ES2202153T3 - Purificacion automatica de proteinas en formato de multiples pocillos mediante filtracion en vacio. - Google Patents
Purificacion automatica de proteinas en formato de multiples pocillos mediante filtracion en vacio.Info
- Publication number
- ES2202153T3 ES2202153T3 ES00949438T ES00949438T ES2202153T3 ES 2202153 T3 ES2202153 T3 ES 2202153T3 ES 00949438 T ES00949438 T ES 00949438T ES 00949438 T ES00949438 T ES 00949438T ES 2202153 T3 ES2202153 T3 ES 2202153T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- unit
- procedure
- cells
- proteins
- chamber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
- B01L3/50255—Multi-well filtration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D19/00—Degasification of liquids
- B01D19/02—Foam dispersion or prevention
- B01D19/04—Foam dispersion or prevention by addition of chemical substances
- B01D19/0404—Foam dispersion or prevention by addition of chemical substances characterised by the nature of the chemical substance
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D19/00—Degasification of liquids
- B01D19/02—Foam dispersion or prevention
- B01D19/04—Foam dispersion or prevention by addition of chemical substances
- B01D19/0404—Foam dispersion or prevention by addition of chemical substances characterised by the nature of the chemical substance
- B01D19/0409—Foam dispersion or prevention by addition of chemical substances characterised by the nature of the chemical substance compounds containing Si-atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
- Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento para la obtención de soluciones transparentes que contienen sustancias constitutivas de células a partir de muestras biológicas por el procedimiento de alto caudal de paso, que comprende las etapas de: (a) poner a disposición varias soluciones con un contenido de proteínas, que contienen constituyentes insolubles, en cámaras separadas de una unidad de filtración de cámaras múltiples, (b) retirar constituyentes insolubles por filtración de las soluciones a través de la unidad de filtración de cámaras múltiples, mediando aplicación de una diferencia de presiones, realizándose que por adición de un agente antiespumante a los materiales lisados de células y/o por utilización de una unidad de transferencia entre el lado de salida de la unidad de filtración de cámaras múltiples y el lado de entrada de los recipientes colectores, se impide una contaminación cruzada de cámaras contiguas, y (c) recoger los materiales filtrados individuales, en cada caso por separado, dentro de recipientes colectores.
Description
Purificación automática de proteínas en formato
de múltiples pocillos mediante filtración en vacío.
El presente invento se refiere a un procedimiento
así como a un estuche de reactivos para la obtención de soluciones
transparentes que contienen sustancias constitutivas de células a
partir de muestras biológicas según el procedimiento de alto caudal
de paso, así como para la obtención de sustancias constitutivas de
células a partir de las soluciones transparentes obtenidas. Además,
el invento se refiere a la utilización de un dispositivo
automatizable para la obtención de soluciones transparentes que
contienen proteínas.
En los sectores de la bioquímica y de la biología
molecular existe, en particular en escrutinios, con frecuencia la
necesidad de investigar con mayor detalle un gran número de
muestras biológicas, a fin de identificar por ejemplo clones
deseados o de determinar la presencia y el contenido de sustancias
constitutivas de células en muestras biológicas. Con el fin de
disminuir la dedicación de tiempo y por consiguiente los costos así
como las posibilidades de errores, se desarrollaron en el pasado
procedimientos y sistemas que simplifican el transcurso de los
procesos. Un enfoque para la disminución del esfuerzo de trabajo
consistió en poner a disposición sistemas que hacen posible un
tratamiento paralelo de varias muestras, tales como por ejemplo
placas de microtitulación, pipetas múltiples apropiadas para ellas
o unidades insertables de rotor, que pueden recibir placas de
microtitulación. Un enfoque adicional tiene como meta automatizar
ampliamente etapas individuales de los procedimientos, tal como
mediante el empleo de autómatas apropiados.
Felleisen y colaboradores (en Biotechniques 20,
616-620 (1996)), describen un procedimiento para la
purificación de proteínas de fusión recombinantes de la proteína de
fijación de maltosa (MBP, de
Maltose-Binding-Protein) en el
formato de 96 pocillos. El procedimiento parte de materiales
lisados transparentes de células, que se preparan de un modo
habitual y se disponen en pocillos de una placa de 96 pocillos, con
fijación de las proteínas de fusión de MBP contenidas en el material
sobrenadante a superficies revestidas con maltosa y con elución de
las proteínas de fusión de MBP por adición de un exceso de maltosa
o de reactivos desnaturalizantes. Resulta desventajoso en el caso de
este procedimiento el hecho de que no está automatizado y tampoco
es automatizable por causa de la preparación de materiales lisados
transparentes de células mediante centrifugación. El procedimiento
es utilizable solamente en condiciones nativas, pero no
desnaturalizadoras, y conduce a un rendimiento solamente pequeño (de
aproximadamente 2 \mug por pocillo).
Bell y colaboradores
(http://www.apbiotech.com/publications/LSN-1-5/gst.
micro. htm, 1999) describen un procedimiento para la purificación
paralela de hasta 24 proteínas de fusión con
glutatión-6-transferasa (GST, de
Glutathion-S-Transferase)
recombinantes. Se preparan por centrifugación materiales lisados
transparentes de células y se aplican sobre microcolumnas de
cromatografía separadas. Las siguientes etapas de fijación y de
lavado se ejecutan por centrifugación o por aplicación de una
depresión. La elución se efectúa por adición de glutatión reducido
a microrrecipientes de reacción individuales. Resulta desventajoso
en el caso de este procedimiento el hecho de que no está
automatizado y tampoco es automatizable a causa de la preparación de
materiales lisados transparentes de células por centrifugación. El
procedimiento se puede realizar solamente en condiciones nativas y
permite un tratamiento paralelo de solamente 24 muestras. Además,
existe un alto peligro de confusión por la utilización de
recipientes de reacción individuales.
Sheer y Pitt (High Throughput Sample Preparation
of Proteins and Peptides for Structural Characterization
[Preparación de muestras con alto caudal de paso de proteínas y
péptidos para su caracterización estructural], Póster nº
446-T, 13-15 de Julio de 1997, 11th
Symposium of the Protein Society [11º Simposio de la Sociedad de
Proteínas], Boston, MA) describen un procedimiento para cargar los
96 pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos por
medio de un "Multiscreen Column Loader" [Cargador de columnas
para escrutinio múltiple] con un material para cromatografía seco,
en forma de polvo. Después del hinchamiento y de la equilibración
del material, se pueden tratar por cromatografía paralelamente 96
tandas, llevándose a cabo todas las etapas por centrifugación. Este
procedimiento se refiere solamente a la purificación por
cromatografía, pero no a la preparación previa de las muestras.
El documento de solicitud de patente europea
EP-A-0.339.769 describe un
procedimiento para la purificación de muestras destinadas a
finalidades de diagnóstico con ayuda de tiras de filtros múltiples
en una filtración en cámaras múltiples. Se utilizan dos
procedimientos esencialmente analíticos, con membranas microporosas.
En este caso el primer procedimiento utiliza la membrana
microporosa para la reunión de pequeñas partículas para su análisis,
mientras que en el segundo procedimiento se lleva a cabo p.ej. una
fijación de los ARN ó ADN monocatenarios a la membrana de
nitrocelulosa para hibridaciones de ácidos nucleicos.
Los documentos precedentemente mejorados
describen la purificación de proteínas en tandas paralelas, pero en
su totalidad no están automatizados y tampoco son automatizables en
la forma que se describe. Como material de partida se emplean en
cada caso materiales lisados transparentes de células, que se han
preparado de una manera habitual, es decir por centrifugación de
las muestras individuales y retirada de los materiales
sobrenadantes. Esto implica la necesidad de numerosas etapas de
manipulación, y como consecuencia de esto, un alta dedicación de
tiempo y el peligro de confusión de muestras.
El documento de patente alemana DE 42 30 089
describe un robot de laboratorio para el tratamiento totalmente
automático de hasta como máximo 30 péptidos sintéticos, procedentes
de la síntesis en fase sólida. Un tratamiento de un material
biológico, tal como por ejemplo células o extractos de células, no
se divulga.
El documento
EP-A-0.376.080 describe un
procedimiento para la extracción y la purificación de ADN sin
etapas de centrifugación. Un tratamiento paralelo de varias
muestras, en particular por el procedimiento de alto caudal de paso,
no se divulga.
El documento
EP-A-0.249.932 describe un
procedimiento automatizado para la purificación de sustancias
fisiológicamente activas a la escala de procesos. El procedimiento
se basa en una macro-separación por filtración de
células o constituyentes de células, en una ultrafiltración para la
separación de sustancias con un bajo peso molecular como la
sustancia que se ha de aislar, así como en una etapa de
cromatografía de afinidad. Una purificación paralela de sustancias,
en particular por un procedimiento de alto caudal de paso, no se
divulga.
Los precedentes documentos de solicitudes de
patente europeas describen procedimientos automatizables para la
purificación de ADN o proteínas a partir de células o suspensiones
de células. Ellos, sin embargo, divulgan exclusivamente
procedimientos para la purificación de estas sustancias a partir de
una muestra individual y no por el procedimiento con alto caudal de
paso, y correspondientemente tampoco toman en consideración las
particularidades especiales que aparecen en el caso de aplicaciones
con alto caudal de paso.
Debido a la pequeña distancia en el espacio entre
las muestras separadas, un problema considerable en el caso de
aplicaciones con alto caudal de paso, consiste en una contaminación
cruzada por soluciones procedentes de pocillos o cámaras
contiguos/as. Este peligro existe en particular en el caso de etapas
de filtración a través de una unidad de filtración de cámaras
múltiples, sobre todo cuando la solución que se ha de filtrar tiene
tendencia a una gran formación de espuma. En particular, es
relevante este problema en el caso de la producción de materiales
lisados transparentes a partir de cultivos celulares. Por esta
razón, los procedimientos paralelos conocidos ya parten de
materiales lisados transparentes de células, que se habían obtenido
de un modo usual, es decir por centrifugación, compárese el estado
de la técnica precedentemente mencionado.
La misión en la que se basa el invento consistía
por consiguiente en poner a disposición un procedimiento sencillo y
rápido para la obtención paralela de soluciones transparentes a
partir de muestras biológicas, en particular a partir de células o
bien de suspensiones o materiales lisados en bruto de células.
