CN1429275A - 基体反应器和在该反应器中制备产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于其中涉及低分子和高分子反应物的反应的基体反应器。反应器空间VR含有基体并且包括反应区室和供应区室。所述基体由多孔材料组成,所述多孔材料能吸收低分子反应物。基体的排斥体积Vo有效作为反应区室并且基体体积VM作为供应区室。所述基体反应器可以用于酶促方法,特别用于制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应。
Description
本发明涉及用于其中涉及低分子和高分子反应物的反应的基体反应器,其中反应器空间VR含有基体并且包括反应区室和供应区室,其中所述基体由大孔材料组成,所述大孔材料能吸收低分子反应物并且排斥高分子反应物,并且其中基体的排斥体积V0可作为反应区室并且基体的基体体积VM作为供应区室。所述基体反应器可以用于涉及高分子催化剂(例如酶催化的反应)的合成方法,特别用于体外转录/翻译偶联反应制备蛋白质。
其中涉及低分子和高分子反应物的反应的例子是用于蛋白质制备的体外转录/翻译反应。间歇式操作或者使用连续供料的方法并且特别适合用于蛋白质制备的体外转录/翻译偶联反应的反应器原理对于本领域技术人员来说已经是公知的(Baranov&Spirin(1993)酶学方法(Meth.Enzym.)
217,123-142)。在用于蛋白质制备的体外转录/翻译偶联反应方法中,使用DNA-依赖性RNA聚合酶从反应混合物中的DNA模板合成相应的mRNA,然后通过核糖体机器将mRNA翻译为蛋白质。反应溶液的组成很复杂。它含有低分子成分(底物,缓冲剂,盐,激活剂,抑制剂,稳定剂)和高分子成分(DNA模板,RNA聚合酶,核糖体,tRNAs,酶,调节蛋白)。这些成分中的一些以纯化形式被加入。一些重要的翻译成分(核糖体,酶,调节蛋白)的这时作为细胞提取物例如大肠埃希氏杆菌S30-溶胞产物,网状细胞溶胞产物或小麦胚芽溶胞产物加给体系。转录/翻译偶联反应的产率是1毫克/毫升数量级。为此的先决条件是底物和能量成分的连续供应和反应终产物的同时分离或稀释。以这种方式,将反应维持很多小时是可能的。根据连续交换无细胞(CECF)或者连续流动无细胞(CFCF)蛋白质合成原理实施这些实验设置(US5478730;EPA0593757;EPA0312612;Baranov&Spirin(1993)酶学方法(Meth.Enzym.)
217,123-142)。CECF反应器由至少两个不连续的室组成,这些室彼此由多孔膜分开。该多孔界面将高分子成分留在反应室中而低分子成分可以在反应室和供应室之间交换。在CFCF方法中将供给溶液直接泵入反应室并且将反应终产物通过一个或几个超滤膜压出反应区室。
但是,所有这些反应器和其中进行的反应具有以下共有缺点:
·反应器由膜表面和几个室组成,因此在制备中操作复杂。
·如果改变批量规模(例如从实验室规模改为生产规模),则要设计,构造和优化新的反应器。
·底物的供应和终产物的分离通过膜发生,构造将技术限制强加于有效交换表面上,因为不可能实现所有大小的表面/体积之比。
·膜容易被堵塞,这损害了反应物供给。
·反应溶液和供应溶液要连续混合(例如通过搅拌或泵循环)来抵消梯度和供应不足。
现有技术反应器的另一个问题是在制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应情况下,使用的溶胞产物与大肠埃希氏杆菌细胞溶胶状态相比被大大稀释。为此的原因是1.获得溶胞产物的溶胞作用和制备方法和2.加入所有必需成分引起的稀释。这导致降低的产率,因为大分子复合体的平衡移向解离一侧(质量作用定律)。
现有技术已经描述过目的在于提高溶胞产物的活性浓度的抵消这种副作用的几种方法。一种方法是向反应混合物加入高分子PEG(聚乙二醇),其结合水,因此促进留下的大分子的相互作用(US5593856)。该方法的缺点是反应成分和积累的产物可以凝结并且沉淀。浓缩溶胞产物的另一种方法是利用反相渗透原理。在该方法中,通过例如聚乙二醇的浓缩高分子溶液的作用通过半渗透表面(例如透析管),从溶胞产物去除水(Kigawa T.(1999)FEBS Lett.
