CN102770769B

CN102770769B - 旋转柱系统和方法

Info

Publication number: CN102770769B
Application number: CN201080041217.7A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·萨科夫斯基; 斯科特·富尔顿
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: EP2454600B1; WO2011014357A1; US20110014722A1; CN102770769A; US8377394B2; EP2454600A1

Abstract

本发明提供了一种低床容量的旋转柱系统及使用方法。该系统包括旋转柱与填充床(17)、用于保持所述旋转柱(10)的支架(50)、附接到所述支架(50)并具有与保持在所述支架(50)中的所述旋转柱(10)配准的孔井(40)的接收器孔板(30)、附接到所述接收器孔板(30)并对所述旋转柱(10)进行密封的盖子(70)、以及容放所述接收器孔板(30)的孔井(40)并对填充床(17)进行培养的培养器块体(80)的各种组合。所述盖子(10)、旋转柱(10)、支架(50)、接收器孔板(30)和培养器块体(80)优选地能够以嵌套构型进行组装。在本发明的优选形式中，所述支架(50)与常规96孔井的微孔板(20)兼容并且可附接到该微孔板(20)。本发明进一步提供了利用该旋转柱系统的方法，包括：对分析物进行定量提纯和分析，除去在所述填充床(17)之内滞留的空气并防止空气在其内滞留，并且在防止所述填充床变干的同时对所述填充床进行培养。

Description

旋转柱系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年3月12日递交的美国临时专利申请61/313,390、2009年12月9日递交的美国临时专利申请61/285,135以及2009年7月15日递交的美国临时专利申请61/225,674的优先权，每个专利申请均通过引用全文而纳入本文中。

技术领域

本发明涉及被设计来进行测定的低床容积(lowbed-volume)的旋转柱(spincolumn)系统，这些测定可以涉及定量结合(binding)和从固相载体洗脱和/或温度受控的化学反应。

背景技术

在医药品、食品和饮料制造、临床诊断和生命科学研究的领域中的许多应用需要准确且精确地确定特殊目标分析物的浓度。目标分析物经常与许多其它种类的相似分子一起包含在非常复杂的混合物中。包含目标分析物的常见样品包括血液、细胞溶菌、细胞培养介质、处理流等。

对于分析物在这种复杂样品中的准确且精确的定量需要一种高选择性的测定。用于这种类型的分析物的常见测定是免疫测定。在免疫测定中，使用抗体结合目标物并将其固定在固相表面上。这样的结合通过将未结合的分子洗掉而使得目标物与液体样品中的其它分子分离。在该分离之后，利用诸如酶、荧光染料等标记标记的对于目标物的第二种抗体用来产生信号，以便灵敏地指示结合到固相的目标物的量。在某些形式中，目标分析法本身可以进行标记以产生可探测的信号。免疫测定是选择性的，即，能够在目标物和样品中的其它分子种类之间进行识别。它们还可以是高选择性的，即，能够测量ng/mL范围内或更低范围内的浓度。

然而，免疫测定对于某些应用具有严重的缺点。免疫测定相对复杂，需要复杂且昂贵的试剂。其对于自动操作存在困难。在诸如生物制药学的制造的大量领域中，在制造应用中极大地需要高精确度以跟踪制造过程中的的产量或质量平衡。目标分析物可以是在处理流中的蛋白质产物本身。在这样的制造应用中的产物浓度通常可能在μg/mL至mg/mL的范围内。因此，免疫测定的高灵敏度(典型地在ng/mL范围内或更低范围内)就是问题所在。通常需要进行数个量级的稀释来使样品浓度达到测定的范围内。这实质上增加了测定的复杂性，并且使其难以实现所需的精确度或再现性。

用于这种类型的应用的一种通常的方法是使用填充有树脂的高性能色谱(HPLC)柱，该树脂以高选择性的方式结合目标分析物。典型的树脂包括选择性地结合目标分析物的固定化亲和配体。可替代地，可以使用更为常规的色谱树脂(例如离子交换或倒相)来选择性地分离目标物。在将样品注入到HPLC柱内之后，对该柱进行洗涤，并且利用从固定化配体释放分析物的试剂对分析物进行洗脱。可以利用HPLC检测器中的紫外线(UV)吸收率来确定分析物的数量。这种处理的实例是利用蛋白质AHPLC柱来测量来自细胞培养产物系统的样品中的治疗性单克隆抗体(IgG)的浓度。这样的测试对于目标物(在此情况下为IgG)是高选择性的，在不进行样品稀释的条件下在μg-mg/mL的范围内进行操作，并且具有非常高的精确度(通常具有＜5％的变异系数(CV))。然而，亲和HPLC需要复杂且昂贵的仪器系统。该系统每次只能够运行一个样品，并且每个样品的运行典型地花费5-15分钟。因此，该系统上的吞吐量被限制为每小时4-12个样品。

提高样品吞吐量的一种方法是同时运行多个柱和样品。利用常规HPLC系统进行大规模多路复用是困难且昂贵的，这是因为对于每个样品通道或柱都需要单独的泵、注射器、柱和检测器。然而，通过能够应用到这种类型的定量测定的固相萃取，已经开发出了用于样品制备的大量相对高吞吐量的设备和方法。

一种这样的设备是移液吸头柱，其利用空气位移移液管来将液体经过一次性吸头(tip)移入及移出，该一次性吸头填充有选择性结合树脂。对于高吞吐量的应用能够使用多通道移液管系统(高达96甚至384个通道)。然而，移液吸头柱具有几点不利之处。高吞吐量的平台需要昂贵的自动的机器人系统。此外，液体经过移液吸头柱中的填充床的流动受限于在吸头的远端处进入和离开的单一端口。因此，由于在移液吸头本身以及包含样品或洗涤缓冲液的孔井(well)两者中发生的混合而极难从填充床获得定量的洗涤和稀释。最后，移动液体的空气位移方法会极难控制样品的流速，特别是在需要相对低的流速来获得定量结合时更是如此。因此，在对于定量样品制备有用的同时，移液吸头设备已证明对于目标分析物的定量分析是不可用的。

替代类型的高吞吐量的提纯设备使用真空歧管来使液体经过多个填充床而在向下方向上移动。这样的设备通常用于固相萃取。如同移液吸头柱一样，对流速的控制是困难的，特别是在对于定量萃取所需的低流速下更是如此。另外，这样的歧管必须具有存在于所有可用真空位置中的柱，否则所产生的真空泄漏将使设备无效。这就使得难以改变正在一批中运行的样品的数量。

使用重力来经过填充床向下汲取液体是另一种提纯方法。对于许多应用而言，这种方法慢的不合实际。为了加速处理，可以将柱设置在离心机中来将有效g场升高到提供预期流速的水平。这样的“旋转柱”广泛地用于在各种应用中从样品萃取目标物，这是因为这些“旋转柱”不需要大大地超出可用的实验室离心机之外的复杂仪器或装备。事实上，所有可商用的旋转柱设计为与通用的微型离心机管道协作，该微型离心机管道的内径(ID)为9mm，且容积为1.5或2.0mL。这些设备的最大外径必须远远大于9mm，以便防止包含树脂的设备被驱动进入管道内。这些设备的树脂床柱典型地为100μL或更大。

对于大数量的相对小的样品的高吞吐量的分析以及便利的处理，非常希望能够在生物分子科学协会/美国国家标准学会(theSocietyforBiomolecularSciences/AmericanNationalStandardsInstitute)(SBS/ANSI)微孔板格式标准之内进行工作。许多不同类型的标准微孔板可作为成型的塑料部件而以低成本得到。诸如移液管的液体处理设备也设计为在该标准之内工作。常规SBS/ANSI96孔井的微孔板具有中心隔开9mm的孔井。其通常设计用于利用广泛可得的测光板(opticalplatereader)来快速地读取所有孔井的吸光度。

常规旋转柱设备具有数个缺点。设计为与微型离心机管道单独地工作的目前可得到的设备体积过大而不能与微孔板作用，无论是对于配合到9mm间隔内而言还是对于具有适合于微孔板孔井的容积的床柱而言都是如此。大量多柱旋转柱设备已经以在每个孔井中具有容积的微孔板的形式设立。如果使用者有96个样品要运行，则这些旋转柱的孔板工作良好。然而，如果有少于96个样品要运行，则旋转柱孔板在首次运行之后被丢弃，并且浪费了未使用的孔井。可替代地，在二次运行中使用在旋转柱的孔板上的未使用的孔井，但是其具有交叉污染的风险。其有利之处在于，每个样品仅耗费一个旋转柱，但是能够在用于分析的常规微孔板的孔井中收集洗出液。