Un objeto del invento es por consiguiente un
procedimiento para la obtención de soluciones transparentes que
contienen sustancias constituyentes de células a partir de muestras
biológicas por el procedimiento de alto caudal de paso, que
comprende las etapas de:
- (a)
- poner a disposición soluciones con un contenido de proteínas, que contienen constituyentes insolubles, en cámaras separadas de una unidad de filtración de cámaras múltiples,
- (b)
- retirar constituyentes insolubles por filtración de las soluciones a través de la unidad de filtración de cámaras múltiples mediando aplicación de una diferencia de presiones, realizándose que por adición de un agente antiespumante a los materiales lisados de células y/o por utilización de una unidad de transferencia entre el lado de salida de la unidad de filtración de cámaras múltiples y el lado de entrada de los recipientes colectores se impide una contaminación cruzada de cámaras contiguas, y
- (c)
- recoger los materiales filtrados individuales, en cada caso por separado, dentro de recipientes colectores.
Por una muestra biológica se entiende dentro del
marco de esta solicitud una muestra que contiene un material
biológico. El material biológico procede por ejemplo de tejidos de
cualquier tipo, médula ósea, líquidos corporales humanos y animales
tales como sangre, suero, plasma, orina, espermatozoides, fluido
cerebroespinal, esputos y frotis, plantas, partes y extractos de
plantas, p.ej. zumos, hongos, microorganismos, tales como bacterias
o virus, células procarióticas y/o eucarióticas o cultivos
celulares, muestras fósiles o momificadas, muestras de suelos, un
lodo de clarificación (depuración), aguas residuales y alimentos.
En particular, la muestra biológica puede comprender un material
recombinante, por ejemplo células eucarióticas y/o procarióticas,
modificadas por ejemplo con técnicas recombinantes.
La solución con un contenido de proteínas
contiene péptidos y/o polipéptidos procedentes del material
biológico en una forma soluble. Por ejemplo, estos péptidos y/o
polipéptidos solubles son sustancias segregadas, que están presentes
en la muestra biológica y/o son segregadas por células en la
muestra biológica. Alternativamente, pueden ser péptidos y/o
polipéptidos, que se presentan dentro de células o son expresados
por vía recombinante en ellas, y han sido puestas en libertad por
una rotura de células. En una forma de realización especial, las
soluciones de partida que contienen proteínas (es decir soluciones,
que contienen constituyentes insolubles) son materiales lisados en
bruto de células, llevándose a cabo la lisis en condiciones que
solubilizan a las proteínas. Además, las soluciones de partida que
contienen proteínas pueden constituir también fracciones de los
materiales lisados de células en bruto. Un ejemplo acerca de una
obtención de una fracción de material lisado es por ejemplo la
realización de la lisis en condiciones que precipitan proteínas y
la separación de los ácidos nucleicos, y la recogida renovada del
residuo en condiciones que solubilizan a las proteínas.
Los conceptos de "solución transparente" y
"material filtrado" se utilizan aquí de modo sinónimo y
designan a una solución que en lo esencial está exenta de
constituyentes insolubles, tales como p.ej. desperdicios
celulares.
Las soluciones serán por lo general de origen
diferente, pero se pueden imaginar también aplicaciones en las que
se tratan paralelamente partes alícuotas procedentes de una muestra
idéntica.
Por el concepto de "alto caudal de paso" se
entiende en este caso un tratamiento en paralelo de por lo menos
24, preferiblemente por lo menos 48, y del modo más preferido 96 y
más muestras, por ejemplo 384 muestras.
De acuerdo con una forma de realización, la
contaminación cruzada se evita por disminución de la formación de
espuma. Una tal formación de espuma aparece al realizar la
filtración de una solución que contiene proteínas a la salida de las
cámaras individuales de una unidad de filtración de cámaras
múltiples. Esta corona de espuma que se forma puede unirse con la
espuma existente junto a salidas contiguas de cámaras y conducir a
contaminaciones cruzadas. La formación de espuma se observa al
realizar la filtración de materiales lisados que tienen una
concentración de proteínas de \geq 0,1 mg por ml de material
lisado. Asimismo, se observa una formación de espuma al realizar la
filtración de medios de cultivo (complejos), que contienen
proteínas. Tales medios de cultivo son conocidos por un experto y
contienen p.ej. extractos de células de levadura (medios LB, TB,
dYT, YP), extractos digeridos de tejidos animales y vegetales (p.ej.
triptonas, peptonas, peptona de soja), materiales hidrolizados de
p.ej. caseína, albúmina láctea o gelatina, constituyentes de sueros
sanguíneos, o son medios exentos de suero, enriquecidos con
proteínas (p.ej. CHO-S-SFMII). Se
llega a una fuerte formación de espuma en el caso de unos
contenidos de proteínas de \geq 0,01 mg por ml de medio.
En una forma preferida de realización del
invento, la formación de espuma se disminuye por adición de un
agente antiespumante a las soluciones que contienen proteínas, en
particular por cubrimiento de las soluciones que contienen proteínas
con agentes antiespumantes. Apropiados agentes antiespumantes son,
por ejemplo, alcoholes primarios, secundarios o terciarios, en
particular alcoholes C1-C6, agentes antiespumantes
sobre la base de aceites de siliconas o emulsiones de ellos, tales
como por ejemplo el Antifoam A (SIGMA), la emulsión antiespumante
de silicona de Wacker de SRE (reactivo antiespumante DX, Wacker) o
la composición MSA Antifoam Compound de Dow Corning (Dow Corning),
agentes antiespumantes orgánicos no silicónicos o emulsiones de
ellos, p.ej. Antifoam 204 (SIGMA), agentes antiespumantes sobre una
base vegetal, en particular ésteres de ácidos grasos alcoxilados,
p.ej. Struktol J673 (Schill y Sailacher), alcanos de cadenas largas
(C6 y más largas), aceites minerales, poliglicoles, tales como
polipropilen-glicoles y
polietilen-glicoles, así como mezclas de ellos, por
ejemplo mezclas, que contienen agentes antiespumantes silicónicos y
no silicónicos, p.ej. Antifoam 289 (SIGMA). De modo preferido, el
agente antiespumante es un alcohol, en particular etanol o
isopropanol.
La concentración de agente antiespumante varía
dependiendo del tipo de la sustancia antiespumante, por ejemplo los
alcoholes, en particular el etanol, se utilizan en una forma
concentrada, mientras que por ejemplo los agentes antiespumantes
sobre la base de aceites de siliconas se emplean en una
concentración situada en torno a 0,1%.
Cuando la adición del agente antiespumante, de
acuerdo con la forma de realización preferida, se efectúa por
cubrimiento, el volumen necesario de agente antiespumante se ajusta
al diámetro de las cámaras o a la columna de líquido de agente
antiespumante, es decir que es independiente en su mayor parte del
volumen de las soluciones que contienen proteínas. Además, el
volumen es dependiente también del tipo del agente antiespumante.
En el caso de utilizarse etanol como agente antiespumante, se
comprobó que una altura de columna situada en el intervalo de 0,05
cm a 1 cm, preferiblemente de 0,1 cm a 0,3 cm, y en particular de
aproximadamente 0,2 cm, conduce a buenos resultados (referido a un
diámetro de las cámaras de 0,8 cm, en el caso de una modificación
del diámetro de las cámaras, pueden ser convenientes adaptaciones
en lo que se refiere a la altura de las columnas).
De acuerdo con otra forma de realización del
invento, la contaminación cruzada se impide por utilización de una
unidad de transferencia de cámaras múltiples, situada entre el lado
de salida de la unidad de la unidad de filtración de cámaras
múltiples y el lado de entrada de los recipientes colectores. Por
el concepto de "unidad de transferencia de cámaras múltiples"
se entiende una unidad con pasajes separados, cuyos orificios de
entrada corresponden a los orificios de salida de las cámaras
individuales de la unidad de filtración de cámaras múltiples, y
cuyos orificios de salida corresponden a los orificios de entrada
de los recipientes colectores. Por el lado de entrada, la unidad de
transferencia cierra a la unidad de filtración de cámaras múltiples
en lo esencial herméticamente con respecto a los orificios de
salida, con el fin de impedir una contaminación cruzada por
formación de espuma. Por el lado de salida puede estar previsto un
asiento no hermético con relación a los orificios de entrada de los
recipientes colectores, con el fin de hacer posible la aplicación
de una diferencia de presiones entre los lados de entrada y de
salida de la unidad de filtración de cámaras múltiples. De manera
alternativa, por el lado de salida de la unidad de filtración de
cámaras múltiples puede estar previsto un asiento hermético con
respecto al lado de entrada de los recipientes colectores, por
ejemplo con el fin de hacer posible la aplicación de una diferencia
de presiones entre el lado de entrada de la unidad de filtración de
cámaras múltiples y un posible lado de salida de los recipientes
colectores. Cuando los recipientes colectores contienen una matriz
de cromatografía, de esta manera una filtración de las soluciones
de partida y un tratamiento ulterior, tal como p.ej. una fijación a
la matriz de sustancias constitutivas de células, que se han de
purificar, se pueden llevar a cabo en una etapa en vacío (véase a
continuación). La unidad de transferencia es por ejemplo una
esterilla de hermetización, un bloque de aluminio, vidrio o
material sintético, provisto de taladros pasantes, o una disposición
de correspondientes tubitos o mangueras.
En una forma de realización especial, el
procedimiento conforme al invento parte de materiales lisados en
bruto de células, que se ponen a disposición en cámaras separadas
de una unidad de filtración de cámaras múltiples. Los materiales
lisados de células pueden haber sido preparados previamente por
mezclamiento de células o suspensiones de células con reactivos de
lisis, o la lisis se puede llevar a cabo directamente en las
cámaras individuales de la unidad de filtración de cámaras
múltiples, por adición de células y sustancias para lisis, y
eventualmente por incubación. La lisis se efectúa en tal caso en
condiciones que solubilizan a las proteínas, o comprende, después de
la separación de una o varias fracciones, una etapa de
solubilización para proteínas.
