JP2003506456A - マルチウェルにおける減圧濾過による自動タンパク質精製 - Google Patents

マルチウェルにおける減圧濾過による自動タンパク質精製

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、不溶性成分を含有する複数のタンパク質含有溶液をマルチチャンバ濾過ユニットの個々のチャンバ中に調製し、圧力差をかけ、マルチチャンバ濾過ユニットを通してその溶液を濾過することによって、不溶性成分を除去すると同時に、隣接チャンバ間の相互汚染を化学的および／または機械的手段によって防止し、個々の濾液を回収容器に別々に回収する段階を含む、生物サンプルから細胞内容物を含有する清澄な溶液をハイスループット法で得る方法および試薬キット、ならびに得られた清澄な溶液から細胞内容物を回収する方法に関する。本発明はさらに、生物サンプルから清澄なタンパク質含有溶液を回収する装置の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ハイスループット法で生物サンプルから細胞内容物を含有する清澄
な溶液を得て、その得られた清澄な溶液から細胞内容物を回収する方法および試
薬キットに関する。本発明はさらに、タンパク質を含有する清澄な溶液を回収す
るための自動装置の使用に関する。
【０００２】 生化学および分子生物学分野においては、特にスクリーニングで、所望のクロ
ーンを同定するため、または例えば生物サンプルの細胞内容物の存在もしくは含
有量を決定するために、さらに綿密に多数の生物サンプルを検査することがしば
しば必要とされる。費やす時間、そのためのコストおよびエラーの可能性を低減
するために、手順を単純化するための方法またはシステムが過去に開発されてき
た。作業負荷を低減することを目的とする１つのアプローチは、マイクロタイタ
ープレート、例えばこれに適したマルチピペットもしくはマイクロタイタープレ
ートを保持することが可能なロータインサート（ｒｏｔｏｒ ｉｎｓｅｒｔ）な
ど、多数のサンプルの同時処理を可能にするシステムを提供することにあった。
他のアプローチでは、例えば適切なロボットを用いることによって、個々のプロ
セス段階を可能な限り自動化することに着手している。
【０００３】 フェレイセン（Felleisen）等(Biotechniques 20, 616-620(1996))は、組換え
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質を９６穴フォーマットで精
製する方法を記述している。この方法では、従来の手法で調製し、９６穴プレー
トのウェル中に配置した清澄な細胞ライセートから始まり、上清中に含有される
ＭＢＰ融合タンパク質をマルトース被覆表面に結合させ、過剰のマルトースまた
は変性剤を添加することによって、そのＭＢＰ融合タンパク質を溶出する。この
方法の不利な点は、清澄な細胞ライセートを遠心分離によって調製するため、自
動化されておらず、かつ自動化できないことである。この方法は、変性条件下で
は使用できず、未変性条件下でのみ使用することが可能であり、低収量となる（
１ウェルにつき約２μｇ）。
【０００４】 ベル（Bell）等(http://www.apbiotech.com/publications/LSN-1-5/gst-micro
.htm, 1999)は、２４までの組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）融合タンパク質を同時精製する方法を記述している。清澄な細胞ライセート
を遠心分離によって調製し、個々のミクロクロマトグラフィーカラムに加える。
それに続いて、遠心分離するかまたは減圧することによって、結合および洗浄ス
テップを行う。溶出は、還元されたグルタチオンを個々の微量反応容器に加える
ことによって行う。この方法の不利な点は、清澄な細胞可溶化物を遠心分離によ
って調製するため、自動化されておらず、かつ自動化できないことである。この
プロセスは、未変性条件下でのみ行うことが可能であり、２４サンプルのみを同
時処理することができる。さらに、個々の反応容器を使用するため、混同を生じ
る可能性が高い。
【０００５】 シェアー（Sheer）およびピット（Pitt）(構造解析のためのタンパク質及びベ
プチドのハイスループットサンプル調製（High Throughput Sample Preparation
of Proteins and Peptides for Structural Characterization）, Poster Nr.4
46-0T, 13-15 July 1997, 11th Symposium of the Protein Society, Boston, M
A)は、「マルチスクリーンカラムローダー」を用いて、乾燥粉末クロマトグラフ
ィー物質を９６穴マイクロタイタープレートに充填する方法を記述している。物
質を膨潤させ、平衡化した後、クロマトグラフィーによって９６バッチを同時処
理することが可能であり、そのすべての段階が遠心分離によって行われる。この
方法は、クロマトグラフィー精製にのみ適用され、サンプルの調製には適用され
ない。
【０００６】 上記の文書には、同時バッチでのタンパク質の精製が記載されているが、記載
の形式ですべてが自動化されているわけではなく、かつ自動化することもできな
い。使用する出発原料は、各ケースにおいて清澄な細胞ライセートであり、従来
の手法、例えば個々のサンプルを遠心分離し、上清を除去することによって生成
されている。これは、非常に多くの取り扱い段階を必要とし、したがって非常に
時間がかかり、サンプルを混同する可能性が生じる。
【０００７】 ドイツ特許第４２３００８９号には、固相合成から得た３０までの合成ペプチ
ドを全自動で処理する実験用ロボットが記載されている。例えば、細胞または細
胞抽出物などの生物素材の処理は開示されていない。
【０００８】 欧州特許第Ａ−０３７６０８０号には、遠心分離段階を用いることなく、ＤＮ
Ａを抽出および精製する方法が記載されている。特にハイスループット法での多
数のサンプルの同時処理は開示されていない。
【０００９】 欧州特許第Ａ−０２４９９３２号には、プロセス規模で生理活性物質を自動精
製する方法が開示されている。この方法は、分離する目的物質よりも低い分子量
を有する物質を分別するマクロ濾過、限外濾過と、アフィニティークロマトグラ
フィー段階による細胞または細胞成分の分離に基づくものである。特にハイスル
ープット法による物質の同時精製は開示されていない。
【００１０】 上記の欧州特許出願には、細胞もしくは細胞懸濁液からＤＮＡまたはタンパク
質を精製する、自動化可能な方法が記載されている。しかしながら、ハイスルー
プット法ではなく、個々のサンプルからこれらの物質を生成する方法のみが開示
されており、したがって、ハイスループットの適用で生じる特殊な状況は考慮に
入れられていない。
【００１１】 各サンプル間の間隔が狭いため、ハイスループットの適用では、隣接するウェ
ルまたはチャンバからの溶液による相互汚染という考慮すべき問題がある。特に
濾過する目的の溶液が、激しく泡立つ傾向がある場合、特にマルチチャンバ濾過
ユニットを用いた濾過段階でこの可能性がある。この問題は、細胞培養液から清
澄なライセートを生成する際、特に深刻である。このため、公知の同時プロセス
は、従来の手法で得た、つまり遠心分離によって得た清澄な細胞ライセートから
開始される。上記の従来技術を参照のこと。
【００１２】 このように、本発明が基礎とする課題は、生物サンプルから、特に細胞または
細胞懸濁液または未精製ライセートから、清澄な溶液を同時に得るための簡易か
つ迅速な方法を提供することである。
【００１３】 一態様において、本発明は次のように、生物サンプルから細胞内容物を含有す
