NO331586B1 - Metode for cellefri proteinsyntese samt cellefri reaksjonsblanding - Google Patents
Metode for cellefri proteinsyntese samt cellefri reaksjonsblanding Download PDFInfo
- Publication number
- NO331586B1 NO331586B1 NO20064735A NO20064735A NO331586B1 NO 331586 B1 NO331586 B1 NO 331586B1 NO 20064735 A NO20064735 A NO 20064735A NO 20064735 A NO20064735 A NO 20064735A NO 331586 B1 NO331586 B1 NO 331586B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cell
- reaction mixture
- mrna
- free
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 42
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 title description 23
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims abstract description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 42
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 20
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 20
- -1 glycol ethers Chemical class 0.000 claims description 15
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 230000003254 anti-foaming effect Effects 0.000 claims description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 9
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 8
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 8
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims description 7
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 7
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims description 7
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 7
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000010512 small scale reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 59
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 4
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical class CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920002004 Pluronic® R Polymers 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000010667 large scale reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
Abstract
Sammensetninger og metoder er tilveiebrakt for in vitro syntese av biologiske molekyler i reaksjonsblandinger omfattende en antiskumforbindelse kan være oppskalerte reaksjoner, for eksempel i reaksjonsvolum større enn minst omtrent 15 μl. Reaksjoner kan utføres i ulike reaktorer, som kjent innen teknikken, som inkluderer omrøringsreaktorer, boblekolonnereaktorer, og lignende.
Description
O ppfinnelsens bakgrunn
Proteinsyntese er en fundamental biologisk prosess som ligger bak utviklingen av polypeptidterapeutika, diagnostikk og katalysatorer. Med tilgang til rekombinant DNA (rDNA) teknologi har det blitt mulig å utnytte det katalytiske maskineri til cellen for å fremstille et ønsket protein. Dette kan bli oppnådd i det cellulære miljø eller in vitro ved å anvende ekstrakter avledet fra celler.
I løpet av det siste tiåret er produktiviteten til cellefrie systemer forbedret med 100 ganger, fra omtrent 5^g/ml-time til omtrent 500 ug/ml-time. Denne oppnåelsen har gjort in vitro proteinsyntese til en egnet teknikk i laboratorieskalaforskning og er en plattformteknologi for høykapasitet proteinekspresjon. Det begynner også å bli foreslått muligheten av å bruke cellefrie teknologier som et alternativt middel for in vivo storskalaproduksjon av proteinpreparater.
Cellefri proteinsyntese har en rekke fordeler sammenlignet med konvensjonelle in vivo proteinekspresjonsmetoder. Cellefrie systemer kan rette de fleste, hvis ikke alle, av de metabolske ressurser til cellen mot eksklusiv produksjon av et protein. Videre er mangel på en cellevegg in vitro fordelaktig siden dette tillater bedre kontroll av syntesemiljøet. For eksempel kan tRNA-nivåer bli endret for å gjenspeile kodonbruken til genene som skal uttrykkes. Også redokspotensialet, pH, eller ionestyrke kan bli endret med større fleksibilitet enn in vivo idet cellevekst eller levedyktighet ikke er en bekymring. Videre kan direkte gjenvinning av de rensede, korrekt foldede proteinproduktene lett bli oppnådd.
In vitro translasjon er også kjent for dets evne til å inkorporere unaturlige og isotopmerkede aminosyrer så vel som dets evne til å produsere proteiner som er ustabile, uløselige eller cytotoksiske in vivo. I tillegg kan cellefri proteinsyntese spille en rolle i å revolusjonere proteinteknikken og proteomiske screening-teknologier. Cellefrie metoder går utenom de strevsomme prosesser som er nødvendig ved kloning og transformering av celler for ekspresjon av nye genprodukter in vivo og er i ferd med å bli en plattformteknologi for dette område.
På tross av de lovende særpreg med cellefri proteinsyntese, har den praktiske bruken og storskala-implementeringen vært begrenset av en rekke hindere. Overordnet blant disse er korte reaksjonstider og lav proteinproduksjonshastighet, noe som gir dårlig utbytte av proteinsyntese og overflødige reagenskostnader. Pionerarbeidet til Spirin et al., (1988) Science 242:1162-1164, omgikk problemet med kort reaksjonstid med utvikling av et kontinuerlig flow-system. Mange laboratorier har kopiert og forbedret dette arbeide, men de har alle primært anvendt metoder som kontinuerlig leverer substrater til reaksjonskammeret. Denne tilnærmingen øker varigheten av translasjonsreaksjonen og proteinutbyttet sammenlignet med batch-systemet, men er ineffektivt i dets bruk av dyre reagenser, produserer vanligvis et fortynnet produkt og det har ikke blitt gjort tilstrekkelige forbedringer i produksjonshastighetene.
Det konvensjonelle batch-systemet tilbyr en rekke fordeler sammenlignet med disse kontinuerlige og semi-kontinuerlige metoder, som inkluderer lett oppskalering, reproduserbarhet, økte proteinproduksjonshastigheter, bekvemmelighet, anvendbarhet av et mangfold av formater for høykapasitets ekspresjon og mer effektiv substratanvendelse. Disse fordelene gjør at det å forbedre batch-system produktiviteten er avgjørende for den industrielle anvendelsen av cellefrie proteinsynteser. Men ved bruk av vanlig metodologi er det et tap av effektivitet når reaksjoner er oppskalert. Reduksjonen i spesifikt proteinproduktutbytte er spesielt kraftig i systemer som krever oksygen for oksidativ fosforylering. Det å øke produktutbyttet i større reaksjoner er en essensiell komponent for tilfredsstilling av dette behovet.