常规旋转柱设备的另一个缺点在于，这些设备易掺气。掺入旋转柱之内的空气会具有数个有害后果。这些有害后果包括流速降低并且结合能力丧失，流速降低导致流速在给定的“xg”力下在柱管之间出现变化性，结合能力丧失是由于填充床的空气阻塞部分引起的。这两个问题导致分析结果中的变化性极大地升高，并且在极端情况下，会导致柱管的气阻，其完全阻止了样品的加载。拂过捕获的气泡足够大，则这些气泡还会减少或阻塞在离心的过程中经过床的流动，特别是在定量结合所需的低g场下更是如此。因此需要一种不易掺气的旋转柱设备。

常规旋转柱设备的又一个缺点在于，这些设备易干燥。某些类型的固相载体的旋转柱设备必须在湿润条件下存储和运送。这些载体包括通常凝胶类型的色谱介质(例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素)和各种合成聚合物水凝胶材料，例如聚(甲基丙烯酸酯)。这些材料在干燥时会经受凝胶结构不可逆的塌缩，这就极大地降低了性能。因此需要一种不易干燥的旋转柱设备。

发明内容

本发明提供了的旋转柱系统克服了上述常规系统的缺点。在示例性形式中，所述旋转柱系统包括至少一个旋转柱、支架和接收器孔板。所述支架具有穿过该支架的至少一个孔隙，所述孔隙的尺寸和构型设计为可释放地接合所述旋转柱。对于所述支架中的每个孔隙，所述接收器孔板都具有至少一个对应孔井。所述支架和接收器孔板的尺寸和构型设计为彼此接合，从而当所述支架和所述接收器孔板接合时使所述孔隙和所述孔井配准。当所述支架和所述接收器孔板接合并且所述旋转柱设置在所述孔隙中时，所述旋转柱的填充床完全设置在所述孔井的底部表面和所述孔井的孔井开口之间。

在某些形式中，所述支架、所述旋转柱和所述接收器孔板的尺寸和构型优选地设计为将所述旋转柱的出口吸头悬挂在所述接收器孔板的孔井的底部表面的5mm之内。当所述支架和所述接收器孔板接合时，在所述接收器孔板上的顶部板的顶部表面优选地接触所述支架的顶部板的底部表面。另外，当所述支架和所述接收器孔板接合时，所述支架的侧部板和边沿优选地分别接触所述孔板的侧部板和边沿。当所述支架和所述接收器孔板接合时，所述支架的侧部板还优选地接触所述接收器孔板的边沿。

在某些形式中，支架的尺寸和构型设计为与微孔板接合，所述微孔板例如为常规96孔井的微孔板或适合于分析样品的另一种微孔板。在某些形式中，所述支架、所述旋转柱和所述微孔板的尺寸和构型优选地设计为将所述旋转柱的出口吸头悬挂在所述孔井的孔井开口的5mm之内。这些形式可以与包括具有容量的填充床的旋转柱进行组合，其中所述填充床的容量至多为所述微孔板的孔井的容量大约1/5，或者在某些情况下至多为所述微孔板的孔井的容量大约1/10。在一个特定实例中，所述填充床的容量为大约60μL或更少。本文所描述的容积比为系统提供了适合于以高吞吐量的方式进行分析的容量，其中所述分析涉及从所述旋转柱进行定量洗脱并且增加体积等于分析溶液体积的分析试剂。

在本发明的特定形式中，所述支架包括96个孔隙且所述接收器孔板包括96个孔井，并且所述孔隙和所述孔井以9mm中心距呈8×12阵列设置。这就能使该系统与常规SBS/ANSI96孔井的微孔板相兼容。

本发明的某些形式还包括盖子，所述盖子的尺寸和构型设计为与所述支架接合，并接触所述旋转柱。当所述盖子与所述支架接合并且正接触所述旋转柱，特别是正接触所述旋转柱的上轮缘时，并且当所述支架安装在本文所述的接收器孔板上时，该组件优选地形成基本密封的腔室。该腔室包括所述旋转柱的样品杯、所述填充床以及所述接收器孔板的孔井。在某些情况下，所述腔室借助于所述旋转柱和所述支架、所述支架和所述孔板以及所述盖子和所述旋转柱的上轮缘之间的连续接触而对来自所述腔室的过度蒸发基本地密封。

本发明的某些形式还包括培养器块体，所述培养器块体的尺寸和构型设计为接触所述孔板的孔井外表面的实质部分。所述培养器块体进一步构型为加热及冷却到特定温度特定的时间量。所述盖子、旋转柱、接收器孔板和培养器块体的构型和尺寸优选地设计为以嵌套构型进行组装。

本发明还提供了利用本文所述的旋转柱系统的方法。一个方法是对分析物进行分析的方法。所述方法包括：作为第一步骤，将所述旋转柱插入所述支架中的孔隙中，并且使所述支架与所述接收器孔板接合，其中所述旋转柱、所述支架和所述接收器孔板形成组装单元，并且其中所述旋转柱与所述接收器孔板中的孔井配准。所述方法还包括以下步骤：将样品加载到所述旋转柱中，使所述组装单元旋转，其中所述样品中的分析物结合到所述旋转柱中的填充床，对来自所述填充床的未结合的样品成分进行洗涤，对来自所述填充床的分析物或该分析物的衍生物进行洗脱，并且分析所述分析物或该分析物的衍生物。

该旋转步骤优选地包括：使所述组装单元在离心机中旋转，从而在离心力下将增加到所述旋转柱的液体推动经过所述旋转柱的填充床，并且推动到所述可变的孔井内。按照本文的用法，“结合到填充床”包括将所述分析物结合到固定化亲和试剂或吸附剂微粒的填充床中的其它选择性结合表面，用于使所述分析物分离或对所述分析物提纯。在所述旋转步骤的过程中，所述分析物定量地结合并保留在所述填充床中。在某些形式中，洗涤或洗脱步骤包括：将体积至少是所述填充床的容量的五倍的洗涤或洗脱缓冲液增加到所述旋转柱，旋转所述组装单元，并且收集经过所述孔井中的流体，其中所述孔井的容量为所述填充床的容量的至少5倍。在其它形式中，所述孔井的容量为所述填充床的容量的至少10倍，并且分析包括：将体积至少等于所述洗脱缓冲液的体积的分析试剂增加到所述孔井，将洗脱液和分析试剂混合以产生混合物，并且读取该混合物。分析步骤优选地包括：对分析物的量进行定量。该实例中描述的分析物的其它类型、描述于本文其它位置的分析物或者本领域公知的分析物也是可接受的。在该方法中所用的系统构型为使得在所述分析步骤之后，能够将所述旋转柱从所述支架移走，并且能够利用相同的支架并利用第二旋转柱或第二套旋转柱来重复所述方法。

所述方法的某些形式在加载步骤之前还包括：对所述填充床进行再湿润，其中该再湿润包括：将一定量的液体增加到所述旋转柱，并且利用所述接收器可变高速旋转所述组装单元，其中在旋转步骤之后，以一定量的液体将所述接收器孔板的孔井填充到至少等于在所述旋转柱中的所述填充床和所述样品杯之间的界面的高度，其中一部分液体在旋转之后保留在所述样品杯中，并且其中从所述填充床中除去空气。

本发明的某些形式包括：利用如本文所述的接收器孔板来执行插入、加载和旋转步骤。所述接收器孔板能够随后被移走并被常规96孔井的微孔板或适合于分析样品的其它孔板替代，其中分析物在洗脱步骤的过程中被收集在该微孔板的孔井中。随后的分析步骤也利用该微孔板来执行。

本发明的某些形式包括：利用如本文所述的接收器孔板来执行插入、加载和旋转步骤，以便将分析物结合到所述填充床。其随后的步骤是：将包含诸如酶的分析试剂的液体加载到所述旋转柱内，将该液体旋转到所述填充床内以使该酶暴露到所述填充床中的结合的分析物，在培养器块体上对该组件进行培养以允许在受控温度下发生酶促反应，并且将得到的诸如分析物衍生物的反应产物从所述旋转柱洗脱到诸如接收器孔板的孔板内。

在某些形式中，所述方法还包括：使盖子与所述支架接合以形成基本密封的腔室，该腔室包括所述旋转柱的样品杯、所述填充床和所述接收器孔板的孔井。形成这样的腔室在运送该组件的过程中保护了所述旋转柱。特别是在培养器块体中培养所述接收器孔板的孔井的过程中，形成这样的腔室还使来自该系统的蒸发最小化。在其它形式中，所述方法包括：在洗脱步骤之后在培养器块体中培养所述接收器孔板的孔井，以便促进洗脱缓冲液从该分析物的蒸发。