442,15-19)。但是,该方法的缺点是太复杂。后者也应用于超滤方法(US5593856),其中在使用之前利用超滤作用浓缩溶胞产物。在这种情况下还需要另外一个步骤来制备溶胞产物。
本发明的目的是提供一种反应器,其适合用于蛋白质制备的体外转录/翻译偶联反应并且克服了现有技术反应器的缺点。另外提供适合用于蛋白质制备的体外转录/翻译反应并且不具有现有技术缺点的方法。另外,根据本发明的方法抵消大分子成分的稀释作用。特别要提供使得通过体外转录/翻译反应进行大规模蛋白质制备的反应器和方法。
本发明涉及用于其中涉及低分子和高分子反应物的反应和其中反应器空间含有基体并且包括反应区室与供应区室的反应器,其中
·基体由多孔材料组成,其中低分子反应物可以大自由度分散,
·高分子反应物不能渗透到基体中,
·低分子反应物分布在整个反应器空间VR中,
·基体体积VM作为供应区室和
·基体的排斥体积V0作为反应区室。
在根据本发明的反应器中,由于反应器空间的基体结构,反应区室和供应区室可以存在于一个反应器空间中。这种变化方式是优选的。但是,反应区室和供应区室存在于一个反应器空间中并且还有与反应器空间直接连接或者通过半渗透膜连接的另外一个供应容器也是可接受的。
使用多孔材料作为基体并且多孔材料可以是无机材料例如氧化铝和/或有机材料例如凝胶。基体在含水溶液中必须是可湿润的或者能够溶胀并且具有分子筛性质。根据本发明,含水溶液也指只含有50%体积的水的溶液。在优选的实施方案中,基体由聚合物,交联聚合物(例如葡聚糖),共聚物(例如聚丙烯酰胺)或无机“凝胶”组成。由0.1至1000微米范围粒度的颗粒组成的基体是特别优选的。基于使用的形式(即水合的)具有低物质比重的基体是优选的。物质比重通常小于0.5克/毫升,但优选小于0.3克/毫升。基体颗粒表面(以球体表面计算)优选是0.004至40m2/ml床体积范围。也用大分子排阻限(排除分子量)定义基体。排阻限可以是0.5至300kDa范围。排阻限在2至300kDa之间是优选的,排阻限在10至100kDa之间是特别优选的。合适的材料是商业上可获得的(例如Sephadex,Pharmacia;Bio-Gel,BIO-RAD)。可以使用均匀的或者不同粒度的材料。也可以使用不同材料的混合物。基体本身由其本身不参与反应,甚至也不作为催化剂的惰性材料组成。但是,根据需要,例如酶这样的物质可以结合在该惰性基体上。
反应器空间完全或部分装有该多孔基体材料。要求基体对反应器的最小装填量来实现本发明效果。低于20体积%(床体积)不再能预期到本发明效果。当然,在各种情况下,不排除基体装填例如是19.9%体积。因此,根据本发明的反应器装有至少大约20体积%,特别优选至少大约30体积%的多孔基体材料。其中反应器完全装有多孔基体材料的变化形成是特别优选的。80-100体积%范围是极为优选的。
基体将反应器体积分为至少两个区室。可以只由低分子成分占据的一个空间和其中存在低分子及所有的高分子成分的一个空间。作为第一近似值,通过它们能够达到的分布空间的大小确定得到的所用反应物的最终浓度。
具有基本上低于基体排阻限的分子量的成分占据总反应器体积VR。这适用于底物,缓冲物质,盐和低分子抑制剂,激活剂或稳定剂。这也特别适用于能潜在抑制反应(例如产物抑制作用)或者其积累改变一般反应条件(例如pH值)并因此延缓反应的低分子反应终产物。
高分子成分不能渗透到基体中。它们唯一的分布空间是基体颗粒之间的体积,即排斥体积V0。从总反应器体积减去基体体积计算该空间(V0=VR-VM),并且等于反应区室。反应区室和供应区室通过短传播途经并且通过非常大的交换面积彼此连接。反应区室V0与供应区室VM的体积之比取决于基体的性质,大小和结构特征,并且取决于加入的基体的量。VR/VM之比可以在宽范围内变化。
大分子特定部分的反应体积可以通过混合不同排阻限(例如10kDa和200kDa)的凝胶材料而增大。因此,在该实施例中,核糖体,DNA模板和mRNA的体积被减小(分子量大于200kDa),而在延伸的反应空间发生氨基酰基-tRNA合成酶(分子量小于100kDa)对tRNA的载荷量。这可以用来优化部分反应的条件。
多孔基体的材料也使得具体修饰表面或腔。酶学功能例如修饰的酶(限制蛋白酶)或能量再生酶系统可以以特别颗粒上固定的特定比例导入体系中。腔的化学修饰使得具体吸附抑制物质。
基体反应器的构造设计使得简单地由试验规模变为生产规模。在最简单情况下,商售色谱柱可以用作反应器,该柱大小在10毫升和1000升之间。一旦被优化,该方法以简单快速和成本有利方式被转化为更大规模。这大大降低了反应器和生产工厂设计,组建和评价的成本。反应器材料可以不同,从不锈钢(Edelstahl)至塑料或玻璃。但是,也可以使用其它材料。
根据本发明的反应器与先前可获得的反应器不同之处在于
-供应区室VM和反应区室V0之间的非常大的交换面积并且两个区室之间基本上没有底物扩散,
-供应区室VM和反应区室V0之间的非常短的传播途经,其保证对反应有效供应并且消除梯度形成问题。不需要搅拌或混合。
-简单构造并且成本上有利的生产。
-对小规模优化的条件向更大规模的简单的可转移性。
第一次有可能开发体外蛋白质合成的特别潜力,例如大规模并且以经济方式制备毒性蛋白质或者将非天然氨基酸插入蛋白质中。
下面描述根据本发明的反应器的可能实施方案(参见图1)。
1)基体柱反应器
-反应器由完全装满基体(总体积=VR)的室/柱组成。
-供应区室相应于基体体积(VM)。
-反应区室相应于基体的排斥体积V0。
-基体的排阻限是0.5-300kDa,优选2-300kDa范围。
-反应器具有溶液入口(上)和出口(下)。