CA2486913 omtaler metoder for in vitro syntese av biologiske molekyler i reaksjonsblandinger hvor nevnte reaksjonsblanding er foreslått å inneholde en detergent.
Relevant litteratur
US patent 6.337.191 Bl, Swartz et al, Kim og Swartz (2000) Biotechnol. Prog.. 16:385-390; Kim og Swartz (2000) Biotechnol. Lett. 22:1537-1542; Kim og Choi
(2000) J. Biotechnol. 84:27-32; Kim et al. (1996) Eur J. Biochem. 239:881-886; Tao og Levy (1993) Nature 362:755-758; Hakim et al. (1996) J. Immun. 157:5503-5511; Pratt
(1984) Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free systems. I: Hames B. D., Higgins S. J., Ed. In transcription and translation: a practical approach, New York: IRL press: 179-209; Davanloo et al. (1984), PNAS 81:2035-2039; Cock et al. (1999) Biochemistr<y>259:96-103; Gill og Hippel (1989) Anal. Biochem. 182:319-326; Kim et al. (1999) Europ. J. Biochem. 239:881-886; Davanloo et al. (1984) PNAS 81: 2035-2039; CA2486913.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører metode for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA-templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider, kjennetegnet ved at metoden omfatter: syntetisere nevnte mRNA og/eller polypeptider i en cellefri reaksjonsblanding, som omfatter et volum som er større enn 15 ul, som omfatter en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent og som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet; alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en cellefri reaksjonsblanding for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider, kjennetegnet ved at den omfatter: et biologisk ekstrakt; et templat for produksjon av mRNA og/eller polypeptid;
monomere for mRNA og/eller polypeptid som skal syntetiseres; slike kofaktorer, enzymer og andre reagenser som er nødvendig for syntese; og en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent, som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet; alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 er en graf som avbilder proteinutbyttet i reaksjoner omfattende ulike antiskumforbindelser.
Figur 2 er en skjematisk illustrasjon av en boblereaktor.
Figur 3 er en graf som avbilder utbyttet av proteinet GMCSF-scFv i en boblekolonne med totalt reaksjonsvolum på 1500 (il, sammenlignet med en 15 (il reaksjon. Figur 4 er en graf som illustrerer utbytte i en boblekolonne med et reaksjonsvolum på 2000 ul, sammenlignet med 200 ul tynn filmreaksjon, og en 15 ul Eppendorf rørreaksjon. Med tilsats av antiskum er det spesifikke utbytte i hvert system sammenlignbart.
Detaljert beskrivelse av utførelsesformene
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører metode for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA-templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider, kjennetegnet ved at metoden omfatter: syntetisere nevnte mRNA og/eller polypeptider i en cellefri reaksjonsblanding, som omfatter et volum som er større enn 15 (il, som omfatter en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent og som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet; alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en cellefri reaksjonsblanding for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider, kjennetegnet ved at den omfatter: et biologisk ekstrakt; et templat for produksjon av mRNA og/eller polypeptid;
monomere for mRNA og/eller polypeptid som skal syntetiseres; slike kofaktorer, enzymer og andre reagenser som er nødvendig for syntese; og en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent, som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet; alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
Nevnte antiskumforbindelser er anvendt for å øke total, løselig og aktivt utbytte av proteiner syntetisert i cellefrie systemer. Tilsats av antiskum kan øke utbyttet i småskalareaksjoner, men er spesielt fordelaktig i storskalareaksjoner, spesielt reaktorer med aerobiske betingelser.
In vitro syntese som anvendt heri viser til cellefri syntese av biologiske makromolekyler i en reaksjonsblanding omfattende biologiske ekstrakter og/eller definerte reagenser. Reaksjonsblandingen vil omfatte et templat for produksjon av makromolekylet, f. eks. DNA, mRNA, etc; monomerer av makromolekylet som skal bli syntetisert, f. eks. aminosyrer, nukleotider, etc, og slike kofaktorer, enzymer og andre reagenser som er nødvendig for syntesen, f. eks. ribosomer, tRNA, polymeraser, transkripsjonsfaktorer, etc. Slike syntetiske reaksjonssystemer er velkjente innen teknikken og har blitt beskrevet i litteraturen. En rekke kjemiske reaksjoner for polypeptidsyntese kan bli anvendt i metodene ifølge oppfinnelsen. For eksempel er en rekke kjemireaksjoner beskrevet i US patent nr. 6.337.191, meddelt 8. januar 2002, og US patent nr. 6.168.931, meddelt 2. januar 2001.
I en utførelsesform av oppfinnelsen er kjemireaksjonen som beskrevet i den løpende patentsøknaden US 10/643.683. Oksidativ fosforylering er aktivert, noe som gir økt utbytte og forbedret anvendelse av energiressurser. Forbedret utbytte er oppnådd ved en kombinasjon av faktorer, inkludert anvendelsen av biologiske ekstrakter avledet fra bakterier som er dyrket på et glukoseinneholdende medium; et fravær av polyetylenglykol; og optimalisert magnesiumkonsentrasjon. Dette tillater et homeostatisk system, hvor syntesen kan foregå selv i fravær av sekundære energikilder.
Det er velkjent innen teknikken at ytelsen til bioreaktorer kan endres dramatisk ved skalering. Det er vanskeligheter ved å opprettholde homogenitet i store systemer, endringer i overflate til volum forhold og endringer i reaksjonene selv, noe som skyldes økte tidsrammer. I tillegg til disse problemer kan in vitro proteinsyntesereaksjoner som aktiverer oksidativ fosforylering kreve økning i oksygen for optimal ytelse, hvor denne leveringen blir mer vanskelig etter som reaksjonsvolumene øker.