本发明提供了一种用于以高吞吐量的方式在样品中进行提纯、化学反应和对分析物进行分析的模块化系统。即使在使用小于96个样品时，该系统也使得每个样品只耗费一个旋转柱，但是能够利用通用的方法在常规96孔井的微孔板中对分析物进行收集和分析。本文所公开的所述填充床与孔井的容积比容许以定量且高吞吐量的方式通过大量通用的整套方法来对分析物进行分析。本文所述的方法还构型为防止填充床的干燥和掺气。

通过接下来与所附附图相结合的本发明的优选实施方案的具体描述将更为全面地呈现本发明的各目的和优点。

附图说明

图1显示了本发明的盖子、旋转柱、支架、接收器孔板和培养器块体的分解的侧视剖视图。

图2显示了以嵌套构型组装的本发明的盖子、旋转柱、支架和接收器孔板的侧视剖视图。

图3显示了以嵌套构型组装的本发明的盖子、旋转柱、支架、接收器孔板和培养器块体的侧视剖视图，其用于在受控制的温度下进行培养。

图4显示了以嵌套构型组装的本发明的接收器孔板和培养器块体的侧视剖视图，其用于从接收器孔板中蒸发液体。

图5显示了本发明的旋转柱、支架和接收器孔板的侧视剖视图，其中旋转柱组装在支架中。

图6显示了在再湿润之后以嵌套构型组装的本发明的旋转柱、支架和接收器孔板的侧视剖视图。

图7显示了在加载之后以嵌套构型组装的本发明的旋转柱、支架和接收器孔板的侧视剖视图。

图8显示了在定量和/或分析之前与用于在其中洗脱的常规微孔板组装的本发明的旋转柱和支架的侧视剖视图。

图9为显示通过本发明的旋转柱系统提纯并定量的人类IgG(hIgG)的恢复的图表。

图10为显示通过本发明的旋转柱系统利用考马斯蓝(CoumassieBlue)提纯并定量的hIgG的恢复的图表。

图11显示了利用本发明的旋转柱系统通过增溶的肽N糖苷酶F酶而从固定化IgG释放的N联聚糖的HPLC色谱图。

具体实施方式

旋转柱系统大致包括下列项的组合或任意的部分组合形式：旋转柱10、微孔板20、接收器孔板30、支架50、盖子70和培养器块体80。

旋转柱10和填充床17：

图1-3和5-8中显示了旋转柱10的示例性形式。具体参考图1，旋转柱10包括与填充床17呈流体连通的样品杯14。样品杯14在一端处具有由旋转柱10的上轮缘(upperrim)12限定的入口，并且在相对端处具有与填充床17的界面16。样品杯14限定空腔，并且具有的容量足以保持样品、洗涤溶液、洗脱缓冲液或其它液体的体积。样品杯14和/或样品杯入口的尺寸和构型优选地被设计为将移液吸头容放在其中，以便于液体的运送。

填充床17由液体可渗透的固相构成，例如微粒(凝胶微粒或其它)或薄膜等。适合的固相材料包括常见凝胶类型的色谱介质(例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素)、各种合成聚合物材料(例如聚(甲基丙烯酸酯)和聚(苯乙烯-二乙烯苯))以及各种无机材料(例如二氧化硅、氧化铝、碳和玻璃)。填充床17在一端处经由界面16而与样品杯14流体连通，并且在相对端处通向旋转柱10的出口吸头18。出口吸头18限定开口以允许流体在离开填充床17时经其流动离开旋转柱10。填充床17的液体容量优选地介于大约0.5和500μL之间，更优选地介于大约1和250μL之间，最优选地介于大约5和100μL之间，例如大约5、10、20、30、40、50、60、70、80或90μL或介于这些数值之间的范围。

填充床17构造为与目标分析物选择性地结合。填充床17可以经过适合的选择性结合表面或经过表面涂层而能够靠其自身结合目标分析物，或者可以具有试剂(例如亲和试剂)，该试剂能够共轭(conjugated)结合到目标分析物。

适合的选择性结合表面或涂层包括疏水的或亲水的表面(对于正相和反相，疏水作用和亲水作用)和带正电荷或带负电荷的表面(对于离子交换)。适合的亲和试剂包括经过亲和识别和吸引力而特定地且选择性地结合分析物的任何物质。亲和识别通常类似于锁和钥匙之间的关系，其对于目标物是高度特定的，并且通常具有在10^-8M以下的离解常数(WinzorD.J.，JChromatogr.20041037(1-2)：351-67；ChaikenI.M.，JChromatogr.1986，376：11-32)。适合的亲和试剂包括抗体、蛋白质、肽、亲和体、小体、适配子、核苷酸(RNA或DNA)、聚合物、金属螯合配体、小分子等等。

由选择性吸附微粒的填充床17捕获的分析物可以是样品(该样品需要进行分析、提纯、表征、定量或化学改性)中的任何分子或物质。分析物的实例通常包括但不限于蛋白质、肽、核苷酸、碳水化合物、合成化合物和小分子，并且特别是包括抗原、RNA、DNA及其配合物等。在某些实例中，分析物可以包括亚细胞器、细胞和微生物。特定分析物通常在利用本文所述系统进行提纯/或分析之前与其它非分析物物质在样品中进行混合或配合。特定地结合到结合表面、表面涂层或亲和试剂的分析物能够利用本文所述的系统而与分析物和非分析物物质的给定化合物中的非分析物物质分离。按照本文的用法，“分析物”还包括结合到填充床17的反应物，并且“分析物的衍生物”包括源于反应物的反应产物。

可行的分析物亲和试剂结合对的实例包括但不限于抗体-抗原和抗体-半抗原对；受体-配体结合对；核酸杂交低聚物(例如DNA或RNA片段)；人造结合配对体(bindingpartner)(例如分子印迹——对小分子进行分子铸型的工艺，通过如下步骤实现：组合树脂与小分子，对树脂进行交联或进行其它硬化，对树脂进行研磨，并且萃取小分子而形成能够特定地结合该小分子的小分子特定铸型)；以及RNAnexamers——能够充当特定结合配对体的官能化RNA低聚物。

对于如本文所述地进行构造并构型的旋转柱10，液体经由样品杯入口而被导入到样品杯14内。液体可以包含洗掉未结合样品元素或从填充床洗脱已结合分析物所需的分析物或缓冲液成分。在施加离心力时，液体经过填充床17行进并经过出口吸头18离开填充床。分析物变为结合到填充床17。洗涤或洗脱液体以相似方式经过填充床而被导入并旋转。

微孔板20：

图8显示了微孔板20的示例性形式。示例性微孔板20包括具有上表面22的顶部板21以及具有外表面24的侧部板23。微孔板20还包括顶部板21之内限定的孔井25。在由顶部板21、孔井壁27和底部表面28限定的平面中，孔井25包括孔井开口26。微孔板20的孔井25优选地限定具有孔井壁27和底部表面28的圆柱形形状，该孔井壁27限定的平面基本垂直于由微孔板顶部板21限定的平面，该底部表面28限定的平面基本平行于由微孔板顶部板21限定的平面。底部表面28还可以具有圆形或圆锥形的底部。微孔板20可以具有呈任意构型的、任意数量的孔井25。然而，优选的微孔板20包括以8×12的二维矩形阵列、9mm的中心距分布在顶部板21上的96个孔井。与本发明一起使用的示例性微孔板包括常规SBS/ANSI格式的96孔井的微孔板。其它微孔板也是适合的。

微孔板20构造为接收从旋转柱10洗脱的液体90，并且在某些情况下，附加地构造并且/或者构型为执行对从旋转柱10洗脱的液体90中的分析物的下游分析。对于下游分析，微孔板20中的孔井25可以包括试剂。在某些情况下，试剂化学结合到孔井25的内表面，例如底部表面28。这样的试剂可以包括在分析物检测或分析中所涉及的目前公知的或将来发现的任何试剂，包括抗体、配体、酶、辅因子、共酶、蛋白质等。构型用于例如执行酶键合免疫吸附剂测定(ELISAs)的微孔板在市场上从GreinerBio-One(Kremsmünster，Austria)可获得。

旋转柱10和孔井25优选地配准(inregistration)地定位，即相对于彼此定位，使旋转柱10的出口吸头18定位在孔井25紧上方或者定位为相对于孔井25居中。这就能够在洗脱液从填充床17洗脱时经过出口吸头18对洗脱液进行收集。这样的定位可以例如通过使用支架50(在下文中将具体讨论)来实现。

旋转柱10和孔井25的尺寸和构型优选地协调地涉及为能够对分析物进行定量提纯和分析。要想准确并可再现地进行定量提纯和分析，则应当满足两个不同要求。首先，洗脱容积应当足以完全地洗脱所有的已结合分析物。对于色谱柱，应当使用洗脱缓冲液的至少五个床容积来完成定量洗脱。其次，来自填充床17的所有洗脱液加上任何色度或荧光测定试剂(如果使用的话)所需容积应当能够配合在单一光微孔板孔井25的容积之内。这就免去了要将液体转移到用于进行定量分析的分离孔井25内的需要，这样的转移将使测定变得复杂并使其可再现性降低。