る清澄な溶液をハイスループット法で得る方法であって： （ａ）不溶性成分を含有するタンパク質含有溶液を、マルチチャンバ濾過ユニ
ットの個々のチャンバ中で調製する段階と、 （ｂ）マルチチャンバ濾過ユニットに通し、圧力差をかけることによって、そ
の溶液を濾過して、不溶性成分を除去する段階であって、隣接チャンバ間の相互
汚染が、化学的手段および／または機械的手段によって防止される段階と、 （ｃ）回収容器中に個々の濾液を別々に回収する段階と、を含む方法に関する
。
【００１４】 本出願では、生物サンプルという語句は、生物素材を含有するサンプルを意味
する。生物素材は、例えば各種の組織、骨髄、ヒトおよび動物の体液、例えば血
清、血漿、尿、精液、脳脊髄液、痰、およびスメア、植物、植物成分および植物
抽出物、例えば植物液、菌類、微生物、例えば細菌またはウイルス、原核細胞お
よび／もしくは真核細胞または細胞培養、化石化もしくはミイラ化したサンプル
、土壌サンプル、清澄化した汚泥、汚水および食物から生じる。特に、生物サン
プルは、組換え素材、例えば組換え技術によって改変された真核細胞および／ま
たは原核細胞を含有する場合がある。
【００１５】 タンパク質含有溶液は、生物素材からのペプチドおよび／またはポリペプチド
を可溶型で含有する。例えば、これらの可溶性ペプチドおよび／またはポリペプ
チドは、生物サンプル中に存在する分泌物であり、かつ／または生物サンプル中
の細胞によって分泌される。あるいは、それらは、細胞内で生じるか、または組
換えにより発現し、細胞の分解によって放出されたペプチドおよび／またはポリ
ペプチドである。特定の一実施形態では、タンパク質含有出発溶液（つまり、不
溶性成分を含有する溶液）は、未精製細胞ライセートであり、その溶解はタンパ
ク質可溶化条件下で行われる。さらに、タンパク質含有出発溶液は、未精製細胞
ライセートの画分であってもよい。ライセート画分を得る一方法は、例えば、タ
ンパク質沈殿条件下で溶解を行い、核酸を分離し、タンパク質可溶化条件下で再
度その残渣を回収することである。
【００１６】 「清澄な溶液」および「濾液」という表現は、本明細書中では同意語として使
用され、例えば細胞片などの不溶物を実質上含まない溶液を意味するものである
。
【００１７】 それらの溶液は一般に、異なる起源のものであるが、同一サンプルのアリコー
トを同時処理する用途を考案することも可能である。
【００１８】 本明細書において、「ハイスループット」という用語は、少なくとも２４サン
プル、好ましくは少なくとも４８サンプル、最も好ましくは９６サンプル以上、
例えば３８４サンプルの同時処理を意味する。
【００１９】 一実施形態に従って、泡立ちを減らすことにより、相互汚染を防止する。かか
る泡立ちは、タンパク質含有溶液を濾過する際、マルチチャンバ濾過ユニットの
個々のチャンバからの出口で生じる。形成する泡の上部が、隣接するチャンバ出
口の泡と一体化し、相互汚染が引き起こされる。ライセート１ｍｌ当たり０．１
ｍｇ以上のタンパク質濃度を有するライセートを濾過する際、泡立ちが観察され
る。泡立ちは、タンパク質を含有する（複合）培地の濾過でもまた観察される。
かかる培地は専門家には公知であり、例えば酵母菌の抽出物（例えばＬＢ、ＴＢ
、ｄＹＴおよびＹＰ培地）、動物および植物組織の一部消化された抽出物（例え
ばトリプトン、ペプトン、大豆ペプトン）、例えばカゼイン、ラクトアルブミン
またはゼラチンまたは血清成分の加水分解物を含有するか、あるいは、血清を含
有しないタンパク質強化培地（例えばＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ）である。培地１
ｍｌ当たり０．０１ｍｇ以上のタンパク質含有量で激しい泡立ちが生じる。
【００２０】 本発明の好ましい実施形態では、タンパク質含有溶液に消泡剤を添加すること
によって、特にタンパク質含有溶液を消泡剤で被覆することによって、泡立ちを
減らす。適切な消泡剤には、例えば第一、第二もしくは第三アルコール、特にＣ 1 〜6アルコール、シリコン油もしくはそのエマルジョンをベースとする消泡剤、
例えばＡｎｔｉｆｏａｍ Ａ（ＳＩＧＭＡ社）、Ｗａｃｋｅｒシリコン消泡剤エ
マルジョンＳＲＥ（ａｎｔｉｆｏａｍ ｒｅａｇｅｎｔ ＤＸ、Ｗａｃｋｅｒ社
）またはＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ消泡剤ＭＳＡ化合物（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ
社）、非シリコーン有機消泡剤またはそのエマルジョン、例えばＡｎｔｉｆｏａ
ｍ ２０４（ＳＩＧＭＡ社）、植物をベースとする消泡剤、特にアルコキシル化
脂肪酸エステル、例えばＳｔｒｕｃｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ ａｎｄ
Ｓａｉｌａｃｈｅｒ社）、長鎖アルカン（Ｃ6以上）、鉱油、ポリプロピレング
リコール、ポリエチレングリコールなどのポリグリコール、およびそれらの混合
物、例えばシリコーンおよび非シリコーン消泡剤を含有する混合物、例えばＡｎ
ｔｉｆｏａｍ ２８９（ＳＩＧＭＡ社）が含まれる。消泡剤は、アルコール、特
にエタノールまたはイソプロパノールであることが好ましい。
【００２１】 消泡剤の濃度は、消泡物質の種類に応じて異なり、例えばアルコール、特にエ
タノールは濃縮状態で使用されるのに対して、シリコン油をベースとする消泡剤
は約０．１％の濃度で使用される。
【００２２】 好ましい実施形態のように、消泡剤を上に注ぐことによって添加する場合には
、必要な消泡剤の容積は、チャンバの直径または消泡剤の液体のカラムによって
異なる。つまりタンパク質含有溶液の容積にはほとんど依存しない。さらに、そ
の容積は、消泡剤の種類にも依存する。消泡剤としてエタノールを用いた場合、
範囲０．０５ｃｍ〜１ｃｍ、好ましくは０．１ｃｍ〜０．３ｃｍ、特に約０．２
ｃｍのカラム高さで良好な結果が得られることを見出した。（チャンバ直径０．
８ｃｍを基準とする；チャンバの直径を変更する場合、カラム高さに調整が必要
である）
【００２３】 本発明の他の実施形態に従って、マルチチャンバ濾過ユニットの出口端と回収
容器の入口端との間にマルチチャンバ移送ユニットを使用することによって、相
互汚染が防止される。「マルチチャンバ移送ユニット」とは、個々の流路を有す
るユニットであって、その入口開口部が、マルチチャンバ濾過ユニットの個々の
チャンバ出口開口部に対応し、その出口開口部が、回収容器の入口開口部に対応
するユニットを意味する。入口端において、移送ユニットは、マルチチャンバ濾
過ユニットの出口開口部に対して、実質上密閉する手法で嵌合し、泡立ちによる
相互汚染を防ぐ。その出口端において、回収容器入口開口部の非密閉嵌合は、マ
ルチチャンバ濾過ユニットの入口端と出口端との間に圧力差をかけることができ
るように設けられる。代替方法としては、マルチチャンバ濾過ユニットの出口端
において、マルチチャンバ濾過ユニットの入口端と回収容器の予想出口端との間
に圧力差をかけることができるように、回収容器の入口端で密閉を提供する。回
収容器がグロマトグラフィーのマトリックスを含む場合、出発溶液の濾過および
、例えば精製する目的の細胞内容物のマトリックスへの結合など他の処理は、減
圧段階で行う（以下を参照のこと）。移送ユニットは例えば、封止マットと、内
腔を備えたアルミニウム製、ガラス製もしくはプラスチック製ブロック、または
それに対応するチューブもしくはホースの配置とからなる。
【００２４】 特定の一実施形態では、本発明による方法は、マルチチャンバ濾過ユニットの
個々のチャンバで調製される未精製細胞ライセートから始まる。その細胞ライセ
ートは、細胞もしくは細胞懸濁液を溶解試薬と混合することによって予め調製し
ておくか、あるいは細胞および溶解物質を添加し、任意にインキュベーションす