Blant de vanligste typer av reaktorer er, uten begrensning, rørte tankreaktorer; boblekolonnereaktorer og luftbroreaktorer, som baseres på gassbobling for blanding; etc. Boblekolonnereaktoren er foretrukket med Cytomin reaksjonsbetingelser.
Et problem man ofte treffer på i kommersiell fermentering er skumdannelse, som er uønsket, av ulike grunner, inkludert at det gir en inngang for kontaminerende celler for å komme inn i fermentoren. Skum i cellekulturer har vært kontrollert ved tilsats av overflateaktive kjemiske forbindelser, selv om slike antiskumforbindelser normalt senker Ki,a-verdier, reduserer reaktorens kapasitet til å levere oksygen og andre gasser, og kan også hemme cellevekst. Ved in vitro syntese vil de hydrofobiske komponenter av antiskumforbindelser være forventet å interferere med proteinsyntese og folding, idet katalysatorene og de kommende produkter ikke er beskyttet inne i en celle slik de er når proteiner er uttrykt in vivo, f. eks. ved konvensjonelle rekombinant ekspresjonsmetoder. Resultatene som tilveiebringes heri er derfor ikke ventet.
Antiskumforbindelser
In vitro proteinsyntesereaksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en antiskumforbindelse. Forbindelsen er tilstede i en konsentrasjon på minst 0,00007%, og kan være minst 0,0001%, og ikke mer enn 0,001%, normalt ikke mer enn 0,007% med vekt. Ulike kontrollstrategier, inkludert fastsatt alikvot, anfordringskontroll og proporsjonal, integral og/eller derivativ kontroll eller en kombinasjon av disse, kan bli anvendt for å justere antiskumforbindelsens flow-hastighet i kontinuerlige tilførselsreaksjoner. Optimale mengder av antiskumforbindelsestilsatser er avhengig av variabler slik som reaksjonsbetingelser, type antiskumforbindelse og lignende. Optimale mengder av antiskumforbindelsestilsats; og hvor det er egnet tidsspennet mellom tilsatsene, kan bli bestemt empirisk i løpet av prøvekjøringene.
Antiskumforbindelse, som anvendt heri, er et overflateaktivt kjemikal som er tilsatt reaksjonsblandingen for å fasilitere ødelegging av bobler og gassavlevering og å motvirke skummet som kan komme som et resultat av blanding, bobling eller røring. Antiskumforbindelser kan hindre, eliminere, og/eller redusere skum. Antiskumforbindelser kan i tillegg gi positive overflateegenskaper slik som fukting, dispersjon, emulsifisering, solubilisering, strøm og utjevning, vedhenging og glans.
Antiskumforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er valgt fra en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet; alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
I enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen er antiskumforbindelsen en annen enn en detergent.
Den avskummende virkning av blokk-kopolymerer er en funksjon av både blakkingspunktet til kopolymeren og anvendelsestemperaturen. For utvelgelse av en effektiv avskummer er en blokk-kopolymer valgt som har et blakkingspunkt lavere enn den tilsiktede anvendelsestemperaturen. Blokk-kopolymerer med lavt etylenoksidinnhold er de mest effektive avskummerne. PLURONIC® surfaktantene er meget brukt som avskummere. Revers-struktur PLURONIC® R surfaktantene er også effektive i avskummingsanvendelser.
Reaksjonskjemi
Templatet i cellefri proteinsyntese kan være enten mRNA eller DNA. Translasjon av stabilisert mRNA eller kombinert transkripsjon og translasjon omdanner lagret informasjon til protein. Det kombinerte systemet, som oftest anvendt i E. coli systemer, genererer kontinuerlig mRNA fra et DNA-templat med en gjenkjennbar promotor. Enten er endogen RNA polymerase anvendt eller en eksogen fag RNA polymerase, typisk T7 eller SP6, er tilsatt direkte til reaksjonsblandingen. Alternativt kan mRNA bli kontinuerlig forsterket ved å sette inn koden i et templat for QB replikase, en RNA-avhengig RNA polymerase. Renset mRNA er vanligvis stabilisert ved kjemisk modifisering før den er tilsatt til reaksjonsblandingen. Nukleaser kan bli fjernet fra ekstrakter for å hjelpe å stabilisere mRNA-nivåer. Templatet kan kode for hvilket som helst spesielt gen av interesse.
Andre salter, spesielt de som er biologisk relevante, slik som mangan, kan også bli tilsatt. Kalium er vanligvis tilsatt mellom 50-250 mM og ammonium mellom 0-100 mM. pH i reaksjonen er vanligvis mellom pH 6-9. Temperaturen til reaksjonen er vanligvis mellom 20°C og 40°C. Disse områder kan bli utvidet.
Metabolske inhibitorer til uønsket enzymatisk aktivitet kan bli tilsatt til reaksjonsblandingen. Alternativt kan enzymer eller faktorer som er ansvarlig for uønsket aktivitet bli fjernet direkte fra ekstraktet. For det tredje kan genet som koder for det uønskede enzymet bli inaktivert eller slettet fra kromosomet.
Vesikler, enten renset fra vertsorganismen eller syntetisk, kan også bli tilsatt systemet. Disse kan bli anvendt for å forsterke proteinsyntese og folding. Denne cytomimteknologien har blitt vist å aktivere prosesser som anvender membranvesikler inneholdende åndedrettskjedekomponenter for aktivering av oksidativ fosforylering. De foreliggende metoder kan bli anvendt for cellefri ekspresjon for å aktivere andre sett av membranproteiner.
