JPH09509249A

JPH09509249A - リガンドからの結合タンパク質の除去法

Info

Publication number: JPH09509249A
Application number: JP7517560A
Authority: JP
Inventors: モハン，サブブラマン; ベーリンク，デイヴィッド・ジェイ
Original assignee: モハン，サブブラマン; ベーリンク，デイヴィッド・ジェイ
Priority date: 1993-12-20
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 1997-09-16
Also published as: DE69428454D1; EP0733205B1; WO1995017671A1; EP0733205A1; US5851907A; DE69428454T2; EP0733205A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、結合タンパクからリガンドを分離する方法を提供する。該方法としては、酸性分離およびサイズ分離がある。本発明の方法は、インスリン様成長因子結合タンパク質からインスリン様成長因子を分離するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】リガンドからの結合タンパク質の除去法発明の背景本発明は、概して、結合タンパク質をリガンドから分離する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、酸性抽出およびサイズ分離を含む分離法を提供する。本発明の方法は、種々のタンパク質の分離、特に、インスリン様成長因子をインスリン様成長因子結合タンパク質から分離するのに有用である。結合タンパク質のリガントからの分離は、種々の臨床診断設定において重要である。例えば、インスリン様成長因子（insulin-like growth factor：ＩＧＦ）のインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）からの解離は、有効なＩＧＦ放射性リガンド検定の実施に不可欠である。ＩＧＦＢＰはまた、検定される試料から除去される必要がある。さもなければ、試料中のＩＧＦＢＰの存在は、放射性リガンド検定において有意の人工産物を生じることがある。ソマトメジンとして従来知られるＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩは、インスリンと構造的に関連があり、そしてヒト血漿中で循環する２種類の最も豊富なポリペプチド成長因子である（ドーハデイ（Ｄａｕｇｈａｄａｙ）ら、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．，１０：６８〜９１，１９８９年）。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ −ＩＩは、脳、甲状腺、肝臓、筋肉、腎臓、血液および骨に由来する細胞を含む多数の細胞種の細胞増殖の調節に関与している。これらの細胞種の多くは、培養中にＩＧＦを生産し、ＩＧＦに対する高親和性受容体を有し、そして外部から加えられたＩＧＦに対して生物学的応答を示すことが分かっている。したがって、ＩＧＦが細胞増殖の局所調節において有意の役割を果たしていることは明らかである。一つの細胞種によって生産されたＩＧＦは、オートクリン様式で同一細胞種に対してまたはパラクリン様式で隣接細胞種に対して作用することができる。ＩＧＦは、血漿中においてＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）と称される特定のタンパク質に対して結合した大分子量タンパク質として循環している。６種類の異なるＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６まで示された）が、様々なヒト組織から精製され且つクローン化されている（シマサキ（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ）およびリング（Ｌｉｎｇ）、ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，３：２４１〜２６６（１９９１））。ＩＧＦＢＰはいくつかの重要な機能を有し、例えば、（１）遊離ＩＧＦの急性代謝作用、具体的には低血糖の予防、（２）循環中のＩＧＦの半減期を増加させること、（３）局所部分におけるＩＧＦの生物学的利用能の調節、および（４）ＩＧＦの局所作用に対する組織特異性の供給がある。血清およびならし培地（conditioned medium）などの他の生物学的流体中におけるこれらのＩＧＦＢＰの存在は、ＩＧＦの測定のための特異的放射性リガンド検定（ラジオイムノアッセイおよびラジオレセプターアッセイ）の適用を難しくする。試料中の天然に存在するＩＧＦＢＰは、トレーサー結合に対して抗体または受容体と競合することがあり、例えば、捕捉抗体または受容体との結合に利用可能なトレーサーの量を減少させる。この競合的結合は、抗体または受容体に結合した放射性シグナルの減少を引き起こす。トレーサー結合の減少は、概して、試料中の免疫反応性ＩＧＦの不当に高い量として理解される。ＩＧＦＢＰ人工産物が除去されない方法を用いて行われるＩＧＦ測定は、ＩＧＦＢＰおよびトレーサー分子の相互作用のために、誤った結果を生じることがある。例えば、フォルスコリンおよびジブチリルサイクリックＡＭＰ処理は、ならし培地中においてＴＥ８５ヒト骨肉腫細胞のＩＧＦ−１様およびＩＧＦ−ＩＩ様活性を増加させる。観察された放射性リガンド活性の明らかな増加は、ＩＧＦＢＰ−４の増加した生産のためであり、ＩＧＦのためではなかった（モハン（Ｍｏｈａｎ）およびベーリンク（Ｂａｙｌｉｎｋ）、ＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ１：１１０〜１１８（１９９１））。したがって、ＩＧＦの有効な測定のためには、ＩＧＦＢＰからのＩＧＦの解離および試料からのＩＧＦＢＰの排除を、放射性リガンド検定でのＩＧＦの測定の前に行う必要がある。ＩＧＦの測定は、いくつかの成長関連障害、腫瘍誘導低血糖および栄養状態を含む多数の臨床的障害を評価する場合に有用であるので、ＩＧＦＢＰに関係した妨害を排除する抽出法が不可欠である。ＩＧＦの生理学的役割の解明へのますます高まる関心および臨床診断のためのＩＧＦ放射性リガンド検定の広範囲の使用は、生物学的流体中のＩＧＦの測定に対する特性決定または有効性の立証が不完全な若干の検定の適用をもたらした。ヒト血清試料中のＩＧＦＢＰを排除するために、酸性ゲル濾過、酸エタノール抽出およびＣ−１８セプ・パク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）分離を含む多数の方策が用いられてきた（ザプフ（Ｚａｐｆ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６８：１３２１（１９８１）；ドーハデイら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ．，５１：７８１（１９８０）；ドーハデイ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４６：２１８（１９８７））。これらの方法の内、酸エタノール抽出は、その簡単さゆえに最も広く用いられてきた。ＩＧＦ放射性リガンド検定において重大な人工産物を生じる生物学的流体中の多数のＩＧＦＢＰの存在のためにおよびＩＧＦＢＰおよびＩＧＦは互いに独立して調節されうるので、有効な結果のためにはＩＧＦＢＰ全部を順に除去することが不可欠である。