这两个要求组合起来设定了旋转柱10中的填充床17的容量相对于孔井25的容量的上限。如果直接对洗脱液进行分析，则孔井25的容量应当为填充床17的容量的大约或至少五倍，以允许从填充床17进行定量洗脱。下面将描述直接分析洗脱液的方法。如果在该分析中使用分析试剂(例如色度或荧光试剂)，则孔井25的容量相对于填充床17的容量的比值更大。通常，测定试剂的增加体积应当至少等于正在被分析的样品溶液的体积。因此，在优选形式中，孔井25的容量为填充床17的容量的大约或至少十倍，以便除了测定试剂之外还容纳洗脱液(5×填充床17)。孔井25的其它容量也是可接受的，其中孔井25的容量为填充床17的容量的大约或至少大约0.5倍、2倍、5倍、20倍、50倍或100倍。反过来，本发明的填充床17的容量优选地为孔井20的容量在至多大约1/5，例如容量为孔井25的容量的大约1/10，1/50或1/100。

适合于在测光板中进行光检测的常规SBS/ANSI格式的96孔井的微孔板具有的孔井的容量为大约300μL或更小。本发明的示例性形式的格式设计为与这样的常规微孔板可兼容。因而，本发明的填充床17(被格式设计为在直接分析时与常规微孔板一起使用)的容量应当为大约60μL或更小，例如为60、50、40、30、20、10、5、2.5或1μL，或者介于这些数值之间的容量。在利用色度或荧光试剂的分析中与常规微孔板一起使用的本发明的填充床17的容量应当为大约30μL或更小，例如为30、20、10、5、2.5或1μL，或介于这些数值之间的容量。

接收器孔板30：

图1-7显示了示例性接收器孔板30。参考图1，示例性接收器孔板30包括具有上表面32的顶部板31、具有外表面34的侧部板33以及从侧部板33偏移的边沿(lip)35，该边沿35具有上表面36和外表面37。接收器孔板30还包括顶部板31之内限定的孔井40。孔井40在由顶部板31限定的平面中包括孔井开口41，并且包括具有内表面43和外表面45的孔井壁42。内表面43包括作为其子部的底部表面44。接收器孔板30的孔井40优选地限定截头圆锥形形状，其中孔井壁42以孔井40的横截面直径从孔井开口41到底部表面44减小的方式形成角度。底部表面44限定的平面优选地平行于由接收器孔板的顶部板31限定的平面，但也可以是圆形或凹面的。接收器孔板30可以具有呈任意构型的任意数量的孔井40。然而，优选微孔板30包括以8×12的二维矩形阵列、9mm的中心距分布在顶部板上的96个孔井。设计为一起使用的接收器孔板30和微孔板20具有同样数量的孔井40、25，这些孔井40、25横跨顶部板31、21具有同样的分布和构型。接收器孔板30优选地由薄壁塑料制成，但是可以由任何其它材料制成。

如图2、3、6和7所示，接收器孔板30被构造为将液体90存储在孔井40中，将旋转柱10的出口吸头18浸没在存储于孔井40的液体90中，接收从旋转柱10洗脱的液体90，并且在某些情况下，附加地构造并且/或者构型为对于从旋转柱10洗脱的液体中的分析物执行下游分析。接收器中的孔井40可以包括与如上对于微孔板20所述的同样的试剂，并且可以具有与如上对于微孔板20所述的相对于填充床17的容量的同样的容量。

旋转柱10和孔井40优选地相对于彼此定位，从而使旋转柱10的出口吸头18对准地相对于孔井40居中。出口吸头18优选地定位在孔井40的底部表面44的略微上方。这就使得除了在从填充床17洗脱液体时经过出口吸头18收集液体90之外，出口吸头18浸没存储在孔井40的液体90的极小的体积中。这样的定位可以通过使用支架50(在下文中将具体讨论)来实现。在某些形式中，旋转柱10和孔井40可以协调地构造并构型为对分析物进行定量提纯和分析，如本文对于微孔板20所述的那样。

支架50：

图1-3和5-8显示了示例性支架50。具体参考图1，示例性支架50包括：具有上表面52和下表面53的顶部板51；限定在顶部板51之内的孔隙54；具有内表面56、外表面57和底部表面58的侧部板55；从侧部板55偏移的边沿60，该边沿60具有内表面61和外表面62。

支架50，更具体地为孔隙54构造为固定地但可松开地将旋转柱10保持于其中。如图2所示，环绕旋转柱10的外周缘的脊部19提供了止挡件来防止旋转柱10经过孔隙54掉落，并且能使旋转柱10在悬挂在支架50之内。旋转柱10的可选渐缩部与孔隙54的对应渐缩部一起便于将旋转柱10固定支撑在支架50之内，并且优选地便于在旋转柱10和支架50之间形成连续接触。按照本文中的用法，“连续接触”意指两个物体之间的在其之间不存在间隙的接触。

支架50构造为在接收器孔板30和/或微孔板20的孔井40、25的中心上配准地悬挂旋转柱10的出口吸头18。通过具有相同数量的孔隙54的支架50来实现这点，这些孔隙54横跨顶部板51的分布和构型与接收器孔板30和/或微孔板20中的孔井40、25的分布和构型相同。因此，支架中的孔隙54还与接收器孔板30和/或微孔板20中的孔井40、25配准。支架50还可以包括任意构型的任意数量的孔隙54，包括一个、两个或更多个。在优选形式中，支架50包含8×12的二维矩形阵列的、中心距为9mm的96个孔隙54，以便能与96常规96孔井的微孔板20和/或相似格式的接收器孔板30一起使用。因而，与这样的支架50一起使用的旋转柱10的大小设计为使旋转柱10能够以中心距为9mm的出口吸头19的二维阵列布置在支架50之内。该构型中的旋转柱10利用其竖直取向的纵向轴线进行定位。然而，支架50还可以构型为以任何预期构型或几何形状来保持旋转柱10。

支架50的构型和尺寸被设计为固定地并可松开地安装在微孔板20和/或接收器孔板30上，以便在孔井25的中心上对准地悬挂旋转柱10。图8中显示了安装在微孔板20上的支架50。为了能够将支架50这样安装在微孔板20上，微孔板20和支架50优选地协调地进行构造，其中档支架50安装在微孔板20上时，支架50的侧部板55的底部表面58接触微孔板20的上表面22，并被支撑在上表面22上。(参考图1对于支架50的元件的编号。)这就优选地在支架50的顶部板51和微孔板20的顶部板21之间产生间隔。此外，支架50的边沿60的内表面56优选地接触微孔板20的侧部板23的外表面24。支架50和微孔板20之间的接触优选地为连续接触。

如图8所示，微孔板20、支架50和旋转柱10优选地构造为使得当旋转柱10安装在支架50中并且支架50安装在微孔板20上时，旋转柱10的出口吸头18被大致悬在由微孔板20的顶部板21限定的平面中，悬挂成刚刚高于该平面，或者悬挂成刚刚低于该平面。例如，出口吸头18可以被悬在离由微孔板20的顶部板21限定的平面小于或等于大约0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5mm的距离处。这就防止了液体在从出口吸头18洗脱的同时与孔井40错开，并且允许在浸没出口吸头18的条件下将液体收集在孔井40中。

支架50的构型和尺寸还设计为固定地并可松开地安装在接收器孔板30上，以便在接收器孔板30的孔井40的中心上对准地悬挂旋转柱10。为了能使支架50这样安装在接收器孔板30上，接收器孔板30和支架50优选地协调地进行构造，其中接收器孔板30和支架50能够以嵌套构型进行堆叠。图2显示了这样的构型。(参考图1对于支架50和接收器孔板30的元件的编号。)特别而言，支架50的顶部板51、侧部板55和/或边沿60优选地能够分别与接收器孔板30的顶部板31、侧部板33和/或边沿35接触。更特别地，支架50上的顶部板51的下表面53、侧部板55的内表面56、侧部板55的底部表面58和/或边沿60的内表面61优选地能够与接收器孔板30上的顶部板31的底部表面32、侧部板33的外表面34、边沿35的上表面36和/或边沿35的外表面37分别接触。支架50和接收器孔板30之间的接触优选为连续接触。

