KR101365474B1 - 생체분자의 크로마토그래피 정제 방법을 최적화하는 방법 - Google Patents

생체분자의 크로마토그래피 정제 방법을 최적화하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체분자의 크로마토그래피 정제에 적합한 파라미터를 찾는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계로 구성되고, 이러한 순서의 단계들은 부분 배치 공정으로 수행된다. 소규모, 바람직하게는 복수의 병행 배치들에서 측정된 파라미터들은 소정의 생체분자가, 적당하다면 비교적 대규모일지라도, 칼럼 크로마토그래피에 의해서 최적으로 정제될 수 있는 크로마토그래피 조건에 대한 정보를 제공한다.
생체분자, 크로마토그래피 정제, 파라미터, 평형화, 충전, 세척, 용출

Description

생체분자의 크로마토그래피 정제 방법을 최적화하는 방법{Process for optimizing chromatographic purification processes for biomolecules}
본 발명은 대규모로 수행될 수 있는 생체분자의 크로마토그래피 정제 방법의 개발 및 최적화를 허용하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
단백질, 폴리뉴클레오타이드, 폴리삭카라이드 등과 같은 생체분자는 약제로서, 진단제로서, 식료품, 세정제 등의 첨가제로서, 연구 시약으로서, 기타 많은 적용으로서 상업적 유의성이 증가하고 있다. 이러한 생체분자의 요구는 통상 천연 공급원으로부터의 분자의 분리를 통해서는 만족될 수 없고(예컨대, 단백질의 경우), 생명공학적 생산 방법의 사용이 요구된다.
단백질의 생명공학적 생산은 통상 원하는 단백질을 암호화하는 DNA의 분리 및 이를 적합한 발현 벡터 내로의 클로닝으로 시작한다. 발현 벡터를 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 발현 세포에 형질감염시킨 후, 이어서 형질감염된 세포를 선택한 후, 이 세포를 발효조에서 항온처리하여 원하는 단백질을 발현시킨다. 그 다음, 세포 또는 배양 상청액을 수확하여, 여기에 함유된 단백질을 후처리 및 정제한다.
진핵생물 발현계인 경우, 즉 CHO 또는 NS0 세포와 같은 포유동물 세포 배양물을 사용할 때, 지난 15년 동안은 발현 단계의 세포 배양물 또는 세포 배양 상청액에서 달성될 수 있는 원하는 단백질의 농도가 100배 증가하였다. 동일한 기간 동안에 단백질의 후속 정제 동안에 사용된 크로마토그래피 물질의 결합능 개선은 3 인자(factor)뿐이었다. 이러한 이유 때문에, 대량의 산업적 규모에서 수행될 수 있는 생체분자, 특히 단백질의 개선된 최적의 정제 방법이 절실히 요구되고 있다.
치료용 항체와 같이 약제로서 사용되는 단백질 등의 생물의약품인 경우에는 산물의 수율 외에 불순물의 제거도 매우 중요하다. 공정 의존적 불순물과 산물 의존적 불순물 사이에는 차이가 있을 수 있다. 공정 의존적 불순물은 단백질 및 핵산과 같은 숙주 세포의 성분을 함유하고 세포 배양물(예컨대, 배지 성분)에서 유래되거나, 후처리 공정(예, 염 또는 분리된 크로마토그래피 리간드)에서 유래되기도 한다. 산물 의존적 불순물은 성질이 다른 산물의 분자 변형체이다. 그 예에는 전구체 및 가수분해적 분해 산물과 같은 단축된 형태뿐만 아니라 탈아민화, 부정확한 글리코실화 또는 잘못 결합된 이황화 브릿지 등에 의해 생산된 변형된 형태도 포함된다. 산물 의존적 변형체는 또한 중합체 및 응집물도 포함한다. 오염물이란 용어는 제조 공정에 직접 속하지 않은 화학적, 생화학적 또는 미생물학적 특성의 기타 모든 물질을 나타내는데 사용된다. 오염물의 예는 세포 배양물에서 바람직하지 않게 나타날 수 있는 바이러스를 포함한다.
불순물 및 오염물은 생물의약품인 경우에 안전성 문제를 야기한다. 이것은 생물의약품인 경우에 매우 흔한 경우로서, 치료용 단백질이 주사 또는 주입에 의해 혈류로 직접 투여된다면 심각해진다. 이에 따라, 숙주 세포 성분은 알레르기 반응 또는 면역병리학적 효과를 야기할 수 있다. 또한, 불순물은 투여된 단백질의 바람직하지 않은 면역원성으로 이어질 수도 있고, 즉 치료제에 대하여 환자의 바람직하지 않은 면역 반응을, 아마도 치명적인 아나필락시스 쇼크 순간까지 촉발시킬 수 있다. 따라서, 모든 바람직하지 않은 물질이 무의미한 수준까지 제거될 수 있는 적당한 정제 방법이 요구되고 있다.
한편, 생물의약품인 경우에는 경제적 관점을 무시할 수 없다. 이에 따라, 사용된 생산 및 정제 방법은 이와 같이 생산된 생물의약품의 경제적 실현가능성을 위협하지 않아야 한다. 또한, 새로운 정제 방법이 확립될 수 있는 시간의 척도는 중요한 역할을 한다. 즉, 비용에 미치는 영향 외에도, 공정 개발은 약물의 임상전 개발 및 임상 개발과 조화를 이루어야 한다. 이에 따라, 예컨대 일부 임상전 시도와 모든 임상 시도는 충분한 순도의 생물의약품이 충분한 양으로 이용가능한 경우에만 시작할 수 있다.
다음과 같은 4가지 기본 단계로 이루어진 표준 방법은 대규모로 수행될 수 있는 항체 정제 방법의 개발을 위한 출발점으로서 작용할 수 있다: 제1 단계로서, 표적 단백질을 분리, 농축 및 안정화한다("포획화"). 제2 단계로서, 바이러스를 제거한다. 제3 단계로서, 핵산, 다른 단백질 및 내독소와 같은 불순물의 대부분이 제거되는 정제를 수행한다. 마지막 단계에서, 남아있는 임의의 미량의 불순물 및 오염물을 제거한다("마무리").
여과 및 침전 단계 외에, (칼럼) 크로마토그래피 방법이 가장 중요하다. 이 에 따라, 포획은 흔히 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 단계를 포함한다. 따라서, 이 단계에 사용될 수 있는 칼럼 크로마토그래피 방법과 크로마토그래피 물질은 수많은 종류가 공지되어 있다. 하지만, 대안적인 방법의 수가 증가할수록, 정제 효과, 수율, 생물학적 활성, 시간, 비용 등의 면에서 최적의 물질 및 방법을 결정하기 위해서는 훨씬 많은 수의 예비 시도가 수행되어야만 한다.
또한, 정제 방법의 확립 및 최적화 시에는 정제될 특정 분자(표적 분자, 표적 단백질)의 생화학적 및 생물물리학적 성질 및 생물학적 출발 물질이 수득되는 조건에 따라 매우 개별적으로 조정되어야 한다는 것을 명심해야 한다. 표적 물질이 분리되어야만 하는 생물학적 출발 물질은 일반적으로 매우 복잡한 물질의 혼합물로 이루어진다. 표적 분자를 분리 및 농축하기 위해서는 모양, 크기, 용해성, 표면 전하, 표면 소수성 및 결합 파트너에 대한 생물특이적 친화성과 같은 특정 성질이 이용된다. 각각 새로운 표적 분자에 대하여, 심지어 이전 단계들 중 하나(예컨대, 발효 배양 배지의 조성의 변화)만이 변화된 동일한 표적 분자에 대해서도, 상기 관점으로부터 가능한 최상의 결과가 상기 새로운 조건 하에서 더 이상 달성되지 않을 수 있기 때문에 정제 공정은 새롭게 조정되어야 한다.