Syntetiske systemer av interesse inkluderer replikasjon av DNA, som kan inkludere forøkning av DNA, transkripsjon av RNA fra DNA eller RNA templater, translasjon av RNA til polypeptider, og syntese av komplekse karbohydrater fra enkle sukkere.
Reaksjonene kan være storskala, småskala eller være mangfoldige for utførelse av et mangfold av simultane synteser. Tilleggsreagenser kan bli introdusert for å forlenge varigheten for aktiv syntese. Syntetisert produkt er normalt akkumulert i reaktoren og er så isolert og renset i henhold til vanlige metoder for proteinrensing etter systemoperasjonen er ferdig.
Av spesiell interesse er translasjon av mRNA for å fremstille proteiner, hvor translasjon kan bli koblet til in vitro syntese av mRNA fra et DNA templat. Et slikt cellefritt system vil inneholde alle faktorer som er nødvendig for translasjon av mRNA, for eksempel ribosomer, aminosyrer, tRNA'er, aminoacylsyntetaser, elongeringsfaktorer og initieringsfaktorer. Cellefrie systemer kjent innen teknikken inkluderer E. coli ekstrakter, etc, som kan bli behandlet med en egnet nuklease for å eliminere aktive endogene mRNA.
I tillegg til de ovennevnte komponenter slik som cellefritt ekstrakt, genetisk templat og aminosyrer, kan materialer som spesifikt er nødvendige for proteinsyntese bli tilsatt til reaksjonen. Disse materialer inkluderer salter, polymeriske forbindelser, cyklisk AMP, inhibitorer av protein eller nukleinsyre degraderingsenzymer, inhibitorer eller regulatorer av proteinsyntese, oksiderings/reduksjonsmodifikatorer, ikke-denaturerende surfaktanter, bufferkomponenter, spermin, spermidin, etc
Foretrukket inkluderer saltene kalium, magnesium, ammonium og mangansalter av eddiksyre eller svovelsyre, og noen av disse kan ha aminosyrer som motanion. De polymeriske forbindelsene kan være polyetylenglykol, dekstran, dietylaminoetyldekstran, kvatært aminoetyl og aminoetyldekstran, etc. Oksidasjons/reduksjonsmodifikatorene kan være ditiotreitol, askorbinsyre, glutation og/eller deres oksider. Også en ikke-denaturerende surfaktant slik som Triton X-100 kan bli anvendt ved en konsentrasjon på 0-0,5 M. Spermin og spermidin kan bli anvendt for forbedring av proteinsynteseevne, og cAMP kan bli anvendt som en genekspresjons-regulator.
Når konsentrasjonen av en spesiell komponent i reaksjonsmediet blir endret, kan annen komponent bli endret tilsvarende. For eksempel kan konsentrasjonene av en rekke komponenter slik som nukleotider og energikildeforbindelser bli simultant kontrollert i samsvar med endringer i de andre komponenter. Konsentrasjonsnivåene av komponentene i reaktoren kan også bli variert over tid.
Foretrukket er reaksjonen holdt i området med pH 5-10 og en temperatur på 20°C til 50°C, og mer foretrukket i området med pH 6-9 og en temperatur på 25°C til 40°C. Mengde protein produsert i en translasjonsreaksjon kan bli målt på ulike måter. En metode baserer seg på tilgang til et assay som måler aktiviteten til det spesielle proteinet som er translatert. Eksempler på assay som måler proteinaktivitet er et luciferase assay-system og et kloramfenikol acetyl transferase assay-system. Disse assay'er måler mengden av funksjonelt aktivt protein produsert fra translasjonsreaksjonen. Aktivitet-assay vil ikke måle fullengde protein som er inaktivt grunnet ukorrekt proteinfolding eller mangel på andre post-translasjonelle modifikasjoner som er nødvendig for proteinaktivitet.
En annen metode for å måle mengde protein fremstilt i en kombinert in vitro transkripsjon og translasjon reaksjon er å utføre reaksjonene ved å anvende en kjent mengde av en radioaktivt merket aminosyre slik som<35>S-metionin eller<14>C-leucin og deretter måle mengden av radioaktivt merket aminosyre inkorporert inn i det nylig translaterte proteinet. Inkorporerings-assay vil måle mengden av radioaktivt merket aminosyre i alle proteiner fremstilt i en in vitro translasjonsreaksjon inkludert trunkerte proteinprodukter. De radioaktivt merkede proteiner kan videre bli separert på en proteingel og ved autoradiografi bekreftet at produktet er av korrekt størrelse og at sekundære proteinprodukter ikke har blitt fremstilt.
Reaksjonsvolum og geometrier
Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter reaksjonsvolum som er større enn 15 (il, vanligvis minst omtrent 50 (il, mer vanligvis minst omtrent 100 (il, og kan være 500 (il, 1000 (il, 5000 (il eller større. I mange tilfeller vil individuelle reaksjoner ikke være mer enn omtrent 10 ml, selv om multiple reaksjoner kan bli kjørt i parallell. Men det er også antatt at foreliggende oppfinnelse vil gjøre det mulig å oppskalere til mye større volum, som anvendt i kommersielle bioreaktorer, som kan være konfigurert for volum på 1 liter, 10 liter, 100 liter, 1000 liter, eller mer. Mens reaksjonsblandingen kan omfatte lipider, f. eks. inverterte vesikler, er den vanligvis ikke omgitt ved overflaten av lipide bilag.