ることによって、マルチチャンバ濾過ユニットの個々のチャンバ中で直接溶解を
行う。溶解は、タンパク質可溶化条件下で行うか、または１つまたは複数の画分
を分離した後、タンパク質の可溶化段階を含む。
【００２５】 マルチチャンバ濾過ユニットの入口端と出口端との間に圧力差、出口端で一般
的な低い圧力をかけることによって、タンパク質含有溶液を不溶性成分から分離
する。その圧力差は、入口端で過剰圧力をかけるか、または好ましくは出口端で
減圧することによって生じさせることができる。
【００２６】 マルチチャンバ濾過ユニットの個々のチャンバに存在するフィルターは、フィ
ルターを通る濾液の流れの方向にしたがって孔径が小さくなるフィルターが好ま
しい。この種のフィルターは、さらに詳しい記載がある、欧州特許第０６１６６
３８ Ｂ１号に記載されている。この種のフィルターは、粗いフィルターの利点
（フィルター細孔の最小限の閉塞）と細密メッシュフィルターの利点（微細な不
溶性成分の良好な保持）を兼ね備えている。しかしながら、均一な孔径を有する
従来のフィルターもまた適している。
【００２７】 濾過段階後、回収容器中に、便宜上マルチチャンバユニットの個々のチャンバ
中に、濾液を別々に回収する。特に、本発明が、清澄な溶液をさらに処理するも
のである場合、このマルチチャンバユニットは一般に、追加の濾過ユニットまた
はクロマトグラフィーユニットである。
【００２８】 特定の一実施形態では、本発明による方法は、この方法で得た濾液から細胞内
容物を回収することを含む。この目的のために、この方法は、例えば１つまたは
複数の追加の濾過段階、例えば目的の細胞内容物より低い分子量を有する物質を
分離する限外濾過、およびサンプル容積を低減する濃縮段階を含む。
【００２９】 細胞内容物を回収するために、この方法は、少なくとも１つのクロマトグラフ
ィー分離段階および／または沈殿段階を含むことが好ましい。沈殿段階は、例え
ば核酸を沈殿させるのに十分な濃度でエタノールを添加すること、またはペプチ
ドを沈殿させるのに十分な濃度でエーテルを添加することを含む。クロマトグラ
フィー分離段階は、適切なグロマトグラフィー物質に所望の細胞内容物を結合さ
せ、その上清を除去し、次いでその内容物を溶出することを含む。
【００３０】 クロマトグラフィー物質は、特定の制約を受けず、分離される特定の細胞内容
物に適合するように選択することができる。例えば、クロマトグラフィー物質は
、イオン交換マトリックスであり得る。
【００３１】 適切なマトリックス物質には、例えばアガロース、シリカ、ニトロセルロース
、セルロース、アクリルアミド、ラテックス、ポリスチレン、ポリアクリレート
、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコールなどのポリエチレンポリマー、ガ
ラス粒子、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウムおよびケイ酸アルミニウムな
どのケイ酸塩、酸化チタンなどの金属酸化物、アパタイトおよびそれらの組み合
わせが含まれる。好ましいマトリックス物質は、シリカゲルおよび／またはアガ
ロースである。
【００３２】 他の好ましい実施形態では、本発明による細胞内容物を回収する方法は、アフ
ィニティーマトリックスを用いたクロマトグラフィー分離段階を含む。この種の
アフィニティーマトリックスは、当技術分野で公知であり、例えば以下に示すリ
ガンド系（マトリックス物質に結合するリガンド系、上記を参照のこと）を含む
。
【００３３】 アフィニティーリガンド：それによって分離される分子 抗原：特異性抗体 抗体：特異性抗原 抗体：特異性抗体 抗体（例えば抗ヒトＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ）：ヒトまたはマウスからのＩｇＧ
分子など、特定のカテゴリーの抗体 タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ：特定のカテゴリーの抗体 ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン標識融合タンパク質：ビオチン、
アビジン、ビオチン標識もしくはアビジン標識融合タンパク質 グルタチオン：グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＧＳＴ
融合タンパク質 セルロース：セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）またはＣＢＤ融合タンパク質 カルモジュリン：カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）またはＣＢＰ融合タ
ンパク質 アミロース：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはＭＢＰ融合タンパク質 イオン交換基：生体分子 疎水的相互作用に対するリガンド：生体分子 オリゴｄＴ：例えば、ｍＲＮＡ分子のポリＡ領域 核酸：ハイブリッド形成核酸 核酸、定義された配列：特に、核酸結合生体分子、例えばタンパク質 タンパク質：相互作用パートナー（一般に、タンパク質、核酸、特定の配列の核
酸、小さな生体分子） 小さな生体分子：タンパク質、核酸 細胞結合リガンド、例えばポリペプチド：細胞表面分子の結合を介した細胞 ファージ結合リガンド、例えばポリペプチド：ファージ表面への分子の結合を介
したファージ 抗体：表面分子の結合を介した細胞またはファージ
【００３４】 アフィニティーマトリックスの他の例は、タンパク質またはペプチドを精製す
るための金属キレートアフィニティーマトリックスである。Ｎｉ‐ＮＴＡマトリ
ックス（Ｑｉａｇｅｎ社から入手可能）を用いて、６ｘＨｉｓ標識タンパク質の
精製において優れた結果が得られた（実施例を参照のこと）。
【００３５】 マトリックス物質の形状は、特に制限されない；懸濁液またはメンブレン形状
の物質を使用することが可能である。その例には、官能性が付与された各場合に
おいて、メンブレン、（単分散）ラテックスビーズ、連続ベッド物質、高分子ク
ロマトグラフィー媒体、シリカ粒子等が含まれる。「官能性が付与された」とは
、所望の細胞内容物との親和性相互作用に参加することが可能な基が存在するこ
とを意味するものである。懸濁液型のクロマトグラフィー媒体の詳細な一例とし
ては、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ社から入手可能）が挙
げられる。
【００３６】 本発明による、適切に細胞内容物を得る方法は、１つまたは複数の洗浄段階を
含む。液体、つまりクロマトグラフィー物質に所望の細胞内容物が結合または沈
殿した後の上清と、洗浄液との分離は、その出口端で圧力差をかける、特に減圧
することにより、本発明に従って行うことが好ましい。必要であれば、隣接チャ
ンバ内の液体による相互汚染を防ぐために、これらの追加の濾過および／または
クロマトグラフィー段階で、例えば消泡剤を添加するか、または移送ユニットを
使用することによって適切な対策が取られる。
【００３７】 特定の一実施形態では、廃棄されるべき液体（洗浄液等）は、排液ユニットを
用いて排出される。この排液ユニットは、その入口端において上述のマルチチャ
ンバ移送ユニットに対応する。つまり、マルチチャンバ濾過ユニットの出口端か
ら個々のパッセージを通って上清が除去される。出口端において、これらの液体
は、排液ユニットを通り廃棄物回収タンクに送られる。
【００３８】 細胞内容物を回収または精製／分離するプロセスを行った後、細胞内容物を含
有する溶液を、回収容器中、特にマルチチャンバユニットの個々のチャンバ中に
別々に回収する。
【００３９】 本発明による方法はまた、細胞内容物を分析および／または保存する段階を含
む。分析段階は一般に、例えばアリコートを取ることと、電気泳動ユニット、例
えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または分光学ユニット、例えば質量分析計もしく
はアッセイにおいて、それを設置することを含む。保存段階の詳細な例は、凍結
乾燥である。
【００４０】 本発明による方法は、複数の細胞内容物を回収するのに適しており、特にペプ
チド、ポリペプチド、核酸および／または代謝産物を得るのに適している。その
必要条件は、１種または複数種の濾過、沈澱および／またはクロマトグラフィー
段階を用いて、他の物質から細胞内容物を分離するのに適した手順である。この
方法は、ペプチドまたはポリペプチドを得るために使用することが好ましく、ポ
リペプチドは一般に、少なくとも５０種のアミノ酸を含有する。
【００４１】 そのポリペプチドには、例えば、任意に多数のサブユニットから構成される、
かつ／または抗体若しくは酵素などの補欠分子団を含有するタンパク質、糖タン
パク質およびリポタンパク質が含まれる。さらに、プロセス段階を適切に組み合
わせることによって、同一ライセートから多数の細胞内容物を回収することが可
能である。例えば、複合プロセス段階を用いて、ペプチドまたはポリペプチドを
、アフィニティーマトリックスに結合させることによって分離することが可能で
あり、他の複合核酸では、例えばこれらのペプチドまたはポリペプチドをコード
するプラスミドＤＮＡを回収することが可能である。
【００４２】 本発明による方法は、実験室規模で、つまりタンパク質含有出発溶液が供給さ
れるマルチチャンバ濾過ユニットの各チャンバにおいて、５０ｍｌまで、好まし
くは２０ｍｌまで、最も好ましくは０．１〜２ｍｌの容量でサンプルを迅速に同
時処理することを特に企図するものである。 ハイスループット法において相互汚染を防止することに加えて、本発明による
方法の他の利点には、特に： 清澄な細胞ライセートの同時調製の高度自動化と、 手作業の移送段階および／ピペッティング段階の回避と、 未精製細胞ライセートからの細胞内容物の回収の高度自動化と、 得られた高純度の細胞内容物の高収量と、 未変性条件下および変性条件下両方での、その方法の適用可能性と、 そのプロセスを自動化し、マルチチャンバユニットを用いることによる、エラ
ーの原因の低減と、 そのプロセス速度と、 その系の適応性と、が含まれる。
【００４３】 本発明による方法は、清澄なタンパク質含有溶液を回収すること、または生物
サンプル、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの原核生物、酵母菌属などの真核
細胞、植物、動物およびヒト組織および培養細胞、昆虫細胞、菌類、古細菌等か
ら細胞内容物を取り除くこと、例えば自動ファージディスプレイアッセイに適し
ている。
【００４４】 本発明による、ハイスループット（ＨＴ＝ハイスループット）法の実際の応用
例は、例えば： 機能ゲノミクス： ゲノム配列決定プロジェクト（例えば酵母菌ゲノムプロジェクト、ヒトゲノム
プロジェクト）コンテクスト内の、タンパク質レベルでの遺伝子／オープンリー
ディングフレームのＨＴキャラクタリゼーション 機能プロテオミクス： 組換えタンパク質と、タンパク質およびペプチド複合体のＨＴ精製； 表面（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロ反応器、タンパク質チッ
プ［マイクロアレイ］）に固定化するサンプル標本としての組換えタンパク質、
タンパク質およびペプチド複合体のＨＴ精製； 活性物質スクリーニングプログラムに用いるサンプル標本としての組換えタン
パク質のＨＴ精製； 例えば細胞測定プロテオミクスプロジェクトのコンテクスト内で相互作用の研
究に用いるサンプル標本としての組換えタンパク質、タンパク質およびペプチド
複合体のＨＴ精製； 例えば細胞測定プロテオミクスプロジェクト、活性物質スクリーニングプログ
ラムの範囲内での、固定化、例えば６ｘＨｉｓタグ標識タンパク質との相互作用
による、ペプチド、タンパク質、ペプチドもしくはタンパク質複合体および他の
生体分子（例えば、核酸、炭水化物、脂質）の分離； 固定化された相互作用パートナー、例えばＮｉ−ＮＴＡマトリックス上に固定
化された６ｘＨｉｓタグ標識タンパク質との特異的相互作用（親和性強化、発現
クローニング、パニング）を介して、特異的生体分子（例えばタンパク質）をそ
の表面に発現する全有機体（細胞、ファージ）の分離； タンパク質レベルでの遺伝子発現分析（タンパク質発現プロファイリング）；
からなる。
【００４５】 さらに本発明は、生物サンプルから清澄なタンパク質含有溶液を回収するため
の； 第１位置でマルチチャンバユニットを保持する手段と、 第２位置でマルチチャンバユニットを保持する手段と、 第１位置にある少なくともマルチチャンバユニットの入口端と出口端との間に
圧力差をかける手段と、 第１位置にある少なくともマルチチャンバユニットの個々のチャンバに試薬を
添加する手段とを備える装置の使用に関する。
【００４６】 第１位置には、不溶性成分を含有するタンパク質含有溶液を受けるマルチチャ
ンバ濾過ユニットを準備する。第２位置には、清澄なタンパク質含有溶液を回収
するマルチチャンバ回収ユニットを設ける。特に、タンパク質含有溶液からペプ
チドおよび／またはポリペプチドを続いて回収することを意図する場合、第２位
置のマルチチャンバユニットは一般に、もう１つのマルチチャンバ濾過ユニット
またはマルチチャンバクロマトグラフィーユニットである。
【００４７】 第１位置にある少なくともマルチチャンバユニットの入口端と出口端との間に
圧力差をかける手段は、入口端で過剰圧力を生じさせる、かつ／または出口端で
減圧する手段からなる。これらの手段は、出口端に減圧装置を備えることが好ま
しい。第１位置のマルチチャンバユニットは、圧力差を生じることができるよう
に、出口端から入口端が締め切られ、実質上密閉される。第１位置のマルチチャ
ンバユニット入口端と出口端との間、または第１位置のマルチチャンバユニット
入口端と第２位置のマルチチャンバユニット出口端の間に圧力差を生じさせる。
その装置は任意に、第２位置のマルチチャンバ入口端と出口端の間に圧力差をか
ける手段もまた備える。
【００４８】 試薬を添加する手段は、特にピペッティング手段、好ましくは溶解用溶液、洗
浄用バッファー等を個々のチャンバに添加するためのマルチピペッティング手段
を備える。
【００４９】 第１位置および第２位置のマルチチャンバユニットは一般に、第１位置にある
１つのユニットのチャンバ出口が、第２位置にある１つのユニットのチャンバ入
口と整列するように位置合わせされている。これによって、濾過手段を通した後
、第１位置にあるユニットのチャンバから第２位置にあるユニットのチャンバへ
の溶液の移送が確実に容易になる。
【００５０】 この装置を使用して、ペプチドおよび／またはポリペプチドを回収する場合、
第１位置にマルチチャンバ濾過ユニットを設け、第２位置にマルチチャンバ回収
ユニット、好ましくはもう１つの濾過ユニットまたはクロマトグラフィーユニッ
トを設ける。マルチチャンバ濾過ユニットを通して、ライセートを濾過した後、
その清澄な溶液は、第２マルチチャンバ濾過ユニットまたはクロマトグラフィー
ユニットのチャンバ内に収容され、更なる操作に適用することができる。もう１
つの濾過またはクロマトグラフィー段階については、少なくとも詳細な実施形態
において、追加の真空ポンプが、第２位置のマルチチャンバユニットの出口端に
必要である。第１位置のマルチチャンバユニットを取り除き、マルチチャンバユ
ニットを第２位置から第１位置へ移動することによって、この必要が無くなる。
特定の一実施形態では、その装置は次のように： 第１位置からマルチチャンバユニットを取り除く手段と、 第２位置から第１位置へマルチチャンバユニットを移送する手段と、 マルチチャンバユニットを第２位置へ移送する手段と、を備える。