이와 동시에, 이론적으로 추정할 수 있는 대체 공정의 수는 앞에서 열거한 매개변수의 수에 의해 좌우된다. 칼럼 크로마토그래피에서 예컨대 전체 공정에서 일련의 크로마토그래피 단계, 칼럼 물질, pH, 염 함량 및 사용된 각종 용출 완충액의 특성, 칼럼에 충전할 때의 단백질 농도 및 기타 많은 관점은 최적화되어야 한다. 이것은 산업적 규모에서 적당한 비용과 적당한 시간 범위 내 최적의 칼럼 크로마토그래피 공정을 개발하는 것을 사실상 불가능하게 한다. 한편, 경제적 실현가능성 및 장치 관련 제한(예컨대, 가능한 적은 수의 완충액 사용 및 완충액과 크로마토그래피 물질의 가능한 최소 양 또는 용적의 필요성, 가능한 적은 용적의 산물 함유 분획 유지의 필요성, 및 공정 시간과 폐수 용적의 최소화 필요성)도 공정의 각 단계에 대해 전술한 최적화를 요구한다.
통상, 제한된 수의 공정 매개변수를 다소 체계적으로 수행되는 "시행착오" 원리의 예비 시도를 통해 연속적으로 변화시키고, 이러한 시도를 기본적으로 "기능적인" 공정이 발견될 수 있는 즉시 종료하는 방식으로 이러한 문제에 접근한다. 즉, 공정의 모든 필수 매개변수의 체계적인 최적화는 가능하게는 다수의 관점, 예컨대 불순물의 제거, 산물의 고수율 및 동시에 생물학적 활성의 적은 손실 등과 관련하여 사실상 이루어지지 않거나 매우 제한적이다. 이러한 방식으로 확립된 공정은 결국 이상적인 방법에 미치지 못하는 것이 일반적이다.
대안적으로, 상기 최적화를 실험실 규모의 작은 칼럼들(예컨대, 약 1ml의 크로마토그래피 물질을 함유하는 작은 칼럼)을 이용하여 수행하는 시도가 이루어졌다. 하지만, 이러한 작은 규모에서도 충전, 세척 및 용출 단계에 상당한 시간이 요구되어 적당한 비용으로 변화시킬 수 있는 매개변수의 수는 매우 제한적인 것으로 밝혀졌다.
공정을 최적화하기 위한 소형 규모의 또 다른 접근은 WO 제2004/028658호에서 찾아볼 수 있다. 크로마토그래피 물질에 대한 생물학적 시료의 결합은 배치법으로 멀티웰 플레이트 상에서 병행 배치들에서 시험된다. 명백히, 이 공정은 이 결합 단계의 최적 조건이 빠르고 비용 효과적으로 결정될 수 있게 한다. 하지만, 이와 같이 특정된 조건이라도 반드시 산업적 규모의 조건 하에 사용되는 칼럼 크로마토그래피 방법이 여전히 최적의 결과를 달성할 수 있다고 말할 수는 없을 것이다. 또한, 이러한 공정의 최적화는 오로지 크로마토그래피 물질의 충전 단계, 즉 전체 공정에서 단지 일부분만을 최적화하는 것에 관한 것이다.
따라서, 생체분자의 칼럼 크로마토그래피 정제 방법이 빠르고 저비용으로 확립 및 최적화될 수 있으면서, 생체분자의 대규모 산업적 생산 및 정제 조건 하에서 만족스러운 결과도 산출하는 공정의 필요성은 여전히 절실하다. 본 발명의 목적은 이러한 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
전술한 문제는 청구의 범위에 언급된 방법들에 의해 해결된다.
구체적으로, 본 발명은 생물학적 분자를 분리 또는 정제하기 위한 크로마토그래피 공정에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법으로서, 일련의 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계가 소규모, 예컨대 크로마토그래피 물질의 겔 층 용적이 0.01 내지 2ml 사이인 부분 배치법(크로마토그래피 물질의 현탁을 수행하거나 수행하지 않는 단계)으로 완료되는 방법을 제공한다. 이러한 방식에서, 하나 이상의 매개변수는 많은 시험에서 변동될 수 있고, 이 시험 결과로부터 상기 크로마토그래피 공정이 수행될 수 있는 최적의 조건이 도출될 수 있다. 이와 같이 결정된 최적 조건은 이후 대규모로 수행되는 크로마토그래피법, 특히 칼럼 크로마토그래피법에 적용될 수 있다.
"부분 배치법"이란 어구는 모든 단계는 아니지만 하나 이상의 특정 단계에서 크로마토그래피 물질이 현탁되는, 즉 배치법으로 처리되는 것을 의미한다. 크로마토그래피 물질의 현탁이 일어나지 않는 단계는 용출 완충액과 같은 특정 완충 용액을 침적된 겔 층에 이 겔 층의 현탁을 유발하지 않고 적용하고, 이 완충액이, 예컨대 중력, 원심분리, 압력 구배의 적용 등에 의해 유도되어 칼럼 물질을 통해 관류하게 하는 "통상의" 칼럼 크로마토그래피 방식으로 수행된다.
본 발명에 따르면, 앞에서 언급한 문제를 해결하기 위하여, 충전 단계 동안에는 크로마토그래피 물질이 현탁되지만 용출 단계(또는 수회 용출 단계인 경우에는 단계들) 동안에는 크로마토그래피 물질의 현탁이 억제되고, 침적된 겔 층을 통해 용출제 용액이 유도된 방식으로 이동하는 "부분 배치법"을 수행하는 것이 특히 유용한 것으로 입증되었다.
특정 크로마토그래피 물질과 정제될 생체분자에 최적인 충전, 세척 및/또는 용출 조건이 전술한 부분 배치법에 따라(예컨대, 각 용액의 pH 및/또는 이온 강도, 단백질 농도 등의 매개변수를 변동시키고, 생체분자의 정제 효과, 수율 및 생물학적 활성과 관련하여 최적의 결과를 측정함으로써), 약 50㎕ 내지 2ml의 크로마토그래피 물질을 사용하는 것과 같이 소규모로 측정된다면, 이러한 조건은 놀랍게도 심지어 더 큰 규모의 칼럼 크로마토그래피법에서도, 후자는 부분 배치법이 아닌, 순수 칼럼 크로마토그래피법과 같은 통상의 방식, 즉 산업적 양까지 증량될 수 있는 방식으로 수행되더라도 높은 재현성으로 이행될 수 있다. 다시 말하면, 소규모로 수행된 부분 배치법은 칼럼 크로마토그래피법을 위한 "모델"로서 사용될 수 있다. 소형화는 종래 최적화 방법에 비해 실질적으로 더 저렴하고 더 신속한 조작을 가능하게 한다. 또한, 바람직한 양태에 따르면, 소형화된 시험 배치는 적당한 시료 용기(예컨대, 멀티웰 여과 플레이트) 및 장치(멀티채널 피펫, 피펫팅 로봇)를 사용하여 다수가 병행으로 실시될 수 있고, 다수의 매개변수가 동시에 변동될 수 있다. 그 결과, 다량의 데이터가 수득되고, 이로부터 정제될 특정 생체분자를 위한 칼럼 크로마토그래피 조건을, 모든 중요한 매개변수에 대해 동시에 최적화된 조건으로 결정하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 종류의 최적화 방법은 비용이 저렴하고 신속하게 수행되어, 크로마토그래피 분리 방법에 적합한 매개변수의 최적 선택의 관점에서 상당한 진보를 이룬 것이다. 즉, 본 발명의 방법은 생체분자의 정제 방법을 개선하여, 이러한 종류의 생체분자가 사용되는 산물의 품질 및 경제적 실현가능성에도 상당히 기여한다.