-溶液供应导致液体柱向出口平稳流动。
-反应器可以是恒温的。
因此其中基体是凝胶基体的基体反应器是特别优选的。特别地,其中反应器空间具有圆柱形的基体反应器是优选的。因此优选的实施方案是其中反应器是可以是恒温的装有凝胶基体的色谱柱的反应器。特别地,优选的是基体具有2-300kDa范围的排阻限。
根据本发明的反应器原理也可以有利地与确定的反应器类型(间歇式,CECF,CFCF)相组合。这能够导致由于提高的生产率而提高的产率。因为要求较小量的原材料来达到最佳浓度(例如DNA模板,T7聚合酶,tRNAs),本发明原理也是成本降低的原因。
2)基体间歇式反应器
·反应器由可密封反应器组成。
·反应器具有足够的容积来容纳反应溶液和可变量的凝胶基体。
·反应器可以是恒温的(例如在水浴中)。
3)含有基体的CECF反应器
·所述反应器是CECF反应器,包括至少两个室,它们通过一个或几个半渗透膜连接。
·反应器包括至少一个反应室和至少一个供应室。
·反应室部分或全部装有凝胶基体。
·反应器可以是恒温的(例如保温箱)。
·反应器可以任选地搅拌或振动。
4)含有基体的CFCF反应器
·CFCF反应器包括至少一个带有出口开口和至少一个多孔表面的室。
·这个室是反应室并且部分或全部装有基体。
·供应溶液可以通过开口泵压到反应室中。消耗过的供应溶液通过超滤膜被压出反应室。
·反应器可以是恒温的(例如保温箱)。
·反应溶液可以任选地通过搅拌,振动,或者泵循环而搅动。
本发明的另一个主题是在本发明反应器中制备产物的方法,其中起始物是低分子和高分子原料,其中
·反应混合物的低分子成分和特别是反应消耗的底物大部分在整个反应器空间VR中均匀分布,
·反应器空间中只有基体的排斥体积V0对于高分子成分特别是对催化活性反应物是有效的并且
·底物只有在基体的排斥体积V0中才可以被转化(反应)。
根据本发明的方法优选是其中通过一种或几种酶将一种或几种底物转化为一种或几种产物的酶促方法。所述反应器可以特别地在制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应方法中使用。
高分子成分是核糖体,tRNAs,DNA模板,RNA聚合酶,mRNA和中间代谢的酶(例如氨基酰基tRNA合成酶,转甲酰酶,焦磷酸酶,核苷酸激酶)和能量再生体系(例如乙酸激酶,丙酮酸激酶,肌酸激酶,糖酵解酶,柠檬酸循环酶)和调节蛋白(例如起始因子,延长因子,终止因子)和支持蛋白质折叠和进行蛋白质修饰的因子。
低分子成分包括底物(20种天然存在的氨基酸,ATP,GTP,CTP,UTP,第二能量底物例如乙酰磷酸)和效应物(缓冲物质,盐,还原化合物,叶酸,抑制剂,稳定剂)。本发明定义低分子化合物比基体的排阻限小。相应地,高分子化合物比排阻限大。柱方法是特别优选的,其特征在于
·凝胶基体被掺入到反应器空间中。
·用供应溶液平衡凝胶基体并且在反应温度下保温(其中在掺入之前或之后发生凝胶基体的平衡),
·将反应溶液施加给柱子,
·在柱中将反应溶液搅拌经过所述反应时间(静态过程)或者缓慢泵压通过柱子(动态过程)和
·反应完全之后从柱子上洗脱下含有产物的反应溶液。
本发明方法还包括对间歇式方法和连续供料方法的改进。
间歇式方法:向一批反应混合物加入供应溶液平衡过的凝胶基体,使得由于提高的底物利用率而延长反应时间。作为第一近似值,加入凝胶基体导致高分子反应物体积没有增加,因此反应不受稀释作用的损害。总之加入基体导致相对溶胞产物来说提高的生产率。
CECF和CFCF方法:反应空间中凝胶基体的存在总体上导致高分子反应物较小的稀释作用,这相对溶胞产物来说提高了生产率。在这种情况下
·供应溶液平衡过的凝胶基体被掺入CECF或CFCF反应器的反应室中,
·含有高分子反应物的反应溶液被填流至反应室中,开始体外转录/翻译反应制备蛋白质,
·在CECF方法情况下,供应室装有供应溶液,
·在CFCF方法情况下,供应溶液被连续泵入反应室,
·在确定的温度下将反应混合物搅拌或振动经过所述反应时间和
·在反应终止时从反应室取出含有产物的反应溶液。
本发明还包括用于进行蛋白质制备的体外转录/翻译偶联反应的配方。这些配方特别适合在本发明基体反应器中制备蛋白质。制备蛋白质的转录/翻译偶联反应中需要的所有的成分分为两种溶液,即供应溶液和反应溶液。供应溶液只含有低分子成分例如缓冲剂,盐,底物和效应物。合适的缓冲剂和盐是例如Hepes或Tris,钾离子,镁离子和铵离子。要求的底物是20种天然存在的氨基酸,四种核糖核酸ATP,GTP,CTP,UTP或者合适的代谢母体例如AMP,GMP,CMP,UMP和第二能量底物例如磷酸烯醇丙酮酸,磷酸肌酸或乙酰磷酸或者这样的底物的合适的代谢母体。效应物是对反应有正影响或者抑制副作用的物质。这些包括一种或几种还原化合物,特别是含有巯基的化合物例如二硫苏糖醇,二硫赤藓糖醇,谷胱甘肽,巯基乙磺酸,和另外的蛋白质-稳定化合物例如甘油,糖,二乙二醇,聚乙二醇,洗涤剂,辅助因子及激活剂例如辅酶和中间代谢的共底物例如叶酸。NAD/NADH,NADP/NADPH或者其母体,还有抑制不期望的副反应的抑制剂例如利福平,RNA酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,叠氮化合物。
反应溶液含有需要的高分子成分并且也可以含有供应溶液的一些或全部低分子成分。反应溶液的基础和含多高分子成分的来源是细胞溶胞产物。可以从原核(例如大肠埃希氏杆菌)或从真核细胞(例如酵母,网状细胞,小麦胚芽)获得这种溶胞产物。通常通过细胞溶胞和颗粒级分的分离(例如通过离心)获得这样的溶胞产物。本领域技术人员从文献中对这些方法是公知的。用这种方法获得的溶胞产物可以直接加给反应溶液或者可以首先加工和/或分级分离(例如通过透析,沉淀,差速离心,色谱方法,浓缩步骤)并且以几种合适的级分的形式加入。