如图2具体所示，在本发明的优选形式中，旋转柱10在接收器孔板30之内悬挂到位，以便维持将出口吸头18浸没在接收器孔板30的空间40中包含的少量液体90中。减速器孔板30、支架50和旋转柱10优选地构造为使得当旋转柱10安装在支架50中并且支架50安装在接收器孔板30上时，旋转柱10的出口吸头18恰好悬挂在接收器孔板孔井40的底部表面44上，以便在两者之间限定最小间隙64。间隙64优选地等于或小于介于大约10mm和0.0001mm之间的距离，例如为大约10mm、5mm、2.5，1mm、0.5mm、0.1mm、0.05mm、0.01mm、0.005mm、0.001mm、0.0005mm或0.0001mm，或者这些数值之间的范围。同样优选地，旋转柱10悬在孔井40中，使填充床17和样品杯17之间的界面16低于由孔井开口41限定的平面，进而使液体能够将孔井40填充到高于由界面16限定的平面的点，而液体不会从孔井40溢出或流出，如图6所示。

当旋转柱10安装在支架50上并且支架50安装在接收器孔板30上时，支架50优选地能够与旋转柱10和接收器孔板30两者产生连续接触。特别而言，优选地在旋转柱10的外表面和孔隙54的内表面之间优选地产生连续接触。在支架50的顶部板51的下表面53和接收器孔板30的顶部板31的顶部表面32之间同样优选地产生连续接触。

本文所述的接收器孔板40和微孔板20优选地能够在具有微孔板转子的标准台式离心机中与支架50和旋转柱10组合使用。

盖子70：

图1-3显示了示例性盖子70。具体参考图1，示例性盖子70包括具有下表面72的顶部板71、侧部板73和延伸边沿74。边沿74从侧部板73偏移并且包括内表面75。盖子70配合在支架50的顶部上，其中旋转柱10安装在其中。优选地，盖子70在支架50上的配合是固定的但是足够松动的，从而能够在不拾取支架50的条件下例如利用机器人夹持器移走盖子70。盖子70并不通过其任何部分竖直地固定在包括侧部板55的任何部分的支架50上。这使得当盖子70安装在支架50(旋转柱10安装在其中)上时，盖子70的下表面72能够倚靠在旋转柱10的上轮缘12上，从而优选地在两者之间产生连续接触。

当盖子70、支架50、旋转柱10和接收器孔板30组装为单一的嵌套单元(参见图2和3)时，在盖子70和旋转柱10的上轮缘12之间、在支架50和接收器孔板30之间以及在旋转柱10和支架50之间的连续接触形成基本密封的“腔室”。该腔室包括旋转柱样品杯14、填充床17和接收器孔板孔井40，其限制了液体从该系统的蒸发或溢出。这对于存储、运送或者在升高的温度下培养的过程中是特别有用的，如下文所述并如图3所示。该组装的系统能够堆叠在标准机器人孔板处理设备上，并且利用建立在自动液体处理器上的自动标准机器人夹持器系统来进行组装或拆卸。

培养器块体80：

图1、3和4显示了示例性培养器块体80。具体参考图1，示例性培养器块体80包括培养器块体孔井81。如在接收器孔板30中那样，培养器块体80优选地具有同样数量的具有同样分布和构型的孔井81。培养器块体孔井81成形为直接接触接收器孔板孔井壁42的外表面45的实质部分，例如主要部分。培养器块体80的孔井可以接触接收器孔板30的孔井壁42的外表面45的大于或等于大约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，或者介于这些竖直之间的范围。为了实现该接触，构型为与具有截头圆锥形孔井40的接收器孔板30一起使用的培养器块体80也将具有截头圆锥形的孔井81。培养器块体80优选地包括诸如铝或铜的金属。

培养器块体80优选地连接到控温设备82。温度设备82可以被构型为在特定温度下对培养器块体80加热或冷却设定的时间量，并且可以受到温度控制器的控制。培养器块体80的热质量和导热性远大于薄壁塑料的微孔板30，并且经过接收器孔板孔井壁42的传递路径相对较短。因此，在孔井40中的任意液体经过热传递快速地达到培养器块体80的温度。

如图3所示，盖子70、支架50、旋转柱10、接收器孔板30和培养器块体80能够以嵌套构型进行组装。该构型的优点在于，当接收器孔板30通过培养器块体80进行加热时，由盖子70、支架50、旋转柱10和接收器孔板30的嵌套产生的基本密封的腔室使液体从腔室的蒸发尽可能小。

该系统可以包括任意数量的旋转柱10和对应的接收器孔板孔井40、支架孔隙54、培养器块体孔井81和微孔板孔井25。该数量少至一个，多至96或更多。该系统的优选形式的尺寸和构型设计为要么手动地要么利用机器人系统来同时处理多达96个柱管，并且设计为与常规ANSI/SBS96孔井的微孔板作用。

对于分析物的选择性提纯和定量分析：

利用上述要素，本发明提供了对来自样品的分析物进行选择性提纯和定量分析的方法。这样的方法可以包括：将包含分析物的样品加载在样品杯14中，在离心机中使旋转柱10旋转以促进分析物到填充床17中的亲和试剂的定量结合，对来自填充床17的剩余样品进行洗涤，将分析物从填充床17洗脱到孔井内，并且/或者对洗脱液中的分析物的量进行定量。

对于定量结合，旋转步骤必须在特定离心力下执行。离心力必须足够高以产生充分的样品流速，以便使样品移动经过填充床17。然而，离心力必须足够低以容许在分析物和亲和试剂之间进行结合反应，以便达到平衡。如果该结合未达到平衡，则样品将不会以定量方式结合并保留在填充床17中。能够进行这样的定量结合的离心力基本依赖于填充床17的容量，容量越大，则所使用的力越高，并且容量越小，则所使用的力越低。填充床17的诸如长度、半径等的其它尺寸也会影响最佳的力。通常而言，容许用于定量结合的离心力能够通过以下操作来确定：将单个样品分为相等部分，并且在旋转步骤中利用各种升高的离心速度来执行本发明。当分析物回收物显示为离心速度的函数时，容许范围由在给定离心力或力的范围下分析物回收物的峰值来指示。

洗涤步骤包括：在样品杯14中加载洗涤缓冲液，并且在离心机中使旋转柱10旋转。可以执行数次洗涤。洗涤步骤从填充床17移走来自初始样品的未结合到亲和试剂的残余物质。对于特定应用的可得到的洗涤缓冲液在本领域中是公知的。

洗脱步骤包括：增加优选地为填充床17的容量的至少五倍的量的洗脱缓冲液，在离心机中使旋转柱10旋转，并且在容量为填充床17的容量的至少五倍的孔井中收集洗脱液。如果随后需要进行定量分析，则关键是该步骤要形成为使得在平衡时还发生分析物与亲和试剂的脱离。所用的洗脱缓冲液和洗脱缓冲液经过填充床17的流速是导致以定量方式脱离的两个因素。所使用的具体洗脱缓冲液依赖于具体的分析物-亲和试剂的作用。用于特定分析物-亲和作用的洗脱缓冲液在本领域中是公知的。流速由离心力确定。容许的离心力能够以类似于对于定量结合所述方式的方式来确定。

定量步骤可以通过任意数量的公知方法来执行。定量优选地使用测光板来执行。测光板在本领域是公知的。常见的测光板具有检测像如吸光率、荧光强度、冷光、时间分辨荧光和荧光偏振等的能力。

对分析物进行定量的一种方法是在适合的波长下简单地测量已知体积的所收集分析物的吸光率。例如，蛋白质吸收280nm的光，而DNA吸收260nm的光。该方法简单且准确。然而，该方法的灵敏度和动态范围受到限制。其可能不适合用于某些应用，特别是在旋转柱10的容量受限制时。更高的灵敏度和动态范围可以通过混合洗脱分析物与分析试剂(例如色度或荧光试剂)来进行增益，该分析试剂有效地“放大”了光信号。其实例是布拉德福试剂(BradfordReagent)，其通常用于确定样品中的蛋白质浓度。当试剂之内包含的考马斯蓝结合到溶液中的蛋白质时，布拉德福试剂产生颜色变化。这些试剂用于对诸如蛋白质的分析物进行大致定量。利用与微量的高选择性分析物分离系统(通过本文所述的旋转柱设备来提供)组合的基于试剂的测定以高吞吐量的方式提供了得到提高的简易性，吞吐量、灵敏度、范围和可再现性。

定量的预期方法确定了填充床17相对于收集有洗脱液的孔井的容量的容量。例如，如果直接经过吸光率来分析样品，则填充床17的容量为孔井容量的大约或至少5倍。如果利用分析试剂来分析样品，则填充床17的容量为孔井容量的大约或至少10倍。