酸エタノール抽出およびセプ・パク分離は、生物試料中のＩＧＦＢＰ人工産物を除去するために文献中で広く用いられてきたが、これら二つの方法は、ＩＧＦＢＰ人工産物が不完全に除去されることか多いので信頼できない。難点に妥協しても、酸エタノール抽出されたおよびセプ・パク抽出された血清試料中の妨害の相対レベルは実験室間で異なることがある。いくつかの変数が妨害の程度に影響を与え、（１）捕捉抗体およびＩＧＦＢＰのトレーサーに対する相対親和性、（２）検定で用いられる捕捉抗体の濃度および試料中に残留しているＩＧＦＢＰの濃度、並びに（３）抽出された試料中のＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの相対濃度がある。ＩＧＦ放射性リガンド検定において用いられる抗体の量は通常制限されるので、ＩＧＦＢＰは、酸性ゲル濾過およびセプ・パク分離において人工産物を生じることがある重要な変数と考えられるべきである。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５分離などの他の方法は、労力を要し且つ完了に多くの時間を必要とする。概して、これらの方法は酸エタノールセプ・パク抽出よりも信頼できるが、どちらも、臨床実験室で必要とされるように多数の試料を迅速に処理するには適当ではない。様々な他のリガンドは生体中の結合タンパク質と結合している。これらには、例えば、チログロブリンに対して天然に結合している甲状腺ホルモン、血清タンパク質（主としてアルブミン）を結合する多数の薬物、テストステロン、成長ホルモン、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞成長因子、骨形態形成タンパク質等がある。これらのリガンドが結合した結合タンパクからのそれらの分離は、正しい臨床的評価にとって重要である。上記インスリン様成長因子に対して記載のように、これらのリガンドおよび結合タンパクを分離する方法は、実施するのが比較的容易であり且つ信頼できる結果を生じるはずである。当該技術分野において必要とされるものは、検定用にリガンドを確実に分離するように、生物試料中のリガンドおよび結合タンパクを分離する方法である。好ましくは、該方法は、迅速で、比較的費用がかからず、そして容易に再現できるものである。全く驚くべきことに、本発明は、これらのおよび他の関連した要求を十分満たしている。発明の概要本発明は、試料中の結合タンパクからリガンドを分離する新規の方法を提供する。概して、該方法は、試料を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ；カラムを遠心分離して試料画分を溶離し；そして溶離画分を集めることを含む。該方法は、インスリン様成長因子をインスリン様成長因子結合タンパク質から分離するのに特に有用である。該方法は、サイズ排除と酸性分離とを組合わせる。概して、試料は、血液、血漿、血清、尿またはならし培地である。本発明は、更に、試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定する方法を提供する。該方法は、概して、酸性ゲル遠心分離カラムに試料を入れ；カラムを遠心分離して試料画分を溶離し；溶離した画分を集め；試料中のインスリン様成長因子の量を定量し；そしてそこから試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定することを含む。試料中のインスリン様成長因子の量はいくつかの方法によって定量することができ、例えば、免疫検定およびインスリン様成長因子受容体結合検定がある。遊離（非結合）インスリン様成長因子濃度もまた、中性緩衝液によるカラムからの試料画分の溶離によって試料中で決定することができる。インスリン様成長因子の全濃度に対する遊離の比率は、上記方法から計算することができる。図面の簡単な説明図１Ａは、標識および未標識ＩＧＦ−１間の競合的結合のＩＧＦＢＰ妨害を図示する。図１Ｂは、標識および未標識ＩＧＦ−１Ｉ間の競合的結合のＩＧＦＢＰ妨害を図示する。図２Ａは、未処理ヒト血清、並びに酸エタノール抽出、Ｃ１８セプ・パク分離およびセファデックスＧ−７５によって処理された血清中のＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離後のＩＧＦＢＰ溶離プロフィールを図示する。図２Ｂは、未処理ヒト血清、並びに酸エタノール抽出、Ｃ１８セプ・パク分離およびセファデックスＧ−７５によって処理された血清中のＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離後のＩＧＦ−Ｉ溶離プロフィールを図示する。図２Ｃは、未処理ヒト血清、並びに酸エタノール抽出、Ｃ１８セプ・パク分離およびセファデックスＧ−７５によって処理された血清中のＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離後のＩＧＦ−ＩＩ溶離プロフィールを図示する。図３は、酸エタノール抽出、Ｃ１８セプ・パク分離およびセファデックスＧ− ７５酸性ゲル濾過による抽出後に得られたＩＧＦプールのウェスタンリガンドブロット分析を図示する。図４は、本発明の方法を用いて得られた正常ヒト血清の存在下および不存在下の標識ＩＧＦ−Ｉの溶離プロフィールを図示する。図５は、本発明の方法を用いる精製ＩＧＦ−Ｉの溶離プロフィールを図示する。図６Ａは、本発明の方法を用いるＩＧＦＢＰの溶離プロフィールを図示する。図６Ｂは、本発明の方法を用いるＩＧＦ−Ｉの溶離プロフィールを図示する。図６Ｃは、本発明の方法を用いるＩＧＦ−ＩＩの溶離プロフィールを図示する。図７は、本発明の方法の検定間変動を図示する。図８Ａおよび８Ｂは、セファデックスＧ−７５酸性ゲル濾過、ＦＰＬＣゲル濾過と本発明の方法との間のＩＧＦおよびＩＧＦＢＰ分離の相関関係を図示する。図９は、本発明の方法によってＩＧＦＢＰからＩＧＦ分離後に得られた画分のウェスタンリガンドブロット分析を図示する。具体的な実施態様の詳細な説明本発明は、結合タンパクからリガンドを分離する新規の方法を提供する。該方法は、インスリン様成長因子をインスリン様成長因子結合タンパク質から分離するのに特に有用である。該方法は、迅速で再現性のある分離手段を提供し、したがって、臨床試料中のインスリン様成長因子の正確で且つ再現性のある臨床測定を可能にする。概して、本発明は、酸性分離およびサイズ排除の組合わせを包含する。該方法は、様々なリガンドを結合タンパク質から分離するのに用いることができる。結合したリガンドとしては、ホルモン、薬物等を挙げることができる。リガンドおよび結合タンパク質は酸性条件下で解離し、そして引続き大きさによって分離される。解離は、結合対のｐＫａ未満で起こる。「結合対」とは、対象リガンドおよびその結合した結合タンパク質を意味する。分離ｐＨは、概して、ｐＫａより僅かに酸性に選択される（これは異なるリガンドおよび結合タンパク質によって変化しうるが、概して、結合対のｐＫａより少なくとも０．０１〜０．０５少ないｐＨ）。これは、リガンドの変性を避けながら結合対を分離しうる可能性を最大限にする。概して、リガンドは結合検定においてしばしば検出され且つ定量されるので、リガンドの変性を避けることは好ましい。リガンドの変性は、検出検定において結合を阻害するように結合部分を変化させることによって誤った結果を生じることがある。結合対のｐＫａがリガンドの変性ｐＨに近い場合、リガンド含有部分のｐＨをサイズ分離後に規格化した後、更に検出または定量を行うことができる。試料中の結合タンパク質からリガンドを分離する方法は、本発明によって提供される。該方法は、概して、試料を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ且つ画分を遠心分離して試料画分を溶離することを含む。