도 1은 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따른 부분 배치법을 도시한 흐름도이다.
도 2는 로봇을 이용한 시험 순서를 개략적으로 도시한 것이다. 에탄올 용액을 함유하는 수조(1), 단백질 용액을 함유하는 시료 용기(2), 크로마토그래피 물질의 현탁액을 함유하는 시료 용기(3), 평형화, 세척 및 용출 완충액을 함유하는 미세역가 평판(4), 미세역가 여과 플레이트(5) 및 피펫 팁의 공급원(6)이 도시되어 있다.
도 3a 내지 도 3l은 실시예 3에 기술된 실험의 결과를 그래프로 도시한 것으로서, 도 3a 부터 도 3h까지 8개의 도면은 8가지 다른 크로마토그래피 물질에 의한 "결합 스크리닝(screening)"의 결과를 나타내는 반면, 도 3i부터 도 3l까지 4개의 도면은 4가지 다른 크로마토그래피 물질에 의한 "용출 스크리닝"의 결과를 나타낸다. 충전 단계("관류"), 세척 단계("세척1"), 3회의 용출 단계 "용출1"부터 "용출3"에서의 관류물 또는 용출액에서 공동(cavity)당 사용된 단백질의 총 양 및 회수된 단백질의 총 양(총 단백질)이 백분율로 제시되어 있다. 다이아그램에 제시된 4개 막대의 각 그룹 내 각각의 막대는 주석에 제시된 여러 pH 및 염 농도에서의 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 4에서 수득된, 단백질 mAb1의 칼럼 크로마토그래피 정제에 대한 용출 프로필(실선: 단백질 농도; 파선: 전도도) 및 상응하는 조건 하에 멀티웰 여과 플레이트에서 스크리닝의 mAb1 농도(막대)를 비교하여 도시한 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 실시예 5에 기술된 실험의 결과를 그래프로 도시한 것이며, 도 5a부터 도 5d는 4가지 다른 크로마토그래피 물질에 의한 스크리닝 결과를 나타낸다. 충전 단계("관류"), 세척 단계("세척1"), 3회의 용출 단계 "용출1"부터 "용출3"에서의 관류물 또는 용출액에서 공동당 사용된 단백질의 총 양 및 회수된 단백질의 총 양(총 단백질)이 백분율로 제시되어 있다. 8개 막대로 이루어진 각 그룹에서, 각 막대는 주석에 제시된 여러 염 농도에서의 결과를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 생물학적 분자를 분리(정제)하는 크로마토그래피 방법에 적합한 매개변수를 찾아내는 방법이 제공되며, 이 크로마토그래피 방법은 (하나 이상의) 평형화 단계, (하나 이상의) 충전 단계, (하나 이상의) 세척 단계 및 (하나 이상의) 용출 단계를 포함하고, 이러한 일련의 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계가 부분 배치법으로 수행되는 것을 특징으로 한다. 적어도 충전 단계는 크로마토그래피 물질의 현탁을 포함하고, 하나 이상의 용출 단계에서는 크로마토그래피 물질의 현탁이 제외되는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 크로마토그래피 물질이 평형화 단계(또는 평형화 단계들) 동안 현탁된다. 본 발명의 2가지 다른 대안적 양태에 따르면, 크로마토그래피 물질은 세척 단계 또는 세척 단계들에서 현탁되거나 현탁되지 않는다. 이러한 모든 양태들에서, 공정의 일부, 적어도 충전 단계를 크로마토그래피 물질의 현탁 하에(즉, 배치법) 수행하고, 다른 일부, 적어도 생체분자의 용출 동안은 크로마토그래피 물질이 현탁되지 않고, 대신 용출 완충액이 비현탁된 겔 층에 적용된 후 원심분리, 압력 구배의 적용 등에 의해 용출액이 회수되는 칼럼 크로마토그래피 방식으로 수행되는 것으로 이루어지는 부분 배치법이 사용된다.
"크로마토그래피 물질"이란 칼럼 크로마토그래피에 통상 사용되는 모든 물질을 의미한다. 다음과 같은 용도의 물질로 분류될 수 있다:
- 친화성 크로마토그래피,
- 이온 교환 크로마토그래피, 특히 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피,
- 소수성 상호작용 크로마토그래피,
- "역상" 크로마토그래피,
- 하이드록시-아파타이트 크로마토그래피,
- "소수성 전하 유도" 크로마토그래피 및
- "혼합 방식" 크로마토그래피.
하지만, 본 발명은 이러한 그룹이나, 이하에 명시되는 물질에만 제한되는 것은 아니다.
친화성 크로마토그래피용 물질은 정제될 생체분자가 크로마토그래피 물질에 선택적이고 특이적인 결합을 하게 하는, 담체 물질에 결합된 리간드를 포함한다. 항체의 정제에 흔히 사용되는 리간드는 단백질 A, 포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 세포벽 단백질 및 이의 다양한 변형체들 및 유도체들이다.
음이온 교환 크로마토그래피에 적합한 크로마토그래피 물질에 존재하는 작용그룹의 예에는 4급 하이드록시프로필디에틸아미노-에틸 그룹, 4급 트리메틸아미노에틸 그룹 또는 디에틸아미노에틸 그룹이 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에 적합한 그룹에는, 예컨대 설포메틸 그룹, 설포프로필 그룹 및 카복시메틸 그룹이 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피에는, 예컨대 에테르 및 메틸 리간드(단백질과의 상호작용이 보다 약함), 또는 부틸, 페닐 및 옥틸 리간드(상호작용이 강함)와 같은 알킬 및 아릴 리간드가 사용될 수 있다.
역상 크로마토그래피에도 알킬 또는 아릴 리간드가 사용되지만, 리간드 밀도는 소수성 상호작용 크로마토그래피에서보다 높은 것이 일반적이다.
"혼합 방식" 및 "소수성 전하 유도" 크로마토그래피에서는, 특히 pH에 따라 생체분자와의 상호작용이 달라지는 리간드가 사용된다(예컨대, BioSepra 제품인 MBI HyperCel® Sorbent 및 MEP HyperCel® Sorbent).
평형화 완충 용액, 시험 용액, 세척 용액 및 용출 용액(이하, 일반적으로 "완충 용액"이라 언급한다)은 포스페이트, 트리스, 아세테이트, 시트레이트 또는 글리신 완충액 등을 기본으로 하는 용액일 수 있다.
크로마토그래피 물질의 현탁은 예컨대 시료 용기를 (고 빈도) 진탕하거나(예컨대 기계식 진탕기를 사용하여), 크로마토그래피 물질의 피펫팅 반복을 통해 수행한다.