如果想要对常规微孔板20中的分析物进行定量，则当前方法可以与本文所述的支架一起使用。在这样的情况下，旋转柱10插入到支架50的孔隙54内，并且支架50在从填充床17洗脱分析物之前安装在微孔板20上(参见图9)。旋转柱10、支架50和微孔板20一起旋转，并且分析物被收集在微孔板20的孔井25中用于进一步的分析。因为旋转柱10能够可拆卸地插入支架50之内，所以每次测定运行并不会使用支架50中的所有孔隙54。因此，支架50能够容纳对应于确切数量的待分析样品的数量的旋转柱10。这就避免了想要分析的样品少于96个时对旋转柱10造成浪费的消耗。而且，支架50能够在进一步的测定运行中重新使用。旋转柱10、支架50和微孔板20的组合提供了用于对来自样品的分析物进行提纯和分析的模块化平台。相似的模块化能够利用接收器孔板30来实现。

能够用于本发明中的与亲和提纯和/或分析相关的成分和方法的进一步的实例见于U.S.Pub.No.2008/0176254中(U.S.Appl.No.11/874884)，通过引用全文将其纳入本文中。

对固定化反应物进行化学反应：

本发明还提供了以高吞吐量的方式对样品中的固定化反应物进行化学反应的方法。在这些应用中，通过疏水性和/或离子吸附性、共价结合或选择性结合(例如通过亲和配体)来将反应物固定在固相载体材料上。包含分析试剂的少量反应溶液被代换为填充床17的固相。反应溶液在填充床17中的代换容许将反应物转换为产物。反应产物优选地立即被释放为液相。出于分析的目的，关键是恢复与填充床17流体连接的所有液体，特别是因为预期反应产物能够潜在地散播到填充床17外。一旦完成反应，所释放的反应产物和/或固定化反应物就可以通过在一个或更多连续步骤中从旋转柱10洗脱而得到恢复。如上所述，“分析物”包括反应物，并且“分析物的衍生物”包含反应产物。

为了促进反应物和分析试剂之间的作用，反应物本身被固定在填充床17上，并且反应试剂以溶液被保持。该构型具有许多益处。首先，反应物的结合能够是高选择性的，从而能使其在反应之前从未处理样品混合物中被提纯。其次，反应时间能够被控制为长到达到完成反应的必要时间(其通常长于由经过填充床17的旋转液体能够获得的驻留时间)。最后，反应温度(其通常也是关键的)能够通过利用接收器孔板30和培养器块体80而受到精确控制。在离心的过程中极难实现精确的温度控制。

可以通过填充床17中的分析试剂来执行的各种分析的化学反应包括但不限于酯化、异构化、氧化、还原、环化、水解反应和标记反应。适合的分析试剂包括酶、共酶、辅因子、金属、离子和任何其它催化剂。在本发明中有用的酶包括已经用于合成目的的所有类别的酶，其要么利用合适的辅因子通过自身来合成，要么在多酶处理中与其它酶合成。已经用于合成目的的酶的实例包括但不限于肽N糖苷酶F、碱性磷酸酶、纤维素酶、过氧化氢酶、溶菌酶、脲酶、木瓜酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、辣根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、萄糖氧化酶、马肝醇脱氢酶、转化酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、肝素酶、硫酸酯酶、蔗糖合成酶、醛缩酶、天门冬氨酸酶、延胡索酸酶、β半乳糖苷酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶、米赫毛霉脂肪酶、萤光假单胞菌脂肪酶、猪肝酯酶、青霉素酰化酶和马肝酯酶。标记化合物或水解试剂也可以用作催化试剂。

反应物能够是能够通过催化剂化学转换为反应产物的任何有机或无机溶质。有机反应物包括核苷酸、核酸、氨基酸、蛋白质、肽、碳水化合物、糖类、糖蛋白和小分子。能够单独使用的有用反应物包括能够异构化的各种碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖以及能够环化的鲨烯类化合物。有用的反应物对包括酯-水、腈-水、酰胺-水、烯烃-水、酸-醇、酐-醇、酐-氨基酸、酯-胺、醛-羟基酮、醛-氰醇、氧化腈-烯烃、环氧乙烷-水和烯烃-胺。包含酶催化剂的辅因子介导的还原物包括酮、醛和烯烃物质。相似地，氧化物包含醇、醛、酮、硫化物和各种脂肪族和芳香族碳水化合物物质。

洗涤和洗脱步骤可以包括：增加为填充床17的容量的至少五倍的量的洗涤或洗脱缓冲液，在离心机中使旋转柱10旋转，并且在容量为填充床17的容量的至少五倍的孔井中收集洗脱液。使固定化反应物化学反应为如上所述的一种或更多者产物的方法能够与对分析物进行选择性地提纯和/或定量分析的所述方法一起使用，其中来自反应的产物构成分析物的衍生物。

温度受控的培养以及因其而减少蒸发：

在受控制的(典型地为升高的)温度下执行如上所述的反应通常是有利的，并且有时是重要的。在这些情况下，必须控制安装在支架50中的填充床17以及在填充床17之内并与填充床17接触的任何液体90的温度。已经发现，将组装好的系统简单地设置在烘炉或温度受控的腔室中是无效的，这是因为由空气到塑料部件内并由此到液体样品和填充床17内的热传导非常低。

例如在图2和3中所示的本发明的示例性形式中，支架50和接收器孔板30的系统构型为将旋转柱10保持在位，从而使旋转柱10的出口吸头18浸没接收器孔板孔井40中的一定量的液体90中。根据实验已经发现，热量高效地经过孔井40中的液体90传递，并高效地传递到填充床17内，从而快速且有效地控制填充床17中的温度。即使孔井40中存在极少量的液体90也会发生这样的高效热传递。几乎与孔井中的液体90一样快速，填充床17中的温度与培养器块体80平衡。

填充床17中的容积以及用于大部分应用的相关液体体积优选地相当小(典型地为5-100μL)。这就导致在温度升高的培养的过程中可能产生蒸发。将系统构型为使旋转柱10保持在位，使得旋转柱10的出口吸头18浸没在接收器孔板40中的一定量的液体90中(参加图2和3)，这有助于防止填充床17在温度升高的培养的过程中变干。蒸发到填充床17的顶部外的液体将由虹吸自接收器孔板孔井40的液体代替。此外，形成基本密封的腔室的盖子70和旋转柱10的上轮缘12之间、支架50和接收器孔板30之间以及旋转柱10和支架50之间的连续接触(参加图2和3)整体上限制了从该系统蒸发的量。

使用时，反应溶液被置于旋转柱样品杯14内，并且在足够低的力下利用安装在支架50之下的接收器孔板30进行离心，从而使反应溶液进入填充床17之内，但由于毛细作用而并不会清空填充床。在该步骤中，该系统优选地在接收器孔板孔井40之内包括一定量的液体(参见图2)。组装好的系统随后利用处于培养位置的盖子70而被安装到培养器块体80上(参见图3)。在培养的过程中发生化学反应，其产生了反应产物。通过将洗脱溶液移液到旋转柱样品杯17内并离心到同样或不同的接收器孔板30内，从而使反应产物能够在不发生任何体积损失的条件下进行洗脱。所有这些操作能够利用标准机器人可变和液体操作系统来直接执行。

在某些情况下，可望在已经发生反应之后从样品中蒸发掉某些或全部液体。例如，洗脱的反应产物可能需要更换为来自反应溶液的不同溶质，用于随后的清理步骤。本发明的系统能够用于这些干燥步骤，例如，通过仅采用接收器孔板30和培养器块体80来执行，如图4所示。这就有效地“解封”了基本密封的腔室，并且容许进行蒸发。通过利用同样的接收器孔板30，能够免去液体转移步骤，从而减少了样品损失并使整个工作流程化。

滞留空气：

本发明还提供了在使用之前及使用的过程中减少滞留在填充床17之内的空气的系统和方法。空气能够以数种方式进入旋转柱10的填充床17。首先，在柱10的基本操作和运行中，空气能够滞留在填充床17中。其次，如果在使柱10旋转时使用的“×g”力超过特定的临界值(其取决于填充微粒的直径和珠上的液相的表面张力)，则离心g场将迫使液体在抵达床的顶部表面之后溢出床外，从而在之后吸入空气。再次，旋转柱10的样品杯17在运行过程中一被排空，液体就开始从填充床17的顶部和底部两处进行蒸发。因为床容积非常小(因此包含于床之内的液体体积非常小，其可以小至2至3μL)，因此仅由于10至15分钟的该蒸发就会使大量空气进入床17。最后，在本发明的非常小的设备中，在通过移液导入样品和缓冲液的过程中还可以恰好在填充床17的顶部之上在样品杯14的受限区域中捕获气泡。本文所述的旋转柱系统和相关方法避免了这些问题。