用于制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应十分复杂并且需要大量细胞成分。现在不可能假设所有这些成分的全部是已知的或者它们的功能已经被完全了解。
溶胞产物带来的高分子成分是核糖体,转移RNA,调节蛋白和酶。调节蛋白特别是翻译的起始因子,延长因子,终止因子。酶成分例如是氨基酰基tRNA合成酶,用于能量供给和转化的酶体系(例如乙酸激酶,丙酮酸激酶,肌酸激酶,二磷酸核苷激酶,一磷酸核苷激酶,糖酵解酶和柠檬酸循环酶)和中间代谢的酶例如焦磷酸酶,转甲酰酶,转氨酶。此外,可以假设溶胞产物的其它成分对于有效转录和翻译是必需的。
其它高分子物质作为独立成分加给反应溶液。这些包括转移RNA,DNA-依赖性RNA聚合酶,优选病毒聚合酶例如T7-RNA聚合酶,T3-RNA聚合酶,SP6 RNA聚合酶,另外再生能量成分的其它酶和溶胞产物中不含有的或数量不够的中间代谢的酶(例如肌酸激酶,丙酮酸激酶,焦磷酸酶),另外的高分子抑制剂(例如RNasin),另外的蛋白质有效而正确折叠所必需的酶体系(例如陪伴分子,蛋白质二硫化物异构酶,肽基脯氨酰-顺-反异构酶),另外的蛋白质转录后修饰所必需的酶,稳定蛋白质或者将它们保持在溶液中的另外的大分子成分。
向反应溶液加入环形(例如质粒)或线性核酸(例如PCR产物)作为要转录和翻译的蛋白质的模板。蛋白质密码(例如cDNA序列)和系统正确转录和翻译所需要的另外的调节序列位于该模板上。这些包括例如启动子序列,核糖体结合位点,起始密码子,终止密码子,聚合酶终止序列和翻译增强子。另外,模板也可以含有克隆,扩增或mRNA稳定作用所需要的区。
在优选的实施方案中,供应溶液有下面的组成:150-300mM乙酸钾,4-20mM乙酸镁,1-10%甘油,0.5-2.5mM ATP,0.5-2.5mMCTP,0.5-2.5mM GTP,0.5-2.5mM UTP,0.1-2mM的各种氨基酸(所有的20种天然存在的氨基酸),10.8微克/毫升叶酸,0.5-5mM EDTA,100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃,1微克/毫升利福平,0.03%叠氮化钠,10-100mM乙酰磷酸,1-10mM二硫苏糖醇,1-10mM巯基乙磺酸,70mM KOH。
在优选的实施方案中,反应溶液有下面的组成:150-300mM乙酸钾,4-20mM乙酸镁,1-10%甘油,0.5-2.5mM ATP,0.5-2.5mMCTP,0.5-2.5mM GTP,0.5-2.5mM UTP,0.1-2mM的各种氨基酸(所有的20种天然存在的氨基酸),10.8微克/毫升叶酸,0.5-5mM EDTA,100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃,1微克/毫升利福平,0.03%叠氮化钠,10-100mM乙酰磷酸,480微克/毫升来自大肠埃希氏杆菌MRE600的tRNA,1-10mM二硫苏糖醇,1-10mM巯基乙磺酸,70mM KOH,0.1U/微升RNA酶抑制剂,1-20微克/毫升模板,100-500微克/毫升大肠埃希氏杆菌A19溶胞产物,1-10U/微升T7-RNA聚合酶。
本发明因此还涉及本发明反应器用于酶促反应特别是制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应的用途。
根据本发明的反应器用于独立进行的反应例如只是产生蛋白质的翻译反应或者只是体外转录反应也是可能的。
附图说明
图1:
基体柱反应器的可能实施方案和VR(反应器体积),VM(基体体积)和V0(排斥体积)的说明。
附图2:
加和不加平衡过的基体的间歇式反应中GFP的合成(实施例1)。
附图3:
CECF反应器和反应室中含有基体的CECF反应器中GFP的合成。使用相同的试剂进行这两个反应(实施例2)。
附图4:
CECF反应器中和相当大小的柱反应器中GFP的合成。使用相同的试剂进行这两个反应(实施例3)。
附图5:
CECF反应器中和柱反应器(静态方法)中GFP的合成。柱反应器中装有1毫升和3毫升反应溶液。使用相同的试剂进行所有的反应(实施例4)。
附图6:
200毫升柱反应器中GFP的合成(动态方法)。施加20毫升反应溶液。使用相同的试剂作为对照进行0.1毫升间歇式反应和1毫升CECF反应(实施例5)。
附图7:
GFP表达载体pIVEX2.1-GFP的质粒图和序列(SEQ.ID.NO:1)。
附图8:
CAT表达载体pIVEX1.1-CAT的质粒图和序列(SEQ.ID.NO:2)。
实施例
通过下面的实施例进一步说明本发明。列出的反应成份,反应器和GFP测定和CAT测定适用于所有的列出的实施例。
使用绿色荧光蛋白质(GFP)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)的无细胞蛋白质合成作为例子来测试根据本发明的反应器和本发明方法。作为转录/翻译偶联反应进行无细胞蛋白质合成。在处于T7噬菌体启动子控制下的表达质粒上编码GFP-cDNA和CAT-cDNA。相应地利用DNA-依赖性T7-RNA聚合酶发生生成mRNA的转录作用。体外以这种方式转录的mRNA借助于偶联体系中存在的大肠埃希氏杆菌溶胞产物而翻译成蛋白质。
A)反应成份
1.