「酸性ゲル遠心分離」とは、ゲルのｐＨが酸性である遠心分離に適当なゲルクロマトグラフィーカラムを意味する。本明細書中で用いられる「試料画分」とは、遠心分離カラムを介する試料成分の通過から得られた溶液を示す意味である。画分は、試料成分だけから成っていてよいしまたは試料成分および溶離緩衝液を含んでいてよい。典型的に、該方法は、インスリン様成長因子のインスリン様成長因子結合タンパク質からの分離に適用される。該方法は、いずれかのインスリン様成長因子結合タンパク質（例えば、ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６）からインスリン様成長因子−Ｉかまたはインスリン様成長因子−ＩＩを分離するのに用いることができる。試料中のインスリン様成長因子結合タンパク質からインスリン様成長因子を分離する本発明の方法は、概して、酸性ゲル遠心分離カラムに試料を入れ、カラムを遠心分離して試料画分を溶離し、そして溶離した画分を集めることを含む。本発明の方法は、様々な試料に適用することができる。概して、試料は、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、腹水または間質液などの患者から得られた体液である。患者からの試料は、本発明の方法による分離を行う前に、全血から細胞を除去するなどの処理を行ってよい。固形組織もまた処理して、請求の範囲に記載の方法によって用いるための試料を提供することができる。概して、固形組織は細かく刻まれ、そして適当な抽出緩衝液中で機械的にまたは酵素によって均一化することができる。次に、均一化された組織を適当な希釈剤と混合し、そして本発明の分離方法に供する。或いは、試料は、細胞培養からのならし培地などの実験室試料であってよい。ならし培地試料は、直接検定することができるしまたは当該技術分野において周知の方法によって調製することができる。当業者は、異なる種類の試料に適用するための適当なならし培地調製法を理解している。試料は、酸性ゲル遠心分離カラムに入れられる。概して、細胞または細胞片などの粒状物質は、試料をカラムに入れる前に除去される。さもなければ、粒状物質は、カラムの細孔を塞ぐことによってサイズ分離の妨げとなることがある。多くの場合、試料を生理学的担体、例えば、食塩水またはウシ胎児血清などによって希釈して、カラムを介して一層容易に流れる粘性の少ない試料を提供することができる。典型的に、ポリアクリルアミドゲル遠心分離カラムを用いる。ゲルは、酸性条件において耐分解性でなければならない。概して、ゲルは、ｐＨ２またはそれより低い程度の酸性条件に対して耐性であるが、これは、分離されるリガンドおよび結合タンパク質の性質によって変化しうる。ゲルの耐酸性は、分離される結合対のｐＫａによって決定されうる。インスリン様成長因子結合タンパク質からのインスリン様成長因子の分離に有用なゲルは、概して、ｐＨ２の酸性条件に対して耐性である。更に、ゲルは、概して、有意の加圧変型に対して耐性である。概して、ゲルは、１２〜２０ポンド／平方インチまたはそれ以上のような高圧に耐えるべきである。高遠心分離速度は、概して、リガンドおよび結合タンパク質が同様の寸法である結合対のサイズ分離に要求される。これらの場合、ゲルは、高遠心分離速度に関係した高圧に耐えるべきである。さもなければ、ゲルは、貫通できない塊を形成することがあるしまたはサイズ分離用に与えられたその固有の細孔構造を失うことがある。ゲルの排除限界は、分離されるリガンドおよび結合タンパク質の寸法によって決定される。概して、インスリン様成長因子結合タンパク質からインスリン様成長因子を分離する場合、排除限界は約２０，０００ダルトンである。これは、より小さいインスリン様成長因子を保持しながらより大きいインスリン様成長因子を空隙容量で溶離させる。当業者は、リガンドおよび結合タンパク質をそれらの相対寸法に基いて分離するための適当な排除限界を選択する方法を容易に理解する。適当なゲルは様々な源から商業的に入手可能である。インスリン様成長因子結合タンパク質からのインスリン様成長因子の分離に特に有用な一つのゲルは、バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ、ＣＡからのバイオゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−１０である。バイオゲルＰ−１０は、ｐＨ２条件に対して耐性であり、１５ポンド／平方インチの加圧下でほとんど変形しないし、そしてその排除限界は２０，０００ダルトンである。ゲル標品は、他の製造業者から入手可能であり、例えば、セファデックスＧ５０（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ、スウェーデン）があるが、しかしながら、これらのゲルは、本発明の方法で用いられる遠心力に耐えられないことがある。ゲルは、ゼラチン状態で得ることができるしまたは粉末から水和させることができる。粉末から水和させる場合、例えば、１Ｍ酢酸などの酸によってゲルを水和させるのが望ましいことが多い。プレ水和ゲルもまた、請求の範囲に記載の発明の方法で用いる前に、１Ｍ酢酸などの酸性溶液中に浸漬することができる。水和または酸性溶液中の浸漬後、ゲルを、ウシ血清アルブミンまたは他の血清タンパク質、例えばγグロブリンによって前処理することができる。前処理は、ゲル中のインスリン様成長因子の保持を制限することによってインスリン様成長因子の収率をしばしば増加させる。典型的に、前処理は、試料成分の分離効率に影響を与えない。概して、前処理中に、ゲルを前処理剤と一緒に一晩中インキュベートする。ゲル遠心分離カラムは商業的に入手することができ、例えば、バイオラド、ハーキュリーズ、ＣＡからのバイオスピン（Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ）カラムがある。或いは、ゲル遠心分離カラムは、本明細書中に援用されたサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ），１９８９年に記載のような当業者に周知の一般的な方法によって構築することができる。簡単にいうと、１ｍｌ使い捨て注射器の底に滅菌ガラスウールを詰める。水和ゲルを、注射器の側面に静かに滴下する緩衝溶液中において、いっぱいになるまで注射器に加える。注射器を１６００ｘｇで４分間遠心分離する。ゲルを注射器に加え且つ再度遠心分離する。充填された容量が約０．９〜１．１ｍｌになるまでこれを繰り返す。次に、カラムは上記前処理に用意される。カラムを完全に調製後、試料を酸性溶液、例えば、酢酸またはＨＣｌなどと混合する。インスリン様成長因子結合タンパク質からのインスリン様成長因子の分離に対して、得られた試料溶液のｐＨは、概して、約１〜約３、通常は約２である。溶液をカラムに加える。カラムを約５００〜２０００×ｇで、通常は約１２５０×ｇで２〜１０分間遠心分離する。遠心分離の際にカラムから画分が溶離される。インスリン様成長因子結合タンパク質をインスリン様成長因子から分離する場合、概して、空隙容量（void volume）は結合タンパク質全部を含む。空隙容量を集めた後、溶離緩衝液をカラムに加える。逐次的に溶離緩衝液をカラムに充填し且つ充填されたカラムを遠心分離することにより、更に別の画分がカラムから溶離される。概して、溶離緩衝液は、結合対の再結合を妨げるように、試料溶液とほぼ同様のｐＨでなければならない。インスリン様成長因子結合タンパク質をインスリン様成長因子から分離する場合、好都合な緩衝液は０．１ＭＮａＣｌ中の１Ｍ酢酸である。この溶離緩衝液を用いて、概して、インスリン様成長因子を第四および第五画分中に溶離する。インスリン様成長因子およびインスリン様成長因子結合タンパク質を含む画分は、当業者に周知のいくつかの方法によって識別することができる。例えば、既知量の標識インスリン様成長因子を試料に加えることができる。