La separación de las soluciones que contienen
proteínas con respecto de los constituyentes insolubles se efectúa
por aplicación de una diferencia de presiones entre el lado de
entrada y el lado de salida de la unidad de filtración de cámaras
múltiples, presentándose una menor presión por el lado de salida. La
diferencia de presiones se puede generar por aplicación de una
sobrepresión por el lado de entrada, o preferiblemente de un vacío
por el lado de salida.
El filtro, presente en las cámaras separadas de
la unidad de filtración de cámaras múltiples, es de modo preferido
un filtro cuyo tamaño de poros disminuye en la dirección de
circulación de los materiales filtrados a través del filtro. Un
filtro de este tipo se describe en el documento de patente europea
EP 0.616.638 B1, al que se remite por la presente para más
detalles. Éste reúne las ventajas de un filtro de poros gruesos
(pequeña obstrucción de los poros del filtro) con las de un filtro
de poros estrechos (buena retención de constituyentes insolubles
finos). Un filtro habitual con un tamaño uniforme de poros es, sin
embargo, asimismo apropiado.
Después de la etapa de filtración, los materiales
filtrados se recogen en cada caso por separado en recipientes
colectores, convenientemente en las cámaras separadas de una unidad
de cámaras múltiples. En particular, cuando está previsto un
tratamiento ulterior de las soluciones transparentes (véase a
continuación), esta unidad de cámaras múltiples será en general una
unidad adicional de filtración o de cromatografía.
En una forma especial de realización, el
procedimiento conforme al invento comprende además la obtención de
sustancias constitutivas de células a partir de materiales
filtrados obtenidos de este modo. Para ello, el procedimiento
comprende por ejemplo una o varias etapas de filtración
adicionales, por ejemplo una ultrafiltración, con lo que se
consigue una separación de sustancias, que tienen un peso molecular
más pequeño que las buscadas sustancias constitutivas de células,
así como una concentración por evaporación del volumen de las
muestras.
Para la obtención de sustancias constitutivas de
células, el procedimiento comprende preferiblemente por lo menos una
etapa de separación por cromatografía y/o una etapa de
precipitación. Una etapa de precipitación comprende por ejemplo la
adición de etanol en una concentración suficiente como para
precipitar ácidos nucleicos, o la de un éter para la precipitación
de péptidos. Una etapa de separación por cromatografía comprende la
fijación de las sustancias constitutivas de células deseadas a un
material para cromatografía apropiado, la retirada de los materiales
sobrenadantes y a continuación la elución de las sustancias
constitutivas.
El material para cromatografía no está sujeto a
limitaciones especiales de ningún tipo y se escoge en dependencia
de las sustancias constitutivas de células que se han de separar.
Por ejemplo el material para cromatografía puede ser una matriz de
intercambio de iones.
Apropiados materiales de matriz comprenden p.ej.
los de agarosa, sílice, nitrocelulosa, celulosa, acrilamida, látex,
poliestireno, poliacrilato, polimetacrilato, polímeros de
polietileno tales como poli(alcohol vinílico), partículas de
vidrio, silicatos, tales como p.ej. silicatos de calcio, magnesio y
aluminio, óxidos metálicos tales como p.ej. óxidos de titanio,
apatito y combinaciones de ellos. Materiales de matriz apropiados
son gel de sílice y/o agarosa.
En una forma de realización nuevamente preferida,
el procedimiento conforme al invento para la obtención de
sustancias constitutivas de células comprende una etapa de
separación por cromatografía a través de una matriz de afinidad.
Tales matrices de afinidad son conocidas por un experto en la
especialidad y comprenden por ejemplo los sistemas de ligandos que
se indican en la siguiente lista (acoplados a un material de
matriz, véase más arriba).
| Ligando de afinidad | Molécula que se ha de aislar con éste |
| Antígeno | Anticuerpo determinado |
| Anticuerpo | Antígeno determinado |
| Anticuerpo | Anticuerpo determinado |
| Anticuerpo (p.ej. anti-IgG | Clase determinada de anticuerpos, tales como p.ej. |
| humana, anti-IgG de ratón) | moléculas de IgG procedentes de un ser humano o un ratón |
| Proteína A o Proteína G | Clases determinadas de anticuerpos |
| Estreptavidina o proteínas de fusión | Biotina, avidina, proteínas de fusión marcadas con biotina o avidina |
| marcadas con estreptavidina | |
| Glutatión | Glutation-S-transferasa (GST) o proteínas de fusión con GST |
| Celulosa | Dominio que fija celulosa (CBD) o proteínas de fusión con CBD |
| Calmodulina | Proteína que fija calmodulina (CBP) o proteínas de fusión con CBP |
| Amilosa | Proteínas que fijan maltosa (MBP) o proteínas de fusión con MBP |
| Grupos de intercambiadores de iones | Biomoléculas |
| Ligandos para interacciones hidrófobas | Biomoléculas |
| Oligo dT | Zonas de poli A, p.ej. de moléculas de ARNm |
| Ácidos nucleicos | Ácido nucleico que se hibridaza |
| Ácidos nucleicos, secuencia definida | Biomoléculas que fijan específicamente ácidos nucleicos, p.ej. |
| proteínas | |
| Proteínas | Partícipes en una interacción (proteínas, ácidos nucleicos en general, |
| ácidos nucleicos de secuencia determinada, biomoléculas pequeñas) | |
| Pequeñas biomoléculas | Proteínas, ácidos nucleicos |
| Ligandos que se fijan a células, p.ej. | Células a través de la fijación de moléculas superficiales de células |
| un polipéptido | |
| Ligandos que se fijan a fagos, p.ej. | Fagos a través de la fijación de moléculas sobre la superficie de fagos |
| un polipéptido | |
| Anticuerpos | Células o fagos a través de la fijación de moléculas superficiales |
Un ejemplo adicional para matrices de afinidad es
una matriz de afinidad con un quelato metálico para la purificación
de proteínas o péptidos. Mediando utilización de una matriz de
Ni-NTA (obtenible de Qiagen) se consiguieron
sobresalientes resultados en el caso de la purificación de
proteínas marcadas con 6xHis (véanse los Ejemplos).
La forma del material de matriz no está limitada
de un modo especial, se pueden emplear materiales en forma de
suspensiones o membranas. Ejemplos de ellos son membranas, perlas de
látex (monodispersas), material de perlas continuas, medios para
cromatografía poliméricos, partículas de sílice, etc, en cada caso
funcionalizados/as. Por el concepto de "funcionalizado/a" se
entiende la presencia de un grupo que es capaz para la formación de
un intercambio afín con las sustancias constitutivas de células que
se buscan. Un ejemplo específico para un medio de cromatografía del
tipo de suspensión es por ejemplo
Ni-NTA-Superflow (obtenible de
Qiagen).
El procedimiento conforme al invento para la
obtención de sustancias constitutivas de células comprende
convenientemente una o varias etapas de lavado. La separación de
líquidos, es decir del material sobrenadante después de una
precipitación o fijación de las deseadas sustancias constitutivas
de células a un material para cromatografía, así como del líquido
de lavado, se lleva a cabo de acuerdo con el invento, de un modo
preferido, por aplicación de una diferencia de presiones, en
particular de una depresión por el lado de salida. Si es necesario,
en estas etapas adicionales de filtración y/o cromatografía se
adoptan medidas apropiadas, con el fin de evitar una contaminación
por líquidos en cámaras contiguas, por ejemplo por adición de un
agente antiespumante o por utilización de una unidad de
transferencia.
En una forma especial de realización, los
líquidos (líquidos de lavado, etc.) que se han desechar, se
eliminan mediando utilización de una unidad de drenaje. Esta unidad
de drenaje corresponde por el lado de entrada a la unidad de
transferencia de cámaras múltiples que se ha descrito
precedentemente, es decir que los materiales sobrenadantes se
conducen a través de pasajes por separado fuera del lado de salida
de una unidad de filtración de cámaras múltiples. Por el lado de
salida, estos líquidos son aportados a través de la unidad de
drenaje a un recipiente colector de residuos.
Después de haber realizado el procedimiento
conforme al invento para la obtención o bien la purificación o el
aislamiento de materiales de sustancias constitutivas de células,
las soluciones, que contienen las sustancias constitutivas de
células, se recogen por separado en recipientes colectores, en
particular en las cámaras separadas de una unidad de cámaras
múltiples.
El procedimiento conforme al invento puede
comprender además etapas para el análisis y/o la conservación de
las sustancias constitutivas de células. Las etapas de análisis
comprenden por lo general la retirada p.ej. de una parte alícuota y
su aportación a una unidad de electroforesis, p.ej. una
SDS-PAGE y/o una unidad de espectroscopia, p.ej. a
un espectrómetro de masas o a un de ensayo. Un ejemplo específico
acerca de una etapa de conservación es la liofilización (desecación
por congelación).
El procedimiento conforme al invento es apropiado
para la obtención de un gran número de sustancias constitutivas de
células, en particular para la obtención de péptidos, polipéptidos,
ácidos nucleicos y/o metabolitos. Una premisa para ello es un
protocolo apropiado para la separación de las sustancias
constituyentes de células con respecto de otras sustancias mediando
utilización de una o varias etapas de filtración, precipitación y/o
separación por cromatografía. De modo preferido, el procedimiento se
emplea para la obtención de péptidos o polipéptidos, conteniendo
los polipéptidos por lo general por lo menos 50 aminoácidos.
A los polipéptidos pertenecen por ejemplo
proteínas, glicoproteínas y lipoproteínas, que eventualmente se
componen de varias subunidades y/o contienen grupos protésicos,
tales como anticuerpos o enzimas. Además de ello, mediante una
combinación apropiada de etapas del procedimiento se puede prever
una obtención de varias sustancias constitutivas de células a partir
del mismo material lisado. Por ejemplo, en un complejo de etapas de
procedimiento se pueden aislar péptidos o polipéptidos por fijación
a una matriz de afinidad, y en otro complejo adicional se pueden
obtener ácidos nucleicos, p.ej. ADN's de plásmidos que codifican
estos péptidos o polipéptidos.
El procedimiento conforme al invento está
previsto en particular para el tratamiento paralelo rápido de
muestras a la escala de laboratorio, es decir para una capacidad de
cabida de hasta 50 ml, de modo preferido hasta de 20 ml y mayor,
preferiblemente de 0,1 a 2 ml en cada cámara de la unidad de
filtración de cámaras múltiples, en la que se ponen a disposición
las soluciones de partida que contienen proteínas.
