KR102066758B1 - 효소 매개 단백질 전위를 위한 나노기공 센서 - Google Patents

Abstract

나노기공을 통해 단백질을 전위시키고 단백질에서 상이한 아미노산에 의해 발생한 전자 변화를 모니터링하기 위한 디바이스 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 이 디바이스는 막에서의 나노기공, 막의 시스 측과 트랜스 측 사이에 전압을 제공하기 위한 증폭기 및 전위시키고자 하는 단백질을 처리하는 NTP 추진 언폴다제를 포함한다. 예시된 언폴다제는 이. 콜라이로부터의 ClpX 언폴다제이다.

Description

효소 매개 단백질 전위를 위한 나노기공 센서{NANOPORE SENSOR FOR ENZYME-MEDIATED PROTEIN TRANSLOCATION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 제61/599,754호(발명의 명칭: "Unfolding and Translocation of Proteins Through a Nanopore Sensor and Methods of Use", 발명자: Jeffrey Nivala 등, 출원일: 2012년 2월 16일) 및 미국 가출원 제61/713,163호(발명의 명칭: "Nanopore Sensor for Enzyme-Mediated Protein Translocation", 발명자: Jeffrey Nivala 등, 출원일: 2012년 10월 12일)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 기초 출원은 둘 다 그 전문이 참조로로 본 명세서에 포함된다.

정부 지원 성명

본 발명은 미국 보건부(National Institutes of Health)와 맺은 R01HG006321 계약 및 국가 인간 게놈 연구 위원회(National Human Genome Research institute)와 맺은 24033-444071 계약 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권한을 갖는다.

서열 목록, 컴퓨터 프로그램 또는 콤팩트 디스크에 대한 참조

"Legal Framework for EFS-Web"(11년 4월 06일)에 따라, 출원인들은 ASCII 텍스트 파일로서 서열 목록을 본 명세서와 함께 제출하였다. 텍스트 파일은 37 CFR 1.821 (c)가 요구하는 종이 카피 및 37 CFR 1.821 (e)가 요구하는 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF) 둘 다로 제공되었다. 파일 생성일은 2013년 2월 13일이고, ASCII 텍스트 파일의 크기는 바이트 단위로 24,576이다. 출원인들은 서열 목록 내용 그 전체를 참조문헌으로 통합하였다.

기술 분야

본 발명은 단일 분자 단백질 분석의 분야 및 또한 나노기공 분석의 분야에 관한 것이다.

본 발명의 특정한 양태는 상세한 설명에 기재된 기술적 특징에 관한 것으로 이에 대한 배경 기술이 하기 제시되어 있지만, 자세히 기재될 필요는 없다. 즉, 본 발명에서 사용되는 개별적인 조성물 또는 방법은 하기 기재된 공보 및 특허에 더 자세히 기재되어, 청구된 본 발명의 특정한 양태를 만들고 사용하기 위한 추가의 지도를 당해 분야의 당업자에게 제공할 수 있다. 하기 설명은 기재된 특허 또는 공보의 관련성 또는 선행 기술 효과에 대한 승인으로 해석되어서는 안 된다.

나노기공은 다양한 바이오센싱(biosensing) 분야에 사용되지만, 가장 흔한 것은 DNA 분석(예를 들면, 서열분석)이다. 유사하게, 단백질의 나노기공 서열분석이 또한 고안되었다. 그러나, 핵산과 달리, 단백질은 일반적으로 균일하게 하전되지 않고(인가 전압을 통해 전위를 추진하는 것이 어렵게 만듦), 또한 나노기공의 어퍼처(aperture)를 횡단할 수 없는 복잡하고 크고 안정한 구조로 폴딩된다. 더 구체적으로, 단백질 서열분석이 DNA 서열분석보다 기술적으로 더 도전인 이유는 ⅰ) DNA 서열분석에 대한 4개의 뉴클레오타이드(번역후 및 후성적 변형을 포함하지 않음)와 비교하여 20개의 상이한 천연 아미노산이 단백질에서 발견된다는 것; ⅱ) 변성 단백질이 단일 파일 순서로 나노기공 센서를 통해 트레딩(threading)되게 하도록 3차 구조 및 2차 구조 둘 다 비폴딩되어야 한다는 것; 및 ⅲ) 나노기공 전기장을 통한 변성된 폴리펩타이드의 진행성 단방향성 전위가 폴리펩타이드 골격을 따라 비균일한 전하에도 불구하고 성취되어야 한다는 것이다.

서열 생물중합체에 대한 나노기공의 사용은 10년 이전에 제안되었다(Pennisi, E. Search for pore-fection. Science 336, 534-537 (2012), Church, G.M., Deamer, D.W., Branton, D., Baldarelli, R. & Kasianowicz, J. Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interaction.)

DNA 전위의 효소 기반 제어(Cherf, G.M., Lieberman, K.R., Rashid, Hytham, R., Lam, C.E., Karplus, K. & Akeson, M. Automated "Forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-Å precision," Nat. Biotechnol. 30, 344-348 (2012)) 및 변형 생물학적 기공을 사용한 DNA 뉴클레오타이드 분해(Manrao, et al. "DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase," Nat. Biotechnol. 30, 349-353 (2012))의 최근의 진전은 2012년 말에 상업 출시가 기대된 나노기공 DNA 서열분석 기기에 대한 발판이 되었다(Hallam, K. "Oxford nanopore to sell tiny DNA sequencer," Bloomberg, 2012년 2월 17일 온라인 공개, Hayden, E. Nanopore genome sequencer makes its debut. Nature, 2012년 2월 17일 온라인 공개).

나노기공을 통한 단백질 이동이 확립되었지만(Mohammadet al., "Controlling a single protein in a nanopore through electrostatic traps," J. Am . Chem . Soc . 130, 4081-4088 (2008), Talaga, D.S. & Li, J. "Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores," J. Am . Chem . Soc . 131, 9287-9297 (2009), Merstorf, et al. "Wild type, mutant protein unfolding and phase transition detected by single-nanopore recording," ACS Chem . Biol . 7, 652-658 (2012)), 제어된 순차적 전위를 위해 단백질을 비폴딩하는 기술은 현재까지 입증되지 않았다.

하기 간단한 요약은 본 발명의 모든 특징 및 양태를 포함하는 것으로 의도되지 않고, 본 발명이 이 요약에 기재된 모든 특징 및 양태를 포함해야 한다는 것을 의미하지 않는다.

본 발명은 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 디바이스로서, 내부에 나노기공을 갖고 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막(단백질은 시스 측에 첨가되고 나노기공을 통해 트랜스 측으로 전위됨); 및 챔버의 적어도 하나의 측에서, 단백질에 결합하고 단백질을 나노기공을 통해 전위시키는 단백질 전위효소를 포함하는 디바이스를 제공한다. 전위는 순차적인 순서로, 즉 나노기공으로 통과하는 아미노산 잔기의 한정된 서열에서 일어나고, 이는 일반적으로 단백질의 1차 아미노산 서열을 따른다. 다중 단백질이 한번에 전위될 수 있다.

본 발명은 또한 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 디바이스로서, 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에서의 나노기공(전위시키고자 하는 단백질은 시스 측에 첨가되고 나노기공을 통해 트랜스 측으로 전위됨); 시스 측과 트랜스 측 사이에 전압 구배를 제공하고 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류를 측정하기 위한 회로; 및 예를 들면 시스 측에서 상기 나노기공에 부착됨으로써 또는 용액 중의 트랜스 측에 대한 첨가에 의해, 유체 챔버로 첨가되는 특이적 효소, 예컨대 단백질 전위효소 및/또는 NTP 추진 언폴다제(NTP driven unfoldase)를 포함하는 디바이스를 제공한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 나노기공은 기공 단백질에 의해 획정된다. 바람직한 일 실시양태에서, 기공 단백질은 α-헤몰리신이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 단백질 전위효소는 전위시키고자 하는 단백질 분자에 작동하는 NTP 추진 언폴다제이다. 바람직한 일 실시양태에서, NTP 추진 언폴다제는 AAA+ 효소이다. 다른 바람직한 실시양태에서, AAA+ 효소는 이. 콜라이 ClpX의 서브유닛의 조합이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 단백질 전위의 검출을 위한 회로는 트랜스 측에 양의 전압을 인가하는 패치 클램프 증폭기를 포함한다. 패치 클램프 증폭기는 정전압을 유지시키고 전류 변화를 측정한다. 바람직한 실시양태에서, 디바이스는 나노기공을 통한 이온 전류 변화를 신속히 기록하기 위한, 패치 클램프 증폭기에 부착된, 컴퓨터를 포함한다. 단백질이 나노기공을 통과하면서, 초당 1 내지 100,000 변동의 차수로 검출할 수 있는 이온 전류 서명이 얻어져서, 기공을 통해 전위하는 개별적인 아미노산에 대한 정보를 제공한다. 예를 들면, 100㎑에서의 기록을 이용하여 10μS마다 하나의 데이터 점을 생성할 수 있다. 데이터는 전위시키고자 하는 단백질의 구조 특징과 상관될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에서의 나노기공(전위시키고자 하는 단백질은 시스 측에 첨가되고 나노기공을 통해 트랜스 측으로 전위되고; 상기 유체 챔버는 시스 측에 비변성 전위시키고자 하는 단백질 및 효소 보조인자, 예컨대 NTP(뉴클레오사이드 5'-트라이포스페이트, 예를 들면 ATP 및/또는 GTP)를 포함하는 이온 완충제를 포함함); 시스 측과 트랜스 측 시이에 전압을 제공하고 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류를 측정하기 위한 회로; 및 챔버 내에 시스 측에 용액 중의 단백질 전위효소, 예컨대 NTP 추진 언폴다제를 포함하는, 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 시스템이 제공된다.