충전 단계에서는 특히 생체분자를 함유하는 시험 용액을 크로마토그래피 물질에 첨가한 후 항온처리 단계를 필요로 할 수 있다. 크로마토그래피 물질이 시험 용액과 지나치게 짧은 시간 동안 항온처리되면, 시험 용액이 세척 용액으로 교체되기 전에 생체분자가 크로마토그래피 물질에 완전하게 결합하지 않는 문제가 생길 수 있다. 항온처리 시간이 너무 길면, 많은 생체분자에서 생체분자의 변성이 생기기 시작할 위험이 있다. 따라서, 생체분자의 종류, 시험 완충액 및 크로마토그래피 물질에 따라, 항온처리 기간은 전술한 극한값 사이에서 선택되어야 한다. 흔히, 측정된 최적 항온처리 기간은 120분을 초과하지 않을 것이다. 항온처리 기간은 60분 이하인 것이 바람직하다. 30분 미만의 항온처리 기간이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 "세척 단계"는 크로마토그래피 물질에 생체분자를 충전한 후, 이어지는 단계이다. 직면하는 특정 문제에 따라서, 이 단계 동안의 의도는 생체분자를 용출시키는 것일 수 있다. 이러한 경우에, 세척 단계는 용출 단계를 구성하여, 세척 단계와 용출 단계가 동시에 일어난다.
특정 문제에 따라, 충전 단계 동안의 시험 용액은 일정한 생체분자 또는 생체분자의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 문제에 따라 일정한 생체분자는 예컨대 확립되고 최적화되어야 하는 방법에서 대규모로 정제되어야 하는 단백질, 또는 (이전 정제 단계에서 단백질 A 칼럼으로부터 임의로 해리된 "추출 단백질 A"의 제거능을 조사하기 위해) 정제되어야 하는 단백질의 응집물 또는 단백질 A와 같은 일정한 불순물일 수 있다. 이 혼합물은 이후 단계에서 대규모로 정제하기 위한 출발 물질로서 사용되어야 하는, 예컨대 임의로 이전 원심분리 및/또는 여과 단계 후의 세포 용해물, 예컨대 과발현된 표적 단백질과 숙주 세포 단백질(HCP)의 혼합물일 수 있다.
앞에서 설명한 바와 같이, 소규모로 수행된 전술한 배치법은 대규모로 수행되어야 하는 상응하는 칼럼 크로마토그래피 정제 방법이 최적의 결과를 산출하는 크로마토그래피 조건을 측정하는데 사용될 수 있다. 크로마토그래피 물질의 특성, 완충액의 종류, 이온 강도/전도도, pH 등과 같은 선택된 조건이 더 좋은 결과 또는 더 나쁜 결과를 제공하는지는 적어도 용출 단계 또는 단계들의 관류물을 용출된 생체분자의 양 및 품질(예컨대, 여전히 존재하는 생물학적 활성)에 대해 분석하는 통상의 방식으로 측정할 수 있다. 더욱이, 충전 단계 및 세척 단계(또는 세척 단계들) 유래의 관류물은 수집한 후, 선택된 조건 하에 이들 단계에서 모든 생체분자의 결합성을 기술하기 위해 동일한 방식으로 분석한다. 관류물 및 용출액을 후처리 및 분석하는 성질은 크로마토그래피 및 시료물질, 즉 생체분자 또는 생체분자들의 혼합물의 특성에 따라 달라진다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피이고 이 칼럼에 HCP와 과발현된 표적 단백질(면역글로불린)의 혼합물을 충전한 경우에는, 예컨대 충전 단계 동안 시험 용액과 함께 첨가된 면역글로불린 중에서 크로마토그래피 물질에 결합한 비율(즉, 충전 단계 유래의 관류물에서는 발견할 수 없는 것), 세척 단계 또는 단계들 유래의 관류물에서 나타나는 면역글로불린 및 불순물의 양, 및 용출 단계 또는 단계들 유래의 용출액에서 발견될 수 있는 면역글로불린의 양 및 순도, 및 바람직한 생물학적 활성을 여전히 보유하는 비율을 찾아내는데 유용할 것이다. 이러한 발견은 통상의 방식, 예컨대 분광법 및 단백질을 측정하는 다른 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 불순물의 양은 SDS-겔 전기영동 또는 등전초점법에 의해 발견 및 정량할 수 있다.
본 발명의 하나의 특정 양태에 따르면, 이온 교환 크로마토그래피 시에 충전 및 용출 조건은 별도의 실험(결합 및 용출 스크리닝)에서 최적화되고, 용출 스크리닝 동안, 임의의 경우에 염 농도가, 예컨대 각 단계마다 단계적으로 변화되는 수개의 용출 단계가 제공된다.
바람직한 양태에 따르면, 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계는 많은 병행 시험 배치들에서 수행된다. 최적의 크로마토그래피 조건을 측정하기 위해, 이러한 조건은 각 시험 배치마다 적절하게 변동되어, 병행 실험 결과에서 달성될 수 있는 정제 결과로부터 특정 생체분자 및/또는 크로마토그래피 물질에 최적인 크로마토그래피 조건이 도출될 수 있다. 병행 실험의 진행은 다수의 시료 용기가 구비되어 있고, 여기에 크로마토그래피 물질과 완충 용액(예컨대, 평형화 완충액, 임의로 생체분자를 함유하는 시험 용액, 세척 용액 및 용출 용액)이 주입되는 멀티웰 여과 플레이트를 사용하여 달성할 수 있으며, 상기 용기의 바닥은, 완충 용액은 통과시키지만 크로마토그래피 물질은 이탈시키지 않는 여과성 물질로 봉쇄되어 있다. 이러한 종류의 멀티웰 또는 미세역가 여과 플레이트는 예컨대 상표명 Captiva®(Varian®, 96웰, 공극 크기 0.45㎛), MultiScreen®(Millipore®, 96웰, 공극 크기 0.22㎛, 0.45㎛ 및 0.65㎛) 및 Silent Screen®(Nunc®, 96웰, 공극 크기 0.45㎛)에서 구할 수 있다. 크로마토그래피 용액 및 완충 용액은 통상의 멀티채널 피펫이나 피펫팅 로봇(예, Freedom Evo 150®, 제조사 Tecan®)을 이용하여 플레이트 상의 시료 용기에 피펫팅할 수 있다.
웰에 피펫팅되는 크로마토그래피 물질 및 완충 용액의 용적은 다양하며, 전술한 96웰 여과 플레이트 중 하나를 이용한 경우에는 0.01 내지 2ml 범위가 바람직하고, 0.05 내지 2ml 범위가 더욱 바람직하다. 처음에 여과 플레이트를 크로마토그래피 물질로 충전하는 동안에는, 먼저 여과 플레이트를 예를 들면 20% 또는 10% 에탄올 용액 등으로 세정한 다음, 크로마토그래피 물질을 20% 또는 10% 에탄올 용액 중의 1 내지 60%(w/v) 현탁액으로서 첨가하는 것이 유리한 것으로 입증되었다.
병행 시험 배치들에서 본 발명에 따른 방법의 수행은 다수의 칼럼 크로마토그래피 매개변수가 동시에 최적화되게 하여, 이와 같이 측정된 조건 하에 심지어 산업적 규모에서도 우수한 정제 수율을 산출하는 칼럼 크로마토그래피 공정을 극히 짧은 시간 내에 더 소량의 물질을 가지고 개발할 수 있는 가능성을 개척한다. 이러한 방식으로 더 유익한 공정이 달성될 수 있고 고가의 개발 시간 및 고가 물질(크로마토그래피 물질, 생체분자 등)을 절약할 수 있다.