Ventajas adicionales del procedimiento conforme
al invento, además de la evitación de contaminaciones cruzadas en
un procedimiento de alto caudal de paso, consisten en particular
en
- -
- una alta automatizabilidad de la preparación paralela de materiales lisados de células,
- -
- evitación de etapas de transferencia y/o etapas de pipeteo manuales,
- -
- una alta automatizabilidad de la obtención de sustancias constitutivas de células a partir de materiales lisados en bruto de células,
- -
- buenos rendimientos, así como una alta pureza de las sustancias constitutivas de células que se han obtenido,
- -
- posibilidad de utilización en principio del procedimiento en condiciones tanto nativas como también en condiciones desnaturalizantes,
- -
- disminución de las fuentes de errores por automatización del procedimiento y utilización de unidades de cámaras múltiples,
- -
- rapidez del procedimiento,
- -
- flexibilidad del sistema.
El procedimiento conforme al invento es apropiado
para la obtención de soluciones transparentes que contienen
proteínas o para la obtención de sustancias constitutivas de
células a partir de una muestra biológica, por ejemplo de
procariotas, tales como p.ej. E.coli, de eucariotas, tales
como p.ej. Saccharomyces cerevisiae, células de tejidos y
cultivos vegetales, animales y humanas, células de insectos, hongos,
arqueas, etc., así como por ejemplo para sistemas automáticos de
ensayo con presentación visual de fagos.
Posibilidades de aplicación en la práctica del
procedimiento con alto caudal de paso (HT, de High Throughput)
conforme al invento, se encuentran por ejemplo en:
La ciencia genómica funcional:
- -
- caracterización con HT de genes y cuadros de lectura abiertos en el plano de proteínas dentro del marco de proyectos de secuenciación de genomas (p.ej. el proyecto del genoma de levaduras, el proyecto de genoma humano)
La ciencia proteómica funcional:
- -
- purificación con HT de proteínas recombinantes y de complejos de proteínas y péptidos
- -
- purificación con HT de proteínas recombinantes y de complejos de proteínas y péptidos como preparación previa de las muestras para la inmovilización junto a superficies (p.ej. placas de microtitulación, microrreactores, chips proteínicos [microagrupaciones])
- -
- purificación con HT de proteínas recombinantes como preparación previa de las muestras para programas de escrutinio de sustancias activas
- -
- purificación con HT de proteínas recombinantes y de complejos de proteínas y péptidos como preparación previa de muestras para estudios de interacción, p.ej. dentro del marco de proyectos de proteomas (es decir el complemento con proteínas del genoma) en dimensiones celulares.
- -
- aislamiento de péptidos, proteínas, complejos de péptidos o proteínas, y otras biomoléculas (p.ej. ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos) a través de la interacción con proteínas inmovilizadas, p.ej. marcadas con 6xHis, p.ej. dentro del marco de proyectos de proteomas en dimensiones celulares, programas de escrutinio de sustancias activas
- -
- aislamiento de organismos enteros (células, fagos) que en su superficie expresan determinadas biomoléculas (p.ej. proteínas), a través de las que se produce una interacción específica con partícipes inmovilizados en una interacción, p.ej. proteínas marcadas con 6xHis inmovilizadas a una matriz de Ni-NTA (enriquecimiento por afinidad, clonación por expresión, separación por adsorción (del inglés panning)
\newpage
- -
- análisis por expresión de genes en el plano proteínico (perfilamiento de la expresión de proteínas).
Un objeto adicional del presente invento es la
utilización de un dispositivo, que comprende
- -
- medios para retener una unidad de cámaras múltiples en una primera posición,
- -
- medios para retener una unidad de cámaras múltiples en una segunda posición,
- -
- medios para aplicar una diferencia de presiones entre el lado de entrada y el lado de salida de por lo menos una unidad de cámaras múltiples en la primera posición, y
- -
- medios para la adición de reactivos a cámaras individuales de por lo menos la unidad de cámaras múltiples en la primera posición,
para la obtención de soluciones transparentes
que contienen proteínas, a partir de muestras biológicas.
En la primera posición se pone a disposición una
unidad de filtración de cámaras múltiples para la recepción de
soluciones con un contenido de proteínas, que contienen
constituyentes insolubles. En la segunda posición se pone a
disposición una unidad de recogida de cámaras múltiples para la
recogida de las soluciones transparentes que contienen proteínas.
En particular, cuando está prevista una subsiguiente obtención de
péptidos y/o polipéptidos a partir de las soluciones con un
contenido de proteínas, la unidad de cámaras múltiples en la
segunda posición es por lo general otra unidad de filtración de
cámaras múltiples o una unidad de cromatografía de cámaras
múltiples.
Los medios para aplicar una diferencia de
presiones entre el lado de entrada y el lado de salida, por lo
menos de la unidad de cámaras múltiples en la primera posición, son
un dispositivo para generar una sobrepresión por el lado de entrada
y/o una depresión por el lado de salida. Estos medios son
preferiblemente un dispositivo para aplicación de un vacío por el
lado de salida. La unidad de cámaras múltiples en la primera
posición cierra el lado de entrada en lo esencial herméticamente con
respecto del lado de salida, con el fin de hacer posible la
generación de una diferencia de presiones. La diferencia de
presiones puede ser producida entre el lado de entrada y el lado de
salida de la unidad de cámaras múltiples en la primera posición o
entre el lado de entrada de la unidad de cámaras múltiples en la
primera posición y el lado de salida de la unidad de cámaras
múltiples en la segunda posición. Eventualmente el dispositivo
comprende además unos medios para la aplicación de una diferencia
de presiones entre el lado de entrada y el lado de salida de la
unidad de cámaras múltiples en la segunda posición.
Los medios para la adición de reactivos
comprenden en particular medios de pipeteo, preferiblemente medios
de pipeteo múltiple para la adición de por ejemplo soluciones de
lisis, tampones de lavado, etc., a las cámaras individuales.
Las unidades de cámaras múltiples en las
posiciones primera y segunda están orientadas en general de tal
manera que las salidas desde las cámaras de una unidad en la
primera posición se alinean con las entradas en las cámaras de una
unidad de la segunda posición. Con ello se garantiza una sencilla
transferencia de soluciones desde las cámaras de la unidad en la
primera posición después del paso a través del medio de filtración
a las cámaras de la unidad en la segunda posición.
En el caso de la utilización del dispositivo para
la obtención de péptidos y/o polipéptidos, en la primera posición
se pone a disposición una unidad de filtración de cámaras múltiples
y en la segunda posición se pone a disposición una unidad de
recogida de cámaras múltiples, de modo preferido una unidad de
filtración adicional o una unidad de cromatografía. Después de la
filtración de los materiales lisados a través de la unidad de
filtración de cámaras múltiples, las soluciones transparentes están
situadas en la cámara de la segunda unidad de filtración o de
cromatografía de cámaras múltiples y son accesibles allí a las
manipulaciones adicionales. Para una etapa adicional de filtración o
cromatografía se necesitan, por lo menos en las formas de
realización determinadas, bombas de vacío adicionales situadas
junto al lado de salida de la unidad de cámaras múltiples en la
segunda posición. Por retirada de la unidad de cámaras múltiples en
la primera posición y desplazamiento de la unidad de cámaras
múltiples desde la segunda a la primera posición, se suprime este
requisito. En una forma de realización especial, el dispositivo
comprende por consiguiente
- -
- medios para la retirada de una unidad de cámaras múltiples desde la primera posición,
- -
- medios para la transferencia de una unidad de cámaras múltiples desde la segunda a la primera posición, y
- -
- medios para la transferencia de una unidad de cámaras múltiples a la segunda posición.
La tercera unidad de cámaras múltiples adicional
incorporada en la segunda posición es, dependiendo de la realización
prevista del procedimiento, una unidad de filtración, una unidad de
cromatografía o una unidad de recogida, todas ellas de cámaras
múltiples.
El dispositivo comprende eventualmente una unidad
de transferencia de cámaras múltiples para la transferencia sin
contaminación de soluciones desde una unidad de cámaras múltiples a
una subsiguiente unidad de cámaras múltiples, y de modo preferido
una unidad de drenaje de cámaras múltiples para la retirada de las
soluciones que se han de desechar, que se aportan a una unidad
colectora de desechos. La unidad de drenaje está acoplada
preferiblemente con un dispositivo de vacío. La unidad de drenaje
y/o la unidad de transferencia están dispuestas preferiblemente de
modo desplazable, realizándose en una posición operativa que los
orificios de entrada de la unidad de drenaje están unidos en lo
esencial herméticamente de manera operativa con las salidas de una
unidad de cámaras múltiples, y en una posición no operativa que se
deja libre un pasaje de líquidos desde el lado de salida de una
unidad de cámaras múltiples hacia el lado de entrada de una
subsiguiente unidad de cámaras múltiples. Por consiguiente, el
dispositivo comprende preferiblemente además unos medios para la
colocación desmontable de la unidad de drenaje de cámaras múltiples
junto al lado de salida de una unidad de cámaras múltiples en las
posiciones primera y/o segunda. Eventualmente, la unión entre el
lado de salida de la unidad de cámaras múltiples y la unidad de
drenaje de cámaras múltiples puede efectuarse a través de la unidad
de transferencia de cámaras múltiples. Asimismo, pueden estar
previstos medios para desplazar una unidad de transferencia de
cámaras múltiples en las posiciones primera y/o segunda entre una
posición operativa y una posición no operativa.
Además, el dispositivo puede comprender medios
para el análisis de sustancias constitutivas de células, tales como
por ejemplo dispositivos de electroforesis y/o espectrómetros, así
como aparatos de control apropiados para ello y/o medios para la
retirada de partes alícuotas desde una unidad de recogida de cámaras
múltiples, y/o para la alimentación de un agente de análisis.
Además, el dispositivo comprende preferiblemente un sistema lógico
(software) que permite el control de por lo menos una etapa del
procedimiento. De modo preferido, el sistema lógico hace posible por
lo menos el control de la temperatura, de la duración de las etapas
de procedimiento, así como de los medios para generar una
diferencia de presiones.
