. 1(1):17-30; Poulsen & Iversen (1999) Biotechnol Bioeng. 64 (4):452-8; Poulsen & Iversen (1998) Biotechnol Bioeng. 58(6):633-41)를 참조하라.

본 발명은 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구성물 및 기재된 시약에 제한되지 않으며, 물론 그 자체로 다양해질 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 구체예만을 설명하기 위한 목적이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

달리 한정하지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속한 분야의 전문가라면 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기술한 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 지금 설명한다.

본 명세서에서 언급한 모든 문헌은 예를 들면 지금 설명하는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 문헌에 기재된 세포주, 구성물 및 방법론을 설명하고 개시할 목적으로 본 명세서에 인용된다. 상기 및 명세서 전반에 논의된 문헌은 본 출원의 출원일 전에 이들의 개시에 대하여 단독으로 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 발명자는 선행 발명에 의하여 이들 개시보다 선행하는 권리가 부여되지 않는다는 승인으로 해석되지 않는다.

하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완전한 개시 및 설명을 위하여 제공되며, 본 발명으로 간주되는 것의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 사용된 수치(예를 들면, 양, 온도, 농도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위하여 노력을 기울였으나, 일부 실험적 오류 및 편차는 허용되어야 한다. 달리 지적하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도 이고; 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.

실험

실시예 1

무세포 단백질 합성 시스템에 대한 소포제의 첨가를 테스트하였다. 다섯 가지 다른 소포제를 PANOx(Kim and Swartz 2001 Biotechnol. Bioengineer. 74:309-316) 무세포 시스템에 첨가하였으며, 대장균 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT)의 총 가용성 활성 수율을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 1). 도 2는 기포 반응기의 기본 개략도를 도시한다. 도 3 및 4는 GMCSF-VL-VH 포유류 단백질 구성물과 기포 반응기의 CAT의 수율을 에펜도르프 튜브의 대규모 대 소규모로 비교한다. 제제는 표 1에 나열하고, 반응 성분은 표 2 및 3에 나열한다.

시토밈 시스템의 경우, 표 2에 나열된 성분은 지정된 농도로 혼합된다(Jewett and Swartz, 계류중인 출원 10/643,683). PANOx 시스템의 경우, 도 3에 나열된 성분은 문헌(Swartz and Kim, "Regeneration of Adenosine Triphosphate from Glycolytic Intermediates for Cell-Free Protein Synthesis", Biotechnology and Bioengineering, Vol. 74, 4, August 20, 2001)에 기재된 바와 같은 소정의 농도로 혼합된다.

CAT 단백질 발현의 경우, 시스템 내에서 주형으로 사용된 DNA는 T7 프로모터, 이어서 대장균 단백질 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 pK7-CAT 환형 플라스미드이다. 구조 유전자 다음에 T7 종결자가 이어진 다.

GMCSF-scFv 단백질 발현의 경우, 시스템 내에서 주형으로 사용된 DNA는 T7 프로모터와 이어서 GMCSF 단백질을 코딩하는 유전자(Mi-Hua Tao, 1993)를 포함하고, 5 아미노산 연결기(글리신₄-세린)를 통하여 쥐 림프종 항체의 scFv 단편을 코딩하는 유전자, 38C13(Hakim, 1996)에 융합되는 pK7-GMCSF-VL-VH 순환 플라스미드이다. 구조 유전자 다음에 T7 종결자가 이어진다.

S30 세포 추출물을 Pratt(1984)의 과정에 따라서 대장균 K12(균주 A19)로부터 제조하였다. 균질화한 후 세포 용해물에 DL-디티오트레이톨을 첨가하지 않았다. T7 RNA 폴리머라제는 Davanloo et al.(1984)의 과정에 따라서 대장균 균주 BL21(pAR1219)의 배양물로부터 제조하였다.

GMCSF-VL-VH 발현의 경우, 하기 첨가를 사용하여 단백질 폴딩 및 이황화 결합 형성을 향상시키도록 발현 시스템을 변형하였다. 무세포 추출물은 반응 혼합물에 첨가하기 전에 실온에서 30분 동안 0.85 mM 요오드아세트아미드(IAM)로 전처리한다. 대장균 DsbC를 50 ㎍/ml 농도로 첨가하였다. 산화되고 환원된 글루타티온을 각각 4 mm 및 1 mm의 농도로 반응 혼합물에 첨가한다.

대장균 DsbC는 균주 BL21(DE3)(pETDsbC)를 과발현함으로써 제조하였고, 코발트 IMAC 칼럼으로 정제하였다. 선택된 분획들을 5 mM DTT를 함유하는 S30 완충액(Pratt, 1984)으로 투석하여 DsbC의 활성 부위를 감소시켰다.

소포제를 열거된 판매처에서 구입하고, 지정된 양으로 첨가하였다. 일부의 경우, 소포제를 물에 희석하여 무세포 반응물 15 ㎕마다 소포제/물 혼합물 1 ㎕를 첨가하였다.

에펜도르프 테스트 튜브 방법의 경우, 적합한 부피의 혼합물을 에펜도르프 테스트 튜브의 바닥에서 피펫팅한다. 튜브를 적합한 시간 동안(PANOx 경우, 3시간, 시토밈 시스템의 경우, 6시간) 37℃에서 인큐베이션한다.