质粒:pIVEX2.1-GFP含有来自Aequoria victori的突变体GFPcycle3(27kDa)形式的绿色荧光蛋白质的序列(自然生物技术(Nature Biotechnology)(1996)
14,314-319);GFPcycle3突变体的编码区克隆到pTU58中而不是野生型GFP序列(科学(Science)(1994)
263,802),参见图7/SEQ ID NO:1。pIVEX1.1-CAT含有来自大肠埃希氏杆菌的氯霉素乙酰转移酶的基因(参见图8/SEQ IDNO:2)。
2.
大肠埃希氏杆菌S30溶胞产物:根据Zubay(Annu.Rev.Genet.(1973)
7,267)的修饰的方法使用大肠埃希氏杆菌A19菌株制备溶胞产物。修饰的溶胞产物缓冲液:100mMHEPES-KOH pH7.6/30℃,14mM乙酸镁,60mM乙酸钾,0.5mM二硫苏糖醇。各种实验的产率差别是由于不同的溶胞产物制剂。
3.
反应溶液:185mM乙酸钾,15mM乙酸镁,4%甘油,2.06mM ATP,1.02mM CTP,1.64mM GTP,1.02mM UTP,257μM的各种氨基酸(所有的20种天然存在的氨基酸),10.8微克/毫升叶酸,1.03mM EDTA,100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃,1微克/毫升利福平,0.03%叠氮化钠,40mM乙酰磷酸,480微克/毫升来自大肠埃希氏杆菌MRE600的tRNA,2mM二硫苏糖醇,10mM巯基乙磺酸,70mM KOH,0.1U/微升RNA酶抑制剂,15微克/毫升质粒,220微升/毫升大肠埃希氏杆菌A19溶胞产物,2U/微升T7-RNA聚合酶。
4.
供应溶液:185mM乙酸钾,15mM乙酸镁,4%甘油,2.06mM ATP,1.02mM CTP,1.64mM GTP,1.02mM UTP,257μM的各种氨基酸(所有的20种天然存在的氨基酸),10.8微克/毫升叶酸,1.03mM EDTA,100mM HEPES-KOH pH7.5/30℃,1微克/毫升利福平,0.03%叠氮化钠,40mM乙酰磷酸,2mM二硫苏糖醇,10mM巯基乙磺酸,70mM KOH。
5.