본 발명의 대안적인 실시양태에서, 나노기공은 기공 단백질, 예컨대 다합체 기공 단백질에 의해 획정되고, 단백질 전위효소, 예컨대 NTP 추진 언폴다제는 다합체 기공 단백질에 부착된다. 단백질 전위효소는 기공 단백질에 공유로 또는 비공유로 부착될 수 있고, 기공 단백질 및 막의 시스 측, 트랜스 측 또는 양측에 있을 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 전위시키고자 하는 단백질은 비변성 단백질(즉, 이의 네이티브 상태)이고, 표적하고자 하는 단백질이 나노기공을 통과하고 NTP 추진 언폴다제와 접촉하는 표적 도메인을 포함하는 외인성 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, NTP 추진 언폴다제는 ClpX이고, 나노기공 단백질은 α-헤몰리신이다. 외인성 서열에서의 표적 도메인은 단백질을 나노기공으로 지시하도록 작용한다. 표적 도메인은 나노기공에 걸친 전압에 의해 영향을 받도록 구성될 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서, 표적 도메인은 약 5개의 음으로 하전된 아미노산 또는 적어도 약 5 내지 30개의 음으로 하전된 아미노산을 포함하고, 시스 측과 트랜스 측 사이에 인가된 전압 구배에 의해 챔버의 파지티브 측에 유인된다.

본 발명은 또한 나노기공을 통해 비변성 단백질을 전위시키는 방법으로서, 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 디바이스를 제공하는 단계, NTP(여기서, 전위효소는 NTP 추진됨)를 포함하는 완충제를 상기 유체 챔버에 첨가하는 단계; 임의로 시스 측에 비변성 단백질을 첨가하는 단계; 비변성 단백질이 (예를 들면, 전하에 의해) 포획되거나 나노기공을 통해 트레딩되어 단백질 전위효소와 접촉할 수 있도록 하는 단계; 및 나노기공을 통한 비변성 단백질의 전위에 의해 발생한 이온 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 디바이스는 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에서의 나노기공(전위시키고자 하는 단백질은 시스 측에 첨가되고 나노기공을 통해 트랜스 측으로 전위됨); 시스 측과 트랜스 측 사이에 전압을 제공하고 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류를 측정하기 위한 회로; 및 트랜스 측에서 용액 중의 단백질 전위효소를 포함하는 것인 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 전류 변화를 측정하는 단계는 (ⅰ) 나노기공에서의 개방 채널, (ⅱ) 나노기공에 의한 비변성 단백질의 포획 및 (ⅲ) 나노기공을 통한 (ⅱ)로부터의 단백질의 통과의 상태에 대한 전류 변화를 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 상태 (ⅰ), 상태 (ⅱ)와 상태 (ⅲ) 사이의 차이의 검출을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 측정은 나노기공을 통과하는 단백질의 아미노산 구조에 의해 발생한 상태 (ⅲ) 동안의 차이의 측정을 포함한다. 상기 방법은 비변성 단백질에 대한 NTP 추진 언폴다제의 결합 및 나노기공을 향한 언폴다제의 전위(상태 (ⅱ)와 상태 (ⅲ) 사이의 상태로서 발생함)의 상태의 측정 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 4개의 상태를 측정하게 한다. 예를 들면, 도 2에서 기재되고 예시된 것처럼, 전위가 완료되고 나노기공이 최초 상태로 돌아갈 때 측정된 최종 상태 (ⅴ)가 존재할 수 있다.

다른 바람직한 실시양태에서, 나노기공은 기공 단백질에 의해 획정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 기공 단백질은 α-헤몰리신이다. 다른 바람직한 실시양태에서, NTP 추진 언폴다제는 기공 단백질에 부착된다. 다른 바람직한 실시양태에서, NTP 추진 언폴다제는 AAA+ 효소이다. 다른 바람직한 실시양태에서, AAA+ 효소는 ClpX이다. 다른 실시양태에서, 회로는 시스 챔버와 트랜스 챔버 사이에 정전압을 인가하는 패치 클램프 증폭기를 포함한다.

본 발명의 특정한 양태에서, 나노기공은 α-헤몰리신 또는 다른 다합체 기공 단백질에 의해 획정된다. 기공 단백질은 작용기화될 필요는 없고; 즉, 단백질이 이의 네이티브 환경에 존재하면서 사용될 수 있고; 전위되는 단백질에 부착하거나 결합하도록 이에 첨가된 임의의 분자 구조를 가질 필요는 없다. 즉, 임의의 단백질 서열의 전위에 대해 포괄적일 수 있고, 전위시키고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하거나 이를 인식하지 않는다. 전위시키고자 하는 단백질은 또한 바람직하게는 네이티브 형태이다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 나노기공을 통한 단백질의 "트레딩"을 개선하기 위해 분자 구조를 이에 부착시킬 수 있다. 본 발명의 특정한 양태에서, 전위시키고자 하는 단백질은 단백질 전위효소에 대한 표적 도메인을 포함하는 외인성 서열을 포함한다. 표적 도메인은 적어도 약 5 내지 30개의 아미노산 또는 10 내지 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산은 음으로 하전된 아미노산, 예를 들면 30 내지 100개의 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기 또는 다른 음으로 하전된 합성 단량체, 예를 들면 전위시키고자 하는 단백질의 아미노 또는 카복시 말단에 위치한 황산 덱스트란일 수 있다. 전압 극성이 하기 예시된 것으로부터 역전될 때, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산은 또한 양으로 하전될 수 있다.

본 발명의 특정한 양태에서, 전위시키고자 하는 단백질은 이의 네이티브 상태에서, 즉 변성되지 않거나 그렇지 않으면 비폴딩되지 않은 채 전위되고; 전위효소는 나노기공에 걸친 전압 구배를 횡단하면서 단백질을 비폴딩하도록 작용한다.

도 1a는 단일 AHL(α-헤몰리신) 기공이 지질 이중층에 임베딩된 나노기공 센서의 도식적 도면(카툰);
도 1b는 나노기공에 포획된 단백질을 나타낸 도식적 도면;
도 1c는 전위에 대한 본 실시예에 사용되는 공학적으로 조작된 단백질을 나타낸 도식적 도면;
도 2a 및 도 2b는 ClpX 매개 단백질 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸 도식적 표현 및 좌표;
도 2c는 단백질 S2-35 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타내는 파형;
도 2d는 단백질 S2-148 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타내는 파형;
도 3A, 도 3B 및 도 3C는 3개의 모델 단백질에 대한 이온 전류 상태 지체 시간의 비교를 나타내는 일련의 막대 그래프;
도 4a 내지 도 4d는 트랜스 용액 중의 ClpX의 존재 없이 전압 매개 단백질 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타내는 도식적 표현 및 전류 파형이다. 매우 가변적인 포획 기간(5초 미만 내지 2분 초과) 후에, 시험된 모든 기질은 인가 전압으로 인해 결국 비폴딩되고 전위된다. 상승 상태가 관찰되지 않고, 자세한 신호 특징은 S2-35 및 S2-148 링커 상태로부터 손실되고, 모든 상태는 ClpX 매개 사건과 비교하여 더 광범위하게 분포된 기간을 갖는다. 도 4a는 전압 매개 S1 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸다. 도 2a와 비교하여, 상태 ⅲ은 부재하고 상태 ⅳ는 평균적으로 더 길고 더 가변적인 기간을 갖는다. 도 4b는 전압 매개 단백질 전위의 모델을 예시한다. 도 4b는 4개의 카툰 구조를 나타낸다. ⅰ 내지 ⅳ. 카툰 ⅰ-ⅳ는 도 4a에서의 이온 전류 상태 ⅰ-ⅳ에 상응한다. 도 4c는 전압 매개 S2-35 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸다. 상태 ⅲ 및 ⅵ 상승은 부재하고 상태 v의 해상도(도 2c)는 감소한다. 도 4d는 전압 매개 S2-148 동안의 이온 전류 파형이 S2-35와 유사한 거동을 나타낸다는 것을 나타내고(도 2d), 상응하는 상태가 생략되었다;
도 5는 3개의 모델 단백질에 대한 ClpX 독립적(ClpX가 트랜스 측에 존재함) 상승 상태 ⅲ의 이온 전류 상태 지체 시간의 비교를 나타낸 주파수 막대 그래프. S1 n=45, S2-35 n=62, S2-148 n=66;
도 6은 ClpX 독립적 상승 상태 ⅲ 및 ⅵ를 포함하는 사건에서 S2-35(n=42) 및 S2-148(n=41) 단백질의 추정상 제2 Smt3 도메인 전위 상태 ⅶ의 이온 전류 상태 지체 시간의 비교를 나타낸 주파수 막대 그래프;
도 7은 단백질 S2-35(n=44) 및 S2-148(n=44)의 ClpX 독립적 상승 상태 ⅵ의 이온 전류 지체 시간의 비교를 나타낸 주파수 막대 그래프;
도 8은 3개의 모델 단백질에 대한 추정상 Smt3 도메인 전위 상태 ⅳ 및 ⅶ의 이온 전류 지체 시간의 비교를 나타낸 주파수 막대 그래프. 검정색 막대는 상승 상태 ⅲ(ClpX 추진)을 포함하는 사건에 대한 지체 시간을 나타낸다. 회색 막대는 상승 상태를 포함하지 않는(ClpX 추진이 아닌) 사건을 나타낸다. n=254 상승으로, n=183 상승되지 않음;
도 9는 S2-35 전위 사건에 대한 지체 시간에 대한 상태 ⅴ를 나타낸 주파수 막대 그래프. 검정색 막대는 상승 상태 ⅲ(ClpX 추진)을 포함하는 사건에 대한 지체 시간을 나타낸다. 회색 막대는 상승 상태를 포함하지 않는(ClpX 추진이 아닌) 사건을 나타낸다. n=50 상승으로, n=45 상승되지 않음;
도 10은 지질 막 내에 임베딩된 ClpP/α-HL의 융합 단백질을 예시하는 도식적 표현.