소포제명	제조회사
소포제 204	Sigma
소포제 B	J.T. Baker
소포제 O-30	Sigma
Triton X-705	Sigma
소포제 SE-15	Sigma

기포 칼럼 반응기는 1 cm ID의 직경과 5 cm 높이의 칼럼으로 구성된다. 무세포 반응 혼합물(표 1 및 2)을 칼럼 내로 피펫팅하였다(도 2). 기체는 압축 기체 탱크로부터 칼럼의 바닥에 있는 작은 제트(직경 1 mm 미만)를 통하여 기포를 발생한다.

시토밈 시스템(Jewett and Swartz, 공동 계류중인 가출원 10/643,683호에 기재된 바와 같음)의 경우, 순수한 산소 기체를 사용하였고, 반응을 37℃에서 최대 4 시간 동안 진행하였다. PANOx 반응의 경우, 아르곤 기체를 사용하였고, 반응 시간은 37℃에서 3시간이었다. 기포 크기는 직경 약 0.5 cm이고, 기포발생 속도는 약 1 기포/초였다. 소포제를 첨가하지 않으면, 무세포 단백질 합성 반응은 칼럼 반응기의 꼭대기 밖으로 즉시 거품이 나온다. 단백질이 전혀 생성되지 않는다. 소포제의 첨가시(Sigma 204, 1/1000-1/10000 소포제 부피/반응 부피), 단백질 합성 반응은 15 ㎕ 에펜도르프 튜브 반응의 것과 비교할 만한 단백질 수율을 생성하는 3.5 내지 4 시간 동안 최소 거품발생을 하면서 계속된다(도 3 및 4 참조).

합성된 단백질의 양은 액체 섬광 계수기(LS3801, Beckman Coulter, Inc.)에서 측정된 TCA-침전 방사능으로부터 평가하였다. 샘플을 15분 동안 4℃ 및 15,000 RCF에서 원심분리한 후, 상청액을 취하여 TCA 침전 및 섬광 계수에 의하여 가용성 수율을 결정하기 위하여 사용하였다. 그 과정은 이미 상세하게 설명하였다(Kim et al, 1996 b).

결과는 CAT뿐만 아니라 GM-CSF-scFv 융합 단백질에 대하여 나타낸다. 전체 반응은 개시 후 첨가 없이 일괄처리 방식으로 진행된다.

이들 데이터는, 다른 규모 및 다른 반응 구조 및 단백질의 경우에, 소포제의 첨가는 개선된 시험관 내 단백질 합성을 제공한다는 것을 입증한다. 특히, 소포제는 기포 칼럼을 사용하여 규모증대 반응에서 증가된 수율을 제공한다.

Claims

시험관 내(in vitro)에서, mRNA로 전사 또는 폴리펩티드로 번역하는 방법으로서,

상기 방법은 15㎕ 보다 큰 부피의 무세포 반응 혼합물에서 상기 mRNA 또는 폴리펩티드를 합성하는 것을 포함하고, 상기 무세포 반응 혼합물은 0.00007 중량% 이상 0.007 중량%이하의 농도의 표면 작용 소포제를 포함하고,

상기 소포제는 거품의 공기/물 계면에 불용성 단층을 형성함으로써 탈포/소포 작용을 제공하는 블록 코폴리머; 알킬 폴리옥시알킬렌 글리콜 에테르; 실록산 폴리머; 및 유기 비-실리콘 폴리프로필렌계 폴리에테르 분산제의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 블록 코폴리머는 PLURONIC 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 소포제는 알킬 폴리옥시알킬렌 글리콜 에테르; 실록산 폴리머; 및 유기 비-실리콘 폴리프로필렌계 폴리에테르 분산제의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 100㎕ 보다 큰 부피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 1000㎕ 보다 큰 부피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 무세포 반응 혼합물에서 산화성 인산화가 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 합성은 반응기 내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 반응기는 기포 반응기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 생물학적 추출물; mRNA 또는 폴리펩티드의 생산을 위한 주형; 합성하고자 하는 mRNA 또는 폴리펩티드의 모노머; 및 합성에 필요한 보조인자 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
시험관 내(in vitro)에서 mRNA로 전사 또는 폴리펩티드로 번역을 위한 무세포 반응 혼합물로서,

생물학적 추출물; mRNA 또는 폴리펩티드의 생산을 위한 주형; 합성하고자 하는 mRNA 또는 폴리펩티드의 모노머; 합성에 필요한 보조인자 및 효소; 및 농도가 0.0007 중량% 이상 0.007 중량% 이하인 표면 작용 소포제를 포함하고,

상기 소포제는 거품의 공기/물 계면에 불용성 단층을 형성함으로써 탈포/소포 작용을 제공하는 블록 코폴리머; 알킬 폴리옥시알킬렌 글리콜 에테르; 실록산 폴리머; 및 유기 비-실리콘 폴리프로필렌계 폴리에테르 분산제의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 무세포 반응 혼합물.
삭제
제 12 항에 있어서, 상기 블록 코폴리머는 PLURONIC 계면활성제인 것을 특징으로 하는 무세포 반응 혼합물.
제 12 항에 있어서, 상기 소포제는 알킬 폴리옥시알킬렌 글리콜 에테르; 실록산 폴리머; 및 유기 비-실리콘 폴리프로필렌계 폴리에테르 분산제의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 무세포 반응 혼합물.
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