【００５１】 第２位置に設置した追加の第３マルチチャンバユニットは、マルチチャンバ濾
過ユニット、クロマトグラフィーユニット、または回収ユニットであり、考えら
れるプロセスの特定の手順によって異なる。
【００５２】 この装置は任意に、あるマルチチャンバユニットから次のマルチチャンバユニ
ットへ溶液を汚染することなく移送するためのマルチチャンバ移送ユニットと、
好ましくは、廃棄物回収タンクへ回収される、廃棄されるべき溶液を除去するた
めのマルチチャンバ排液ユニットと、を備える。排液ユニットは、減圧装置に連
結することが好ましい。排液ユニットおよび／または移送ユニットは、移動可能
に取り付けることが好ましく、排液ユニットの入口開口部は、マルチチャンバユ
ニットの出口に操作的に連結されて、操作位置に実質上密閉が形成され、その一
方、非操作位置には、マルチチャンバユニットの出口端から次のマルチチャンバ
ユニットの入口端へ液体が通過するように、流路が開かれている。したがって、
この装置は、マルチチャンバ排液ユニットを、第１および／第２位置にあるマル
チチャンバの入口端に取り外し可能に取り付ける手段も含むことが好ましい。任
意に、マルチチャンバユニットの出口端とマルチチャンバ排液ユニットの間の連
結は、マルチチャンバ移送ユニットを介して設けることが可能である。同様に、
第１および／または第２位置のマルチチャンバ移送ユニットを、操作と非操作位
置の間に移動する手段を設けることが可能である。
【００５３】 この装置はさらに、電気泳動装置および／または分光計などの細胞内容物を分
析する手段、ならびにマルチチャンバ回収ユニットからアリコートを取る、かつ
／もしくは分析用試薬を供給するための適切な調節器具および／または手段を備
えることができる。その装置はまた、プロセスの少なくとも１段階を制御するこ
とが可能なソフトウェアを備えることが好ましい。そのソフトウェアは、プロセ
ス段階の温度、持続時間、および圧力差を生じさせる手段を制御することが可能
なことが好ましい。
【００５４】 本発明はさらに、生物サンプルからタンパク質含有溶液をハイスループット法
で回収する試薬キットであって、少なくとも１つのマルチチャンバ濾過ユニット
および消泡剤および／または少なくとも１つのマルチチャンバ移送ユニットを含
む試薬キットに関する。本発明による試薬キットは任意に、１つまたは複数のマ
ルチチャンバユニット、例えばマルチチャンバ受け入れユニットを含む。
【００５５】 特定の実施形態では、本発明による試薬キットはさらに、細胞ライセートに用
いる、好ましくはタンパク質可溶化条件下で細胞ライセートに用いる少なくとも
１種の試薬を含む。その試薬キットは任意に、タンパク質および／またはペプチ
ドを可溶化する１種または複数種の試薬も含む。
【００５６】 好ましい実施形態において、本発明による試薬キットは、クロマトグラフィー
物質を含む。クロマトグラフィー物質は、例えば懸濁液型の物質であり、個々の
容器内に収容され、必要な時に使用者によって、マルチチャンバユニットの個々
のチャンバ中に分配される。そのクロマトグラフィー物質は、既に分配状態であ
る、つまりマルチチャンバクロマトグラフィーユニットの形を取ることが好まし
い。メンブレン型のクロマトグラフィー物質もまた、本発明によるプロセスで直
接使用するために、マルチチャンバクロマトグラフィーユニットの形で存在する
ことが好ましい。
【００５７】 本発明による試薬キットは任意に、平衡および洗浄用バッファーなどの従来の
試薬、および／または例えばピペットチップなど、プロセス段階を行うのに必要
な器具もまた含む。
【００５８】 本発明は、以下に示す図および実施例によって完全に説明される。
【００５９】 実施例 １． ９６チャンバフォーマットの金属アフィニティークロマトグラフィー（マ
トリックス懸濁液）による、６ｘＨｉｓ融合タンパク質の自動精製
【００６０】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットの分配クロマトグラフィー物
質（Ｎｉ−ＴＮＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）による、減圧技術を用いた、大腸菌（
Ｅ．Ｃｏｌｉ）の細胞ライセートからのタンパク質の未変性条件下での自動精製
を示す。
【００６１】 ６倍アミノ酸ヒスチジン（６ｘＨｉｓ−ＣＡＴ）からなるアフィニティー標識
を有する融合タンパク質として、タンパク質クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼを発現する大腸菌ＤＨ５α細胞を、２４チャンバブロック（各チ
ャンバは容積１０ｍｌを有し；合計９６バッチ）で容積５ｍ中に培養し、培養が
終了した後に、遠心分離により沈降させ、上清培地を除去した。その後のすべて
の段階を、実験用ロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００、Ｑｉａｇｅｎ社）を
用いて行った。最初に、細胞沈降物を溶解用バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2Ｐ
Ｏ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、リゾチーム
２００μｇ／ｍｌ）１ｍｌ中に取って、細胞を開き、完全に分解するように振と
うした。その間に、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗアフィニティーマトリッ
クス（Ｑｉａｇｅｎ社）を再懸濁し、他の９６チャンバ濾過ユニットのチャンバ
中に分配し（１チャンバ当たり総容積５０μｌ）、そのマトリックスを平衡化し
、このユニット（Ｎｉ−ＮＴＡプレート）を減圧チャンバの底部位置に配置した
。Ｎｉ−ＮＴＡプレートの上に、濾過ユニット（例えばＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒ
９６、Ｑｉａｇｅｎ社）を上部位置に設置した。ライセートをＴｕｒｂｏＦｉ
ｌｔｅｒ ９６濾過ユニットに移し；次いでそのライセートをエタノール１００
μｌ（１００％ｐ．ａ．）で覆い、減圧した。次いで、ＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒ
９６ユニットを取り除き、清澄なライセートを含有するＮｉ−ＮＴＡプレート
を、減圧チャンバの上部位置に移し、排液ブロックを底部位置に設置した。減圧
することによって、清澄なライセートを、クロマトグラフィーマトリックスのベ
ッドを通して吸引した；このプロセス中、６ｘＨｉｓタグ標識タンパク質はマト
リックスに結合した。バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３０
０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）１ｍｌを２回添加し、続いて減圧す
ることによって、バッチを洗浄した。減圧チャンバの低位置にある排液ブロック
をマイクロタイタープレートと取り替えた。溶出用バッファー（５０ｍＭのＮａ
Ｈ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）３０
０μｌを個々のチャンバに加え、減圧することによって、６ｘＨｉｓタグ標識タ
ンパク質をマイクロタイタープレートのチャンバ中に溶出した。
【００６２】 チャンバ１〜５６の溶出画分中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によ
って決定した（表１）。６ｘＨｉｓＣＡＴの収量は、１チャンバ当たり２１〜２
４０μｇである（３００μｌで１回溶出）。各溶出画分５μｌをＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動し、続いてタンパク質バンドをクーマシーブリリアント