개관

단백질에 대한 정보, 예를 들면 단백질의 아미노산 함량이 나노기공을 통한 단백질의 통과를 반영하는 전자 신호를 통해 얻어지도록 나노기공을 통해 개별적인 단백질을 전위시키기 위한 시스템이 본 명세서에서 기재되어 있다. 막에서의 나노기공, 막의 시스 측과 트랜스 측 사이의 전압 및 단백질 전위효소를 제공함으로써, 본 발명 디바이스는, 시스 측과 트랜스 측 사이의 회로망이 단백질의 아미노산 함량, 예를 들면 아미노산 서열을 나타내는 신호를 모니터링하고 기록할 수 있는 방식으로, 단백질 전위효소를 사용하여 나노기공 센서를 통한 네이티브 단백질의 전위 및 효소 제어 비폴딩을 성취한다. 실제적 목적을 위해, 회로 및 나노기공의 어레이가 제공될 수 있다. 이는 단일 챔버 또는 다중 챔버에 존재할 수 있다.

도 1a를 참조하면, 본 발명 디바이스는 기질 단백질(101)을 전위하도록 작동하고, 단백질(101)을 포함하는 시스 측 및 단백질(101)이 기공(102)을 통해 전위하도록 진행하는 트랜스 측으로 유체 구획을 분리시키는 막(106)에서 약 25㎛ 어퍼처에 포함된 지질 이중층(104)에 임베딩된 기공 단백질(102)(α-헤몰리신 또는 "AHL")을 포함한다. 디바이스는 트랜스 측에서의 양극(110)과 시스 측에서의 음극 사이에 정전압을 인가하기 위한 제어형 증폭기(108)를 포함한다. ClpX로서 하기 예시된 단백질 전위효소(109)는 챔버의 트랜스 측에 존재한다. 증폭기(108)는 또한 단백질(101)이 전위하면서 매우 신속히 발생하는 이온 전류 변화(즉, 도시된 Cl- 및 K+와 같은 이온의 흐름)를 검출하고, 바람직하게는 이를 기록하기 위한 회로망을 제공한다. 일례에서, 데이터는 100㎑에서 수집되지만, 고속 데이터 샘플링 디바이스는 공지되어 있고 사용될 수 있다(예를 들면, 펜텍, 인크(Pentek, Inc)로부터의 200㎒ 모델 7150). 도 1b는 지질 이중층(104)에서의 AHL 기공 단백질(102)의 상세도를 나타내고, 또한 트랜스 측에 있고, 카툰에서 트레딩되고 기공(102) 양측 둘 다에 있는 단백질(101)에 작용하는 단백질 전위효소(109)를 나타낸다. 도 1c에 도시된 바대로, 아미노 말단에서 Smt3 도메인을 보유하는 모델 기질 단백질은 하전된 가요성 링커에 의해 이의 카복시 말단에서 ssrA 태그에 커플링된다. 하전된 가요성 태그는 나노기공을 통해 트랜스 측 용액으로 트레딩되고, 이때 폴딩된 Smt3 도메인은 포획된 단백질의 완전한 전위를 방지한다. 트랜스 용액에 존재하는 ClpX는 기질 단백질의 C 말단 ssrA 서열에 결합한다. ATP 가수분해에 의해 촉진되어, ClpX는 채널을 향해 단백질 꼬리에 걸쳐 전위하고 이후 기공을 통한 Smt3 도메인(들)의 비폴딩 및 전위를 촉진한다. Smt3 도메인은 폴딩되고, 링커(들)는 그렇지 않다. Smt3은 "네이티브 단백질을 제조하기 위한 SUMO 융합 단백질 발현 시스템(SUMO Fusion Protein Expression System for Producing Native Proteins)"인 US 2009/0280535에 추가로 기재되어 있다. α-헤몰리신 나노기공을 통한 단백질 비폴딩 및 전위의 효소 제어가 하기 예에 입증되어 있다. 각각의 기질 단백질의 분절은 약 50Å 길이의 트랜스 막 기공 루멘(나노기공)을 통과하면서 아미노산 조성물에 기초하여 포착된다. 사용된 전위효소 효소는 디바이스가 단백질 서열 정보를 제공하도록 선택되고 제어된다. 효소는 기질에 대한 물리적 이동을 발생시키는 이러한 효소의 능력을 의미하는 본 명세서에서 일반적으로 "단백질 전위효소"라 칭하는 효소의 종류로부터 선택된다. 본 명세서에 사용된 용어 내에 1차 구조, 즉 단백질의 1차 서열에 영향을 미치는 일 없이 네이티브 단백질의 비폴딩을 촉진한다는 점에서 "언폴다제"라 대개 칭하는 효소의 종류가 포함된다.

특정한 실시양태에서, 전위효소에 의한 인식을 위해 기질 단백질은 태그화된다. 이를 수행하는 일 방식은 ssrA 태그의 사용이다. 다양한 ssrA 태그는 ClpX 프로테아제 시스템에 의해 분해되는 단백질을 제조하기 위한 몇몇 박테리아 종에서 사용되는 기전이므로 공지되어 있다. 예에서, ssrA 태그는 (서열 번호 5의 말단에서 나타난) C 말단 11개 잔기 AA 서열이고, 이들 중 이 서열의 하위세트는 독특하게 ClpA 또는 ClpX에 의해 인식된다. 기재된 바대로, 다른 서열을 사용할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 도 10에 도시된 단백질 나노기공 단백질 또는 키메라 나노기공은 시차 전압의 2개의 전도성 수용액을 분리시키는 얇은 절연 막(예를 들면, 지질 이중층 또는 그래핀 시트)에 임베딩될 수 있다. 나노기공을 통한 이온 전류의 흐름에 의해 감지가 부여되고; 단백질이 전위하거나 그렇지 않으면 기공과 접촉하면서, 이온 흐름의 봉쇄가 발생하여, 후속 분석에 대한 전자 신호를 제공한다. 이 단백질 나노기공 또는 키메라 나노기공은 또한 집괴의 표적 단백질의 동시의 분리 및/또는 정제를 위한 어레이 또는 랩온칩(lab-on-chip) 디바이스에서 사용된다.

본 발명은 어레이 또는 칩과 같은 나노기공 분석을 위한 다양한 기구에서 수행될 수 있다. 이 기구는 국제 출원 PCT/GB08/004127(발명의 명칭이 "Formation of layers of amphiphilic molecules"인 WO 2009/077734로 공개됨), PCT/GB10/000789(발명의 명칭이 "Lipid bilayer sensor array"인 WO 2010/122293으로서 공개됨), 국제 출원 PCT/GB10/002206(발명의 명칭이 "Biochemical analysis instrument"인 WO 00/28132로서 공개됨) 또는 국제 출원 PCT/US99/25679(발명의 명칭이 "Coupling method"인 WO 2000/28312로서 공개됨)에 기재된 임의의 것일 수 있다. 하기 설명으로부터 명확한 것처럼, 단백질은 단일 폴리펩타이드 서열로서 전위되고, 개별적인 아미노산은 순차적으로 기공을 통과한다. 다수의 단백질은 순차적으로 전위될 수 있다.

정의

달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 보통 이해하는 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실행 또는 교시에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 일반적으로, 세포 및 분자 생물학 및 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 기술은 당해 분야에 널리 공지되고 통상 사용되는 것이다. 구체적으로 정의되지 않은 특정한 실험 기술은 일반적으로 본 명세서에 걸쳐 인용되고 기재된 다양한 일반적이고 더 구체적인 참조문헌에 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 수행된다. 명확하게 하기 위한 목적으로, 하기 용어는 하기 정의된다.

범위: 간결함을 위해, 기재된 임의의 범위는 달리 기재되지 않은 한 언급된 범위 내의 임의의 하위범위를 포함하도록 의도된다. 비제한적인 예로서, 120 내지 250의 범위는 120 내지 121, 120 내지 130, 200 내지 225, 121 내지 250 등의 범위를 포함하도록 의도된다. 용어 "약"은 대략의 이의 일상적인 의미를 갖고, 실험 변화에 의해 맥락상 결정될 수 있다. 논의가 있는 경우, "약"은 언급된 수치의 5% 내외를 의미한다.