インスリン様成長因子含有画分は、標識インスリン様成長因子を含んでいる。したがって、標識を含む画分の検出は、インスリン様成長因子含有画分を識別する。インスリン様成長因子結合タンパク質含有画分は、同様の方法で識別することができる。他のリガンドおよび結合タンパク質を含む画分は、上記で説明されたように識別することができる。標識リガンドまたは結合タンパク質を試料に加え且つ溶離された画分で識別することができる。試料リガンドおよび／または結合タンパク質は、以下に記載のように識別し且つ定量することができる。本発明は、更に、試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定する方法を提供する。該方法は、概して、酸性ゲル遠心分離カラムに試料を入れ、カラムを遠心分離して試料画分を溶離し、溶離した画分を集め、画分中のインスリン様成長因子の量を定量し、そしてそこから試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定することを含む。これらの方法は、酸性ゲル遠心分離カラム中で試料を遠心分離することによって、試料中のインスリン様成長因子結合タンパク質からインスリン様成長因子を分離する。インスリン様成長因子を含む画分は上述のようにして同定することが可能である。当該画分中におけるインスリン様成長因子の量は当業者にとって周知の方法によって定量することが可能である。試料中のインスリン様成長因子を定量する一つの好適な方法は免疫検定法（イムノアッセイ）である。本明細書中に援用されるハーロウ（Ｈａｒｌｏｗｅ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー，１９８８年）に概括的に記載されているように、種々の免疫検定法を用いることができる。免疫検定法は直接的であってよいしまたは間接的であってよい。単クローン性および多クローン性抗体は、当業者に周知の方法によってインスリン様成長因子に対して生じることができる。或いは、インスリン様成長因子と反応する抗体は、ナショナル・ホルモン・アンド・ピテュイタリー・プログラム（ＮａｔｉｏｎａｌＨｏｒｍｏｎｅａｎｄＰｉｔｕｉｔａｒｙＰｒｏｇｒａｍ）、バルチモアＭＤまたはアマノ・ファーマソイティカルズ（ＡｍａｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、トロイ、ＶＡなどの供給者から商業的に入手することができる。直接免疫検定法において、抗体は標識することができる。適当な標識としては、酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ；放射性標識、例えば、¹²⁵Ｉ；発色団、例えば、テキサスレッド；および蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネートがある。概して、検定は競合的結合検定である。インスリン様成長因子と反応する抗体を支持体上に固定する。インスリン様成長因子含有画分を標識インスリン様成長因子と混合する。混合物を固定化抗体に与える。インスリン様成長因子は、試料からのも追加の標識分子からのも、固定化抗体を競合的に結合し且つ保持される。保持された標識の測定は、試料中のインスリン様成長因子の濃度の間接的測定を提供する。免疫検定の別の方法、例えば、抗体サンドイッチ検定もまた用いることができる。試料中のインスリン様成長因子の量を定量するもう一つの方法は、受容体検定による。例えば、ＩＧＦ受容体を固体支持体に結合することができる。ＩＧＦ含有画分を固定化受容体と接触させることができる。検定された画分中のＩＧＦは受容体に結合し、そして画分の他の成分を固体支持体から洗浄することができる。ＩＧＦに特異的な標識抗体は、検定された画分に対する固体支持体の暴露と同時にかまたは後に固体支持体と接触させることができる。抗体はＩＧＦに対して結合し、それは順次に、固定化ＩＧＦ受容体に対して結合し且つそれによって保持される。この結果、検定された画分中のＩＧＦの量に正比例して、洗浄後の固体支持体上に標識が保持される。したがって、画分中のＩＧＦの量は、保持された標識の測定から決定することができる。他のリガンドの検出および定量も同様に行うことができる。例えば、免疫検定法かまたは受容体に基づく検定法を用いて、上記のようにリガンドを検出し且つ定量することができる。検出されるリガンドに特異的な抗体および／または受容体をこれらの検定法において用いることができる。試料中の遊離リガントもまた、本発明の方法によって定量することができる。概して、試料を中性ゲル遠心分離カラムに入れる。「中性ゲル遠心分離カラム」とは、ゲルのｐＨが中性である、概して約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、更に好ましくは約ｐＨ７である遠心分離に適当なゲルクロマトグラフィーカラムを意味する。カラムを遠心分離し、そして画分を集める。中性緩衝液を用いて、空隙容量の溶離後の画分を集める。遊離リガンドを含む画分は、標識遊離リガンドを試料に対して加え且つ画分中の標識の存在を検出することによって識別することができる。次に、遊離リガンドを上記のように適当な画分中で定量することができる。試料中の遊離ＩＧＦは、以下のように検出することができる。試料５０μｌを、約２００μｌの中性緩衝液、例えば、０．６％塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）によって希釈する。バイオゲルＰ−１０を緩衝液中で平衡させ、そして遠心分離カラムを上記のように調製する。カラムを遠心分離して緩衝液を除去する。希釈試料５０μｌをカラムに入れ、そして約１２５０ｘｇで３〜５分間遠心分離する。中性緩衝液を加え、カラムを更に２回遠心分離する。結合ＩＧＦは、これらの最初の三つの画分中に溶離される。中性緩衝液１ｍｌをカラムに加え、それを約１２５０ｘｇで５分間遠心分離する。遊離ＩＧＦはこの画分中に溶離される。遊離ＩＧＦプールをポリプロピレン試験管中に集め、そして上記のＩＧＦ検定に用いる。試料中の遊離ＩＧＦの濃度は、最終画分の遊離ＩＧＦの定量後に決定することができる。全リガンドに対する遊離の濃度比は、本発明の方法によって決定することができる。試料を等しいアリコート（aliquot）に分ける。一方のアリコートを、適当なｐＨの酸性緩衝液で希釈する。もう一方のアリコートを中性緩衝液で希釈する。遊離リガンドおよび全リガンドの濃度を上記のように決定する。次に、濃度比を計算する。以下の実施例は例証のために与えられ、制限するためのものではない。実施例実施例ＩＩＧＦ放射性リガンド検定におけるＩＧＦＢＰの妨害の評価抗体に対する¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ結合の競合は、異なる濃度の精製ＩＧＦＢＰの存在下および不存在下において決定されて、ＩＧＦ放射性リガンド検定における種々のＩＧＦＢＰによる妨害の程度を決定した。検定されたＩＧＦＢＰはいずれも（ＩＧＦＢＰ−２〜ＩＧＦＢＰ−６）、ＩＧＦ−ＩＩの結合を実質的に阻害した（図１Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−６を除く全部のＩＧＦＢＰが、ＩＧＦ−１結合を実質的に阻害した（図１Ａ）。以下のＩＧＦ放射性リガンド検定を全ての検定に用いた。標準および未知試料（０．１ｍｌ）を、ＲＩＡ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを補足した０．０４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）０．