Som anvendt heri er termen "småskala" referert til som reaksjoner som har et volum på omtrent, eller mindre enn omtrent, 15 (il. Metodene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater oppskaleringsreaksjoner slik som beskrevet ovenfor med i det vesentlige sammenfallende utbytter sammenlignet med småskalareaksjoner. Utbytte kan bli regnet ut ved hvilken som helst passende metode såfremt den anvendes konsekvent mellom reaksjonene, f. eks. total proteinsyntese per ml reaksjonsblanding; løselig proteinsyntese per ml reaksjonsblanding; biologisk aktivt proteinsyntese per ml reaksjonsblanding; og lignende. Utbyttet i en oppskalert reaksjon, som sammenlignet med en sammenlignbar småskalareaksjon (dvs. en reaksjon omfattende de samme reaktanter, hvor de er forskjellige kun i volum), er normalt minst omtrent 90%, mer normalt minst omtrent 95%; og kan være minst omtrent 99%. I enkelte tilfeller har det blitt observert at utbyttet faktisk er økt i en oppskalert reaksjonsblanding av foreliggende oppfinnelse.
Systemet kan bli kjørt under aerobiske og anaerobiske betingelser, foretrukket aerobiske. For å forhindre destabilisering av reaksjonen, kan topprommet bli fuktet, vanligvis minst omtrent 80% mettet ved arbeidstemperaturen, mer normalt minst omtrent 90% ved arbeidstemperaturen. Under laboratoriebetingelser er det vanligvis tilstrekkelig å forsegle kammeret som omgir topprommet. Topprommet av reaksjonskammeret kan bli fylt med oksygen eller oksygen kan bli fylt inn i reaksjonsblandingen. Oksygen kan bli tilsatt kontinuerlig eller topprommet av reaksjonskammeret kan bli etterfylt i løpet av proteinekspresjonsforløpet ved lengre reaksjonstider. Ved siden av oksygen, kan andre elektronakseptorer som nitrat også bli tilsatt til celleekstrakter som tidligere er indusert for egnet respirasjons-pathway.
Kullsyreholdige reaksjonsbetingelser kan bli tilveiebrakt i en boblekolonneutførelse. I en boblekolonne er luft boblet eller spredt inn i den væskefylte beholder. Gassen kan bli spredt i bobler ved å sprøyte gassen inn i væskefasen, som i en kolonne. Gassen, f. eks. oksygen eller en blanding omfattende oksygen, kan bli fordelt i bobler gjennom distribusjonsplater som dekker hele kolonnens areal, og også luftbroreaktorer, hvor luften er begrenset i en kanal i form av en loop eller pipette som er designet for å gi en viss type generelt sirkulasjonsmønster i hele tanken. En rekke kolonnekonfigurasjoner er kjent innen teknikken, og kan inkludere variasjoner i størrelse, separasjonsflate, topprom, etc. Se for eksempel "Bubble Column Reactions, 1. utgave; Wolf-Dieter Deckwer (Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH, Braunschweig, Tyskland) ISBN: 0471918113; Oldshue (1983) Biotechnol Adv. l(l):17-30; Poulsen & Iversen (1999) Biotechnol Bioeng. 64(4):452-8; Poulsen & Iversen (1998) Biotechnol Bioeng. 58(6):633-41; inter alia.
Det skal forstås at denne oppfinnelsen ikke er begrenset til den beskrevne spesielle metodologi, protokoller, cellelinjer, dyrearter eller slekter, konstrukter og reagenser beskrevet, idet slike selvfølgelig kan variere. Det skal også forstås at terminologien anvendt heri kun er med hensikt på beskrive spesielle utførelsesformer og er ikke ment å begrense omfanget av foreliggende oppfinnelse, som kun vil være begrenset ved de følgende krav.
De følgende eksempler er fremsatt for å gi fagmannen en fullstendig redegjørelse og beskrivelse av hvordan oppfinnelsesgjenstanden kan lages og anvendes. Bestrebelser har blitt gjort for å besørge nøyaktighet med hensyn på de anvendte tall (f. eks. mengder, temperatur, konsentrasjoner, etc), men enkelte eksperimentelle feil og avvik må være tillatt. Uten at annet er indikert, er deler deler av vekt, molekylærvekt er gjennomsnittlig molekylærvekt, temperatur er i grader Celsius og trykk er ved eller nær atmosfærisk.
Eksperimentelt
Eksempel 1
Tilsats av antiskumforbindelser til cellefrie proteinsyntesesystemer ble testet. Fem ulike antiskumforbindelser ble tilsatt til det PANOx (Kim og Swartz 2001 Biotechnol. Bioengineer. 74:309-316) cellefrie systemet og ble funnet å øke det totale, løselige og aktive utbytte av E. coli kloramfenikolacetyl-transferase (CAT) (Figur 1). Figur 2 viser grovskisse av boblereaktoren. Figur 3 og 4 sammenligner utbyttet av GMCSF-VL-VH mammalt protein konstrukt og CAT i boblereaktoren ved storskala versus småskala i Eppendorf-rør. Forbindelsene er listet i Tabell 1 og reaksjonskomponentene i Tabell 2 og 3.
For cytomim-systemet er komponentene listet i Tabell 2 blandet i de indikerte konsentrasjoner (Jewett og Swartz, co-pending application 10/643.683). For PANOx-systemet er komponentene listet i Tabell 3 blandet inn i de indikerte konsentrasjoner som beskrevet av Swartz og Kim, "Regeneration of Adenosine Triphosphate from Glycolytic Intermediates for Cell-Free Protein Synthesis", Biotechnology and Bioengineering, vol. 74, 4, 20. august 2001.
For CAT protein ekspresjon er DNA'et som er anvendt som templat i systemet pK7-CAT sirkulær plasmid som inkluderer T7 promotor etterfulgt av genet kodende for E. coli protein kloramfenikolacetyltransferase. Det strukturelle genet er fulgt av en T7 terminator.