Un objeto adicional del invento es un estuche de
reactivos para la obtención de soluciones con un contenido de
proteínas, a partir de muestras biológicas según el procedimiento
de alto caudal de paso, que comprende por lo menos una unidad de
filtración de cámaras múltiples, así como agentes antiespumantes y/o
por lo menos una unidad de transferencia de cámaras múltiples.
Eventualmente, el estuche de reactivos conforme al invento contiene
una o varias unidades adicionales de cámaras múltiples, por ejemplo
una unidad de recogida de cámaras múltiples.
En una forma de realización especial, el estuche
de reactivos conforme al invento comprende además por lo menos un
reactivo para la lisis de células, preferiblemente para la lisis de
células en unas condiciones que solubilizan a las proteínas.
Eventualmente, el estuche de reactivos comprende además uno o varios
reactivos para la solubilización de proteínas y/o péptidos.
El estuche de reactivos conforme al invento
comprende, en una forma de realización preferida, un material para
cromatografía. El material para cromatografía es, por ejemplo, un
material del tipo de una suspensión, que se presenta en un
recipiente separado y que es dispensado por el usuario en caso
necesario a las cámaras individuales de una unidad de cámaras
múltiples. Preferiblemente, el material para cromatografía se
presenta ya en forma dispensada, es decir en forma de una unidad de
cromatografía de cámaras múltiples. Los materiales para
cromatografía del tipo de membranas se presentan preferiblemente
asimismo en forma de una unidad de cromatografía de cámaras
múltiples para su utilización inmediata en el procedimiento
conforme al invento.
El estuche de reactivos conforme al invento
contiene, además de ello, eventualmente reactivos habituales, tales
como por ejemplo tampones para equilibración y lavado y/o medios
que son necesarios en la realización de etapas del procedimiento,
tales como por ejemplo puntas de pipetas.
El invento se explica con mayor detalle mediante
las Figuras y los Ejemplos siguientes.
La Figura 1 representa una forma de realización
del procedimiento conforme al invento;
la Figura 2 muestra un gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) de CAT
purificada a través de una cromatografía con intercambiadores de
aniones de acuerdo con el Ejemplo 3 mediando utilización de una
suspensión de matriz;
la Figura 3a muestra un gel de
SDS-poliacrilamida de diferentes proteínas de
fusión con 6xHis, purificadas a través de una cromatografía de
afinidad con quelatos metálicos de acuerdo con el procedimiento
conforme al invento según el Ejemplo 6; y
la Figura 3b muestra un gel de
SDS-poliacrilamida de diferentes proteínas de
fusión con 6xHis, purificadas a través de una cromatografía de
afinidad con quelatos metálicos de acuerdo con un procedimiento
habitual según el Ejemplo 6, como comparación.
\newpage
Este Ejemplo muestra la purificación automática
de proteínas a partir de materiales lisados de células de
Escherichia coli (E.coli) a través de un material para
cromatografía (Ni-NTA Superflow) dispensado, en
condiciones nativas y en el formato de 96 cámaras mediando
aplicación de la tecnología de vacío.
Células de E.coli DH5\alpha, que
expresan la proteína
cloramfenicol-acetil-transferasa
(CAT) como proteína de fusión con una marcación de afinidad
(6xHis-CAT) que consta de seis veces el aminoácido
histidina, se cultivaron cada vez en 5 ml de un volumen de cultivo
en bloques de 24 cámaras (volumen de capacidad 10 ml por cámara; en
total 96 tandas) y después de haberse terminado la cultivación se
sedimentaron por centrifugación, el medio de cultivo sobrenadante
se retiró. Todas las siguientes etapas se llevaron a cabo en un
autómata de laboratorio (BioRobot 9600 QIAGEN). En primer lugar, los
sedimentos celulares se recogieron, para la disgregación de células,
cada vez en 1 ml de tampón para lisis (50 mM de NaH_{2}PO_{4},
de pH 8,0, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 200 \mug/ml de
lisozima) y se agitaron para ayudar a una disgregación total.
Mientras tanto, la matriz de afinidad Ni-NTA
Superflow (QIAGEN) se volvió a suspender y se dispensó a las cámaras
de una adicional unidad de filtración de 96 cámaras (50 \mul de
volumen de lecho por cámara), la matriz se equilibró y esta unidad
(placa de Ni-NTA) se colocó en la posición inferior
de una cámara de vacío. En la posición superior, exactamente por
encima de la placa de Ni-NTA, se colocó una unidad
de filtración (p.ej. TurboFilter 96, QIAGEN). Se efectuó la
transferencia de los materiales lisados a la unidad de filtración
TurboFilter 96; a continuación los materiales lisados se cubrieron
cada vez con 100 \mul de etanol (100% a.p. [analíticamente puro])
y se aplicó un vacío. A continuación la unidad
TurboFilter-96 se retiró, la placa de
Ni-NTA que contenía los materiales lisados
transparentes se transfirió a la posición superior de la cámara de
vacío y el bloque de drenaje se colocó en la posición inferior.
Mediante aplicación de un vacío, los materiales lisados
transparentes se aspiraron a través del lecho de la matriz para
cromatografía; durante este proceso se efectúo la fijación de las
proteínas marcadas con 6xHis a la matriz. Por adición en dos veces
de 1 ml de un tampón (50 mM de NaH_{2}PO_{4}, de pH 8,0; 300 mM
de NaCl; 20 mM de imidazol) y por subsiguiente aplicación de un
vacío, las tandas se lavaron. El bloque de drenaje, situado en la
posición inferior de la cámara de vacío, se reemplazó por una placa
de microtitulación. Se efectuó la adición de 300 \mul de un tampón
para elución (50 mM de NaH_{2}PO_{4}, de pH 8,0; 300 mM de
NaCl; 250 mM de imidazol) en las cámaras individuales y una elución
de las proteínas marcadas con 6xHis en las cámaras de la placa de
microtitulación por aplicación de un vacío.
Las concentraciones de las proteínas en las
fracciones de elución de las cámaras 1 a 56 se determinaron por un
análisis de Bradford (Tabla 1). El rendimiento de
6xHis-CAT está situado entre 21 y 240 \mug por
cámara (en el caso de elución en una sola vez con 300 \mul). Las
proteínas purificadas son de homogeneidad aparente, de acuerdo con
una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de 5
\mul de cada fracción de elución y subsiguiente tinción con Azul
Brillante de Coomassie de las bandas de proteínas (análisis con
SDS-PAGE; no mostrado).
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A1 | 64 | C2 | 88 | |
| A2 | 108 | C3 | 84 | |
| A3 | 64 | C4 | 74 | |
| A4 | 240 | C5 | 72 | |
| A5 | 67 | C6 | 91 | |
| A6 | 94 | C7 | 191 | |
| A7 | 77 | C8 | 109 | |
| A8 | 65 | C9 | 70 | |
| A9 | 89 | C10 | 91 | |
| A10 | 102 | C11 | 90 |
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A11 | 61 | C12 | 60 | |
| A12 | 56 | D1 | 84 | |
| B1 | 64 | D2 | 71 | |
| B2 | 111 | D3 | 88 | |
| B3 | 86 | D4 | 93 | |
| B4 | 52 | D5 | 81 | |
| B5 | 90 | D6 | 21 | |
| B6 | 59 | D7 | 98 | |
| B7 | 80 | D8 | 40 | |
| B8 | 111 | D9 | 77 | |
| B9 | 178 | D10 | 62 | |
| B10 | 91 | D11 | 44 | |
| B11 | 104 | D12 | 135 | |
| B12 | 178 | E1 | 54 | |
| C1 | 237 | E2 | 76 | |
| E3 | 71 | E6 | 91 | |
| E4 | 87 | E7 | 84 | |
| E5 | 58 | E8 | 84 |
| Rendimiento [\mug] | |
| Promedio: | 93 |
| Desviación típica | 42 |
Este Ejemplo muestra la purificación automática
de proteínas a partir de materiales lisados de células de
Escherichia coli a través de una membrana de afinidad (con
partículas de sílice Ni-NTA incorporadas en la
polimerización) en condiciones nativas y en el formato de 96
cámaras mediando aplicación de una tecnología de vacío.
El material y el modo de proceder para el
experimento en el que se basa el Ejemplo 2 corresponden a los del
Ejemplo 1, excepto que se había empleado una placa de 96 cámaras
con una membrana de afinidad ya incorporada previamente, para la
fijación de proteínas de fusión con 6xHis. En la membrana se
incorporaron partículas de sílice Ni-NTA
(QIAGEN).
Las concentraciones de proteínas en las
fracciones de elución de las cámaras 1 a 62 se determinaron por un
análisis de Bradford (Tabla 2). El rendimiento de
6xHis-CAT está situado entre 50 y 250 \mug por
cámara (en el caso de elución en una sola vez con 300 \mul). Las
proteínas purificadas son de homogeneidad aparente de acuerdo con
la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de 5
\mul de cada fracción de elución y de una subsiguiente tinción
con Azul Brillante de Coomassie de las bandas de proteínas
(análisis por SDS-PAGE; no mostrado).
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A1 | 250 | C3 | 202 | |
| A2 | 169 | C4 | 151 | |
| A3 | 174 | C5 | 196 | |
| A4 | 149 | C6 | 134 | |
| A5 | 179 | C7 | 145 | |
| A6 | 93 | C8 | 128 | |
| A7 | 152 | C9 | 147 | |
| A8 | 131 | C10 | 184 | |
| A9 | 171 | C11 | 137 | |
| A10 | 156 | C12 | 103 | |
| A11 | 123 | D1 | 91 | |
| A12 | 106 | D2 | 117 | |
| B1 | 225 | D3 | 168 | |
| B2 | 176 | D4 | 90 | |
| B3 | 148 | D5 | 73 | |
| B4 | 153 | D6 | 131 | |
| B5 | 148 | D7 | 137 | |
| B6 | 143 | D8 | 117 | |
| B7 | 129 | D9 | 160 | |
| B8 | 137 | D10 | 113 | |
| B9 | 126 | D11 | 145 | |
| B10 | 130 | D12 | 93 | |
| B11 | 246 | E1 | 158 | |
| B12 | 102 | E2 | 127 | |
| C1 | 129 | E3 | 166 | |
| C2 | 190 | E4 | 49 | |
| E5 | 121 | E10 | 147 | |
| E6 | 59 | E11 | 130 |
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| E7 | 170 | E12 | 129 | |
| E8 | 98 | F1 | 172 | |
| E9 | 145 | F2 | 131 |
| Rendimiento [\mug] | |
| Promedio: | 142 |
| Desviación típica | 39 |
Este Ejemplo muestra la purificación automática
de la proteína CAT a partir de materiales lisados de células de
Escherichia coli a través de un material para cromatografía
con intercambiador de iones (Q-Sepharose Fast Flow)
dispensado, en condiciones nativas y en el formato de 96 cámaras
mediando aplicación de la tecnología de vacío.