가장 특히 바람직한 양태에 따르면, 다음과 같은 순서의 단계들에 따른 방법이 수행된다(도 1 참조):
(a) 크로마토그래피 물질의 현탁액을 멀티웰 여과 플레이트 내의 복수의 웰(시료 용기)에 놓는다.
(b) 원심분리 또는 압력차를 적용하여 크로마토그래피 물질 위의 상청액을 제거하여, 상기 현탁액을 함유한 웰에 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
(c) 웰에 함유된 크로마토그래피 물질을 평형화시키기 위해 평형화 완충 용액을 수분 겔 층에 첨가하고, 이 겔 층을 현탁시키고, 임의로 특정 시간 동안 상기 용액과 항온처리하는 단계(평형화 단계),
(d) 상기 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
(e) 임의로 상기 단계 (c)와 (d)를 수회, 특히 1회, 2회 또는 3회 반복하는 단계,
(f) 크로마토그래피 물질의 충전을 위해, 상기 겔 층에 적어도 하나의 생체분자를 함유하는 시험 용액을 첨가하고, 이 겔 층을 현탁시키고 임의로 충전 용액과 항온처리하는 단계(충전 단계),
(g) 상기 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
(h) 크로마토그래피 물질의 세척을 위해 세척 용액이 겔 층에 첨가되고, 임의로 이 겔 층을 현탁시키며, 임의로 다시 항온처리하는 단계(세척 단계),
(i) 상기 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
(k) 임의로, 상기 단계 (h) 및 (i)를 수회, 특히 1회, 2회 또는 3회 반복하며, 그 동안 사용된 세척 용액은 조성이 동일하거나 상이한 것일 수 있고, 임의로 겔 층을 현탁시키거나 현탁시키지 않는 단계,
(l) 생체분자의 용출을 위해, 겔 층의 현탁을 유발하지 않고 겔 층에 용출 용액을 첨가하는 단계(용출 단계),
(m) 상기 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키고 용출액을 수집하는 단계,
(n) 임의로, 상기 단계 (l) 및 (m)을 수회, 특히 1회, 2회 또는 3회 반복하고, 이 때 사용되는 용출 용액은 조성이 동일하거나 상이한 것일 수 있는 단계, 및
(o) 수집된 용출액을 분석하는 단계.
수집될 수 있는 기타 관류물과 용출액을 농도 및 생물학적 활성(예컨대, 특정 결합성)에 대해 통상의 방법으로 분석한 후에는 당업자는 최상의 결과를 나타낸 시험 배치를 말할 수 있고, 이로써 최적 결과를 수득하기 위해 어떠한 조건 하에서 각 단계가 수행되어야 하는지를 결론지을 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 설명되지만, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 주제가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명의 하나의 양태에 따른 방법의 수행을 위한 일반적 지침(다수의 병행 시험 배치들의 자동화 방법)
제1 단계로서, 멀티웰 여과 플레이트를 20% 에탄올 용액으로 세정한다. 이를 위해, 상기 용액을 플레이트에 쏟아붓고, 이것을 원심분리하고, 이와 같이 원심분리된 에탄올 용액을 미세역가 플레이트의 하부로 몰리게 한 후 폐기한다. 그 다음, 여과 플레이트를 크로마토그래피 물질의 각 현탁액으로 충전한다. 필요하다면, 추가로 20% 에탄올 용액이 현탁액에 첨가될 수도 있다. 원심분리는 물질이 침착되게 하고, 액체는 물질이 너무 건조되지 않을 때까지 제거한다. 관류물도 역시 제거한다. 그 다음, 크로마토그래피 물질의 평형화를 수행한다(도 1 참조). 이를 위해, 평형화 조건에 상응하는 완충액을 크로마토그래피 물질에 첨가한다. 그 후, 플레이트를 미세역가 플레이트 진탕기에서 최대 속도로 항온처리하여 완충액과 물질을 혼합한 다음, 다시 완충액을 원심분리한 후 제거한다. 이 단계는 예시로서, 도 1에 도식적으로 나타낸 개요도에 따라 1회 반복한다.
후속 충전 단계에서는, 미리 평형화에서와 같은 pH 수준 및 염 함량으로 조정해 놓은 준비된 단백질 용액을 크로마토그래피 물질에 첨가하고 미세역가 플레이트 진탕기에서 항온처리한다. 여액은 관류물(FT)을 형성한다. 후속 세척 및 용출 단계에서는 상응하게 조정된 완충액(예컨대, 실시예 3 및 5 참조)을 크로마토그래피 물질에 첨가한다. 임의로, 세척 단계 동안 추가로 진탕 및 항온처리를 수행할 수도 있지만, 용출 동안에는 진탕이 없어야 한다("부분 배치법"). 각 단계마다 액체 상은 원심분리로 제거된다. 세척 단계의 여액은 "W" 또는 "세척"과 진행 횟수로 표시하고, 용출 단계 유래의 용출액은 유사하게 "E" 또는 "용출"과 진행 횟수로 표시한다. 마지막에, 제거되지 않은 총 여액 150㎕는 280nm에서 함량을 광도 측정하기에 적합한 미세역가 플레이트로 옮겨 담는다.
평형화, 충전 및 세척 동안에 혼합물은 진탕 및 항온처리하는 것이 바람직하다. 이에 반해, 보통 pH 및/또는 염 함량의 변동 하에 수행되는 용출 동안(예컨대, 실시예 3 및 5 참조)에는 용출 완충액을 크로마토그래피 물질에 조심스럽게 첨가하고, 그 즉시 혼합 및 항온처리 없이 충분하게 원심분리한다.
표 1은 상기 단계들의 전형적인 순서를, 전형적인 항온처리 기간에 대해 예시적으로 제공된 데이터를 포함해서 제시한 것이다. 세척 완충액은 pH와 염 함량이 평형화 완충액에 상응한다. 이 때, 용적과 원심분리 세팅은 Silent Screen® 멀티웰 여과 플레이트(Nunc® 제품)에 맞춰 조정한다. 2200rpm(분당 회전수)은 1012g의 상대적 원심분리 가속도에 상응하고, 1200rpm은 301g에 상응한다. 항온처리는 미세역가 플레이트 진탕기에서 최대 속도, 즉 약 1400rpm으로 수행한다.
단계 액체의 첨가 항온처리
기간		 원심분리 횟수
용적 종류 속도 기간
세정 350㎕ 20% 에탄올 용액 - 2200rpm 1분 1x
크로마토그래피 매질로 충전됨 100㎕ 현탁액
-
1200rpm
1분
1x
100㎕ 20% 에탄올 용액
평형화 200㎕ 평형화 완충액 5분 1200rpm 1분 2x
충전 200㎕ 단백질 용액 21분 1200rpm 1분 1x
세척 200㎕ 세척 완충액 9분 1200rpm 1분 0-4x
용출 200㎕ 용출 완충액 - 1200rpm 1분 0-5x
다수의 병행 시험을 자동으로 수행하기 위해서는 피펫팅 로봇을 사용하는 것이 바람직하다. 도 2는 이러한 형태의 방법에 사용될 수 있는 전형적인 배열을 예시한 것이다. 수조(1)는 전술한 에탄올 용액을 함유한다. 시험 용기(2) 및 (3)에는 생체분자를 함유하고 적당한 pH 값과 염 농도로 조정된 시험 용액 및 크로마토그래피 물질의 현탁액이 담겨 있다. 위치 (4)에는, 평형화 완충액, 세척 완충액 및 용출 완충액을 함유하는 미세역가 플레이트/DWP가 구비된다. 이 옆에는 멀티웰 여과 플레이트(5)가 구비된다.