２ｍｌが入っているポリプロピレン試験管に加え、そして一次抗体（ＩＧＦ−Ｉに対して生じたウサギ多クローン性抗血清の１：６０００希釈（ナショナル・ホルモン・アンド・ピテュイタリー・プログラム、バルチモア、ＭＤ）；またはＩＧＦ− ＩＩ単クローン性抗体１０μｇ／ｍｌの１：６４００希釈（アマノ・ファーマソイティカルズ、トロイ、ＶＡ））０．１ｍｌと一緒に室温で１時間プレインキュベートした。¹²⁵Ｉ−ＩＧＦトレーサー（３０，０００〜４０，０００ｃｐｍ）０．１ｍｌを混合物に加え、そして試験管を４℃で更に１６時間インキュベートした。０．１ｍｌの適当な非免疫血清の１：２０希釈液、０．４ｍｌのヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス免疫グロブリンＧの適当な希釈液、並びに０．２ｍｌの８％ポリエチレングリコール８０００を加えることによって、結合¹²⁵Ｉ−ＩＧＦを遊離¹²⁵Ｉ−ＩＧＦから分離した。試料を混合し且つ室温で２時間インキュベートした。沈澱を遠心分離によってベレットにし、そしてγカウンターで計数した。ＩＧＦＢＰの存在下および不存在下で結合した¹²⁵Ｉ−ＩＧＦトレーサーの百分率を、実験で用いられた各ＩＧＦＢＰの濃度に対してプロットした。ＩＧＦＢＰ−６を除く全部の精製ＩＧＦＢＰが、抗体に対する¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ −Ｉの結合を用量依存様式で減少させた。ＩＧＦＢＰ−６を除くＩＧＦＢＰそれぞれによる¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉの５０％阻害は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌで観察された。精製ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−５は、抗体に対する¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉトレーサーの結合の阻害に対して、他のＩＧＦＢＰよりも数倍強力であった。ＩＧＦＢＰの妨害は、ＩＧＦ−ＩＲＩＡの場合よりもＩＧＦ−ＩＩＲＩＡの場合にはるかに多く見られた。¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−ＩＩ結合の５０％阻害は、種々のＩＧＦＢＰに対して５〜５０ｎｇ／ｍｌで見られた。６種類全部のＩＧＦＢＰが、抗体に対する¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−ＩＩの結合をＩＧＦ −ＩＩ標準と並行して減少させた。６種類全部の精製ＩＧＦＢＰが、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方の放射性リガンド検定において人工産物を生じた。妨害の程度は、ＩＧＦＢＰに対するＩＧＦの親和性によって異なった。ＩＧＦ−Ｉに対して最低の親和性を有するＩＧＦＢＰ−６は、ＩＧＦ−ＩＲＩＡにおいてごく僅かしか人工産物を生じなかった。これに反して、最高の親和性によってＩＧＦ−１を結合するＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−４は、ＩＧＦ−ＩＲＩＡにおいて最も多い人工産物を生じた。更に、ＩＧＦ−Ｉよりも高い親和性によってＩＧＦ−ＩＩを結合するＩＧＦＢＰ−２、−５および−６は、ＩＧＦ−ＩＲＩＡの場合よりもＩＧＦ−ＩＩＲＩＡの場合に多く妨害を生じた。これらの結果は、インスリン様成長因子検定のためにＩＧＦをＩＧＦＢＰから分離する必要性を実証した。実施例ＩＩセファデックスＧ−７５、酸エタノールおよびセプ・パク法によるＩＧＦＢＰの除去効率標準的な分離および除去法によるＩＧＦＢＰ除去の効率を決定した。血清試料を酸エタノール法、セプ・パク法およびセファデックスＧ−７５法によって抽出した。酸エタノールおよびセプ・パク法は、ＩＧＦＢＰを試料から確実に除去しなかった。血清を、ドーハデイら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，５１：７８１（１９８０）で記載されたように、標準的な酸−エタノールによって処理した。簡単にいうと、血清１００μｌを酸−エタノール（２ＭＨＣｌ１２．５％およびエタノール８７．５％、ｖ／ｖ）９００μｌと混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした。酸エタノール抽出物をエッペンドルフミクロ遠心分離機（ブリンクマン・インスツルメンツ（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ウェストバリー、ＮＹ）において４℃で３０分間遠心分離した。変法において（酸−エタノール低温沈澱法）、酸−エタノール処理された上澄みを０．８５５Ｍトリス塩基によって中和し、−２０℃で１時間貯蔵し、そしてブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）ら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２８：３４７（１９９１）に記載のように、ミクロ遠心分離機において再度３０分間遠心分離した。Ｃ−１８セプ・パクカラム（ウォーターズ・アソシエーション（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃ．）、メドフォード、ＭＡ）を酸クロマトグラフィー抽出に用いて、ＩＧＦＢＰからＩＧＦを分離した。簡単にいうと、血清５０μｌを０．５ＮＨＣｌ９５０μｌと混合し且つ３０分間インキュベートした。この混合物２００μｌを、アセトニトリル５ｍｌによって予め湿潤された後に水５ｍｌによって濯ぎ洗浄されたＣ−１８セプ・パクカラムに入れた。非結合タンパク質は、カラムを４％酢酸１０ｍｌによって濯ぎ洗浄することにより溶離された。結合タンパク質（ＩＧＦ）は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有９５％アセトニトリル５ｍｌによってカラムを濯ぎ洗浄することにより溶離された。結合画分をスピード・バク遠心によって乾燥させ且つＩＧＦＢＰ分析用に用いた。ＦＰＬＣカラムＨＲ１０／３０（１ｃｍＸ３０ｃｍ）に、緩衝液として０．１ＭＮａＣｌ含有１Ｍ酢酸を用いてセファデックスＧ−７５を充填した。血清１００μｌを、０．１２５ＭＮａＣｌ含有１．２５Ｍ酢酸４００μｌと混合し且つ室温で１５分間インキュベートした後、それを２００μｌ試料ループを用いてカラムに入れた。タンパク質は、流速０．５ｍｌ分で溶離した。２分の画分を集め、スピード・バク遠心によって乾燥させて酢酸を除去し（サバント・インスツルメンツ（ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ヒックスビル、ＮＹ）、２０ｍＭ酢酸中に還元し、そしてＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦＢＰ検定に用いた。若干の実験において、ＩＧＦＢＰ（１６〜３０分）およびＩＧＦ（３０〜４４分）プールを１３ｘ１００ｍｍポリプロピレン試験管に集め、スピード・バク遠心によって乾燥させ、２０ｍＭ酢酸中に還元し（元の試料の１／１０希釈）、そしてＩＧＦ検定およびリガンドブロットに用いた。未処理、酸エタノール、セプ・パクおよびセファデックスＧ−７５抽出血清試料に、上記のようにＦＰＬＣ系においてセファデックスＧ−７５を用いる酸性ゲル濾過を施してＩＧＦをＩＧＦＢＰから分離した後に分析を行った。結合検定用緩衝液（０．１Ｍヘペス（Ｈｅｐｅｓ）／４４ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００／０．０２％アジ化ナトリウム）０．１５０ｍｌおよび¹²⁵Ｉ標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（２５，０００〜３０，０００ｃｐｍ）０．