El material y el modo de proceder para el
experimento en el que se basa el Ejemplo 3 corresponden a los del
Ejemplo 1 con una modificación. En este caso se utilizó el hecho de
que la
cloramfenicol-acetil-transferasa
(CAT) se puede purificar por medio de una cromatografía con
intercambiador de aniones. En el experimento aquí descrito, se
empleó una placa de 96 cámaras con suspensión dispensada de la
matriz con intercambiador de aniones Q-Sepharose
Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) para la fijación de la
proteína recombinante (tampón para lisis: 50 mM de Tris HCl, 25 mM
de NaCl, 200 \mug/ml de lisozima, de pH 7,0; tampón para
fijación/tampón para lavado: 50 mM de Tris HCl, 25 mM de NaCl, de
pH 7,0; tampón para elución: 50 mM de Tris HCl, 500 mM de NaCl, de
pH 7,0).
Las concentraciones de proteínas en las
fracciones de elución de las cámaras 1 a 62 se determinaron
mediante un análisis de Bradford (Tabla 3). 5 \mul de cada
fracción se cargaron sobre un gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE, 15%).
Las bandas de proteínas en el gel se hicieron visibles mediante una
tinción con Azul Brillante de Coomassie (Figura 2). La CAT se pudo
enriquecer después de ello hasta una pureza de aproximadamente 40
%. El rendimiento de CAT está situado después de ello entre 40 y 120
\mug por cámara (en el caso de una elución en una sola vez con
200 \mul).
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A1 | 152 | C3 | 152 | |
| A2 | 125 | C4 | 266 | |
| A3 | 116 | C5 | 157 | |
| A4 | 151 | C6 | 222 | |
| A5 | 206 | C7 | 138 | |
| A6 | 127 | C8 | 163 | |
| A7 | 213 | C9 | 125 | |
| A8 | 194 | C10 | 166 | |
| A9 | 215 | C11 | 159 | |
| A10 | 121 | C12 | 108 |
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A11 | 107 | D1 | 149 | |
| A12 | 162 | D2 | 146 | |
| B1 | 156 | D3 | 141 | |
| B2 | 110 | D4 | 132 | |
| B3 | 134 | D5 | 117 | |
| B4 | 162 | D6 | 240 | |
| B5 | 213 | D7 | 192 | |
| B6 | 209 | D8 | 209 | |
| B7 | 161 | D9 | 147 | |
| B8 | 133 | D10 | 206 | |
| B9 | 135 | D11 | 153 | |
| B10 | 176 | D12 | 112 | |
| B11 | 147 | E1 | 118 | |
| B12 | 108 | E2 | 169 | |
| C1 | 98 | E3 | 165 | |
| C2 | 158 | E4 | 301 | |
| E5 | 158 | E10 | 149 | |
| E6 | 228 | E11 | 204 | |
| E7 | 301 | E12 | 110 | |
| E8 | 191 | F1 | 172 | |
| E9 | 226 | F2 | 131 |
| Rendimiento [\mug] | |
| Promedio: | 165 |
| Desviación típica | 46 |
Este Ejemplo describe la purificación de
proteínas de fusión con 6xHis a partir de materiales lisados de
células de la levadura Saccharomyces cerevisiae a través de un
material para cromatografía (Ni-NTA Superflow)
dispensado, en condiciones nativas y en el formato de 96 cámaras
mediando aplicación de la tecnología de vacío.
El material y el modo de proceder para el
experimento en el que se basa el Ejemplo 4 corresponden a los del
Ejemplo 1, con la modificación de que en el experimento aquí
descrito se había purificado la proteína
FBA1-aldolasa marcada con 6xHis, expresada en
células de Saccharomyces cerevisiae eucarióticas. Para ello las
condiciones de lisis se modificaron de la siguiente manera: Las
células cultivadas en bloques de 24 cámaras, cada vez en 5 ml de un
medio de cultivo, se volvieron a suspender en un tampón para lisis
(20 mM de mezcla de KH_{2}PO_{4} y K_{2}HPO_{4}, de pH 7,4;
1,2 M de sorbitol, 1 mg/ml de zimoliasa), y para ayudar a la
formación de esferoplastos se sacudieron durante 45 minutos. A
continuación se añadieron un agente inhibidor de proteasa, 300 mM de
NaCl así como 0,4% (v/v) de Triton X-100 para lisis
de los esferoplastos y las tandas de lisis se transfirieron para su
clarificación a una unidad de filtración (p.ej.
Turbo-Filter 96, QIAGEN). Todas las siguientes
etapas se llevaron a cabo tal como se ha descrito para el Ejemplo
1.
Las concentraciones de proteínas en las
fracciones de elución se determinaron mediante un análisis de
Bradford (Tabla 4). El rendimiento de
6x-His-FBA1-aldolasa
estaba situado entre 10 y 25 \mug por cámara. Las proteínas
purificadas son de homogeneidad aparente según un análisis por
SDS-PAGE (no mostrado).
| Cámara | Rendimiento [\mug] | Cámara | Rendimiento [\mug] | |
| A1 | 15 | E1 | 16 | |
| A2 | 16 | E2 | 16 | |
| A3 | 11 | E3 | 12 | |
| A4 | 21 | E4 | 15 | |
| A5 | 13 | E5 | 17 | |
| A6 | 19 | E5 | 17 | |
| B1 | 16 | F1 | 15 | |
| B2 | 24 | F2 | 16 | |
| B3 | 8 | F3 | 22 | |
| B4 | 9 | F4 | 10 | |
| B5 | 17 | F5 | 19 | |
| B6 | 15 | F6 | 14 | |
| C1 | 16 | G1 | 12 | |
| C2 | 10 | D2 | 12 | |
| C3 | 16 | G2 | 8 | |
| C4 | 12 | D3 | 21 | |
| C5 | 11 | G3 | 15 | |
| C6 | 17 | D4 | 18 | |
| D1 | 18 | H1 | 11 | |
| D2 | 14 | H2 | 16 | |
| D3 | 17 | H3 | 10 | |
| D4 | 16 | H4 | 16 | |
| D5 | 18 | H5 | 13 | |
| D6 | 15 | H6 | 19 |
| Rendimiento [\mug] | |
| Promedio: | 15 |
| Desviación típica | 4 |
Este Ejemplo muestra la purificación automática
de proteínas a partir de materiales lisados de células de
Escherichia coli a través de un material para cromatografía
(Ni- NTA Superflow) dispensado en condiciones desnaturalizadoras y
en el formato de 96 cámaras, mediando aplicación de la tecnología
de vacío.
En células E.coli M15/pREP4, que expresan
tiorredoxina como proteína de fusión con una marcación de afinidad
que consta de seis veces el aminoácido histidina (6xHis), se
cultivaron cada vez en 5 ml de volumen de cultivo en bloques de 24
cámaras (volumen de capacidad 10 ml por cada cámara; en total 96
tandas) y después de haberse terminado la cultivación se
sedimentaron por centrifugación; el medio de cultivo sobrenadante
se retiró. Todas las siguientes etapas se llevaron a cabo en un
autómata de laboratorio (BioRobot 9600, QIAGEN). Primeramente, los
sedimentos celulares, para la disgregación de las células, se
recogieron cada vez en 1 ml de tampón para lisis (8 M de urea, 100
mM de NaH_{2}PO_{4}, 10 mM de Tris HCl, de pH 8,0) y para ayudar
a una disgregación total se sacudieron durante 30 min. Mientras
tanto, la matriz de afinidad Ni-NTA Superflow se
volvió a suspender y se dispensó a las cámaras de una unidad
adicional de 96 cámaras (50 \mul de volumen de lecho por cada
cámara), la matriz se equilibró y esta unidad (placa de
Ni-NTA) se colocó en la posición inferior de una
cámara de vacío. En la posición superior, exactamente por encima de
la placa de Ni-NTA, se colocó una unidad de
filtración (p.ej. TurboFilter 96, QIAGEN). Se efectuó la
transferencia de los materiales lisados a la unidad de filtración
TurboFilter 96; a continuación los materiales lisados se cubrieron
cada vez con 100 \mul de etanol (a.p., analíticamente puro) y se
aplicó un vacío. Después de una filtración completa, se retiró la
unidad TurboFilter 96, la placa de Ni-NTA, que
contenía los materiales lisados transparentes, se transfirió a la
posición superior de la cámara de vacío y el bloque de drenaje se
colocó en la posición inferior. Por aplicación de un vacío, los
materiales lisados transparentes se aspiraron a través del lecho de
la matriz de cromatografía; durante este proceso se efectuó la
fijación de las proteínas marcadas con 6xHis a la matriz. Por
adición en dos veces de 1 ml del tampón para lavado 1 (8 M de urea,
100 mM de NaH_{2}PO_{4}, 10 mM de Tris HCl, de pH 8,0) y la
adición en una sola vez del tampón para lavado 2 (8 M de urea, 100
mM de NaH_{2}PO_{4}, 10 mM de Tris HCl, de pH 6,3) y
subsiguiente aplicación de un vacío, las tandas se lavaron. El
bloque de drenaje situado en la posición inferior de la cámara de
vacío se reemplazó por una placa de microtitulación. Se efectuaron
una adición de cada vez 300 \mul de un tampón para elución (8 M
de urea, 100 mM de NaH_{2}PO_{4}, 10 mM de Tris HCl, de pH 4,5)
en las cámaras individuales y la elución de las proteínas marcadas
con 6xHis en las cámaras de la placa de microtitulación por
aplicación de un vacío.