平衡过的基体:根据供应商的说明以溶胀状态洗涤象细Sephadex G25这样的凝胶基体。用对色谱柱的常规方法装填空柱子。装填过的色谱柱用1-2柱体积的供应溶液平衡。对于间歇式反应和CECF反应,通过将凝胶基体几次悬浮于供应溶液并且稍微减压抽吸干而将凝胶基体平衡。将该方法处理过的基体加给批混合物或者掺入CECF反应器中。
B)反应器
对于间歇式反应使用塑料制成的可密封的反应器。使用的CECF反应器包括两个室,具有1毫升容积的反应室和具有大约10毫升容积的供应室。室之间由10kDa透析膜彼此分开并且各自可以通过可闭合的开口装载。各室含有磁子搅拌棒。使用备好待用的PD10柱(Pharmacia)或者可以恒温的并且装有凝胶基体的商业上可获得的色谱柱(Pharmacia)作为基体柱反应器。所有的反应器类型在30℃下操作。振荡间歇式反应混合物,搅拌CECF反应,加载基体柱反应器并且使用泵洗脱。
C)GFP测定
为了生成荧光团,GFP要求存在足量的氧。溶解于反应溶液中的氧的量少并且不足以使转化完全。因此,在测量之前将所有样品在4℃下“熟化”12-32小时。使用来自Kontron公司的Tegimenta SFM-25型光谱荧光计测定样品。在395nm波长下测定激发作用,在510nm波长下测定发射作用。
使用来自Roche Diagnostics的编辑号是No.1814524的重组GFP作为标准物。使用浓度是1微克/毫升和2微克/毫升的标准溶液进行校正。
为了测定,根据浓度,使用100mM HEPES-KOH pH7.6/30℃,14mM乙酸镁,60mM乙酸钾,0.5mM二硫苏糖醇将样品稀释到1∶50至1∶400。
D)CAT测定
根据厂商说明使用CAT FAST绿色荧光底物(分子探针)用酶学方法进行CAT(氯霉素乙酰转移酶)测定。
E.方法
实施例1
基体间歇式反应器对间歇式反应器
间歇式反应混合物的组成如上所述(与反应溶液相同)。为了起始反应,最后向混合物加入模板质粒。向可密封反应器加入1毫升等份的反应溶液。向反应混合物之一加入2克平衡过的凝胶基体(SephadexG25,研细)。将混合物密封并且在振动下在30℃下温育4小时。通过标准方法测定GFP的产率(参见上文)。
*因为足量供应氧,所以不要求熟化过程
反应混合物 | GFP产率* |
1毫升间歇式反应混合物 | 72.3微克 |
1毫升间歇式反应混合物+2克平衡过的基体 | 116.7微克 |
结果:与标准间歇式反应相比,加入凝胶基体将荧光活性GFP的产率提高61%。
实施例2
含有基体的CECF反应器对CECF反应器
将0.5毫升平衡过的凝胶基体(Sephadex G-10)掺入到CECF反应器的反应室(1毫升反应室,10毫升供应室)。将具有改变组成的0.5毫升反应溶液装入反应室。反应溶液的高分子成份是双倍浓度(960微克/毫升来自大肠埃希氏杆菌MRE600的tRNA,0.2U/微升RNA酶抑制剂,30微克/毫升质粒,440微升/毫升大肠埃希氏杆菌A19溶胞产物,4U/微升T7-RNA聚合酶),并且低分子成份的浓度是单一浓度(即和供应溶液中的一样)。将10毫升供应溶液装入供应室。标准条件下在CECF反应器中进行对比反应。即将1毫升含有15微克GFP质粒的反应溶液装入反应室并且将大约10毫升供应溶液装入供应室。两个反应器在搅拌下(150rpm)在30℃下温育20小时。各反应期终止时,取出反应室内含物,并且通过标准方法测定合成的GFP的产率(参见上文)。
反应混合物 | GFP产率* |
1毫升CECF反应混合物 | 208微克 |
含有基体的1毫升CECF反应混合物 | 325微克 |
*4℃下熟化36小时。
结果:基体掺入CECF反应器反应室中将荧光活性GFP的制备提高56%。
实施例3:
基体柱反应器(1/10规格)对CECF反应器的比较
标准条件下进行CECF反应,即将1毫升含有15微克GFP质粒的反应溶液装入反应室并且将大约10毫升供应溶液装入供应室。反应器在搅拌下(150rpm)在30℃下温育20小时。使用装有Sephadex G25(Pharmacia)的商售PD-10柱作为基体柱反应器。以生产商提供的信息为基础估计反应器参数如下:VR=8.3毫升,VO=2.5毫升,VM=5.6毫升。该柱子用10毫升供应溶液平衡。加入1毫升反应溶液(15微克GFP质粒/毫升)之后,封闭柱子并且30℃下温育6小时。各反应期终止时,从CECF反应器取出反应溶液,或者从PD-10柱洗脱出反应溶液。并且通过标准方法测定合成的GFP的产率(参见上文)。
结果:
反应混合物 | GFP产率* |
1毫升CECF反应混合物 | 477微克 |
PD-10柱上1毫升CECF反应混合物 | 362微克 |
*4℃下GFP熟化20小时。
PD-10柱上进行的反应得到362微克荧光活性GFP。与相同规格(1毫升)的CECF反应相比,这得到76%的产率。
实施例4:
基体柱反应器(3/10规格,静态方法)
10毫升研细的Sephadex G25装入两个色谱柱中并且接着各自用1柱体积的供应溶液平衡。以生产商提供的信息为基础估计反应器参数:VR=10毫升,VO=3毫升,VM=7毫升。将1毫升反应溶液施加给柱子1并且将3毫升反应溶液施加给柱子2。接着封闭柱子并且30℃下温育20小时。进行1毫升间歇式反应和1毫升CECF反应器中的反应作为对照(也是30℃下20小时)。反应期完成后洗脱柱子。并且通过标准方法测定各自合成的GFP的产率(参见上文)。
反应混合物 | 反应规格 | 以微克/毫升使用的反应溶液表示的GFP产率 | 总GFP产量(微克) |
间歇式反应 | 1毫升 | 15.3微克/毫升 | 15.3微克 |
CECF反应器 | 1毫升 | 168.6微克/毫升 | 168.6微克 |
基体柱反应器1 | 1毫升 | 204.3微克/毫升 | 204.3微克 |
基体柱反应器2 | 3毫升 | 151.3微克/毫升 | 453.9微克 |
*4℃下熟化20小时。
结果:相对于使用的反应溶液的量来说,两个柱反应器进行的反应产率与CECF反应器的产率是可比较的。在加载了三倍反应溶液量的柱子2的情况下,可能将总产率提高2.2倍。