용어 "나노기공"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 내경이 0.5 내지 10나노미터 차수인 임의의 작은 홀 또는 채널을 의미하도록 사용된다. 용어 "나노기공"은 생물학적(예를 들면, α- 헤몰리신) 또는 인공 나노기공 둘 다를 포함한다. 본 발명 나노기공은 치수가 변할 수 있고, 예를 들면 이것은 직경이 약 0.5㎚ 내지 10㎚ 크기일 수 있다. 예를 들면, 직경은 약 0.5㎚, 1㎚, 1.25㎚, 1.5㎚, 1.75㎚, 2㎚, 2.25㎚, 2.5㎚, 2.75㎚, 3㎚, 3.5㎚, 4㎚, 4.5㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 9nm, 10㎚ 또는 이들 사이의 임의의 치수일 수 있다. 생물학적 나노기공은 기공 단백질에 의해 생성될 수 있다. 인공 나노기공은 마이크로몰딩(micromolding) 또는 드릴링(drilling)에 의해 제조될 수 있다. 이것은 또한 실리콘 조각에서 다소 더 큰 홀(수십 나노미터)을 에칭하고 이후 훨씬 더 작은 직경 홀을 생성시키는 이온-빔 조각(sculpting) 방법을 이용하여 이 홀을 점진적으로 충전함으로써 제조될 수 있다.

용어 "기공 단백질"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 자발적인 이중층 삽입을 추진하도록 충분한 소수화도를 노출시키기 위해 표적 막 주위에서 고리 유사 구조로 어셈블링되는 기공 형성 단백질(PFP)을 의미하도록 사용된다. 기공 단백질은 클로스트리듐 셉티쿰(C. septicum) 및 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)와 같은 박테리아에 의해 (배타적은 아니지만) 통상적으로 제조된다. PFP는 알파 기공 형성 독소, 예컨대 이. 콜라이의 시톨리신 A; 또는 베타 기공 형성 독소, 예컨대 α-헤몰리신 및 팬톤-발렌타인 류코시딘(Panton-Valentine leukocidin: PVL); 또는 2원 독소, 예컨대 안트락스(Anthrax) 독소; 또는 콜레스테롤 독립적 시톨리신(CDC), 예컨대 뉴몰리신; 또는 소형 기공 형성 독소, 예컨대 그라미시딘 A일 수 있다. 바람직한 기공 단백질은 α-헤몰리신(AHL)이다.

용어 "α- 헤몰리신"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 박테리움, 스타필로코커스 아우레우스 유래의 기공 형성 독소를 의미하도록 사용된다. α-헤몰리신은 대부분 베타 시트(68%)로 이루어지고, 불과 약 10%만이 알파 나선이다. 스타필로코커스 아우레우스 염색체 상의 hla 유전자는 293개의 잔기 단백질 단량체를 코딩하고, 이 단량체는 세포막에서 7합체 단위를 형성하여 완전한 베타 배럴 기공을 형성한다. 이 구조는 독소가 세포막에서의 기공 발생인 이의 주요 기능을 수행하도록 한다.

용어 "막"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 박막형 구조를 의미하도록 사용된다. 시스 챔버 및 트랜스 챔버를 분리시키는 막은 적어도 하나의 기공 또는 채널을 포함한다. 막은 일반적으로 합성 막 및 생물학적 막으로 분류될 수 있다. 임의의 막은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적합한 막은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 막은 바람직하게는 양친매성 층이다. 양친매성 층은 적어도 하나의 친수성 부분 및 적어도 하나의 친유성 부분 또는 소수성 부분 둘 다를 갖는 양친매성 분자, 예컨대 인지질로부터 형성된 층이다. 양친매성 층은 단일층 또는 이중층일 수 있다. 양친매성 분자는 합성 또는 천연일 수 있다. 단일층을 형성하는 비천연 양친매성 물질은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 블록 공중합체를 포함한다(Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450).

용어 "지질 이중층"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 친수성 포스페이트 헤드가 이중층의 어느 한 측에서 물 "밖으로" 향하고 소수성 꼬리가 이중층의 코어 "내로" 향하도록 배열된 지질 분자의 2개의 층으로 제조된 얇은 극성 막을 의미하도록 사용된다. 지질 이중층은 폭이 일반적으로 수 나노미터이고, 대부분 하전된 수용성 분자에 불투과성이다. 지질 이중층은 액체 또는 고체의 일부 기계적 특성을 갖기에 충분히 큰 구조이다. 이를 기술하기 위해 면적 보상 모듈러스(Ka), 벤딩 모듈러스(Kb) 및 에지 에너지(edge energy)를 사용할 수 있다. 고체 지질 이중층은 또한 전단 모듈러스를 갖지만, 임의의 액체와 같이, 전단 모듈러스는 유체 이중층에 0이다. 지질 이중층은 또한 어퍼처를 갖는 고체 기질, 예컨대 열 수축 배관, 퓸드 실리카, 붕규산 유리, 운모 및 산화 실리콘에 의해 지지될 수 있다. 지질은 예를 들면 랭뮤어-블라젯(Langmuir-Blodgett) 기술, 소포 융합 과정 또는 2의 조합을 통해 적용될 수 있다.

용어 "NTP"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 3개의 포스페이트에 결합된 뉴클레오사이드(이는 뉴클레오타이드가 되게 함)를 포함하는 분자인 뉴클레오사이드 트라이포스페이트를 의미하도록 사용된다. NTP는 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 구아노신 트라이포스페이트(GTP), 사이티딘 트라이포스페이트(CTP), 5-메틸유리딘 트라이포스페이트(m⁵UTP), 유리딘 트라이포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP), 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP), 데옥시사이티딘 트라이포스페이트(dCTP), 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP) 또는 데옥시유리딘 트라이포스페이트(dUTP)일 수 있다. "NTP"는 또한 덜 흔한 천연을 포함하는 뉴클레오타이드 대사의 중간체와 같은 다른 덜 풍부한 NTP를 의미한다.

용어 "NTP 추진 언폴다제"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 단백질 비폴딩을 촉진하는 NTP 독립적 효소를 의미하도록 사용된다. 매우 흔한 NTP 추진 언폴다제는 ATP 독립적 프로테아제, 예컨대 프로테아좀 ATPase, AAA 프로테아제 또는 AAA + 효소(하기 정의); 막 융합 단백질, 예컨대 NSF(N-에틸말레이미드 감지 융합 단백질)/Sac18p(효모에서의 N-에틸말레이미드 감지 융합 단백질 동족체) 또는 p97/VCP/Cdc48p(97kDa 발로신 함유 단백질); Pex1p 및 Pex6p(퍼옥시좀 ATPase); 카타닌 및 SKD1(마우스에서의 Vps4p 동족체)/Vps4p(효모에서의 액포 단백질 분류 4 동족체); 디네인(Dynein)(모터 단백질); DNA 복제 단백질, 예컨대 ORC(기원 인식 복합체), Cdc6(세포 분열 제어 단백질 6), MCM(미니염색체 유지(minichromosome maintenance) 단백질), DnaA 또는 RFC(복제 인자 C)/클램프-로더(clamp-loader); RuvB(홀리데이 졍크션(holliday junction) ATP 독립적 DNA 헬리카제 RuvB, EC=3.6.4.12); TIP49a/TIP49 및 TIP49b/TIP48(진핵생물 RuvB 유사 단백질)이다.

용어 "AAA + 효소"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 효소의 AAA+ 슈퍼패밀리를 의미하도록 사용된다. AAA+는 다양한 세포 활성과 관련된 ATPase에 대한 약어이다. 이는 대략 230개의 아미노산 잔기의 통상의 보존된 모듈을 공유한다. 이는 거대분자의 에너지 독립적 개형 또는 전위를 통해 활성을 발휘하는 고리 형상 P-루프 NTPase의 AAA+ 슈퍼패밀리에 속하는 기능적으로 다양한 큰 단백질 패밀리이다. 예는 박테리아에서 ClpAP, ClpXP, ClpCP, HslVU 및 Lon 및 미토콘드리아 및 엽록체에서 이의 동족체를 포함한다. Lon을 제외하고, AAA+ 효소(때때로 언폴다제 또는 프로테아제라 칭함)는 조절 (ATPase) 및 단백질분해 서브유닛으로 이루어지고, Lon은 조절 도메인 및 단백질분해 도메인 둘 다를 포함하는 단일 폴리펩타이드이다. ClpX 및 ClpA는 ClpP와 도킹(dock)하여 ClpXP 및 ClpAP 프로테아제를 형성하고, HslU는 HslV와 도킹하여, HslVU인 다른 프로테아제를 형성한다. ClpA 및 ClpX는 7합체를 형성하는 ClpP와 반대로 6합체를 형성한다. HslU 및 HslV는 각각 6합체를 형성하지만, HslU 7합체가 또한 보고되었다. 조절 서브유닛 ClpA, ClpX 및 HslU는 세프론으로서 작용한다. ClpX에 대한 추가의 상세내용은 문헌[Maillard et al., "ClpX (P) generates mechanical force to unfold and translocate its protein substrates," Cell 145:459-4669 (2011년 4월 29일)]에서 확인할 수 있다. 상기 기재된 바대로, ClpX 모터 공유는 원핵생물 ClpA, ClpB, HsIu, FtsH 또는 Lon을 포함하는 다른 AAA+ 효소를 갖는 기본적인 설계이다. AAA+ 효소는 또한 "AAA+ 분자 모터"라 칭한다. AAA+ 슈퍼패밀리의 추가의 설명은 문헌[Ogura et al. "AAA+ superfamily ATPase" common structure-diverse function," Genes to Cells, 6:575-597 (2001)]에서 확인한다. 상기 기재된 바대로, 미토콘드리아와 관련된 AAA+ 패밀리 구성원은 Bcs1p, Lon/Pim1p, ClpX 및 Hsp78이다.