For GMCSF-scFv proteinekspresjon er DNA'et anvendt som templat i systemet pK7-GMCSF-VL-VH sirkulær plasmid som inkluderer T7 promotoren fulgt av genet kodende for GMCSF protein (Mi-Hua Tao, 1993) og fusert til genet kodende for scFv-fragmentet av det murine lymphoma antistoff, 38C13 (Hakim, 1996) via en 5-aminosyrelinker (glyciru-serin). Det strukturelle gen er fulgt av en T7 terminator.
S30 celleekstrakt ble fremstilt fra E. coli K12 (stamme A19) ifølge prosedyrene beskrevet av Pratt (1984). Ingen DL-ditiotreitol ble tilsatt til cellelysåtet etter homogenisering. T7 RNA polymerase ble fremstilt fra kulturen av E. coli stamme BL21 (pAR1219) ifølge prosedyrene beskrevet av Davanloo et al. (1984).
For GMCSF-VL-VH ekspresjon ble ekspresjonssystemet modifisert for å fremme proteinfolding og disulfid brodannelse ved anvendelse av de følgende tilsetninger. Cellefritt ekstrakt blir forbehandlet med 0,85 mM jodacetamid (IAM) i 30 minutter ved romtemperatur før tilsats til reaksjonsblandingen. E. coli DsbC ble tilsatt ved 50 fig/ml konsentrasjon. Oksidert og redusert glutation blir tilsatt til reaksjonsblandingen i konsentrasjoner på henholdsvis 4 mm 1 mm.
E. coli DsbC ble fremstilt ved overuttrykking av stamme BL21 (DE3) (pETDsbC) og ble renset med en kobolt IMAC kolonne. De utvalgte fraksjoner ble dialysert mot S30-buffer (Pratt, 1984) inneholdende 5 mM DTT for å redusere det aktive setet til DsbC.
Antiskumforbindelsene ble kjøpt fra de listede leverandørene og tilsatt i de indikerte mengder. I enkelt tilfeller ble antiskumforbindelsene fortynnet i vann slik at det ble tilsatt 1 ul av antiskum/vannblanding til hver 15. (il av cellefri reaksjonsblanding.
For Eppendorf testrørmetoden ble blandingen med passende volum pipettert på bunnen av et Eppendorf testrør. Røret ble inkubert ved 37°C i en passende periode (3 timer for PANOx, 6 timer for Cytomim-systemet). Boblekolonnereaktoren består av en kolonne med en diameter på 1 cm ID og 5 cm høy. Cellefri reaksjonsblanding (Tabell 1 og 2) ble pipettert på innsiden av kolonnen (Figur 2). Gass bobles gjennom et lite munnstykke (mindre enn 1 mm diameter) i bunnen av kolonnen fra en tank med komprimert gass.
For Cytomim-systemet (som beskrevet av Jewett og Swartz, co-pending søknad 10/643.683), ble ren oksygengass anvendt og reaksjonen varte i maksimalt 4 timer ved 37°C. For PANOx-reaksjonen ble argongass anvendt og reaksjonstiden var 3 timer ved 37°C. Boblestørrelsen var omtrent 0,5 cm i diameter og boblingshastigheten var omtrent 1 boble per sekund. Uten tilsats av antiskumforbindelse skummet den cellefrie proteinsyntesereaksjonen umiddelbart ut av toppen på kolonnereaktoren. Intet protein ble produsert. Ved tilsats av antiskumforbindelse (Sigma 204, 1/1000-1/10.000 volum antiskum per volumreaksjon) fortsatte proteinsyntesereaksjonen med minimalt skum i opp til 3,5 til 4 timer og ga proteinutbytter sammenlignbare med de fra 15 ul Eppendorf rørreaksjoner (se Figur 3 og 4).
Mengde av syntetisert protein ble estimert fra målt TCA-felt radioaktivitet i en væske-scintillasjonsteller (LS3801, Beckman Coulter, Inc.). Etter sentrifugering av prøvene ved 4°C og 15.000 RCF i 15 minutter, ble supernatantene tatt og anvendt for å bestemme løselig utbytte ved TCA-felling og scintillasjonstelling. Detaljerte prosedyrer er beskrevet tidligere (Kim et al., 1996 b).
Resultater er vist for CAT så vel som for GM-CSF-scFv fusjonsprotein. Hele reaksjonen er kjørt i batch-modus uten post-start tilsetninger.
Disse data indikerer at i ulik skala og med ulike reaksjonsgeometrier og proteiner gir tilsats av antiskumforbindelse forbedret in vitro proteinsyntese. Spesielt gir antiskumforbindelsene økt utbytte i oppskalerte reaksjoner ved anvendelse av en boblekolonne.
Claims (13)
1.
Metode for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA-templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider,karakterisert vedat metoden omfatter: syntetisere nevnte mRNA og/eller polypeptider i en cellefri reaksjonsblanding, som omfatter et volum som er større enn 15 (il, som omfatter en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent og som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet;
alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
2.
Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte antiskumforbindelse er en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet.
3.
Metode ifølge krav 2,karakterisert vedat nevnte blokk kopolymer er en PLURONIC® surfaktant.
4.
Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte reaksjonsblanding omfatter et volum som er større enn 100 (il.
5.
Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte reaksjonsblanding omfatter et volum som er større enn 1000 (il.
6.
Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisertv e d at nevnte reaksjonsblanding har et utbytte som er minst 90% av utbyttet i en sammenlignbar småskalareaksjon.
7.
Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisertv e d at oksidativ fosforylering blir aktivert i den cellefrie reaksjonsblandingen.
8.
Metode ifølge hvilket som helst av kravene 1-7,karakterisertv e d at nevnte syntetisering utføres i en reaktor.
9.
Metode ifølge krav 8,karakterisert vedat reaktoren er en boblereaktor.
10.
Metode ifølge krav 1,karakterisert vedat reaksjonsblandingen omfatter et biologisk ekstrakt; et templat for produksjon av mRNA og/eller polypeptid; monomere for mRNA og/eller polypeptid som skal syntetiseres; og slike kofaktorer, enzymer og andre reagenser som er nødvendig for syntese.
11.
Cellefri reaksjonsblanding for in vitro transkripsjon av mRNA fra et DNA templat og/eller translasjon av mRNA for å fremstille polypeptider,karakterisert vedat den omfatter: et biologisk ekstrakt; et templat for produksjon av mRNA og/eller polypeptid;
monomere for mRNA og/eller polypeptid som skal syntetiseres; slike kofaktorer, enzymer og andre reagenser som er nødvendig for syntese; og en antiskumforbindelse forskjellig fra en detergent, som er tilstede ved en konsentrasjon på minst 0,00007 vekt-% og ikke mer enn 0.007 vekt-%, hvori antiskumforbindelsen er valgt fra: en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet;
alkylpolyoksyalkylenglykoletere; siloksanpolymerer; og blandinger av organisk ikke-silikon polypropylen baserte polyeter dispersjoner.
12.
Cellefri reaksjonsblanding ifølge krav 11,karakterisertv e d at antiskumforbindelsen er en blokk kopolymer som gir en avskummings/antiskummings effekt under dannelse av et uløselig enkeltlag ved luft/vann grenseflaten av skummet.
13.
Cellefri reaksjonsblanding ifølge krav 12,karakterisertv e d at nevnte blokk kopolymer er en PLURONIC® surfaktant.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55673604P | 2004-03-25 | 2004-03-25 | |
| PCT/US2005/009342 WO2005098048A1 (en) | 2004-03-25 | 2005-03-21 | Protein expression yield enhancement in cell-free protein synthesis systems by addition of antifoam agents |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20064735L NO20064735L (no) | 2006-10-19 |
| NO331586B1 true NO331586B1 (no) | 2012-01-30 |
Family
ID=35125089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20064735A NO331586B1 (no) | 2004-03-25 | 2006-10-19 | Metode for cellefri proteinsyntese samt cellefri reaksjonsblanding |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8298759B2 (no) |
| EP (1) | EP1730313B1 (no) |
| JP (1) | JP4829215B2 (no) |
| KR (1) | KR101229849B1 (no) |
| CN (1) | CN1934276A (no) |
| AU (1) | AU2005230916B2 (no) |
| CA (1) | CA2560504C (no) |
| DK (1) | DK1730313T3 (no) |
| EA (1) | EA010837B1 (no) |
| ES (1) | ES2394443T3 (no) |
| MX (1) | MXPA06010918A (no) |
| NO (1) | NO331586B1 (no) |
| NZ (1) | NZ549523A (no) |
| WO (1) | WO2005098048A1 (no) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7341852B2 (en) | 2003-07-18 | 2008-03-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of decoupling reaction scale and protein synthesis yield in batch mode |
| US8183010B2 (en) | 2005-10-31 | 2012-05-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell-free synthesis of membrane bound polypeptides |
| WO2008002661A2 (en) * | 2006-06-28 | 2008-01-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fusion protein constructs |
| EP2376619A4 (en) | 2008-12-15 | 2012-07-04 | Greenlight Biosciences Inc | METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS |
| KR20130071433A (ko) | 2010-05-07 | 2013-06-28 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 효소의 재배치를 통한 대사 경로에서의 흐름의 제어 방법 |
| US8916358B2 (en) | 2010-08-31 | 2014-12-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
| JP2014526250A (ja) | 2011-09-09 | 2014-10-06 | グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | カルバペネムの無細胞調製 |
| JP2016504034A (ja) | 2012-12-21 | 2016-02-12 | グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＧｒｅｅｎｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． | メタンを燃料、ピルビン酸またはイソブタノールに変換する無細胞システム |
| WO2014197655A1 (en) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Greenlight Biosciences, Inc. | Control of metabolic flux in cell-free biosynthetic systems |
| AU2014306074B2 (en) | 2013-08-05 | 2018-08-30 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered proteins with a protease cleavage site |
| BR112016002597B1 (pt) | 2013-08-19 | 2021-03-02 | Dow Global Technologies Llc | método para polimerizar um ou mais polímeros à base de etileno |
| KR101671688B1 (ko) | 2014-06-12 | 2016-11-03 | 충남대학교산학협력단 | 효소를 이용하여 pH를 조절하는 무세포 단백질 합성 방법 |
| KR20230048162A (ko) | 2015-03-30 | 2023-04-10 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 리보핵산의 무세포 생산 |
| CN105255818A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-20 | 肇庆大华农生物药品有限公司 | 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 |
| WO2017176963A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
| US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| JP7186166B2 (ja) | 2016-12-30 | 2022-12-08 | バックスサイト・インコーポレイテッド | 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体 |
| MX2019008159A (es) | 2017-01-06 | 2019-12-09 | Greenlight Biosciences Inc | Producción acelular de azúcares. |