ブルーで染色すると、精製したタンパク質は明らかに均一である（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析；図示せず）。
【００６３】
【表１】
【００６４】 ２． ９６チャンバフォーマットの金属アフィニティークロマトグラフィー（
メンブレン）による６ｘＨｉｓ融合タンパク質の自動精製
【００６５】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットのアフィニティーメンブレン
（その中で重合したＮｉ−ＮＴＡシリカ粒子を含有する）による、減圧技術を用
いた、大腸菌細胞ライセートからのタンパク質の未変性条件下での自動精製を説
明する。
【００６６】 実施例２の基礎となる、実験に用いる装置および方法は、６ｘＨｉｓ融合タン
パク質の結合に用いられるアフィニティーメンブレンが予め組み込まれている、
９６チャンバプレートを使用することを除いては、実施例１と同一である。Ｎｉ
−ＴＮＡシリカ粒子（ＱＩＡＧＥＮ社）をメンブレンに組み込んだ。
【００６７】 チャンバ１〜６２の溶出画分中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によ
って決定した（表２）。６ｘＨｉｓＣＡＴの収量は、１チャンバ当たり５０〜２
５０μｇである（３００μｌで１回溶出した後）。各溶出画分５μｌをＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動し、続いてタンパク質バンドをクーマシーブリリ
アントブルーで染色すると、精製したタンパク質は明らかに均一である（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析；図示せず）。
【００６８】
【表２】
【００６９】 ３． ９６チャンバフォーマットのアニオン交換クロマトグラフィー（マトリ
ックス懸濁液）による、クロラムフェニコール‐アセチル‐トランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）の自動精製
【００７０】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットの分配アニオン交換クロマト
グラフィー物質（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）による、減圧
技術を用いた、大腸菌細胞ライセートからのタンパク質ＣＡＴの未変性条件下で
の自動精製を説明する。
【００７１】 実施例３の基盤を形成する実験に用いる装置および手順は、１つ変更が加えら
れているが、実施例１で使用した装置および手順と一致する。クロラムフェニコ
ール‐アセチル‐トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をアニオン交換クロマトグラフ
ィーによって精製できるという事実を利用した。上述の試験において、Ｑ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗアニオン交換マトリックス（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）の分配懸濁液を有する、９６チ
ャンバプレートを使用して、組換えタンパク質を結合させた（溶解用バッファー
：５０ｍｍトリスＨＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２００μｇ／ｍｌリゾチーム、
ｐＨ７．０；結合用バッファー／洗浄用バッファー：５０ｍＭトリスＨＣｌ、２
５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０；溶出用バッファー：５０ｍＭトリスＨＣｌ、５
００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。
【００７２】 チャンバ１〜６２の溶出画分中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によ
り決定した（表３）。各画分５μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ１５％）上に投入した。ゲル中のタンパク質バンドを、クーマシーブリ
リアントブルーで染色することによって視覚化した（図２）。次いで、ＣＡＴを
純度約４０％に濃縮した。ＣＡＴの収量は、１チャンバ当たり４０〜１２０μｇ
である（２００μｌで１回溶出した後）。
【００７３】
【表３】
【００７４】 ４． ９６チャンバフォーマットの金属アフィニティークロマトグラフィー（
マトリックス懸濁液）による、真核細胞から発現した６ｘＨｉｓ融合タンパク質
の自動精製
【００７５】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットの分配アニオン交換クロマト
グラフィー物質（Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）による、減圧技術を用い
た、酵母細胞ライセートからの６ｘＨｉｓ融合タンパク質の未変性条件下での自
動精製を説明する。実施例４が基礎とする実験に用いる装置および手順は、本明
細書中で記載の実験において、真核生物の酵母細胞中で発現した６ｘＨｉｓタグ
標識タンパク質ＦＢＡ１‐アルドラーゼを精製したことを除いては、実施例１で
使用した装置および手順と一致する。これを行うために、溶解条件を以下のよう
に変更した：２４チャンバブロックに培地５ｍｌ中で培養した細胞を、溶解用バ
ッファー（２０ｍｍＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４；１．２Ｍソルビトー
ル；１ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ））中に再懸濁し、４５
分間振とうして、スフェロプラストの形成を補助した。次いで、プロテアーゼイ
ンヒビター、３００ｍｍＮａＣｌおよび０．４％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ ｘ
‐１００を加えて、スフェロプラストを溶解し、その溶解混合物を、清澄化する
ために濾過ユニット（例えばＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒ ９６、ＱＩＡＧＥＮ社）
に移した。その後のすべての段階を実施例１に記載のように行った。
【００７６】 溶出画分中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した（表４
）。６ｘＨｉｓ‐ＦＢＡ１アルドラーゼの収量は、１チャンバ当たり１０〜２５
μｇであった。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によれば、精製したタンパク質は明らかに
均一である（図示せず）。
【００７７】
【表４】
【００７８】 ５． ９６チャンバフォーマットの金属アフィニティークロマトグラフィー（
マトリックス懸濁液）による、６ｘＨｉｓタグ標識融合タンパク質の変性条件下
での自動精製
【００７９】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットの分配クロマトグラフィー物
質（Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）による、減圧技術を用いた、大腸菌細
胞ライセートからのタンパク質の変性条件下での自動精製を説明する。
【００８０】 ６倍アミノ酸ヒスチジンからなるアフィニティー標識（６ｘＨｉｓ）を有する