용어 "HsIU"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 언폴다제 HsIU라고도 칭하는 ATP 독립적 프로테아제 ATPase 서브유닛 HsIU를 의미하도록 사용된다. HsIU는 ATPase의 Hsp100 및 Clp 패밀리의 구성원이다. 이것은 또한 HsIV와 복합체를 형성하여 언폴다제로서 작용할 수 있다(문헌[Bochtler et al., "The structures of HsIU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV," Nature 403(6771):800-805 (2000)] 참조).

용어 "Lon 프로테아제"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 고세균, 박테리아 및 진핵생물에서 발견되는 프로테아제의 패밀리를 의미하도록 사용된다. Lon 프로테아제는 MEROPS 펩티다제 패밀리 S16(lon 프로테아제 패밀리, clan SF)에 속하는 ATP 독립적 세린 펩티다제이다. 진핵생물에서, 대부분의 Lon 프로테아제는 미토콘드리아 매트릭스에 위치한다. 효모에서, Lon 프로테아제 PIM1은 미토콘드리아 매트릭스에 위치한다. 이는 미토콘드리아 기능에 필요하고, 이는 구성적으로 발현되지만, 열 응력 하에 증가하고, 이는 PIM1이 열 충격 반응에서 역할을 할 수 있다는 것을 제시한다.

용어 "단백질 전위효소"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 단백질 결합 폴리펩타이드, 예컨대 단백질 기질 상에 작동하고 진행성 방식으로, 즉 효소 활성의 기능으로서 효소에 대해 이를 이동시키는, 단백질 기질, 예를 들면 효소, 효소 복합체 또는 효소 복합체의 일부의 이동을 제어할 수 있는 폴리펩타이드를 의미하도록 의도된다. 용어 "진행성"은 효소가 다수의 단계에서 기질을 "진행시키는" 단계별 활성을 의미하는 것으로 당해 분야에서 이해된다. 본 경우에, 단백질 전위효소는 일반적으로 순차 방식으로, 즉 1차 아미노산 서열을 따라 이동하면서 전위시키고자 하는 단백질을 진행시킨다. 편의를 위해, "언폴다제"라고도 통상 칭하는 다수의 효소, 특히 NTP 추진 언폴다제는 이 정의에 포함된다. AAA + 효소 슈퍼패밀리 및 이 슈퍼패밀리의 ClpX 구성원이 이 범위 내에 또한 구체적으로 포함된다.

일반적인 용어 "단백질 전위효소"의 예로서 프로테아제, 예컨대 Lon 프로테아제 및 HsIU가 또한 포함되고, 이 효소는 효소의 효소 개열 활성을 제거하도록 변형되거나, 서열이 나노기공을 통해 전위된 후 개열이 발생하도록 배열된다.

다른 예시적인 단백질 전위효소는 ClpX(언폴다제라고도 칭함), 예를 들면 ClpA, 미토콘드리아 단백질 전위효소 TOM(외막의 전위효소) 또는 다른 TOM 및 TIM 단백질에 관한다. 선택된 단백질 전위효소는 또한 미토콘드리아 단백질 전위효소 복합체의 임의의 일부, 예컨대 세프론, TOM 수입 수용체, TOM 채널 복합체 및 "모터" 단백질일 수 있다.

용어 "ClpX "의 "ClpX 효소"는 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 서브유닛으로서 성숙 형태로 프로세싱되는, 유니프로트 지칭 clpX를 갖고 여기서 제공된 424개 아미노산 서열을 갖는 HSP(열 충격 단백질) 100개 패밀리의 구성원을 의미하도록 사용된다. ClpX 서브유닛은 회합되어 ATP 또는 ATP의 가수분해 불가능 유사체의 결합에 의해 안정화된 6원 (동종 6합체) 고리를 형성한다. ClpX의 N 말단 도메인은 기질 인식에 관여하는 C4형 아연 결합 도메인(ZBD)이다. ZBD는 몇몇 통상적인 ClpXP 기질, 예컨대 lO 및 MuA의 분해를 촉진하는 데 필수적인 매우 안정한 이합체를 형성한다. 이는 추가로 문헌[Wawrzynow et al, "The ClpX heat-shock protein of Escherichia coli, the ATP-dependent substrate specificity component of the ClpP-ClpX protease, is a novel molecular shaperone," EMBO J. 1995 May 1; 14(9): 1867-1877]에 기재되어 있고, 아미노산 서열은 또한 eclowiki.net에서 "clpX: gene products" 하에 제공된다.

유사하게, ClpA는 ClpA 서브유닛에 제공된 758개 아미노산 서열을 갖는 유니프로트/스위스-프로트(Swiss-Prot) 목록 clpA를 의미한다. 이는 ATP의 존재 하에 6합체 고리로 어셈블링된 6개의 ClpA 서브유닛의 복합체를 형성한다. 이는 ATP의 존재 하에 6합체 고리로 어셈블링된 6개의 ClpA 서브유닛 및 2개의 7합체 고리에 배열된 14개의 ClpP 서브유닛으로 이루어진 ClpAP 복합체의 성분이다. ClpS에 결합한다.

용어 "비변성 단백질"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로, 임의의 네이티브 시스테인 결합, 수소 결합 및 다합체 형태는 본질적으로 온전한 채 있으면서, 네이티브 2차 및 3차 구조로 적어도 부분적으로 폴딩된 단백질을 의미하도록 사용된다. 이는 일반적으로 불용성이면서 응집되는 변성 단백질과 반대이다.

용어 "음으로 하전된 아미노산"은 본 명세서에서 이의 종래의 의미로 글루타메이트 및 아스파르테이트와 같은 음으로 하전된 아미노산이 농후한 표면을 갖는 단백질을 의미하도록 사용된다.

일반적인 방법 및 기구

나노기공 센서 디바이스를 통한 단백질의 전위는 서열분석, 구조/폴드 분석, 정제/분리, 세포내 단백질 전달 및 폴리펩타이드의 전위를 추진하는 효소의 기전에 대한 통찰을 포함하는 다수의 가능한 용도를 제공한다. 핵산과 달리, 단백질은 일반적으로 균일하게 하전되지 않고(인가 전압을 통해 전위를 추진하기 어렵게 만듦), 나노기공의 어퍼처를 횡단할 수 없는 복잡하고 크고 안정한 구조로 폴딩한다. 이러한 논점을 해소하기 위해, 이. 콜라이 ClpX(또는 다른 유형의 단백질 전위효소/언폴다제)로 예시되는 다양한 효소를 통해 단백질 나노기공을 통한 본래 폴딩된 단백질의 비폴딩 및 전위를 성취할 수 있다.

본 방법 및 디바이스는 전위시키고자 하는 단백질의 하나 이상의 특징을 측정하도록 사용될 수 있다.

다양한 상이한 유형의 측정이 이루어질 수 있다. 이는 제한 없이 전기 측정 및 광학 측정을 포함한다. 가능한 전기 측정은 전류 측정, 임피던스 측정, 터널링(tunnelling) 측정(Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85) 및 FET 측정(국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 광학 측정은 전기 측정과 조합될 수 있다(Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301). 측정은 기공을 통해 흐르는 이온 전류의 측정과 같은 막관통 전류 측정일 수 있다.

문헌[Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72] 및 국제 출원 WO-2000/28312에 기재된 바대로 표준 단일 채널 기록 설비를 사용하여 전기 측정을 만들 수 있다. 대안적으로, 예를 들면 국제 출원 WO-2009/077734 및 국제 출원 WO-2011/067559에 기재된 바대로 다채널 시스템을 사용하여 전기 측정을 할 수 있다.

신호 측정은 통상적으로 단백질에서 단백질 또는 아미노산의 정체성을 나타낸다. 따라서, 신호는 상기 기재된 단백질인 서열을 규명하도록 사용될 수 있다.

1. 전위에 사용되는 효소

이. 콜라이 ClpX는 본 발명 디바이스의 실시예에서 사용되었고; 이는 안정한 단백질 폴드를 변성하기 위해 충분한 기계적 힘(20pN 초과)을 생성하고, 나노기공 센서에 의해 1차 서열 분석을 위해 적합한 속도(초당 80개 이하의 아미노산)로 단백질을 따라 전위되므로 최초 작업에 선택되었다. ClpX는 ClpXP 프로테아좀 유사 복합체의 일부이다. ClpP는 조절 6합체 ATP 독립적 언폴다제/전위효소 복합체(예를 들면 ClpX)에 일 말단 또는 양 말단에서 결합하는 다이 7합체 실린더 유사 프로테아제로 이루어진다. ClpX는 태그화 단백질이 후속 분해를 위해 ClpP 프로테아제 복합체의 내부 루멘으로 진입하게 하는 게이트로서 작용한다. ClpX인 6합체 단백질 복합체의 ATP 독립적 언폴다제/전위효소 활성은 나노기공을 통해 단백질을 비폴딩하고 트레딩하도록 사용된다.