| CN106834391A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-13 | 天津大学 | 一种基于人工多酶生化反应网络合成蛋白质的配方和方法 |
| CN108396034A (zh) * | 2017-02-06 | 2018-08-14 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法 |
| WO2019035916A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Northwestern University | DESIGN OF PROTEIN GLYCOSYLATION SITES BY RAPID EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF N-GLYCOSYLTRANSFERASES |
| MX2020003841A (es) | 2017-10-11 | 2020-11-06 | Greenlight Biosciences Inc | Métodos y composiciones para la producción de nucleósido trifosfatos y ácidos ribonucleicos. |
| US11673921B2 (en) | 2017-11-10 | 2023-06-13 | Northwestern University | Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of Vibrio natriegens |
| WO2019204346A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Northwestern University | METHODS FOR CO-ACTIVATING IN VITRO NON-STANDARD AMINO ACID (nsAA) INCORPORATION AND GLYCOSYLATION IN CRUDE CELLLYSATES |
| US11814621B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-11-14 | Northwestern University | Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming |
| KR20220044212A (ko) | 2019-08-09 | 2022-04-06 | 넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드 | 미세유체 장치 및 이의 사용 방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3990905A (en) * | 1976-02-09 | 1976-11-09 | Nalco Chemical Company | Food process antifoam |
| US5547841A (en) * | 1987-10-08 | 1996-08-20 | The Mclean Hospital Corporation | In vitro method for screening for drugs that inhibit production or degradation of human A4-amyloid |
| JPH04200390A (ja) | 1990-11-30 | 1992-07-21 | Shigeyuki Yokoyama | 無細胞ポリペプチド合成系によるポリペプチドの製造方法 |
| US5223412A (en) * | 1991-02-21 | 1993-06-29 | Genencor International, Inc. | Cell-free and whole cell ice nucleators and process for their production |
| US5856174A (en) * | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
| RU2148649C1 (ru) * | 1998-03-31 | 2000-05-10 | Институт белка РАН | Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления |
| ATE265539T1 (de) * | 1998-05-25 | 2004-05-15 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur isolierung von ccc plasmid dna |
| AU4325900A (en) * | 1999-03-17 | 2000-10-04 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system |
| US6337191B1 (en) * | 1999-03-22 | 2002-01-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source |
| WO2003097829A1 (en) * | 2002-05-22 | 2003-11-27 | Riken | Process for producing protein in cell-free protein synthesis system using thioredoxin fused protein expression vector |
| EP2345738A1 (en) * | 2002-08-05 | 2011-07-20 | Quanta Biosciences, Inc. | Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids |
| AU2004293798B2 (en) * | 2003-11-20 | 2008-10-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Improved methods of in vitro protein synthesis |
-
2005
- 2005-03-21 WO PCT/US2005/009342 patent/WO2005098048A1/en active Application Filing
- 2005-03-21 CA CA2560504A patent/CA2560504C/en active Active
- 2005-03-21 EA EA200601748A patent/EA010837B1/ru unknown
- 2005-03-21 DK DK05733219.9T patent/DK1730313T3/da active
- 2005-03-21 AU AU2005230916A patent/AU2005230916B2/en active Active
- 2005-03-21 ES ES05733219T patent/ES2394443T3/es active Active
- 2005-03-21 EP EP05733219A patent/EP1730313B1/en active Active
- 2005-03-21 MX MXPA06010918A patent/MXPA06010918A/es active IP Right Grant
- 2005-03-21 CN CNA2005800094648A patent/CN1934276A/zh active Pending
- 2005-03-21 JP JP2007505063A patent/JP4829215B2/ja active Active
- 2005-03-21 US US10/599,310 patent/US8298759B2/en active Active
- 2005-03-21 NZ NZ549523A patent/NZ549523A/en unknown
- 2005-03-21 KR KR1020067019493A patent/KR101229849B1/ko active IP Right Grant
-
2006
- 2006-10-19 NO NO20064735A patent/NO331586B1/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8298759B2 (en) | 2012-10-30 |
| WO2005098048A1 (en) | 2005-10-20 |
| US20090042244A1 (en) | 2009-02-12 |
| JP2007530042A (ja) | 2007-11-01 |
| MXPA06010918A (es) | 2006-12-15 |
| AU2005230916B2 (en) | 2012-03-08 |
| JP4829215B2 (ja) | 2011-12-07 |
| EA010837B1 (ru) | 2008-12-30 |
| AU2005230916A1 (en) | 2005-10-20 |
| KR20070011320A (ko) | 2007-01-24 |
| CA2560504C (en) | 2014-09-16 |
| KR101229849B1 (ko) | 2013-02-05 |
| EP1730313A4 (en) | 2007-04-11 |
| CN1934276A (zh) | 2007-03-21 |
| EP1730313A1 (en) | 2006-12-13 |
| NO20064735L (no) | 2006-10-19 |
| ES2394443T3 (es) | 2013-01-31 |
| EA200601748A1 (ru) | 2007-04-27 |
| DK1730313T3 (da) | 2013-01-07 |
| EP1730313B1 (en) | 2012-10-17 |
| NZ549523A (en) | 2009-10-30 |
| CA2560504A1 (en) | 2005-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO331586B1 (no) | Metode for cellefri proteinsyntese samt cellefri reaksjonsblanding | |
| AU2004259433B2 (en) | Methods of decoupling reaction scale and protein synthesis yield in batch mode | |
| US7338789B2 (en) | Methods of in vitro protein synthesis | |
| Voloshin et al. | Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode | |
| JP5074768B2 (ja) | インビトロにおけるタンパク質合成の改良された方法 | |
| EP3574099B1 (en) | Promoter construct for cell-free protein synthesis | |
| JP2022535651A (ja) | 好熱性タンパク質を利用した組換えインビトロ転写及び翻訳のための系、方法及び組成物 | |
| JP4787488B2 (ja) | 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液 |