실시예 2: "부분 배치법"과 (완전) 배치법 2개의 양태의 비교
부분 배치법을 배치법과 비교하였다. 배치법에서는 진탕과 항온처리가 모든 단계에서 수행된다. 이에 반해, 본 발명에 따른 부분 배치법에서는 평형화 및 충전 단계에서 혼합물은 진탕, 항온처리 및 원심분리되고(또는 약간 다른 방식으로 상청액이 크로마토그래피 물질로부터 제거된다), 용출 단계에서는 즉시 원심분리가 수행된다(또는 약간 다른 방식으로 상청액이 크로마토그래피 물질로부터 제거된다). 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 세척 단계 동안에도 진탕 및 항온처리가 수행되기도 하지만, 제2 양태에 따르면 세척 단계 동안 세척 완충액을 조심스럽게 적용한 후, 원심분리 또는 약간 다른 방법으로 즉시 제거된다.
어떠한 방법이 적당한 크로마토그래피 조건의 최상의 지표를 제공하는지를 판단할 수 있기 위해, 앞에서 언급한 방법을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 항체의 정제에 대해서 시험하였다. 크로마토그래피 물질로서 Phenyl Sepharose 6 FF를 사용하였다. 사용된 항체는 pH 6.5인 50mM 트리스 완충액의 전도도가 황산암모늄에 의해 120mS·cm-1로 증가할 때 결합한다. 따라서, 평형화 및 세척 완충액과 단백질 함유 충전 용액은 이러한 조건으로 조정하였다. 용출 완충액은 더 적은 황산암모늄을 함유하여, 전도도는 50mS·cm-1 이었다. 평형화의 항온처리 기간은 각 경우마다 5분이고, 21분 동안 충전, 9분 동안 세척을, 적용가능한 경우, 사용하였다. 수집된 분획 중의 회수율(충전시 관류물: FT; 세척 단계: W1 내지 W3; 용출 단계: E1 내지 E4)은 표 2에 제시하였다.
분획 FT W1 W2 W3 E1 E2 E3 E4 합계
부분 배치 방법/현탁을 수행하는 세척 단계:
평균 값 2.4% 2.8% 2.4% 2.2% 42.0% 17.6% 8.7% 5.2% 83.2%
표준 편차 0.7% 0.4% 0.4% 0.3% 1.9% 0.8% 0.4% 0.2%
부분 배치 방법/현탁이 없는 세척 단계:
평균 값 6.9% 3.6% 1.3% 0.4% 33.3% 19.1% 8.5% 5.2% 78.2%
표준 편차 4.0% 1.5% 0.4% 0.1% 3.1% 1.5% 1.0% 0.7%
배치 방법:
평균 값 2.2% 2.8% 2.0% 1.5% 30.2% 16.4% 7.7% 3.8% 66.5%
표준 편차 0.3% 1.2% 0.2% 0.1% 4.0% 3.4% 2.5% 1.3%
표 2로부터 분명하게 알 수 있듯이, 부분 배치법의 회수율은 83.2% 또는 78.2%로, 물질의 약 2/3만을 회수하는 것이 가능했던 배치법에서보다 훨씬 높은 회수율이었다. 더욱이, 이 실험은 배치법에서, 특히 용출 단계 동안의 재현성이 부분 배치법에서보다 훨씬 나쁘다는 것을 보여준다(더 큰 표준편차). 이와 관련하여, 세척 단계 동안에 현탁시키는 양태에 따른 부분 배치법은 특히 양호한 결과를 제공한다. 이 결과의 믿을만한 재현성은 이와 같이 측정된 최적의 크로마토그래피 조건을 대규모로 수행되는 칼럼 크로마토그래피 공정 단계로의 이전가능성에 요구되는 중요한 전제조건이다.
실시예 3: 모노클로날 항체의 정제에 적합한 양이온 교환 물질 및 적합한 크로마토그래피 조건의 스크리닝에 사용되는 본 발명에 따른 방법의 용도
진핵생물 세포 배양물 중의 항체를 제조하는 데 있어서, 표적 단백질은 다른 생체분자와 복합 혼합물에서 배지로 분비된 단백질로서 나타나는 것이 일반적이다. 모노클로날 항체 mAb1의 경우에, 양이온 교환기를 이용한 항체의 농축(enrichment)에 최적인 조건을 측정하기 위해 다음과 같은 스크리닝 과정을 수행하였다:
결합 스크리닝:
최적의 크로마토그래피 물질과 이상적인 결합 조건(결합 스크리닝)을 결정하기 위해 2가지 스크리닝 실험을 사용하였다:
제1 수행: SP Sepharose®, Toyopearl® SP 650M, Toyopearl® SP 550C, EMD Fractogel® SO3;
제2 수행: CM Ceramic Hyper DLS®, S Ceramic Hyper DF®, Poros 50 HS®, CM Sepharose FF.
여기서, SP와 HS는 크로마토그래피 물질의 기본 매트릭스에 공유 결합된 작용그룹으로서, 설포프로필 그룹을 나타내고, SO3은 설포이소부틸 그룹을 나타내며, CM은 카복시메틸 그룹을 나타내고 S는 설폰산 그룹을 나타낸다.
사용된 단백질 용액, 즉 발현 세포를 발효한 후 원심분리 및 여과에 의해 수득한 세포 배양 상청액은 이하 표 3a1에 제시된 조건으로 조정하였다:
표 3.1: 제1 수행과 제2 수행에서 충전 수집물(pool)(mAb1을 함유하는 시험 용액)을 위한 조건
수집물 1 수집물 2 수집물 3 수집물 4 수집물 5 수집물 6 수집물 7 수집물 8
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 7.0 7.5 5.0
용적[ml] 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6
함량[mg/ml] 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
크로마토그래피 물질은 20% 에탄올 용액에 현탁시킨 10% 현탁액을 사용하였고, 이로써 0.05ml의 겔 층이 생성되었다. 스크리닝은 전술한 부분 배치법에 따라 수행하였다(세척 단계 동안 현탁을 수행함). 2회의 평형화 단계 후, 단백질 용액(mAb1을 함유하는 시험 용액; 표 3.1 참조)의 충전 및 세척 단계를 수행하였다. 그 다음, 용출은 3 단계로 수행하였다. 2개의 딥 웰 플레이트(용적이 2ml인 멀티웰 플레이트; 이하 DWP라 지칭함)에, 표 3.2와 3.3에 명시된 바와 같은 실시예 1에 기술된 시험 순서에 따라 완충액을 배치하였다. 각 조건마다 3회 측정을 수행하였고, 이 측정값은 후속되는 rProtA-HPLC(기본 매트릭스에 결합된 재조합 단백질 A를 이용한 분석용 친화성 크로마토그래피)에 의한 항체 농도의 연속 측정 동안 수집되었다.