ClpX는 문헌[Martin et al. "Rebuilt AAA+ Motors reveal operating principles for ATP-fuelled machines," Nature 437:1115-1120(2005)]에 기재된 바대로 제조될 수 있다(그리고 본 발명에서 제조됨). 다양한 대안적인 효소는 본 방법 및 디바이스에서 단백질 전위효소의 기능을 담당할 수 있다. 상기 문헌에 기재된 바대로, 20개의 아미노산 길이의 링커와 연결된, 1-60번 N 말단 아미노산이 결여된 2개, 3개 또는 6개의 ClpX-deltaN 서브유닛의 조합은 단일 폴리펩타이드 사슬로서 제조되었다.

AAA+ ATPase를 포함하는 세포 기능의 레퍼토리는 다양하다. AAA+ 단백질의 하위세트는 ATPase로서 활성이 아니고 몇몇은 심지어 ATP에 결합하지 않는다. 그러나, 이 단백질이 ATPase로서 작용하는 다른 패밀리 구성원과 복합체를 형성하는 것으로 보인다. 그러나, 모든 공지된 ATP 독립적 프로테아제의 ATPase 서브유닛 또는 도메인은 AAA+ 패밀리에 속한다.

적합한 AAA+ 효소의 일례는 Clp/Hsp100 ATPase이다. Clp/Hsp100 ATPase는 단백질 표적을 선택하는 것을 담당한다. 예를 들면, 2종의 상이한 박테리아 ATPase ClpX 및 ClpA는 ClpP 펩티다제에 대해 명확한 기질 선호도를 부여한다. 리보솜에 자리한 폴리펩타이드에 부착된 11개 잔기 펩타이드인 ssrA 분해 서열은 ClpX 및 ClpA 둘 다에 의해 인식된다. ssrA 서열의 돌연변이 분석은 이 동일한 태그가 상이한 잔기를 통해 2개의 비폴딩 효소에 의해 인식된다는 것을 나타내고, 이는 각각의 ATPase의 명확한 결합 선호도를 추가로 확인시켜 준다.

ATP 가수분해로부터의 에너지를 이용하여, Clp/Hsp100 효소는 이의 기질에서 구조 변화를 활발히 지시한다. 이 ATP 추진 구조 변화는 분해 또는 개형의 단백질 기질에 대한 2개의 명확한 생물학적 결과를 발생시킨다. ClpA는, 카세인을 분해하는 이의 능력에 기초하여, 기능적으로 확인된 처음의 원핵생물 Clp/Hsp100 단백질이다. 따라서, Clp/Hsp100 단백질에 대한 분해 경로는 2의 과정으로 잘 규명된다. Clp/Hsp100 촉진 단백질 분해 동안, 처음에, Clp/Hsp100 성분은 표적 단백질을 인식하고 선택한다. 효소는 기질의 C 또는 N 말단 근처에 일반적으로 위치한 짧은 펩타이드 서열(예를 들면, ssrA 분해 태그)에 결합한다. 이후, ATP 가수분해의 다회 사이클을 요하는 반응에서, 효소는 비폴딩하고 표적 기질을 이것이 분해되는 펩티다제 챔버로 방향성 있게 전위시킨다.

미토콘드리아 단백질 전위효소를 또한 사용할 수 있다. 이는 인간 또는 진핵생물 세포로부터의 전위효소 TOM 또는 TIM, 예컨대 TOMM20(미토콘드리아 외막 20 동족체의 전위효소), TOMM22(미토콘드리아 수입 수용체 서브유닛 22 동족체), TOMM40(미토콘드리아 외막 40 동족체의 전위효소), TOM7(미토콘드리아 외막 7의 전위효소), TOMM7(미토콘드리아 외막 7 동족체의 전위효소), TIMM8A(미토콘드리아 내막 8 동족체 A의 전위효소), TIMM50(미토콘드리아 내막 50 동족체의 전위효소)일 수 있다. 예를 들면, TOMM40은 미토콘드리아의 외막에 임베딩되고 미토콘드리아로의 단백질의 이동에 필요하다. 더 정확하게는, TOMM40은 미토콘드리아로의 단백질 수송에 필수적인 미토콘드리아 외막의 전위효소(TOM)의 채널 형성 서브유닛이다.

다른 대안적인 단백질 전위효소는 전위효소의 Sec 패밀리로부터 제조될 수 있다. 이는 SecB(세프론 단백질), SecA(ATPase), SecY(원핵생물에서의 내막 복합체), SecE(원핵생물에서의 내막 복합체), SecG(원핵생물에서의 내막 복합체) 또는 Sec61(진핵생물에서의 내막 복합체), SecD(막 단백질) 및 SecF(막 단백질)를 포함한다.

다른 대안적인 단백질 전위효소는 III형 분비 시스템(TTS) 전위효소, 예컨대 HrcN 및 TTS 전위효소 또는 Sec 독립적 주변세포질 단백질 전위효소 TatC의 임의의 20개의 서브유닛이다.

다른 대안적인 단백질 전위효소는 세프론이다. 이는 다른 거대분자 구조의 비공유 폴딩 또는 비폴딩 및 조립 또는 탈조립을 돕는 단백질이지만, 구조가 폴딩 및/또는 조립의 과정을 완료한 이의 정상 생물학적 기능을 수행할 때, 이 구조 내에 발생하지 않는다. 많은 세프론은 열 충격 단백질, 즉 고온 또는 다른 세포 스트레스에 반응하여 발현되는 단백질이다. Hsp 70은, 공지된 바대로, 원핵생물에서 70kDa 열 충격 단백질(Hsp70), 예컨대 DnaK, HscA(Hsc66) 및 HscC(Hsc62), 및 진핵생물 유기체에서 Hsc70, Hsp70, BiP 또는 Grp78(결합 면역글로불린 단백질), mtHsp70 또는 Grp75, 및 인간 Hsp70 단백질, 예컨대 Hsp70, Hsp70-2, Hsp70-4, Hsp70-4L, Hsp70-5, Hsp70-6, Hsp70-7, Hsp70-8, Hsp70-9, Hsp70-12a, Hsp70-14를 의미한다. Hsp70 단백질은 분자 세프론 및 폴딩 촉매의 세포 네트워크의 중추 성분이다. Hsp70은 새로 합성된 단백질의 폴딩 및 조립, 미스폴딩되고 응집된 단백질의 재폴딩, 세포기관 및 분비 단백질의 막 전위, 및 조절 단백질의 활성의 제어를 포함하는 광범위한 폴딩 과정을 보조한다. ATP 결합 및 가수분해는 Hsp70 단백질의 세프론 활성을 위해 실험실내 및 생체내 필수적이다.

Hsp70 세프론 패밀리는 Hsp60 세프론 패밀리와 함께 가장 흔한 개형 효소로서 인식된다. Hsp70 및 Hsp60은 폴딩 단백질에 단리 환경을 제공함으로써 단백질 폴딩 동안 경로 외 상호작용을 방지한다. 반대로, Clp/Hsp100 비폴딩 효소는 이의 기질에서 구조 변화를 활발히 지시한다. Clp/Hsp100은 폴딩되고 조립된 복합체, 및 부적절하게 폴딩되고 응집된 단백질에 작용한다.

HSP90은 ATP 독립적 과정에서 TOM 복합체에 대한 미토콘드리아 프리단백질의 전달을 보조한다.

Hsp100(이. 콜라이에서의 Clp 패밀리) 단백질은 태그화되고 미스폴딩된 단백질을 표적화하고 비폴딩하는 이의 능력에 대해 생체내 및 실험실내 연구되었다. Hsp100/Clp 패밀리에서의 단백질은 ATP의 존재 하에 언폴다제 활성을 갖는 큰 6합체 구조를 형성한다. 이 단백질은 작은 20Å(2㎚) 기공을 통해 클라이언트 단백질을 진행성으로 트레딩함으로써 세프론으로 작용하는 것으로 생각되고, 이에 의해 각각의 클라이언트 단백질에 폴딩할 제2 기회를 제공한다. ClpA 및 ClpX와 같이, 이 Hsp100 세프론 중 몇몇은 이중 고리 14합체 세린 프로테아제 ClpP와 회합하고; 클라이언트 단백질의 재폴딩을 촉진하는 대신에, 이 복합체는 태그화되고 미스폴딩된 단백질의 표적화된 파괴의 원인이 된다.

사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 Hsp100인 Hsp104는 많은 효모 프리온의 전파에 필수적이다. HSP104 유전자의 결실은 특정한 프리온을 전파시킬 수 없는 세포를 생성시킨다.

작업 실시예에서 사용되는 효소는 하기 서열을 갖는다:

IGRLPVVATLNELSEEALIQILKEPKNALTKQYQALFNLEGVDLEFRDEALDAIAKKAMARKTGARGLRSIVEAALLDTMYDLPSMEDVEKVVIDESVIDGQSKPLLIYGKPEAQQASGE(서열 번호 8)

이는 단일 사슬로서 발현되는 ClpX 서브유닛의 합성으로 설계된 3합체이다. 상기 기재된 바대로, 다양한 전위효소 작제물은 당해 시스템에서 사용될 수 있다.