融合タンパク質として、チオレドキシンを発現する大腸菌Ｍ１５／ｐＲＥＰ４細
胞を、２４チャンバブロック（各チャンバの容積１０ｍｌ；合計９６バッチ）で
培養容積５ｍ中に培養し、培養が終了した後に、遠心分離により沈降させ、上清
培地を除去した。その後のすべての段階を、実験用ロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ
９６００、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。最初に、細胞沈降物を溶解用バ
ッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．０）１ｍｌ中に取って、細胞を開き、３０分間振とうして。完全に分解する
よう補助した。その間に、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗアフィニティーマ
トリックスを再懸濁し、他の９６チャンバ濾過ユニットのチャンバ（１チャンバ
当たり総容積５０μｌ）中に分配し、そのマトリックスを平衡化し、このユニッ
ト（Ｎｉ−ＮＴＡプレート）を減圧チャンバの低位置に配置した。濾過ユニット
（例えばＴｕｒｂｏＦｉｌｔｅｒ ９６、Ｑｉａｇｅｎ社）をＮｉ−ＮＴＡ
プレート上の上部位置に正確に位置決めした。ライセートをＴｕｒｂｏＦｉｌｔ
ｅｒ ９６濾過ユニットに移し；次いでそのライセートをエタノール１００μｌ
（ｐ．ａ．）で覆い、減圧した。次いで、濾過を終了した後、ＴｕｒｂｏＦｉｌ
ｔｅｒ ９６ユニットを取り除き、清澄なライセートを含有するＮｉ−ＮＴＡプ
レートを、減圧チャンバの上部位置に移し、排液ブロックを低位置に設置した。
減圧することによって、清澄なライセートを、クロマトグラフィーマトリックス
のベッドを通して吸引した；このプロセス中、６ｘＨｉｓタグ標識タンパク質が
マトリックスに結合した。洗浄用バッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ２
ＰＯ4、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）１ｍｌを２回添加し、洗浄用バッ
ファー２（８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
６．３）１ｍｌを１回添加し、次いで減圧することによって、バッチを洗浄した
。減圧チャンバの低位置にある排液ブロックをマイクロタイタープレートに取り
替えた。溶出用バッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭト
リスＨＣｌ、ｐＨ４．５）３００μｌを個々のチャンバに加え、６ｘＨｉｓタグ
標識タンパク質を、減圧することによってマイクロタイタープレートのチャンバ
中に溶出した。
【００８１】 チャンバ１〜５４の溶出画分中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によ
って決定した（表５）。６ｘＨｉｓ標識タンパク質の収量は、１チャンバ当たり
８６〜２５２μｇであった。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によれば、精製したタンパク
質は明らかに均一である（図示せず）。
【００８２】
【表５】
【００８３】 ６． ９６チャンバフォーマットの金属アフィニティークロマトグラフィーに
よる、相互汚染の無い、様々な６ｘＨｉｓ融合タンパク質の精製
【００８４】 この実施例によって、９６チャンバフォーマットの分配クロマトグラフィー物
質（Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）による、減圧技術を用いた、大腸菌細
胞ライセートからのタンパク質の未変性条件下での自動精製であって、これらの
手段を用いることなく行われた精製と比較して、相互汚染を防ぐ手段を含む自動
精製を説明する。
【００８５】 実施例６が基礎とする実験に用いる装置および手順は、６ｘＨｉｓ融合タンパ
ク質を発現する様々なクローンを培地５ｍｌ中で培養し、同時に処理することを
除いては、実施例５に記載の装置および手順と一致する。相互汚染を防ぐために
取られた手段（エタノールで覆う、排液ブロックを使用）は、実施例４に記載さ
れている。
【００８６】 指定の溶出画分アリコート５μｌを９５℃で４分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析し、続いて、タンパク質バンドをクーマシー染色した（図３）。本
発明による方法を用いて精製した溶出画分のバンドパターン（図３ａ）から、６
ｘＨｉｓ融合タンパク質のうちの１種に相当するバンド１つのみが画分に現れ、
この結果、相互汚染をこの方法により防ぐことができることが示されている。そ
れとは対照的に、対照実験において、一部のケースでは、６ｘＨｉｓ融合タンパ
ク質に相当するいくつかのバンドを同定することができる（図３ｂ、‐によって
示されるバンド）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による方法の実施形態を示す図である。
【図２】 マトリックス懸濁液を用い、実施例３によるアニオン交換クロマ
トグラフィーによって精製されたＣＡＴのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す
図である。
【図３】 図３ａは、実施例６に記述した本発明による方法を用いて、金属
キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製された、様々な６ｘＨ
ｉｓ融合タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図である。図３ｂは
、比較として、実施例６に記述した従来の方法を用いて、金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製された、様々な６ｘＨｉｓ融合タンパク
質のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１２月１７日（２００１．１２．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ 30/88 30/88 Ｊ (72)発明者 スタイナート ケルスティン ドイツ連邦国、ランゲンフェルド ディー 40764、シュナイダーシュトラーセ ５ (72)発明者 リューベナウ ヘルゲ ドイツ連邦国、ケルン ディー 50859、 マックス−アーンスト−シュトラーセ Ｆターム(参考） 4B029 AA09 BB01 CC01 HA05 4B050 CC07 DD02 FF10C LL05 4B063 QA01 QQ15 QS39 4H045 AA20 GA23 GA26

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞内容物を含有する、生物サンプルの清澄な溶液をハイス
    ループット法で回収する方法であって、 （ａ）マルチチャンバ濾過ユニットの個々のチャンバ中に不溶性成分を含有す
    る複数のタンパク質含有溶液を調製する段階と、 （ｂ）前記溶液を、圧力差をかけることによって前記マルチチャンバ濾過ユニ
    ットに通して濾過し、不溶性成分を除去する段階であって、隣接チャンバの相互
    汚染が、化学的手段および／または機械的手段によって防止される段階と、 （ｃ）個々の濾液を回収容器中に別々に回収する段階と、を含む方法。
  2. 【請求項２】 前記相互汚染が、泡立ちを減少させることによって防止され
    ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記泡立ちが、細胞ライセートに消泡剤を添加することによ