표 3.2: 딥 웰 플레이트 1에서의 완충액 조건 및 순서
평형화 1
(DWP1.1 칼럼 1-4)		 평형화 2
(DWP1.2 칼럼 5-8)		 세척
(DWP1.3 칼럼 9-12)
50mM 아세테이트 pH 4.0
50mM 아세테이트 pH 4.5
50mM 아세테이트 pH 5.0
50mM 포스페이트 pH 5.5
50mM 포스페이트 pH 6.0
50mM 트리스 pH 6.5
50mM 트리스 pH 7.0
50mM 아세테이트 pH 5.0
표 3.3: 딥 웰 플레이트 2에서의 완충액 조건 및 순서
용출1
(DWP2.1 칼럼 1-4)		 용출2
(DWP2.2 칼럼 5-8)		 용출3
(DWP2.3 칼럼 9-12)		 pH
50mM 트리스 0.3M NaCl 50mM 트리스 0.6M NaCl 50mM 트리스 1M NaCl pH 9.0
각 분획들의 관류물 또는 용출액에서 발견되는 mAb1 농도는 도 3a 내지 3h에 제시하였다. 이러한 회수를 기초로 하여 선택된 분획과 결합 특성을 이용하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였고, 용출 스크리닝(최적의 용출 조건을 위한 스크리닝)을 위해 다음과 같은 크로마토그래피 매트릭스를 선택하였다: SP Sepharose® FF, Toyopearl®SP 650M, Poros® 50 HS, EMD Fractogel® SO3.
용출 스크리닝:
용출 스크리닝에서는 mAb1을 함유하는 세포 비함유 배양 상청액의 pH를 표 3.4에 나타낸 바와 같이 pH 5.0 및 6.5로 조정하였다:
표 3.4: 제1 수행 및 제2 수행에서 충전 수집물(mAb1을 함유하는 시험 용액)을 위한 조건
수집물 1 수집물 2 수집물 3 수집물 4 수집물 5 수집물 6 수집물 7 수집물 8
pH 5.0 5.0 5.0 5.0 6.5 6.5 6.5 6.5
용적[ml] 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6
함량[mg/ml] 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
평형화 단계, 세척 단계 및 용출 단계를 위해 표 3.5 및 3.6에 열거된 완충액을 딥 웰 플레이트에 첨가하였다:
표 3.5: 딥 웰 플레이트 1에 사용된 완충액 조건 및 순서
평형화 1
(DWP1.1 칼럼 1-4)		 평형화 2
(DWP1.2 칼럼 5-8)		 세척
(DWP1.3 칼럼 9-12)
50mM 아세테이트 pH 5.0
50mM 아세테이트 pH 5.0
50mM 아세테이트 pH 5.0
50mM 아세테이트 pH 5.0
50mM 포스페이트 pH 6.5
50mM 포스페이트 pH 6.5
50mM 포스페이트 pH 6.5
50mM 포스페이트 pH 6.5
표 3.6: 딥 웰 플레이트 2에 사용된 완충액 조건 및 순서
용출1
(DWP2.1 칼럼 1-4)		 용출2
(DWP2.2 칼럼 5-8)		 용출3
(DWP2.3 칼럼 9-12)		 pH
50mM 포스페이트,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 6.0
50mM 포스페이트,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 6.5
50mM 트리스,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 7.0
50mM 트리스,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 7.5
50mM 포스페이트,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 6.0
50mM 포스페이트,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 6.5
50mM 트리스,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 7.0
50mM 트리스,
50mM NaCl		 + 100mM NaCl + 200mM NaCl 7.5
도 3i 내지 3l은 각 단계에서 특정 조건 하에 웰당 적용된 총 mAb1 함량의 백분율을 그래프로 도시한 것이다. 표적 단백질의 회수율과 유리한 저염 농도(예컨대, 산업적 규모로의 이행 비용을 최소화하기 위해 바람직한 것)와 관련하여, pH 5에서의 충전과 EMD Fractogel® SO3에서 0.05M 염과 pH 6.5에서의 용출이 적합한 조건인 것으로 확인되었다(도 3l, B10-B12 참조).
실시예 4: 마이크로웰 여과 플레이트에서 본 발명에 따른 스크리닝 방법의 결과와 종래 칼럼 실험 결과의 상호 연관의 가능성
실시예 3에서 측정된 최적 조건을 사용하여, 1ml 용적의 층에 대해 칼럼 크로마토그래피 실험을 수행하였다. 유속은 0.5ml/min이었다. 칼럼 충전은 pH 5에서 0M NaCl의 염 농도 하에 수행하였다. 동일한 조건 하에 세척 단계를 수행하였다. 용출을 위해, 0/0.05/0.1/0.2M NaCl의 단계식 구배를 사용하였다. 이것은 EMD Fractogel® SO3이 사용되고 pH 5에서 결합 단계와 pH 6.5에서 용출 단계가 수행된 마이크로웰 여과 플레이트에서의 스크리닝 조건을 모방한 것이다.
도 4는 상기 방식으로 수행된 칼럼 크로마토그래피의 용출 프로필(실선: 단백질 농도; 파선: 전도도) 및 실시예 3(막대)의 상응 조건 하에 멀티웰 여과 플레이트에서 본 발명에 따른 스크리닝에서 수득된 바와 같은, 웰당 적용된 총 mAb1 함량의 백분율이 중첩된다는 것을 보여준다. SDS-PAGE에 의한 관류물 및 용출액의 추가 분석은 피크 중의 mAb1 산물의 분포가 스크리닝에서의 결과 일치하며, 즉 농축된 mAb1이 상응 용출액 중에 존재한다는 것을 입증할 수 있었다. 이것은 본 발명에 따른 방법에 의해 발견된 최적의 크로마토그래피 조건을 크로마토그래피 칼럼이 사용되는 방법에 이행시킬 수 있음을 증명한다.
실시예 5: 여러 크로마토그래피 조건 하에 소수성 상호작용 매트릭스에서의 모노클로날 항체 거동의 스크리닝
본 실시예를 위해, 제1 단계로 rProtein A 친화성 크로마토그래피에 의해 농축된 항체 mAb2를 사용하였다. 본 스크리닝의 목적은 크로마토그래피 물질로서 소수성 상호작용 매트릭스에 상응한 mAb2의 거동을 측정하여, 다음 단계에서 항체 mAb2와 관련하여 결합 또는 관류 조건이 조사되어야 하는지, 즉 항체가 칼럼에 결합하고 불순물이 가능한 멀리 관류하게 하거나, 항체가 관류하고 불순물이 칼럼 물질에 결합하여 불순물이 농축되게 함으로써 달성할 수 있다.
다음과 같은 크로마토그래피 물질을 사용하였다: Phenyl Sepharose® HP, Phenyl Sepharose® FF, Toyopearl® Phenyl 및 Toyopearl® Butyl. 사용된 단백질 용액은 이하 표 5.1에 명시된 조건으로 조정하였다.
표 5.1: 제1 수행 및 제2 수행에서 충전 수집물(mAb2 함유 용액)의 조건
수집물 1 수집물 2 수집물 3 수집물 4 수집물 5 수집물 6 수집물 7 수집물 8
pH 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5
황산암모늄 (AS) 0M 0.1M 0.26M 0.3M 0.4M 0.6M 0.8M 1M
용적[ml] 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6
함량[mg/ml] 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64
상기 크로마토그래피 물질을 20% 에탄올 용액에 현탁시킨 10% 현탁액을 사용하였고, 이러한 방식으로 0.05ml의 겔 층을 만들었다. 부분 배치법을 사용하였다. 실시예 3에서와 같이, 2회의 평형화 단계 후에 단백질 함유 시험 용액의 충전을 수행하고(표 5.1 참조), 그 다음 세척 단계를 (크로마토그래피 물질의 현탁하에) 수행하였다. 그 다음 용출을 3 단계로 수행하였다. 완충액은 표 5.2와 5.3에 제시한 바와 같이, 실시예 1에 기술된 시험 순서에 따라 2개의 딥 웰 플레이트에 주입하였다. 각 조건마다 3회 측정을 실시하였다. 스크리닝에 사용한 단백질 용액에는 불순물이 소량만이 존재하기 때문에, 이어서 미세역가 플레이트 광도계에서 280nm 흡광율로 산물 농도를 측정할 수 있다.