０５０ｍｌを、使い捨てポリプロピレン試験管中で混合し且つ室温で１〜２時間インキュベートした。結合および遊離¹²⁵Ｉ標識ＩＧＦを分離するために、ウシγグロブリンおよびＰＥＧの組合わせを用いた。ＰＥＧは大型の分子を沈澱するが、より大きな分子であるγグロブリンを加えて、沈澱過程を促進させた。緩衝液中２％ウシγグロブリン０．２００ｍｌを試験管に加え、混合し、そして室温において１１８５ｘｇ（３，０００ｒｐｍ）で２０分間遠心分離した。上澄みを傾瀉し、そして水中１５％ＰＥＧを試験管に加えることによってペレットを洗浄し且つ２０分間再度遠心分離した。ペレット中の放射能をγカウンターで計数した。比計数を得るために、緩衝液およびトレーサーが入っているが結合タンパク質は入っていない対照試験管の計数を、試料およびトレーサー両方を含む試験管の計数から差し引いた。図２Ａは、未処理血清試料と比較された各種抽出操作後のヒト血清の酸性ゲル濾過中に得られたＩＧＦＢＰプロフィールを示す。ＩＧＦＢＰ活性（フラクション９〜１５）は、分子量マーカーＢＳＡ（６７，０００）とミオグロビン（１７，５０００）との間に溶離された。ＩＧＦが溶離された範囲（フラクション１５〜２２）では、ＩＧＦＢＰ活性が検出されなかった。有意の量のＩＧＦＢＰ活性は、酸エタノールおよびセプ・パクによる抽出後の血清試料中で保持されたが、セファデックスＧ−７５酸性ゲル濾過後には保持されなかった。酸−エタノール低温沈澱法は標準的な酸エタノール抽出よりも僅かにすぐれていたが、有意の量のＩＧＦＢＰがこの操作後に未抽出のまま残った。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性についてのセファデックスＧ−７５画分のＲＩＡによる分析は、未処理、酸エタノールおよびセプ・パク抽出血清試料に対して二つの活性ピークを生じた（図２Ｂおよび２Ｃ）。高分子量ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性ピーク（フラクション８〜１４）はＩＧＦＢＰ活性ピークと一致し、このＩＧＦ様活性ピークがおそらくはＩＧＦＢＰ人工産物によるものであることを示唆した。この解釈と一致して、これらの画分のアリコートと過剰の未標識ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉとのプレインキュベーション（それぞれＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ放射性リガンド検定において）は、ＩＧＦＲＩＡにおけるＩＧＦ様活性を消滅させた。低分子量ＩＧＦ活性ピークは¹²⁵Ｉ−ＩＧＦと一緒に同時溶離され且つ過剰の未標識ＩＧＦとのプレインキュベーションによって消滅しなかった。酸−エタノールおよびセプ・パク抽出血清試料とは対照的に、セファデックスＧ−７５ゲル濾過後に得られたＩＧＦプールは、高分子量範囲に測定可能なＩＧＦ様活性を生じなかった。酸−エタノールおよびセプ・パク分離されたＩＧＦプールのセファデックスＧ −７５分離によって得られた結果は、第二の方法によって更に確証された。抽出血清試料には、ＩＧＦＢＰの定量のためにウェスタンリガンドブロット分析を施した（図３）。試料を、非還元条件下においてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下の３〜２７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させて、互いから異なるＩＧＦＢＰを分離し且つＩＧＦＢＰからＩＧＦを分離した。予め染色された分子量マーカー（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）を標準としてそれぞれのゲルに流した。電気泳動後、ゲルをＴ緩衝液（０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン、２０％メタノール）中で１５分間洗浄してＳＤＳを除去した後に、Ｔ緩衝液を用いてニトロセルロース膜（０．４５μｍ、シュライシャー・アンド・シューエル・インコーポレーテッド（ＳｃｈｌｅｉｓｓｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌＩｎｃ．）、キーン、ＮＨ）上へ電気移動させた。ニトロセルロース膜上に固定されたタンパク質を２ｘ１０⁶ｃｐｍの¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉおよび¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ− ＩＩと一緒に４℃でインキュベートし、洗浄し、そしてホーセンループ（Ｈｏｓｓｅｎｌｏｏｐ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５４：１３８（１９８６）の方法にしたがってオートラジオグラフィーによって視覚化した。酸−エタノール法およびセプ・パク法は両方とも、高分子量タンパク質（おそらくは、ＩＧＦ受容体）を除去する場合には有効であるが、低分子量ＩＧＦＢＰには有効でないことが分かった。酸−エタノール法およびセプ・パク法とは対照的に、ニトロセルロース膜をＸ線フィルムに対して−７０℃で暴露した２〜３週間後でさえもＩＧＦＢＰバンドが見られなかったことから、セファデックスＧ− ７５を用いるＦＰＬＣ酸性ゲル濾過は、血清からＩＧＦＢＰを完全に除去した。実施例ＩＩＩバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーによるＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離この実施例は、本発明の方法によるＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離を実証する。分離は、迅速でもあり高性能でもあった。バイオゲルＰ−１０（粒度４５〜９０μｍ）を、０．１ＭＮａＣｌを含む（ＢＳＡ１０ｍｇ／ｍｌ存不在下または存在下の）過剰の１Ｍ酢酸中において室温で一晩中水和させた。フラスコを時々回しながら１０〜１５分間ゲルを脱気させた。粒子の９０〜９５％が沈降するまでゲル溶液を静置した。微粒子を含む上澄みを除去し、そしてゲルスラリーを空のバイオスピンカラム（バイオラド、ハーキュリーズ、ＣＡ）に注いで、充填カラム層高さを４ｃｍにした。カラムの底部および上部両方に蓋をし、そして使用するまで室温で貯蔵した。使用前に、カラムを採取用試験管（１０×１７ｍｍポリプロピレン試験管）に入れ、そしてベックマンＴ６Ｊ型遠心機（ベックマン・インスツルメンツ（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、パロ・アルト、ＣＡ）中の振子式バケット中において３０００ｒｐｍ（１２５０×ｇ）で３〜５分間遠心分離して過剰の緩衝液を除去した。次に、試料（血清５０μｌを、０．１２５ＭＮａＣｌ含有１．２５Ｍ酢酸２００μｌと混合し且つ３０分間インキュベートした）５０μｌをカラムに中央に注意深く入れ且つ３〜５分間遠心分離した。溶離用緩衝液（０．１ＭＮａＣｌ中１Ｍ酢酸）５０μｌを加え、そしてカラムを再度遠心分離した。９５％を越えるＩＧＦＢＰが最初の２回の遠心分離中に溶離された。カラムを溶離用緩衝液１ｍｌで濯ぎ洗浄し且つ５分間遠心分離してＩＧＦを溶離した。それぞれの画分の溶離液を別々の採取用試験管に集め（ＩＧＦプール）、そしてスピード・バク遠心によって乾燥させた。ＩＧＦプールを２０ｍＭ酢酸２００μｌによって還元し且つ１分間音波処理してＩＧＦを溶解させた。ＩＧＦ画分を、０．