图5中所示系统中的旋转柱10例如能够准备使用在再湿润步骤中，以便除去在填充床17中会捕获的空气。在再湿润步骤中，支架50、旋转柱10和接收器孔板30组装在一起，如图6所示。将一定量的液体90加入到每一个旋转柱10的样品杯14，并且在离心机中使该组件旋转。使该组件旋转使得旋转柱10中的液位与接收器孔板孔井40中的液位平衡，其中接收器孔板30的孔井40内侧以及旋转柱10的样品杯14内侧的液位是相同的(参见图6)。增加到样品杯14并旋转的液体的量优选地足以使已平衡的液位高于填充床17的界面16，并且使至少部分液体保留在样品杯14中(参见图6)。

再湿润步骤能够在相对高的离心力下执行(例如，大约1000×g或更大)。这就产生了足够高的流速，从而除去在填充床17之内捕获的所有空气。将最终液面保持在填充床17的顶部之上(参见图6)防止床被高离心力“旋转干”，通过恒定地浸没在液体中而始终保持其免于变干，并且以液体填充每一个旋转柱10的样品杯14的大部分受限制区域，以便防止在随后将材料加载到旋转柱10内的过程中使气泡滞留在填充床17中。

在再湿润之后，液体样品能够被加载在包含在旋转柱10的样品杯的少量液体的顶部上。随后从接收器孔板30移走支架50和旋转柱10，并且清空或替换掉接收器孔板30。随后将支架50和旋转柱10设置在清空的接收器孔板30上，并且与设置在位的接收器孔板30一起旋转。相似地执行洗涤步骤。如图7所示，孔井40的圆锥形状确保了甚至在极少量的液体已经穿过床之后，出口吸头18都能够浸没在孔板孔井40中的液体中。这就防止了在床内发生从填充床17的出口吸头侧18的蒸发。此外，如果从填充床17的界面16发生任何蒸发，则液体将由于毛细作用而从接收器孔板30的对应孔井40发生虹吸。该虹吸作用防止了填充床17由于从填充床17的界面16一侧发生蒸发而变干。在随后所述步骤的过程中的任意点处，接收器孔板30都能够容易地从支架50分离，并且被清空或替换掉。

范围较宽的不同体积的液体90能够在加载步骤的过程中被加载到每一个旋转柱10的样品杯14内。如果对应接收器孔板孔井40中的液位并未填充到高于界面16的高度，则所有液体将穿过填充床17。参见图7。

利用该系统在任何测定中的最后步骤都包括：从填充床17洗脱已分离的已提纯的已隔离的或已反应的分析物或其衍生物(或预期部分)，并且将分析物或其衍生物(或部分)收集在微孔板孔井25中用于分析。对于该步骤，将包含旋转柱10的支架50从接收器孔板30移走并组装在微孔板20上，如图8所示。将出口吸头18定位在由微孔板20的顶部板21限定的平面处或恰好定位在该平面下能够在增加到样品杯14的液体洗脱缓冲液已经穿过填充床17之后将其清洁并且准确地对其进行收集。每一个旋转柱10的填充床17在该阶段都容易变干或滞留气泡，但是其总是该处理中的最后步骤。在该步骤之后，能够将旋转柱10立即如上所述地再湿润，并且将其存储在完全湿润的无空气状态下。

本发明包括本文所描述的任意单独的要素或其组合。本文所述的要素能够以任何组合进行使用，无论是否对其进行了明确描述。本发明的任何方法、要素或设备的任意形式都可以与本发明的任意的其它方法、要素或设备一起使用。本文所述的方法或处理步骤的所有组合都能够以任意次序执行，除非通过做出所参考组合的上下文另外指出或清楚地作出了相反的暗示。

按照本文的用法，单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数指示物，除非该内容清楚地进行了其它陈述。术语“或(或者)”基本在其包括“和/或(以及/或者，并且/或者)”的意义上进行使用，除非该内容清楚地进行了其它陈述。

本文所使用的数值范围意在包括包含在该范围之内的任何数值和数值的子集，无论是否对其进行了特别公开。另外，这些数值范围应当被解释为对于涉及该范围中的任何数值或数值的子集的权利要求提供支持。例如，公开了从1至10，就应当解释为支持从2至8、从3至7、从5至6、从1至9、从3.6至4.6、从3.5至9.9等等的范围。

所有公开物、专利和专利申请通过引用明确地纳入本文，引用的程度相当于对其每一个都通过引用进行了具体的且单独的描述。在本发明以及所引入的公开物、专利和专利申请之间发生冲突的情况下，则应当以本发明为准。

本文所描述的要素能够包括本文所述的主要要素及限制以及本文所述的或者本领域中有用的任何附加或可选步骤、配料、成分或限制，由所有这些构成或者主要由这些构成。

应当理解，本发明并不限制于本文所显示和所描述的部件的具体结构和布置，而是包括例如处于权利要求书的范围之内的这些具体结构和布置的修饰形式。

实施例

实施例1：

旋转柱利用模制的聚丙烯壳体进行构造，其中在成型的滤网支撑器和200μL容积的样品杯之间包含5μL容积的填充床(AssayMAPcartridges，BioSystemDevelopment，LLC，Madison，WI)。填充床由涂覆有亲水聚合物的基于聚苯乙烯/二乙烯基苯的多孔珠构成，其具有固定化蛋白质A亲和配体(POROSMAbCaptureA，AppliedBiosystems，Inc.，FosterCity，CA)。旋转柱安装在根据本发明构造的支架中，该支架又安装在接收器孔井上，该接收器孔井具有根据本发明构造的250μL的圆锥底部的孔井。

旋转柱被提供为干的，因此在使用之前必须完全地进行再湿润。为了实现这点，将200μL的缓冲液(50mM磷酸盐pH7.2，150mMNaCl)移液到旋转柱的样品杯内。旋转柱/支架/接收器孔板组件设置在配备有微孔板转子(Model5810，Eppendorf，Inc.，Hauppage，NY)的离心机中，并且在1000×g下离心2分钟。

在离心后，接收器孔板的孔井中的液位恰好处在旋转柱样品杯中的液位处。样品杯包含约15μL的液体，并且接收器孔板的孔井包含约185μL。填充床的微观检查表明，微粒完全进行了水合，并且在填充床和样品杯中均不存在气泡。

实施例2：

实施例1中所述的旋转柱利用该实施例中所述的过程来进行再湿润。接收器孔板的孔井被清空，并且包含浓变化的已提纯的人类IgG的25μL的样品溶液被移液到旋转柱的样品杯内。组件在50×g下被离心5分钟，从而在相对低的流速下将样品中的IgG暴露到固定化蛋白质A，以便通过亲和作用促进IgG到蛋白质A的选择性定量结合。然后，将50μL缓冲液移液到每一个旋转轴的样品杯内，并且使组件在200×g下离心2分钟以进行洗涤。随后重复洗涤步骤。接收器可变随后被移走，并且替换为具有175μL的工作孔井容积的96孔井的半区UV微孔板(Model675801，GreinerGmbH，Frickenhausen，Germany)。随后将50μL缓冲液(100mM甘氨酸，pH2.0)移液到每一个旋转轴的样品杯内，并且使组件在200×g下离心2分钟以将已结合的IgG洗脱到微孔板内。随后在280nm下在测光板(SpectraMAX250，MolecularDevices，Inc.，Sunnyvale，CA)中读取该孔板。结果显示在下表中和图9的图表中。标准曲线是高度线性的(R2＝1.00001)，其具有良好的精确度(CV＜6％)。

实施例3：

为了提高对于低IgG浓度的测定的灵敏度，将125μL的考马斯蓝蛋白质测定试剂(ThermoScientific，Inc.，Waltham，MA)加入到来自实施例2中的实验的每一个产物孔井，混合并培养10分钟。在450和590nm下在测光板中读取这些孔板，并且读出两个吸光率的比值。结果显示在下表中和图10的图表中。结果在约500μg/mL以上是非线性的，但是测定的灵敏度是实施例2中所示的A280nm测定的约10倍。

实施例4：

将包含25μg的hIgG的样品加载在蛋白质A的旋转柱上，并且如实施例2中所述地进行洗涤。在洗涤后，将旋转柱和支架移动到清空的未使用的接收器孔板。将10μL体积的肽N糖苷酶F酶(Glyconase，ProZyme，Inc.，Hayward，CA)移液到样品杯内，并且在200×g下使组件离心2分钟以使蛋白质A结合的IgG暴露到酶。随后将组件设置在如本文所述的培养器块体上，并且在70℃下培养15分钟。酶将N联聚糖从IgG释放到溶液内。在培养后，通过在20μL的洗脱缓冲液中移液而从旋转柱洗脱所释放的聚糖，并且在200×g下使组件离心2分钟。从旋转柱和支架移走接收器孔板。所释放的N联聚糖随后被荧光标记，并通过正相HPLC来进行分析，其中利用标准方法(试剂和柱由ProZyme提供)来进行荧光检测。图11显示了得到的N联聚糖HPLC的色谱图，并且该色谱图非常类似于由常规溶相方法生产的hIgG的N联聚糖所公布的色谱图。