표 5.2: 딥 웰 플레이트 1에서의 완충액 조건 및 순서
평형화 1
(DWP1.1 칼럼 1-4)		 평형화 2
(DWP1.2 칼럼 5-8)		 세척
(DWP1.3 칼럼 9-12)		 pH
50mM 트리스 0M AS 50mM 트리스 0M AS 50mM 트리스 0M AS pH 6.5
50mM 트리스, 0.1M AS 50mM 트리스, 0.1M AS 50mM 트리스, 0.1M AS
50mM 트리스, 0.2M AS 50mM 트리스, 0.2M AS 50mM 트리스, 0.2M AS
50mM 트리스, 0.3M AS 50mM 트리스, 0.3M AS 50mM 트리스, 0.3M AS
50mM 트리스 0.4M AS 50mM 트리스 0.4M AS 50mM 트리스 0.4M AS
50mM 트리스, 0.6M AS 50mM 트리스, 0.6M AS 50mM 트리스, 0.6M AS
50mM 트리스, 0.8M AS 50mM 트리스, 0.8M AS 50mM 트리스, 0.8M AS
50mM 트리스, 1M AS 50mM 트리스, 1M AS 50mM 트리스, 1M AS
표 5.3: 딥 웰 플레이트 2에서의 완충액 조건 및 순서
용출1
(DWP2.1 칼럼 1-4)		 용출2
(DWP2.2 칼럼 5-8)		 용출3
(DWP2.3 칼럼 9-12)		 pH
50mM 트리스 0M AS 50mM 트리스 0M AS 50mM 트리스 0M AS pH 6.5
50mM 트리스, 0M AS 50mM 트리스, 0M AS 50mM 트리스, 0M AS
50mM 트리스, 0.1M AS 50mM 트리스, 0M AS 50mM 트리스, 0M AS
50mM 트리스, 0.2 AS 50mM 트리스, 0.1 AS 50mM 트리스 0M AS
50mM 트리스 0.2M AS 50mM 트리스 0.1M AS 50mM 트리스, 0M AS
50mM 트리스, 0.4M AS 50mM 트리스, 0.2M AS 50mM 트리스, 0M AS
50mM 트리스, 0.6M AS 50mM 트리스, 0.3M AS 50mM 트리스, 0M AS
50mM 트리스, 0.6M AS 50mM 트리스, 0.3M AS 50mM 트리스, 0M AS
각 분획에서의 산물의 농도는 도 5a 내지 5d에 제시하였다. mAb2는 매우 높은 염 농도에서만 소수성 매트릭스에 결합하는 것으로 발견되었다. 즉, mAb2의 경우에는 관류 크로마토그래피 단계로서 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정 단계를 구축하는 것이 더욱 바람직하다. 이를 위한 최적 조건은 본 발명에 따른 방법으로 수행한 추가 스크리닝들에 의해 저렴한 비용으로 용이하게 측정할 수 있다.

Claims (13)

  1. 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법으로서,
    일련의 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계를 포함하는 시험이 다양한 각각의 파라미터를 사용하여 소규모로 실시되고, 이들 시험 결과로부터 최적의 파라미터 결과가 도출되며, 상기 일련의 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계가 부분 배치 방식(크로마토그래피 물질의 현탁을 수행하는 단계 및 상기 현탁을 수행하지 않는 단계)으로 수행되는 것을 특징으로 하고,
    (a) 크로마토그래피 물질의 현탁액이 멀티웰 여과 플레이트 내의 다수의 웰에 배치되는 단계,
    (b) 원심분리하거나 또는 압력차를 적용하여 상기 크로마토그래피 물질 위의 상청액을 제거하여, 상기 현탁액을 함유하는 웰에 수분 겔 층(moist gel bed)을 형성시키는 단계,
    (c) 상기 웰에 함유된 상기 크로마토그래피 물질의 평형화를 위해 상기 수분 겔 층에 평형화 완충 용액을 첨가하고 상기 겔 층을 현탁시키는 단계(평형화 단계),
    (d) 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
    (e) 임의로 단계 (c)와 (d)를 수회 반복하는 단계,
    (f) 상기 크로마토그래피 물질의 충전을 위해, 상기 겔 층에 하나 이상의 생체분자를 함유하는 시험 용액을 첨가하고, 이 겔 층을 현탁시키는 단계(충전 단계),
    (g) 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
    (h) 상기 크로마토그래피 물질의 세척을 위해 세척 용액이 상기 겔 층에 첨가되고, 임의로 이 겔 층을 현탁시키는 단계(세척 단계),
    (i) 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키는 단계,
    (k) 임의로, 단계 (h) 및 (i)를 수회 반복하며, 이 때 사용되는 세척 용액은 조성이 동일하거나 상이한 것일 수 있고, 임의로 상기 겔 층을 현탁시키거나 현탁시키지 않는 단계,
    (l) 상기 생체분자의 용출을 위해, 상기 겔 층의 현탁을 유발하지 않고 상기 겔 층에 용출 용액을 첨가하는 단계(용출 단계),
    (m) 단계 (b)에 따라 수분 겔 층을 형성시키고 용출액을 수집하는 단계,
    (n) 임의로, 단계 (l) 및 (m)을 수회 반복하고, 이 때 사용되는 용출 용액은 조성이 동일하거나 상이한 것일 수 있는 단계, 및
    (o) 상기 수집된 용출액을 분석하는 단계를 포함하는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 평형화, 충전, 세척 및 용출 단계가 다수의 병행 시험으로 수행되고, 이 때 크로마토그래피 조건은 2개 이상의 시험에서 상이하고, 각 실험 결과의 크로마토그래피 결과를 비교함으로써 유리한 크로마토그래피 조건이 도출되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 단계가 피펫팅 로봇을 사용하여 수행되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질로서, 이온교환, 소수성 상호작용, 친화성, 하이드록시 아파타이트, 역상, 소수성 전하 유도 또는 혼합 방식의 크로마토그래피용 물질이 사용되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 현탁이 상기 크로마토그래피 물질 또는 상기 멀티웰 여과 플레이트의 진탕에 의해 또는 상기 크로마토그래피 물질의 피펫팅 반복에 의해 달성되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생체분자가 단백질, 단백질 혼합물 또는 숙주 세포 단백질과 과발현된 표적 단백질의 혼합물인, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 평형화 용액, 상기 시험 용액, 상기 세척 용액 및 상기 용출 용액으로부터 선택된 하나 이상의 용액의 첨가 후에 상기 크로마토그래피 물질이 평형화, 시험, 세척 또는 용출 용액으로 항온처리되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 용출 단계 또는 단계들의 용출액 및, 임의의 충전 및 세척 단계로부터의 관류물이 회수되어 분석되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 각 혼합물의 크로마토그래피 물질이 이로부터 수득되는 겔 층의 용적이 0.01ml 내지 2ml가 되도록 하는 양으로 사용되는, 생체분자 분리를 위한 크로마토그래피 방법에 적합한 파라미터를 찾아내는 방법.
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