Las concentraciones de proteínas en las
fracciones de elución de las cámaras 1 a 54 se determinaron
mediante un análisis de Bradford (Tabla 5). El rendimiento de
proteína marcada con 6xHis está situado entre 86 y 252 \mug por
pocillo. Las proteínas purificadas son de homogeneidad aparente de
acuerdo con el análisis por SDS-PAGE (no
mostrado).
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A1 | 110 | C2 | 118 | |
| A2 | 131 | C3 | 147 | |
| A3 | 185 | C4 | 132 | |
| A4 | 198 | C5 | 147 | |
| A5 | 100 | C6 | 118 | |
| A6 | 114 | C7 | 155 | |
| A7 | 192 | C8 | 180 | |
| A8 | 156 | C9 | 171 | |
| A9 | 248 | C10 | 186 | |
| A10 | 180 | C11 | 152 |
| Pocillo | Rendimiento [\mug] | Pocillo | Rendimiento [\mug] | |
| A11 | 161 | C12 | 145 | |
| A12 | 160 | D1 | 112 | |
| B1 | 129 | D2 | 174 | |
| B2 | 130 | D3 | 152 | |
| B3 | 143 | D4 | 156 | |
| B4 | 197 | D5 | 111 | |
| B5 | 142 | D6 | 97 | |
| B6 | 221 | D7 | 216 | |
| B7 | 203 | D8 | 220 | |
| B8 | 157 | D9 | 171 | |
| B9 | 182 | D10 | 155 | |
| B10 | 153 | D11 | 151 | |
| B11 | 167 | D12 | 141 | |
| B12 | 156 | E1 | 104 | |
| C1 | 131 | E2 | 153 | |
| E3 | 140 | E8 | 174 | |
| E4 | 137 | E9 | 115 | |
| E5 | 86 | E10 | 196 | |
| E6 | 183 | E11 | 196 | |
| E7 | 252 | E12 | 143 | |
| F1 | 150 | |||
| F2 | 159 |
| Rendimiento [\mug] | |
| Promedio: | 156 |
| Desviación típica | 36 |
Este Ejemplo describe la purificación automática
de proteínas a partir de materiales lisados de células de
Escherichia coli a través de un material para cromatografía
(Ni- NTA Superflow) dispensado, en condiciones desnaturalizadoras y
en el formato de 96 cámaras mediando aplicación de la tecnología de
vacío y mediando inclusión de medidas para evitar contaminaciones
cruzadas, en comparación con una purificación, que se había llevado
a cabo sin las medidas descritas.
El material y el modo de proceder para el
experimento en el que se basa el Ejemplo 6 corresponden a los del
Ejemplo 5, excepto que se cultivaron diferentes clones que
expresaban proteínas de fusión con 6xHis cada vez en 5 ml del medio
y se trataron paralelamente. Las medidas, que se adoptaron para
evitar las contaminaciones cruzadas (cubrimiento con etanol,
utilización de un bloque de drenaje) se describen en el Ejemplo
4.
En cada caso 5 \mul de las fracciones de
elución indicadas se calentaron a 95ºC durante 4 min y se
analizaron por SDS-PAGE y subsiguiente tinción con
Coomassie de las bandas de proteínas (Figura 3.). El modelo de
bandas de las fracciones de elución en el caso de una purificación
mediando utilización del procedimiento conforme al invento (Figura
3a) muestra que en las fracciones aparece en cada caso solamente una
banda que corresponde a una de las proteínas de fusión con 6xHis,
por consiguiente mediante este método se pueden excluir
contaminaciones cruzadas. En comparación con ello en el experimento
testigo se pueden identificar en parte varias bandas
correspondientes a una proteína de fusión con 6xHis (Figura 3b, con
bandas caracterizadas por \uparrow).
Claims (31)
1. Procedimiento para la obtención de soluciones
transparentes que contienen sustancias constitutivas de células a
partir de muestras biológicas por el procedimiento de alto caudal
de paso, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner a disposición varias soluciones con un contenido de proteínas, que contienen constituyentes insolubles, en cámaras separadas de una unidad de filtración de cámaras múltiples,
- (b)
- retirar constituyentes insolubles por filtración de las soluciones a través de la unidad de filtración de cámaras múltiples, mediando aplicación de una diferencia de presiones, realizándose que por adición de un agente antiespumante a los materiales lisados de células y/o por utilización de una unidad de transferencia entre el lado de salida de la unidad de filtración de cámaras múltiples y el lado de entrada de los recipientes colectores, se impide una contaminación cruzada de cámaras contiguas, y
- (c)
- recoger los materiales filtrados individuales, en cada caso por separado, dentro de recipientes colectores.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1,
caracterizado porque
el agente antiespumante se selecciona entre
alcoholes C1-C6 primarios, secundarios o
terciarios, agentes antiespumantes silicónicos, agentes
antiespumantes no silicónicos, agentes antiespumantes sobre una
base vegetal, alcanos de cadena larga,
polipropilen-glicoles,
polietilen-glicoles y sus mezclas.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2,
caracterizado porque
las soluciones que contienen proteínas de acuerdo
con (a) son materiales lisados en bruto de células.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3,
caracterizado porque
la lisis de las células se lleva a cabo en cada
caso en las cámaras separadas de la unidad de filtración de cámaras
múltiples.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
el tamaño de poros de los filtros en la unidad de
filtración de cámaras múltiples disminuye en la dirección de
circulación del material filtrado a través del filtro.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la obtención de
sustancias constitutivas de células a partir de los materiales
filtrados de acuerdo con (c).
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
6, que comprende por lo menos una etapa de filtración adicional.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
6 ó 7, que comprende por lo menos una etapa de separación por
cromatografía y/o una etapa de precipitación.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
8, que comprende una etapa de separación por cromatografía a través
de una matriz de intercambio de iones o de una matriz de
afinidad.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9,
caracterizado porque
la matriz de afinidad es una matriz de afinidad
con un quelato metálico.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10,
caracterizado porque
la matriz de afinidad con un quelato metálico es
una matriz de Ni-NTA.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 11,
caracterizado porque
la matriz es una suspensión.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 a 12, que comprende además por lo menos una etapa
de lavado.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 a 13,
caracterizado porque
la separación de los líquidos se lleva a cabo por
aplicación de una diferencia de presiones.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14,
caracterizado porque
los líquidos que se han de desechar se retiran
mediando utilización de una unidad de drenaje.
16. Procedimiento con una de las reivindicaciones
6 a 15, que comprende además por lo menos una etapa para el análisis
de las sustancias constitutivas de las células.
17. Procedimiento con una de las reivindicaciones
6 a 16,
caracterizado porque
las sustancias constitutivas de las células se
recogen en una unidad de cámaras múltiples.
18. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 a 17,
caracterizado porque
las sustancias constitutivas de las células se
escogen entre péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos y
metabolitos.
19. Utilización de un dispositivo, que
comprende
- (i)
- medios para retener una unidad de cámaras múltiples en una primera posición,
- (ii)
- medios para retener una unidad de cámaras múltiples en la segunda posición,
- (iii)
- medios para aplicar una diferencia de presiones entre el lado de entrada y el lado de salida de por lo menos la unidad de cámaras múltiples en la primera posición, y
- (iv)
- medios para la adición de reactivos a cámaras individuales de por lo menos la unidad de cámaras múltiples en la primera posición,
para la obtención de soluciones transparentes que
contienen proteínas a partir de muestras biológicas.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19,
caracterizada porque
las unidades de cámaras múltiples están
orientadas de tal manera que las salidas de las cámaras de una
unidad en la primera posición se alinean con las entradas en las
cámaras de una unidad en la segunda posición.
21. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19 ó 20,
caracterizada porque
el dispositivo comprende:
- (i)
- medios para la retirada de una unidad de cámaras múltiples desde la primera posición,
- (ii)
- medios para la transferencia de una unidad de cámaras múltiples desde la segunda a la primera posición, y
- (iii)
- medios para la transferencia de una unidad de cámaras múltiples a la segunda posición.
22. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 19 a 21,
caracterizada porque
el dispositivo comprende además una unidad de
transferencia de cámaras múltiples.
23. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 19 a 22,
caracterizada porque
el dispositivo comprende además una unidad de
drenaje de cámaras múltiples.
24. Utilización de acuerdo con la reivindicación
23,
caracterizada porque
el dispositivo comprende además medios para la
colocación desmontable de la unidad de drenaje de cámaras múltiples
junto al lado de salida de una unidad de cámaras múltiples en la
primera y/o la segunda posiciones.
25. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 19 a 24,
caracterizada porque
el dispositivo comprende además medios para el
análisis de sustancias constituyentes de células.
26. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones 19 a 25,
caracterizada porque
el dispositivo comprende además un programa
lógico (software) para el control de por lo menos una etapa del
procedimiento.
27. Estuche de reactivos para la obtención de
soluciones que contienen proteínas a partir de muestras biológicas
según el procedimiento de alto caudal de paso, que comprende:
- (a)
- por lo menos una unidad de filtración de cámaras múltiples,
- (b)
- un agente antiespumante y/o por lo menos una unidad de transferencia de cámaras múltiples, y
- (c)
- eventualmente por lo menos una unidad de recogida de cámaras múltiples.
28. Estuche de reactivos de acuerdo con la
reivindicación 27, que comprende además por lo menos un reactivo
para la lisis de células.
29. Estuche de reactivos de acuerdo con la
reivindicación 27 ó 28, que comprende además por lo menos un
reactivo para la solubilización de proteínas y/o péptidos.
30. Estuche de reactivos de acuerdo con una de
las reivindicaciones 27 a 29, que comprende además un material para
cromatografía.