实施例5:
基体柱反应器(20/200规格,动态方法)中GFP的合成
研细的Sephadex G25装入夹套色谱柱(Pharmacia)中并且接着用1柱体积的供应溶液平衡。以生产商提供的信息为基础估计反应器参数如下:VR=200毫升,VO=60毫升,VM=140毫升。利用水浴使柱子保持恒温30℃。将用151微克/毫升GFP质粒起始的20毫升反应溶液泵压到柱子上(120毫升/小时)。接着以12毫升/小时的速度将反应溶液泵压通过基体。将洗脱液在4℃下分级分离。使用相同的反应混合物进行CECF反应(1毫升规格)和间歇式反应(0.1毫升规格)作为对照。通过标准方法测定级分和对照混合物中合成的GFP的产率(参见上文)。
反应混合物 | 反应规格 | 以毫克/毫升使用的反应溶液表示的GFP产率 | 总GFP产量(微克) |
基体柱反应器 | 20毫升 | 0.76毫克/毫升 | 15.2毫克 |
CECF反应器 | 1毫升 | 0.58毫克/毫升 | 0.58毫克 |
间歇式反应 | 0.1毫升 | 0.13毫克/毫升 | 0.013毫克 |
结果:在20毫升大小基体柱反应器中10小时之内产生15.2毫克荧光活性GFP。因此产率是0.76毫克/毫升初始反应溶液。0.58毫克/毫升CECF反应器中的产率在这种反应器类型中在通常获得的范围内。因此基体柱反应器具有与CECF反应器可比较的产率(131%)。该项实验还证明与1毫升CECF混合物相比规格可以提高20-倍而产率没有明显损失。
实施例6:
基体柱反应器(12.5/125规格,动态方法)中CAT合成
研细的Sephadex G25装入夹套色谱柱(Pharmacia)中并且接着用1柱体积的供应溶液平衡(30毫升/小时)。以生产商提供的信息为基础估计反应器参数如下:VR=125毫升,VM=87.5毫升,VO=37.5毫升。利用水浴使柱子保持恒温30℃。将用15微克/毫升pIVEX1.1-CAT的质粒起始的12.5毫升反应溶液泵压到柱子上(18毫升/小时)。接着以3.6毫升/小时的速度将反应溶液泵压通过反应器。将洗脱液在4℃下分级分离。利用酶促荧光测试测定功能-活性CAT的产率。
反应混合物 | 反应规格 | 以毫克/毫升使用的反应溶液表示的CAT产率 | 总CAT产量 |
基体柱反应器 | 12.5毫升 | 0.53毫克/毫升 | 6.6毫克 |
结果:基体柱反应器中12.5毫升反应混合物中产生6.6毫克CAT酶。
实施例7:
基体间歇式反应器中CAT合成
用15微克/毫升pIVEX1.1-CAT开始两个50微升间歇式反应。反应首先在30℃下温育。30分钟之后向一批加入100毫克平衡过的基体(Sephadex G25,研细的)。6小时之后利用荧光测试测定功能-活性CAT酶的产率。
结果:通过加入平衡过的基体将产率提高74%。实施例8:
反应混合物 | 反应规格 | 以毫克/毫升使用的反应溶液表示的CAT产率 | 总CAT产量 |
间歇式反应 | 50微升 | 83微克/毫升 | 4.2微克 |
基体间歇式反应器 | 50微升+100毫克基体 | 154微克/毫升 | 7.7微克 |
基体间歇式反应器中基体量的变化
用15微克/毫升pIVEX2.1-GFP开始50微升间歇式反应。反应在30℃下温育。30分钟之后向混合物加入不同量(0毫克,50毫克,100毫克和150毫克)的平衡过的基体(Sephadex G25,研细的)。5小时反应时间之后将混合物在4℃下保持以使产生的GFP熟化。
反应混合物 | 反应规格 | 以毫克/毫升使用的反应溶液表示的GFP产率 | 总GFP产量* |
间歇式反应 | 50微升 | 64微克/毫升 | 3.2微克 |
基体间歇式反应器 | 50微升+50毫克基体 | 111微克/毫升 | 5.6微克 |
基体间歇式反应器 | 50微升+100毫克基体 | 156微克/毫升 | 7.8微克 |
基体间歇式反应器 | 50微升+150毫克基体 | 160微克/毫升 | 8微克 |
*4℃下GFP熟化1小时。
结果:通过加入平衡过的基体将产率提高至多250%。实施例9:
基体柱反应器(1/10规格,动态方法)中不同凝胶材料的比较
根据生产商说明将各种凝胶材料(Sephadex,Bio-Gel)溶胀,装入10毫升柱子中并且用15毫升供应溶液平衡。对各个柱子施加1毫升反应溶液(15微克/毫升pIVEX2.1-GFP)。然后直接用200微升供应溶液洗涤反应溶液。以2小时间隔加入1毫升等份的供应溶液(保温箱,30℃)。收集洗脱出的级分并且在4℃下贮存。通过标准方法测定各自合成的GFP的产率(参见上文)。
凝胶材料 | 反应规格 | 以微克/毫升使用的反应溶液表示的GFP产率 | 总GFP产量* |
Sephadex G25,中等 | 1毫升 | 126微克/毫升 | 126微克 |
Sephadex G50,研细的 | 1毫升 | 121微克/毫升 | 121微克 |
Sephadex G75,研细的 | 1毫升 | 30微克/毫升 | 30微克 |
Bio-Gel P6,中等 | 1毫升 | 180微克/毫升 | 180微克 |
Bio-Gel P10,中等 | 1毫升 | 251微克/毫升 | 251微克 |
Bio-Gel P30,中等 | 1毫升 | 201微克/毫升 | 201微克 |
*4℃下GFP熟化20小时。