    って減少されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記消泡剤が、第一、第二もしくは第三Ｃ1〜6アルコール、
    シリコーン消泡剤、非シリコーン消泡剤、植物をベースとする消泡剤、長鎖アル
    カン、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混
    合物から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記相互汚染が、前記マルチチャンバ濾過ユニットの出口端
    と、前記回収容器の入口端との間に移送ユニットを用いることによって防止され
    ることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 （ａ）によるタンパク質含有溶液が、未精製細胞ライセート
    であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記細胞溶解が、前記マルチチャンバ濾過ユニットの個々の
    チャンバ中で行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記マルチチャンバ濾過ユニット内のフィルター孔径が、フ
    ィルターを通る濾液の流れの方向にしたがって小さくなることを特徴とする、請
    求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 （ｃ）による濾液から細胞内容物を回収することをさらに含
    む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 少なくとも１つの追加の濾過段階を含む、請求項９に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 少なくとも１つのクロマトグラフィー分離段階および／ま
    たは沈殿段階を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 イオン交換マトリックスを用いた、クロマトグラフィー分
    離段階を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 アフィニティーマトリックスを用いた、クロマトグラフィ
    ー分離段階を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記アフィニティーマトリックスが、金属キレートアフィ
    ニティーマトリックスであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記金属アフィニティーマトリックスが、Ｎｉ‐ＮＴＡマ
    トリックスであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記マトリックスが、懸濁液であることを特徴とする、請
    求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１つの洗浄段階をさらに含む、請求項９から１
    ６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記液体が、圧力差をかけることによって分離されること
    を特徴とする、請求項９から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 廃棄されるべき液体が、排液ユニットを用いて除去される
    ことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記細胞内容物を分析する、少なくとも１つの段階をさら
    に含む、請求項９から１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記細胞内容物が、マルチチャンバユニット中に回収され
    ることを特徴とする、請求項９から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記細胞内容物が、ペプチド、ポリペプチド、核酸、およ
    び代謝産物から選択されることを特徴とする、請求項９から２１のいずれか一項
    に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 生物サンプルから清澄なタンパク質含有溶液を回収するた
    めの、 マルチチャンバユニットを第１位置に保持する手段と、 マルチチャンバユニットを第２位置に保持する手段と、 第１位置にある少なくともマルチチャンバユニットの入口端と出口端との間に
    圧力差をかける手段と、 第１位置にある少なくともマルチチャンバユニットの個々のチャンバに試薬を
    添加する手段と、を備える装置の使用。
  24. 【請求項２４】 第１位置にある１つのユニットのチャンバ出口が、第２位
    置にある１つのユニットのチャンバ入口と整列するように、前記マルチチャンバ
    ユニットが位置合わせされることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
  25. 【請求項２５】 前記装置が、 マルチチャンバユニットを第１位置から取り外す手段と、 マルチチャンバユニットを第２位置から第１位置へ移す手段と、 マルチチャンバユニットを第２位置へ移す手段と、を備えることを特徴とする
    、請求項２３または２４に記載の使用。
  26. 【請求項２６】 前記装置がさらに、マルチチャンバ移送ユニットを備える
    ことを特徴とする、請求項２３から２５に記載の使用。
  27. 【請求項２７】 前記装置がさらに、マルチチャンバ排液ユニットを備える
    ことを特徴とする、請求項２３から２６に記載の使用。
  28. 【請求項２８】 前記装置がさらに、第１位置および／第２位置にあるマル
    チチャンバ出口端に、前記マルチチャンバ排液ユニットを取り外し可能に取り付
    ける手段を備えることを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
  29. 【請求項２９】 前記装置がさらに、細胞内容物を分析する手段を備えるこ
    とを特徴とする、請求項２３から２８に記載の使用。
  30. 【請求項３０】 前記装置がさらに、少なくとも１つのプロセス段階を制御
    するソフトウェアを備えることを特徴とする、請求項２３から２９に記載の使用
    。
  31. 【請求項３１】 生物サンプルからタンパク質含有溶液をハイスループット
    法で得るための試薬キットであって、 （ａ）少なくとも１つのマルチチャンバ濾過ユニットと、 （ｂ）消泡剤および／または少なくとも１つのマルチチャンバ移送ユニットと
    、 （ｃ）任意に、少なくとも１つのマルチチャンバ受け入れユニットと、を含む
    試薬キット。
  32. 【請求項３２】 細胞溶解に使用するための、少なくとも１種類の試薬をさ
    らに含む、請求項３１に記載の試薬キット。
  33. 【請求項３３】 タンパク質および／またはペプチドを可溶化するための、
    少なくとも１種類の試薬をさらに含む、請求項３１または３２に記載の試薬キッ
    ト。
  34. 【請求項３４】 クロマトグラフィー物質をさらに含む、請求項３１から３
    ３のいずれか一項に記載の試薬キット。
  35. 【請求項３５】 前記クロマトグラフィー物質が、少なくとも１つのマルチ
    チャンバクロマトグラフィーユニットの形をとる、請求項３４に記載の試薬キッ
    ト。
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