２５％ＢＳＡ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である検定用緩衝液によって更に希釈し、そして上記実施例Ｉに記載のようにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ放射性リガンド検定に用いた。図４は、バイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーを用いるヒト血清存在下および不存在下の¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉの溶離プロフィールを図示する。空隙容量画分（１および２）は、加えられた全計数の５％未満を含んでいた。回収された全¹²⁵ Ｉ−ＩＧＦ−Ｉの９５％より大が、フラクション４〜６で見出された。図５は、精製ＩＧＦ−ＩをバイオスピンＰ−１０カラムに入れた場合、カラムフラクション１および２において検出可能なＩＧＦ−Ｉが見出されないことおよびフラクション４および５は回収されたＩＧＦ−Ｉの９０％より大を含んでいたことを示す。図６Ａ〜６Ｃは、酸性にされた血清（血清１０μｌ＋０．１２５ＭＮａＣｌ含有１．２５Ｍ酢酸４０μｌ）５０μｌにバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーを施した場合のバイオスピンＰ−１０カラムフラクション中のＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのプロフィールを図示する。ＩＧＦＢＰ活性は、¹²⁵ Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ複合体のポリエチレングリコール沈澱によって決定された。活性はフラクション１および２で見られ、フラクション３〜７ではＩＧＦＢＰ活性が検出されなかった（図６Ａ）。ＩＧＦＢＰ活性とは対照的に、ＩＧＦ−Ｉ活性の二つのピークが存在し、ピーク１はＩＧＦＢＰの溶離位置に対応し且つピーク２は¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉの溶離位置に対応した。同様に、ＩＧＦ −ＩＩ活性の二つのピークが存在し、それらはそれぞれＩＧＦＢＰおよび¹²⁵Ｉ −ＩＧＦ−ＩＩの溶離位置に対応した。ピーク１のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ活性は、この活性が、放射性リガンド検定の前のこれらの画分と過剰のＩＧＦ −ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉとのプレインキュベーションによって消滅しうることから、ＩＧＦＢＰ人工産物のためであると考えられた。ＩＧＦＢＰピークのＩＧＦ −ＩＩ様活性は実際のＩＧＦ−ＩＩよりも３〜５倍高く、ＩＧＦＢＰピークのＩＧＦ−Ｉ様活性は実際のＩＧＦ−Ｉよりも１〜２倍高いので、ＩＧＦＢＰによって生じた人工産物は、ＩＧＦ−ＩＲＩＡよりもＩＧＦ−ＩＩＲＩＡにおいて有意に高いと考えられた。フラクション３における検出可能なＩＧＦＢＰ活性またはＩＧＦ活性いずれの不存在も、ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦの分離が、用いられたクロマトグラフィー条件下のＩＧＦおよびＩＧＦＢＰ間の溶離において重複することなく完了していることを示唆した。同様の実験を、バイオゲルＰ−１０の代わりにバイオゲルＰ−３０を用いて行った。バイオゲルＰ−３０の名目排除限界は４０ｋＤａである。バイオゲルＰ− ３０による分離は、ＩＧＦからＩＧＦＢＰを分離する場合にあまり有効ではなかった。バイオゲルＰ−３０を用いる正常ヒト血清中のＩＧＦＢＰおよびＩＧＦの分離は、バイオゲルＰ−１０クロマトグラフィーを用いるフラクション１に匹敵するフラクション１〜３においてＩＧＦＢＰの大部分が溶離したことを示した。更に、フラクション３はＩＧＦＢＰおよびＩＧＦ両方を含んでいたので、ＩＧＦＢＰはＩＧＦから完全に分離されなかった。したがって、バイオゲルＰ−３０クロマトグラフィーは、ＩＧＦＢＰからのＩＧＦの分離に対してバイオゲルＰ−１０ほど有効ではなかった。実施例ＩＶＢＳＡによるバイオゲルＰ−１０の前処理この実施例は、ＢＳＡによって前処理されたゲルおよび前処理されなかったゲル上の、本発明の方法によってＩＧＦＢＰから分離された場合のＩＧＦの回収を実証する。ＢＳＡによる前処理は、ＩＧＦ回収効率を増加させた。ゲル遠心分離カラムを、ＩＧＦの分離および抽出用に調製した。バイオゲルＰ −１０１０ｇを０．１ＭＮａＣｌ下含有１Ｍ酢酸１５０ｍｌ中に浸漬し且つ３０分間水和させた。ＢＳＡ１．５ｇを加え、そしてＢＳＡを振とうすることなく溶解させた。ＢＳＡが溶解した後、ビーズを静かに混合し且つ一晩中インキュベートした。ゲルを脱気させ且つ用いて、高さ４ｃｍのバイオスピンカラムを調製した。精製ＩＧＦ−Ｉの溶液を、実施例ＩＩＩに記載の方法により、前処理されたおよび前処理されていないゲルによって分離した。バイオスピンＰ−１０分離後の血清不存在下の精製ＩＧＦ−Ｉの回収率は低かった（４０％未満）。更に、ＩＧＦ−Ｉの回収率は、血清中のＩＦＧＢＰからのＩＧＦの分離用に従来用いられてきたバイオスピンカラムに血清試料を入れた場合に有意に増加した。結果を以下の表１および２に実証する。表１は、最初の実験後の８種類のヒト血清試料中のＩＧＦ−Ｉの回収率が、引続きの実験の４０〜５０％であったことを示す。実験２と実験３との間には有意の差がなかった。１Ｍ酢酸存在下でさえも、バイオゲルＰ−１０ビーズに対するＩＧＦの非特異的結合のために、有意の量のＩＧＦが最初の実験の際に失われた。このビーズに対するＩＧＦの非特異的結合は、バイオゲルＰ−１０ビーズを血清タンパク質またはＢＳＡによって一晩中前処理することによって実質的に排除されうる。以下の表２は、バイオゲルＰ−１０ビーズを使用前に１Ｍ酢酸中にだけ浸漬した場合に、¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉの＞５０％がカラムに保持されたことを示している。上記に示されたように、１％血清タンパク質または１％ＢＳＡによるバイオゲルＰ−１０ビーズの前処理は、非特異的結合を減少させた（加えられた¹²⁵Ｉ− ＩＧＦ−Ｉの＜２％がカラムに保持された）。このデータと一致して、ＢＳＡで前処理されたおよび未処理のバイオゲルＰ−１０を用いる正常ヒト血清プール中の平均ＩＧＦ−Ｉ回収率は、それぞれ２２１±５および９５±１３ｎｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ、ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）であった。更に、ＢＳＡで前処理されたバイオゲルＰ−１０を分離に用いた場合、実験１、２または３後のＩＧＦ−Ｉの回収率には有意の差がないことが分かった。バイオスピンＰ−１０分離の後の精製ＩＧＦ−Ｉの回収率を決定するために、１Ｍ酢酸、０．１ＭＮａＣｌ中２５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ５０μｌをカラムに入れた。ＩＧＦプール中のＩＧＦ−Ｉの量は、バイオスピン分離の後に決定された。４種類の異なる試料中で回収されたＩＧＦ−Ｉの量は、加えられたＩＧＦ−Ｉの９１±２．５％（平均±ＳＤ）であった。更に、血清試料に対して外部から加えられたＩＧＦ−Ｉの回収率は、バイオスピンＰ−１０分離に対して用いる前に、種々の濃度のＩＧＦ−Ｉを加えることによって決定された。外部から加えられたＩＧＦ−Ｉの回収率は９０％より大であった。低濃度のＩＧＦ−Ｉを含むならし培地試料中のＩＧＦの分離に対してバイオスピンＰ−１０分離技術を適用しうるかどうかを決定するために、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−３および種々の濃度のＩＧＦ−Ｉ（０．