结果:基体反应器中可以使用就聚合物类型,粒度和排阻分子量来说不同的各种凝胶材料。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>基体反应器和在该反应器中制备产物的方法<130>5307/00/<140><141><150>10011209.9<151>2000-03-08<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4342<212>DNA<213>Aequoria victori<400>1aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca 60cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc 120gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg 180tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat ctcgatcccg cgaaattaat 240acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 300agaaggagat ataccatgac tagcaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt 360cttgttgaat tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa 420ggtgatgcta catacggaaa gcttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct 480gttccatggc caacacttgt cactactttc tcttatggtg ttcaatgctt ttcccgttat 540ccggatcata tgaaacggca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag 600gaacgcacta tatctttcaa agatgacggg aactacaaga cgcgtgctga agtcaagttt 660gaaggtgata cccttgttaa tcgtatcgag ttaaaaggta ttgattttaa 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Claims (26)
1.用于其中涉及低分子和高分子反应物的反应的反应器,反应器空间VR含有能在含水溶液中溶胀并且由多孔材料组成的基体,所述多孔材料
-能吸收低分子反应物并且
-排斥高分子反应物,并且
其中所述反应器装有至少20体积%的基体。
2.权利要求1要求的反应器,其中由于反应器空间的基体结构,在一个反应器空间中存在反应区室和供应区室。
3.权利要求1或2要求的反应器,其中在基体的排斥体积V0中发生反应。
4.权利要求1-3之一要求的反应器,其中基体体积VM作为低分子反应成分和特别是底物的供应区室。
5.权利要求1-4之一要求的反应器,其中反应区室和供应区室不被膜隔开。
6.权利要求1-5之一要求的反应器,其中反应区室和供应区室不被膜隔开,但是另外有一个与反应器空间直接连接或者通过半渗透膜连接的供应容器。
7.权利要求1-6之一要求的反应器,其中所述基体是凝胶基体。
8.权利要求1-7之一要求的反应器,其中所述反应器空间具有圆柱形形状。
9.权利要求1-8之一要求的反应器,其中所述反应器是装有凝胶基体的柱子。
10.权利要求1-9之一要求的反应器,其中所述基体具有0.5-300kDa范围内的排阻限。
11.权利要求1-10之一要求的反应器,其中所述基体由非交联的或者交联的有机聚合物或共聚物和/或无机材料组成。
12.在权利要求1-11之一要求的反应器中制备产物的方法,其中起始物是低分子和高分子原料,其特征在于
-反应混合物的低分子成分和特别是反应消耗的底物大部分在整个反应器空间VR中均匀分布,
-反应器空间中只有基体的排斥体积V0对于高分子成分特别是对催化活性反应物是有效的并且
-底物只有在基体的排斥体积V0中才可以被转化。
13.权利要求12要求的方法,其特征在于它是酶促方法。
14.用于制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应的权利要求12或13之一要求的方法,其中所述高分子成份包括核糖体,tRNAs,DNA模板,RNA聚合酶,mRNA和酶和来自溶胞产物的调节蛋白,而低分子成份包括底物和效应物,缓冲物质和盐。
15.权利要求12-14之一要求的方法,其特征在于
-凝胶基体被掺入到反应器空间中,
-用供应溶液平衡凝胶基体,
-反应器空间中的平衡过的凝胶基体接触反应溶液并且
-反应器保持在恒温下。
16.权利要求15要求的方法,其特征在于
-在装有基体的室或柱中进行该方法,
-将反应溶液施加给柱子和
-反应期间反应溶液在柱子上停留。
17.权利要求15要求的方法,其特征在于
-在装有基体的室或柱中进行该方法,
-将反应溶液施加给柱子和
-反应溶液连续泵压或一步一步通过柱子,反应期间持续如此。
18.权利要求15要求的方法,其特征在于
-在间歇式反应器中进行该方法和
-反应溶液和平衡过的凝胶基体在反应器空间中汇合在一起,其中,加入的基体体积至少是反应溶液体积的20体积%。
19.权利要求15要求的方法,其特征在于
-在CECF反应器中进行该方法,
-将凝胶基体加入到CECF反应器的反应区室中和
-基体体积大于反应区室容积的20体积%。
20.权利要求15要求的方法,其中
-在CFCF反应器中进行该方法,
-将凝胶基体加入到CFCF反应器的反应区室中和
-基体体积大于反应区室容积的20体积%。
21.权利要求1-11之一要求的反应器用于酶促反应的用途。
22.权利要求1-11之一要求的反应器用于制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应的用途。
23.权利要求12-20之一要求的方法用于酶促反应的用途。
24.权利要求11-20之一要求的方法用于制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应的用途。
25.在权利要求12-20之一要求的方法中进行制备蛋白质的体外转录/翻译偶联反应的配方。
26.权利要求25要求的包括供应溶液和反应溶液的配方。
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