2. 효소는, 나노기공의 일 측에서 용액 중에 유리되고/되거나 양측에 존재하는 채, 나노기공에 커플링될 수 있다

시스 측 에서의 전위효소(기질 단백질과 같은 측)

특정한 실시양태에서, 예를 들면 도 10에 도시된 것처럼, ClpA 또는 ClpX는 나노기공에 커플링될 수 있다. 공학적으로 조작된 알파-헤몰리신/ClpP 융합 단백질 기공은 N 말단 캡 도메인에서 ClpP 7합체 복합체의 ClpX 결합 도메인에 공유 융합된 활성 7합체 단백질 나노기공을 형성하도록 어셈블링될 수 있다. 나노기공의 상부에 대한 ClpP의 ClpX 결합 도메인의 융합은 ClpX가 용액 중에 어셈블링되고, ClpP 도메인에 부착하고, 나노기공의 상부에서 작용하도록 한다.

도 10은 ClpP 단백질의 서브유닛에 융합된 α-헤몰리신 기공 단백질 서브유닛을 포함하는 융합 단백질을 예시한다. 이후, ClpX 단백질 전위효소는 ClpP 서브유닛에 비공유로 "도킹"할 수 있다. 이 실시양태에서, 단백질 전위효소는 나노기공의 시스 측에 있고, 이에 융합한다.

도 10의 실시양태에서, 전위효소의 축 기공 및 나노기공은 정확한 배향으로 정렬되어야 한다; 즉, 단백질 기질이 용액으로부터 포획되고 ClpX 중앙 동공을 통해 구동되면서, AHL(알파 헤몰리신) 상부 루멘으로 직접 진입하고 결국 전체 나노기공을 통해 강제되는 방식으로 ClpX는 나노기공에 결합되어야 한다(도 10 참조). 이러한 목적을 성취하기 위해, ClpX 결합 도메인은 AHL의 헤드에 융합될 수 있다. 사실상, ClpX 6합체는 자연히 14합체(이중 7합체 고리) 프로테아제 ClpP의 각각의 개구에서 헤드 도메인에 결합하고, 태그화된 단백질이 단백질분해 챔버에 진입하도록 하는 게이트로서 작용한다. ClpP의 ClpX 결합 도메인을 AHL의 헤드에 융합함으로써, 이는 ClpX가 천연 단백질-단백질 상호작용을 통해 나노기공의 상부에 고친화도로 직접 결합하게 한다. 다행히도, AHL 및 ClpP 둘 다 놀랍게도 비슷한 직경을 갖는 동종 7합체 고리로 어셈블링되어서; 각각의 AHL 단량체에 대한 ClpP 단량체의 ClpX 결합 도메인의 융합은 이 ClpP/AHL 융합 단량체로 이루어진 7합체 나노기공 복합체를 생성한다. 이전의 연구는 AHL 단량체의 융합을 조사하였고, AHL이 N 및 C 말단 둘 다에서 융합에 관용적이라는 것을 나타낸다. 또한, 특정 연구는 ClpP의 C 말단에서 결실을 조사하였고, 이것이 7합체 형성 또는 ClpX 결합에 중요한 구역이 아니라는 것을 나타낸다. 이 데이터는 ClpP가 C 말단에 대한 AHL 융합에 관용적이고, N 말단 루프가 이러한 활성에 중요하다고 나타내고, ClpP N 말단에 대한 융합은 ClpX의 결합을 거의 확실히 억제한다는 것을 제시한다. 이러한 선행 연구에 기초하여, AHL/ClpP 융합 단량체는 (각각의 단백질 단량체가 적절히 폴딩되게 하는 가요성 5-15 Gly-Ser 링커에 의해 분리된) 절두된 ClpP 단량체의 C 말단에 융합된 단일 AHL 단량체를 갖도록 설계된다. 이 ClpP - 펩타이드 링커 - AHL 융합 단백질 DNA 서열은 PCR 어셈블리를 통해 작제되고 His 태그화되고, pT7-SC1 발현 벡터 내부에 삽입될 수 있다. 융합 단백질의 발현은 AHL 융합을 발현하도록 이전에 사용되고, Ni-NTA 친화도 크로마토그래피로 정제된 T7-S30 발현 시스템을 사용하여 커플링된 실험실내 전사 및 번역을 통해 수행될 수 있다.

전위효소가 디바이스의 시스 측에 있는 다른 실시양태는 부속 단백질의 사용을 포함한다. 이런 경우, 기질 단백질에 결합하는 단백질은 나노기공 내외로의 기질 단백질의 이동의 제어를 수월하게 하도록 사용된다. 예를 들면, (도 1에서처럼) 트랜스 측에 존재하는 단백질은 활성 전위효소/언폴다제일 필요는 없고, 오히려 폴리펩타이드의 비폴딩된 부분에 비특이적으로 결합하는 다른 단백질(예를 들면, 촉발 인자)이다. 촉발 인자는 리보솜 관련 분자 세프론이고, 초기 폴리펩타이드와 상호작용하는 제1 세프론이다. 이는 개방 구조형태에서 새로 합성된 단백질을 유지시킴으로써 세프론으로서 작용한다. 다른 샤페로닌 또는 열 충격 단백질을 사용한다.

이 트랜스 측 단백질(예를 들면, 촉발 인자)은 이로써 시스 측 전위효소/언폴다제에 의해 트랜스 용액으로 전위하면서 비폴딩된 기질 단백질을 순차적으로 포획하여, 기질 단백질이 시스 측으로 다시 이동하는 것을 방지한다.

다른 실시양태에서, 기질 단백질은 소정의 상태가 도달될 때까지 언폴다제에 의해 이의 비폴딩을 차단하는 인자가 제공된다. 이 실시양태에서, 기질 단백질 및 언폴다제 둘 다 시스 측에 첨가된다. 기질 단백질은 일 말단에서 언폴다제 결합 모티프(예를 들면, ClpX에 대한 ssrA 태그), 기공 표적 도메인(예를 들면, 인가 전압 하에 기공으로 당겨지는 하전된 폴리-펩타이드 꼬리) 및 언폴다제 내성 단백질에 태그화된다(예를 들면, 안정화 리간드의 존재 하의 디하이드로엽산 환원효소 또는 바르나제(barnase)는 ClpX에 의해 비폴딩에 저항한다; 문헌[Hoskins, JR et al. ClpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. PNA August 20, 2002 vol. 99 no. 17 11037-11042] 참조). 따라서, 기질 단백질은 이의 폴딩된 도메인 및 기공 표적화 및 언폴다제 결합 모티프 도메인 사이의 이 "차단 도메인"으로 언폴다제로부터 보호된다.

(기공 표적 도메인 및 언폴다제 표적 모티프 도메인과 융합된) 차단 도메인 단백질은 화학적으로 또는 효소적으로 번역후 기질 단백질에 부착될 수 있다.

벌크 시스 용액에서, 언폴다제는 언폴다제 결합 모티프에 결합하고 기공 표적 도메인을 따라 전위한다. 효소가 언폴다제 내성 단백질("차단 도메인")에 접근하면, 태그화 기질을 따른 언폴다제의 전위는 중지된다. 이 태그화 기질 단백질/언폴다제 복합체가 나노기공에 의해 포획될 때, 차단 도메인의 비폴딩 및 전위가 개시된다. 이는 기공 및/또는 기공을 통한 기질 꼬리의 포획 및 트레딩 후에 태그화 기질 단백질 꼬리와 상호작용하는 트랜스 용액에 존재하는 다른 단백질 전위효소/언폴다제에서 전압에 의해 부여된 추가의 탈안정화 힘에 의해 촉진된다. 이후, 차단 도메인의 기공 활성화 비폴딩이 촉진된 후 나노기공을 통한 시스 결합 언폴다제에 의한 전체 기질 단백질의 비폴딩 및 전위가 가능하다.

차단 도메인 서열 전략 예시 서열의 예는 하기와 같다:

N 말단 - 기질 단백질 - 차단 도메인 - 하전 꼬리 - 언폴다제 결합 모티프 - C 말단.

트랜스 측에서의 전위효소

ClpX 복합체는 나노기공의 트랜스 측에서 용액 중에 위치하고, 나노기공의 시스 측에서 용해된 기질 단백질은 N 또는 C 말단에서 시작하여 나노기공을 통해 트레딩되도록 강제되고(예를 들면, 몇몇 하전된 아미노산을 단백질 말단, 예컨대 5 내지 10개의 Asp, Lys 또는 Arg 잔기로 공학적으로 조작함으로써 전압 추진됨), 여기서 ClpX 복합체는 이 태그화 폴리펩타이드 꼬리를 포획하고 나노기공을 통해 기질을 기계적으로 당기기/전위시키기 시작한다. 후속 분석을 위해 나노기공 센서를 통한 단백질의 이동을 제어하기 위해 태그화 단백질의 네이티브 ClpX 결합, 비폴딩 및 전위 활성이 사용된다. ClpX 또는 다른 전위효소, 예컨대 ClpA가 디바이스의 트랜스 측에서 용액 중에 위치하는 경우(여기서, 이것은 시스 측으로부터 나노기공을 통해 트랜스 측 용액으로 트레딩된 태그화 단백질 꼬리를 포획(즉, ClpX를 "피싱(fishing)")하도록 함) 야생형 단백질 나노기공 또는 다른 고체 상태 나노기공을 사용할 수 있다. 이 태그화 꼬리의 포획 시, ClpX 복합체는 기공을 통해 트랜스 측 용액으로 전체 폴리펩타이드를 결국 비폴딩하고 트레딩할 때까지 기공으로부터 단백질을 기계적으로 당기기 시작할 수 있다. 태그화 꼬리의 최초 트레딩은 표적 단백질의 N 또는 C 말단에서 태그 서열에 인접한 몇몇 하전된 잔기의 삽입을 통해 성취되고, 여기서 전압 차등은 나노기공을 통해 하전 꼬리를 추진하여, 이것이 ClpX의 "피싱"에 이용 가능하게 한다.