31. Estuche de reactivos de acuerdo con la
reivindicación 30, en el que el material para cromatografía se
presenta en forma de por lo menos una unidad de cromatografía de
cámaras múltiples.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19937187A DE19937187A1 (de) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Automatisierte Proteinreinigung im Multiwellformat durch Vakuumfiltration |
| DE19937187 | 1999-08-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2202153T3 true ES2202153T3 (es) | 2004-04-01 |
Family
ID=7917472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00949438T Expired - Lifetime ES2202153T3 (es) | 1999-08-06 | 2000-08-02 | Purificacion automatica de proteinas en formato de multiples pocillos mediante filtracion en vacio. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6864100B1 (es) |
| EP (1) | EP1206483B1 (es) |
| JP (1) | JP4786094B2 (es) |
| AT (1) | ATE244724T1 (es) |
| DE (2) | DE19937187A1 (es) |
| DK (1) | DK1206483T3 (es) |
| ES (1) | ES2202153T3 (es) |
| WO (1) | WO2001010886A2 (es) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1432822B1 (en) * | 2001-09-10 | 2007-05-23 | EMD Biosciences, Inc. | Method for recovering and analyzing a cellular component of cultured cells without having to harvest the cells first |
| US20030087293A1 (en) * | 2001-10-23 | 2003-05-08 | Decode Genetics Ehf. | Nucleic acid isolation method and apparatus for performing same |
| DE10241938A1 (de) * | 2002-09-10 | 2004-03-25 | Noxxon Pharma Ag | Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden |
| US7572578B2 (en) | 2003-09-09 | 2009-08-11 | Fujifilm Corporation | Method for isolating and purifying a nucleic acid |
| US7240572B2 (en) | 2004-02-18 | 2007-07-10 | Millipore Corporation | Vacuum assisted affinity chromatography device and method |
| GB0412301D0 (en) * | 2004-06-02 | 2004-07-07 | Diagenic As | Product and method |
| WO2006015012A1 (en) * | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Protedyne Corporation | Method and apparatus for applying pressure diferential to multi-well plate |
| US20060105391A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Promega Corporation | Device and method for separating molecules |
| US20060105349A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Promega Corporation | Device and method for purification of biological materials |
| DE102005001362A1 (de) * | 2005-01-11 | 2006-07-20 | Protagen Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung von Proteinen |
| CA2649633C (en) * | 2006-06-06 | 2012-11-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Differential hemolysis of a whole blood sample |
| US8703492B2 (en) | 2007-04-06 | 2014-04-22 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Open platform hybrid manual-automated sample processing system |
| US8357538B2 (en) * | 2007-04-06 | 2013-01-22 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Automated assay and system |
| DE102008030142A1 (de) * | 2008-06-27 | 2009-12-31 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Proteinaufreinigung unter denaturierenden Bedingungen |
| US9953141B2 (en) | 2009-11-18 | 2018-04-24 | Becton, Dickinson And Company | Laboratory central control unit method and system |
| US8307490B2 (en) * | 2010-02-24 | 2012-11-13 | Allway Tools, Inc. | Multifunction caulk tool |
| EP2371731A1 (de) * | 2010-03-31 | 2011-10-05 | Roche Diagnostics GmbH | Reagenz-Kit mit Transportsicherung |
| US9157838B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-13 | Emd Millipore Corporation | Chromatography apparatus and method |
| US9084994B2 (en) * | 2011-09-09 | 2015-07-21 | Orochem Technologies, Inc. | Apparatus and method for parallel collection and analysis of the proteome and complex compositions |
| WO2013056253A1 (en) * | 2011-10-15 | 2013-04-18 | The Regents Of The University Of California | High throughput instrumentation to screen cells and particles based on their mechanical properties |
| JP6262152B2 (ja) | 2012-02-03 | 2018-01-17 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | 分子診断試験の分布及び試験間のコンパチビリティ判断のための外部ファイル |
| IN2014DN09302A (es) | 2012-04-13 | 2015-07-10 | Becton Dickinson Co | |
| EP2687592A1 (de) * | 2012-07-20 | 2014-01-22 | greenovation Biotech GmbH | Filtration von Zellkulturüberständen |
| US9423234B2 (en) | 2012-11-05 | 2016-08-23 | The Regents Of The University Of California | Mechanical phenotyping of single cells: high throughput quantitative detection and sorting |
| US8975060B2 (en) * | 2012-11-30 | 2015-03-10 | Qvella Corporation | Method for pretreatment of microbial samples |
| US9707555B2 (en) | 2012-11-30 | 2017-07-18 | Qvella Corporation | Method for pretreatment of microbial samples |
| US10596570B2 (en) | 2014-05-16 | 2020-03-24 | Qvella Corporation | Apparatus, system and method for performing automated centrifugal separation |
| US9758755B2 (en) | 2015-10-23 | 2017-09-12 | Life Technologies Corporation | Filter-based method for efficient capture of lysis of suspended cells |
| WO2017069781A1 (en) * | 2015-10-23 | 2017-04-27 | Life Technologies Corporation | Filter-based system and method for efficient capture and lysis of suspended cells |
| KR102599895B1 (ko) * | 2017-03-22 | 2023-11-07 | 언체인드 랩스 | 버퍼 교환을 위한 샘플 플레이트들 및 제조 방법 |
| EP3662286A1 (en) * | 2017-08-03 | 2020-06-10 | Fraunhofer Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Means and methods for protein quantification |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4364263A (en) * | 1980-09-15 | 1982-12-21 | Burroughs Wellcome Co. | High pressure liquid chromatographic system |
| US4948442A (en) * | 1985-06-18 | 1990-08-14 | Polyfiltronics, Inc. | Method of making a multiwell test plate |
| JPS62298536A (ja) * | 1986-06-17 | 1987-12-25 | Green Cross Corp:The | 生理活性物質の自動精製方法および自動精製装置 |
| US4895706A (en) * | 1986-10-28 | 1990-01-23 | Costar Corporation | Multi-well filter strip and composite assemblies |
| US4902481A (en) * | 1987-12-11 | 1990-02-20 | Millipore Corporation | Multi-well filtration test apparatus |
| US5108704A (en) * | 1988-09-16 | 1992-04-28 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Microfiltration apparatus with radially spaced nozzles |
| IT1226210B (it) | 1988-12-22 | 1990-12-21 | Claudio Schneider | Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna |
| FR2663859B1 (fr) * | 1990-06-28 | 1993-07-16 | Millipore Sa | Support de membrane filtrante et son entonnoir pour la filtration de liquides en vue de leur analyse microbiologique. |
| US5141719A (en) * | 1990-07-18 | 1992-08-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multi-sample filtration plate assembly |
| IT1247964B (it) * | 1991-06-03 | 1995-01-05 | Ministero Dell Uni E Della | Processo per la preparazione enzimatica di derivati cefalosporanici |
| DE4139664A1 (de) | 1991-12-02 | 1993-06-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren |
| DE4230089A1 (de) | 1992-09-09 | 1994-03-10 | Abimed Analysen Technik Gmbh | Laborroboter zur automatischen Aufarbeitung von synthetischen Peptiden |
| US6146854A (en) * | 1995-08-31 | 2000-11-14 | Sequenom, Inc. | Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids |
| US5695639A (en) * | 1996-01-30 | 1997-12-09 | Micron Separations, Inc. | Vacuum filter funnel |
| AU9786798A (en) * | 1997-10-10 | 1999-05-03 | Biosepra Inc. | Aligned multiwell multiplate stack and method for processing biological/chemicalsamples using the same |
| DE19834584A1 (de) * | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Qiagen Gmbh | Vorrichtung zur magnetischen Aufreinigung von biologischen Materialien |
-
1999
- 1999-08-06 DE DE19937187A patent/DE19937187A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-08-02 DE DE50002853T patent/DE50002853D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-02 AT AT00949438T patent/ATE244724T1/de active
- 2000-08-02 DK DK00949438T patent/DK1206483T3/da active
- 2000-08-02 EP EP00949438A patent/EP1206483B1/de not_active Revoked
- 2000-08-02 ES ES00949438T patent/ES2202153T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-02 JP JP2001515694A patent/JP4786094B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-02 WO PCT/EP2000/007478 patent/WO2001010886A2/de active IP Right Grant
- 2000-08-02 US US10/049,003 patent/US6864100B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19937187A1 (de) | 2001-03-01 |
| WO2001010886A3 (de) | 2001-09-07 |
| WO2001010886A2 (de) | 2001-02-15 |
| JP2003506456A (ja) | 2003-02-18 |
| ATE244724T1 (de) | 2003-07-15 |
| JP4786094B2 (ja) | 2011-10-05 |
| EP1206483B1 (de) | 2003-07-09 |
| EP1206483A2 (de) | 2002-05-22 |
| DE50002853D1 (de) | 2003-08-14 |
| DK1206483T3 (da) | 2003-10-27 |
| US6864100B1 (en) | 2005-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2202153T3 (es) | Purificacion automatica de proteinas en formato de multiples pocillos mediante filtracion en vacio. | |
| US7105304B1 (en) | Pressure-based mobility shift assays | |
| Wang et al. | Digital microfluidics: A promising technique for biochemical applications | |
| US20050221385A1 (en) | Pressure based mobility shift assays | |
| US6331431B1 (en) | Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells | |
| KR101005924B1 (ko) | 핵산 추출 장치 | |
| US7977279B2 (en) | Differential phage capture proteomics | |
| Maramorosch et al. | Methods in Virology: Volume V | |
| US20030007897A1 (en) | Pipette tips | |
| US6458275B1 (en) | Multi-well equilibrium dialysis system | |
| US20060144707A1 (en) | Isolation of sperm cells from other biological materials using microfabricated devices and related methods thereof | |
| KR20100001827A (ko) | 핵산 추출 방법 | |
| CN102770769B (zh) | 旋转柱系统和方法 | |
| CA2404075C (en) | Method and apparatus for processing substances in a single container | |
| US8758706B2 (en) | Device for receiving, treating, and storing small volume samples | |
| ES2260016T3 (es) | Estuche para llevar a cabo reacciones bioquimicas con un elevado rendimiento. | |
| US20030213740A1 (en) | Multi-well equilibrium dialysis systems | |
| Krcmova et al. | Microplates in liquid chromatography–New solution in clinical research?–A review | |
| CN1777674B (zh) | 高通量蛋白质合成系统及使该系统自动运行的合成装置 | |
| US20200378958A1 (en) | Device and Method for Sample Isolation | |
| JP2003517582A (ja) | 充填が少なくとも一つの緩衝空間に関連づけられた分析カード | |
| Kwasny et al. | Microtechnologies enable cytogenetics | |
| JP2005526498A (ja) | 全細胞パニングのための方法および装置 | |
| JP2006342154A (ja) | タンパク質分画デバイス |