２５〜２ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ１ｍｌをスピード・バク遠心によって乾燥させ、１Ｍ酢酸１００ μｌ中に還元し、そしてバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーに用いた。引続きのＩＧＦプール中のＩＧＦ−Ｉの分析は、加えられたＩＧＦ−Ｉの回収率が異なる試料において８９％〜１１１％に変化したことを示し、ならし培地などの、低濃度のＩＧＦを含む生物学的流体中のＩＧＦの有効な決定に対してもバイオスピンＰ−１０分離を用いうることを示唆した。実施例ＶバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーの再現性この実施例は、本発明の方法によるＩＧＦ分離および測定の検定内および検定間再現性を実証する。それぞれの検定は、上記実施例ＩＩＩで記載のように行われた。一つの血清試料を６個の別々のカラムに入れ、そしてＩＧＦ−Ｉの回収率は、バイオスピン分離の後に決定された。結果を以下の表３に示す。６個のカラムの検定内カラム変動は６％であった。検定間変動を決定するために、２０種類の血清試料に、バイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーを別々の日に施した。図７は、２回の実験に対して得られたＩＧＦ値の相関係数が０．９１３（Ｐ＜０．００１）であったことを示す。実施例ＶＩバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーの有効性この実施例は、セファデックスＧ−７５酸性ゲル濾過と比較される本発明の方法の信頼性を実証する。本発明の方法によるＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの分離は、セファデックスＧ−７５濾過による分離と十分に相関した。ＩＧＦを、ＦＰＬＣにおいてセファデックスＧ−７５酸性ゲル濾過によって１０種類の正常ヒト試料中のＩＧＦＢＰから分離し、そしてバイオスピン分離によって得られた結果と比較した。図８Ａおよび８Ｂは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ− ＩＩに対するＦＰＬＣセファデックスＧ−７５分離とバイオスピンＰ−１０クロマトグラフィーとの間の相互関係を示す。方法間の相関は０．９１４であった。バイオスピンＰ−１０分離法とは対照的に、ＦＰＬＣセファデックスＧ−７５対酸エタノール抽出またはＦＰＬＣセファデックスＧ−７５対セプパク分離の比較は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方に対して不十分な相互関係を示した（表４）。ＩＧＦＢＰの除去に対するバイオスピンＰ−１０分離技術の効力は、ウェスタンリガンドブロット分析を用いて更に決定された。バイオスピンＰ−１０分離の後に得られたＩＧＦプールは、Ｘ線フィルムに対するニトロセルロース膜の暴露後３週間でも、測定可能なＩＧＦＢＰバンドを含まなかった（図９）。本明細書中に挙げられた公報、特許および特許出願はいずれも、個々の公報、特許および特許出願それぞれが具体的に且つ独立して本明細書中に援用されるように指示されたかのように本明細書にそのまま援用される。前述の発明は、理解を明確にするために図面および実施例によってある程度詳細に記載されたが、請求の範囲の範囲内で若干の変更および修正を行いうることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベーリンク，デイヴィッド・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州92373, レッドランズ，サーペンティン 1428

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中の結合タンパク質からリガンドを分離する方法であって、該試料を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ；該カラムを遠心分離して試料画分を酸性緩衝液によって溶離し；そして該溶離画分を集めることを含む上記方法。２．試料中のリガンドの量を定量することを更に含む請求項１に記載の方法。３．試料中のインスリン様成長因子結合タンパク質からインスリン様成長因子を分離する方法であって、該試料を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ；該カラムを遠心分離して試料画分を酸性緩衝液によって溶離し；そして該溶離画分を集めることを含む上記方法。４．ゲルが５ｐｓｉの圧力に対して耐性である請求の範囲第３項に記載の方法。５．ゲルが１５ｐｓｉの圧力に対して耐性である請求の範囲第４項に記載の方法。６．ゲルの排除限界が８，０００ダルトン〜２５，０００ダルトンである請求の範囲第４項に記載の方法。７．ゲルの排除限界が２０，０００ダルトンである請求の範囲第６項に記載の方法。８．ゲルが酸によって水和された請求の範囲第３項に記載の方法。９．酸が酢酸または塩酸である請求の範囲第８項に記載の方法。１０．ゲルを約５００〜２０００×ｇで遠心分離する請求の範囲第５項に記載の方法。１１．試料が、血液、血漿、血清、尿またはならし培地である請求の範囲第３項に記載の方法。１２．試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定する方法であって、該試料を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ；該カラムを遠心分離して試料画分を溶離し；該溶離画分を集め；該試料中のインスリン様成長因子の量を定量し；そしてそこから該試料中のインスリン様成長因子の濃度を決定することを含む上記方法。１３．インスリン様成長因子の量を免疫検定法によって定量する請求の範囲第２項に記載の方法。１４．免疫検定法が競合的結合検定法である請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．試料中のインスリン様成長因子の量を、インスリン様成長因子受容体との競合的結合によって定量する請求の範囲第１２項に記載の方法。１６．ゲルが１２ｐｓｉの圧力に対して耐性であり且つその排除限界が２０，０００ダルトンである請求の範囲第１２項に記載の方法。１７．ゲルが酢酸または塩酸によって水和している請求の範囲第１２項に記載の方法。１８．試料が、血液、血清、血漿、尿またはならし培地である請求の範囲第１２項に記載の方法。１９．試料中の遊離インスリン様成長因子の濃度を決定する方法であって、該試料を中性ゲル遠心分離カラムに入れ；該カラムを遠心分離して試料画分を中性緩衝液によって溶離し；該溶離画分を集め；該試料中のインスリン様成長因子の量を定量し；そしてそこから該試料中の遊離インスリン様成長因子の濃度を決定することを含む上記方法。２０．試料中のインスリン様成長因子結合タンパク質に対する遊離インスリン様成長因子の濃度比を決定する方法であって、該試料の第一部分を中性ゲル遠心分離カラムに入れ；該中性カラムを遠心分離して第一部分の画分を中性緩衝液によって溶離し；該溶離画分を集め；該試料の該第一部分中のインスリン様成長因子の量を定量し；そこから該試料中の遊離インスリン様成長因子の濃度を決定し；該試料の第二部分を酸性ゲル遠心分離カラムに入れ；該酸性カラムを遠心分離して第二部分の画分を酸性緩衝液によって溶離し；該溶離画分を集め；該試料の該第二部分中のインスリン様成長因子の量を定量し；そこから該試料中の全インスリン様成長因子の濃度を決定し；そして該試料中の全インスリン様成長因子に対する遊離インスリン様成長因子の濃度比を計算することを含む上記方法。