Claims

1.一种旋转柱系统，包括：

至少一个旋转柱，其具有填充床和与所述填充床呈流体连通的样品杯；

可重新使用的支架，其具有穿过该支架的至少一个孔隙，其中，所述孔隙的尺寸和构型被设计为可释放地接合所述旋转柱；以及

接收器孔板，其包括：

顶部板；

至少一个孔井，其限定在所述顶部板之内以对应于所述支架中的所述至少一个孔隙，所述孔井具有底部表面；以及

孔井开口，其位于由所述顶部板限定的平面中，

其中，所述支架和接收器孔板的尺寸和构型被设计为彼此接合，使得当所述支架和所述接收器孔板接合时所述孔隙和所述孔井配准，并且，当所述支架和所述接收器孔板接合并且所述旋转柱被布置在所述孔隙中时，所述填充床被完全布置在所述底部表面与所述孔井开口之间。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述支架的尺寸和构型被设计为与微孔板接合，所述微孔板具有顶部板、孔井和位于由所述顶部板限定的平面中的孔井开口，其中，所述旋转柱包括出口吸头，并且，所述支架和所述旋转柱的尺寸和构型被设计使将所述出口吸头悬在离所述微孔板的孔井开口5mm之内。

3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述支架的尺寸和构型被设计为与微孔板接合，所述微孔板包括具有容量的孔井，其中，所述旋转柱的填充床具有容量，并且，所述填充床的容量为所述微孔板的孔井的容量的1/5或更少。

4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述填充床的容量为所述微孔板的孔井的容量的1/10或更少。

5.根据权利要求1所述的系统，其中，所述旋转柱包括大约60μL或更小容量的填充床。

6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述支架的尺寸和构型被设计为与微孔板接合，其中，所述支架包括具有底部表面的侧部板以及从所述侧部板偏移的边沿，所述边沿包括内表面，并且其中，当所述支架和所述孔板接合时，所述底部表面和所述内表面两者均接触所述微孔板。

7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述支架的尺寸和构型被设计为与常规96孔井的微孔板接合，使得当所述支架与所述微孔板接合时，所述支架中的孔隙与所述微孔板的孔井配准。

8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述旋转柱包括出口吸头，并且其中，所述支架、所述旋转柱和所述接收器孔板的尺寸和构型被设计为使所述出口吸头悬在离所述孔井的底部表面5mm之内。

9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述接收器孔板的顶部板包括顶部表面，并且所述支架包括具有底部表面的顶部板，并且其中，当所述支架和所述接收器孔板接合时，所述接收器孔板的顶部表面与所述支架的底部表面接触。

10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述支架还包括侧部板以及从所述侧部板偏移的边沿，所述接收器孔板还包括侧部板以及从所述侧部板偏移的边沿，并且其中，当所述支架和接收器孔板接合时，所述支架的侧部板和边沿分别接触所述接收器孔板的侧部板和边沿。

11.根据权利要求10所述的系统，其中，当所述支架和所述接收器孔板接合时，所述支架的侧部板还接触所述接收器孔板的所述边沿。

12.根据权利要求1所述的系统，其中，所述支架包括96个孔隙且所述接收器孔板包括96个孔井，所述孔隙和所述孔井以9mm的中心距设置成8×12阵列。

13.根据权利要求1所述的系统，还包括盖子，所述盖子的尺寸和构型被设计为与所述支架接合并接触所述旋转柱。

14.根据权利要求13所述的系统，其中，所述样品杯具有上轮缘，并且其中，当所述支架与旋转柱、所述支架与接收器孔板以及所述盖子与支架接合时，并且还当所述支架接触所述旋转柱的上轮缘时，所述样品杯、所述填充床和所述孔井一起形成限制液体从所述系统蒸发或溢出的基本密封的腔室。

15.根据权利要求14所述的系统，其中，当所述旋转柱插入所述支架中时所述旋转柱与所述支架形成连续接触，当所述支架与所述接收器孔板接合时所述支架与所述接收器孔板形成连续接触，并且当所述盖子与所述支架接合且所述盖子接触旋转柱时所述盖子与所述旋转柱的上轮缘形成连续接触。

16.根据权利要求1所述的系统，还包括培养器块体，所述培养器块体的尺寸和构型被设计为接触所述接收器孔板的孔井的外表面，并且加热和冷却到受控的温度。

17.根据权利要求1所述的系统，还包括盖子和培养器块体，所述盖子、所述旋转柱、所述接收器孔板和所述培养器块体的构型和尺寸被设计为组装成嵌套构型。

18.一种利用权利要求1所述的系统对分析物进行分析的方法，包括：

(a)将所述旋转柱插入所述支架中的孔隙中，并使所述支架与所述接收器孔板接合，其中，所述旋转柱、所述支架和所述接收器孔板形成组装单元，并且其中，所述旋转柱与所述接收器孔板中的孔井配准；

(b)将样品加载在所述旋转柱中；

(c)使所述组装单元旋转，其中，所述样品中的分析物被结合到所述旋转柱中的填充床；

(d)对来自所述填充床的分析物或该分析物的衍生物进行洗脱；并且

(e)对所述分析物或该分析物的衍生物进行分析。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，旋转步骤包括：使所述组装单元在离心力下在离心机中旋转，使得将所述分析物定量地结合并保留在所述填充床中。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，洗脱步骤包括：将体积是所述填充床的容量的至少五倍的洗脱缓冲液增加到所述旋转柱，旋转所述组装单元，并且在孔井中收集洗脱液，其中，所述孔井的容量为所述填充床的容量的至少5倍。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述孔井的容量为所述填充床的容量的至少10倍，并且其中，分析步骤包括：将体积至少等于所述洗脱缓冲液的体积的分析试剂增加到所述孔井，将所述洗脱液和所述分析试剂混合以产生混合物，并且读取该混合物。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，分析步骤包括：对所述分析物或者该分析物的衍生物的量进行定量。

23.根据权利要求18所述的方法，在分析步骤之后，还包括：将所述旋转柱从所述支架移走，利用该支架并利用第二旋转柱来重复步骤(a)-(e)。

24.根据权利要求18所述的方法，还包括：对所述填充床进行再湿润，其中，再湿润步骤包括：将一定量的液体增加到所述旋转柱，并且旋转所述组装单元，其中，这一定量的液体将所述孔井填充到至少等于在所述旋转柱中的所述填充床与所述样品杯之间的界面的高度，其中，部分液体在旋转之后保留在所述样品杯中，并且其中，从所述填充床中除去空气。

25.根据权利要求18所述的方法，在旋转步骤和洗脱步骤之间还包括：从所述接收器孔板移走所述支架，并使所述支架与常规96孔井的微孔板接合，使得当所述支架与所述微孔板接合时，所述支架中的孔隙与所述微孔板的孔井配准，其中，洗脱步骤包括：在所述微孔板的孔井中收集洗脱液。

26.根据权利要求18所述的方法，还包括：使盖子与所述支架接合以形成限制液体从所述系统蒸发或溢出的基本密封的腔室，该腔室包括所述旋转柱的样品杯、所述填充床和所述接收器孔板的孔井。

27.根据权利要求26所述的方法，还包括：在培养器块体中培养所述接收器孔板的填充床，其中，一定量的热量从所述培养器块体经过所述孔井中的孔井壁并经过所述孔井中包含的液体而传递到所述填充床，其中，所述填充床和所述培养器块体的温度是相同的。

28.根据权利要求18所述的方法，在洗脱步骤之后还包括：在培养器块体中对所述接收器孔板的孔井进行培养以促进蒸发。

29.根据权利要求18所述的方法，在旋转和洗脱步骤之间还包括：将包括分析试剂的溶液更换到填充床内，其中，所述分析试剂对结合到所述填充床的分析物进行化学改性，以产生该分析物的衍生物。

30.根据权利要求29所述的方法，在更换和洗脱步骤之间还包括：在培养器块体中培养所述接收器孔板的填充床，其中，一定量的热量从所述培养器块体经过所述孔井中的孔井壁并经过所述孔井中包含的液体而传递到所述填充床，其中，所述填充床和所述培养器块体的温度是相同的。

31.根据权利要求30所述的方法，在培养步骤之前还包括：使盖子与所述支架接合以形成限制液体从所述系统蒸发或溢出的基本密封的腔室，该腔室包括所述旋转柱的样品杯、所述填充床和所述接收器孔板的孔井。

32.根据权利要求29所述的方法，其中，在洗脱步骤之前，从所述填充床释放所述分析物的衍生物。