예를 들면, 하기 실시예 1 및 실시예 2에 도시된 바대로, 단백질 전위효소는 챔버의 트랜스 측에 용액 중에 첨가되고; 전위시키고자 하는 단백질 나노기공(폴딩된 단백질의 통과를 허용하기에 너무 좁음)을 통해 당김으로써 이것을 비폴딩하도록 작용한다. 동일한 또는 상이한 단백질 전위효소는 단백질을 비폴딩하기 위해 나노기공의 시스 측에 위치할 수 있다.

3. 나노기공 감지

본 방법 및 디바이스에서 감지하는 방법은 단백질의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 특징을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 1개 이상의 특징은 바람직하게는 (ⅰ) 단백질의 길이, (ⅱ) 단백질의 정체성, (ⅲ) 단백질의 서열, (ⅳ) 단백질의 2차 또는 3차 구조 및 (ⅴ) 단백질이 변형인지의 여부로부터 선택된다. 본 발명에 따라 (ⅰ) 내지 (ⅴ)의 임의의 조합을 측정할 수 있다.

특징 (ⅰ)의 경우, 단백질과 기공 사이의 상호작용의 수 및/또는 단백질이 기공을 통해 전위하면서 단백질의 지체 시간을 이용하여 단백질의 길이를 측정할 수 있다.

특징 (ⅱ)의 경우, 다수의 방식으로 단백질의 정체성을 측정할 수 있다. 단백질의 서열의 측정과 함께 또는 단백질의 서열의 측정 없이 단백질의 정체성을 측정할 수 있다. 전자가 간단하고; 단백질은 서열분석되고 이에 의해 확인된다. 다양한 방식으로 후자를 수행할 수 있다. 예를 들면, (단백질의 남은 서열을 측정함이 없이) 단백질에서의 특정한 모티프의 존재를 측정할 수 있다. 대안적으로, 이 방법에서의 특정한 전기 신호 및/또는 광학 신호의 측정은 특정한 소스로부터 생기는 단백질을 확인할 수 있다.

특징 (ⅲ)의 경우, 본 명세서에 기재된 바대로 단백질의 서열을 결정할 수 있다. 서열은 개별 아미노산 잔기 마다 결정될 수 있거나, 아미노산의 블록에서 판독될 수 있고, 이 아미노산은 DNA의 재서열분석과 유사한 방식으로 공지된 단백질 서열로 맵핑될 수 있다. 따라서, 이 방법은 각각의 개별 아미노산을 분석할 필요가 없고, 오히려 단백질/폴리펩타이드 서열의 동정이 여전히 가능하게 하는 아미노산의 "워드" 또는 블록/청크(예를 들면, 2개 내지 10개의 aa)를 단지 분석한다.

특징 (ⅳ)의 경우, 다양한 방식으로 2차 및 3차 구조를 측정할 수 있다. 예를 들면, 이 방법이 전기 측정을 포함하는 경우, 지체 시간 변화 또는 기공을 통해 흐르는 전류 변화를 이용하여 2차 구조(예를 들면, 루프 구역 또는 베타 시트 구역에 대한 알파 나선 구역의 검출)를 측정할 수 있다.

특징 (ⅴ)의 경우, 임의의 변형의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 메틸화, 포스포릴화, 산화에 의해, 손상(예를 들면, 아미노산의 미스폴딩 또는 공유 변형)에 의해, 글라이코실화에 의해 또는 하나 이상의 라벨, 태그 또는 스페이서에 의해 단백질이 변형되는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 특이적 변형은 하기 기재된 방법을 이용하여 측정될 수 있는 나노기공과의 특이적 상호작용을 발생시킨다.

하기 기재된 바대로, 본 방법 및 디바이스는 나노기공을 통해 측정되는 이온 전류의 분석에 의해 전위되는 단백질로부터 단백질 서열 정보를 발췌할 수 있다. 이는 부분적으로 민감한 전자부품, 예컨대 패치 클램프 증폭기, 유한 상태 기계 및 신호 처리, 예컨대 가중 평균(모두 하기 기재됨)의 사용에 따라 달라진다. 또한, 본 방법은 나노기공을 통한 단백질의 수송 및 수반되는 전류 봉쇄, 비봉쇄 또는 변형과 관련되는 것으로 밝혀진 다양한 전류 상태의 분석을 포함한다. 하기 기재된 바대로, 효소 매개 단백질 횡단에 의해 측정된 신호는 기질 단백질에 대한 효소의 결합을 특징으로 하는 소위 "상승 상태", 이후 단백질이 나노기공을 통해 전위하면서 일련의 별개의 진폭 전이, 이어서 전위 전의 기공을 통한 전류에 동등한 개방 상태에 진입한다. 요약하면, 예시적인 실험적 설정을 이용하여, 하기의 명확한 상태(도 2 참조)를 관찰할 수 있다:

(ⅰ) 전위 전의 개방 채널 전류 - 약 30 내지 35㎀ 또는 32 내지 36㎀;

(ⅱ) 전위시키고자 하는 단백질의 포획(즉, 단백질은 나노기공 개구를 차단함) 시 약 11 내지 15(예를 들면, 약 13 내지 15)㎀로의 감소;

(ⅲ) 효소가 단백질에 결합하고 단백질 꼬리를 따라 나노기공을 향해 전위하면서(즉, 효소는 나노기공 개구를 차단함), 10pA 이하로의 감소 및 다양한 진폭 변화(하기 기재된 "상승" 효과를 포함);

(ⅳ) 단백질의 비폴딩 후, 전체 단백질은 나노기공을 통해 전위하여, 독특한 전류 패턴을 생성함;

(ⅴ) 개방 채널 상태로의 복귀.

중요한 것은, 상태 (ⅳ)(도 2a 및 2B)는 단백질 구조와 상관될 수 있는 전류 패턴을 제시한다는 것이다. 하기 기재된 것처럼, 실시예에서 사용되는 인공 링커는 상이한 전류 진폭 및 기간을 나타낸다. 비공지된 특징, 예컨대 서열을 결정하기 위해 단백질을 분석할 때, 전위된 단백질의 아미노산 독립적 특징에 대해 관찰된 진폭 변화 및 RMS 노이즈를 상관시킬 수 있다. 이는 3차 구조 및 2차 구조, 아미노산 서열 및 번역후 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

나노기공 바이오센싱 기술은 분자가 인가 전압 하에 기공을 통해 전위하고/하거나 기공과 상호작용할 때 발생하는 이온 전류의 차단에 기초한다. 따라서, 전류 봉쇄는 인가 전압 및 상호작용 분자의 특징(예를 들면, 전하, 크기)에 따라 달라진다.

임의의 적합한 기술에 의해 나노기공 어퍼처의 시간 독립적 수송 특징을 측정할 수 있다. 수송 특징은 폴리펩타이드, 액체 중의 용질(예를 들면, 이온), 폴리펩타이드(예를 들면, 단량체의 화학 구조) 또는 폴리펩타이드 상의 라벨을 수송하도록 사용되는 매질의 기능일 수 있다. 예시적인 수송 특징은 전류, 전도율, 저항, 전기용량, 전하, 농도, 광학 특징(예를 들면, 형광 및 라만 산란) 및 화학 구조를 포함한다. 바람직하게는, 수송 특성은 전류이다.

시스 챔버와 트랜스 챔버 사이에 전류를 검출하는 예시적인 수단은 WO 00/79257, 미국 특허 제6,46,594호, 제6,673,615호, 제6,627,067호, 제6,464,842호, 제6,362,002호, 제6,267,872호, 제6,015,714호, 제6,428,959호, 제6,617,113호 및 제5,795,782호 및 미국 공보 제2004/0121525호, 제2003/0104428호 및 제2003/0104428호에 기재되어 있고, 기공 어퍼처에서 또는 이 근처에서 채널 또는 기공과 직접 관련된 전극, 시스 챔버 및 트랜스 챔버 내에 위치한 전극, ad 절연 유리 마이크로전극을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 전극은 2개의 챔버에 걸친 이온 전류 차이 또는 기공 어퍼처 또는 채널 어퍼처에 걸친 전자 터널링 전류를 검출할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 수송 특징은, 나노기공 원주에 인접하게 배치되거나 접경한 전극에 의해 모니터링될 수 있는, 어퍼처의 직경에 걸쳐 흐르는 전자이다. 이러한 전극은 신호를 증폭하기 위해 악소패치(Axopatch) 200B 증폭기에 부착될 수 있다.

일 실시양태에서, 매질은 전기 전도성이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 매질은 수용액이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 2개의 풀 사이의 전기 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 유도된 제1 시간에 얻은 전기 전류값(I₁)을 제1 극성이 유도된 제2 시간에 얻은 전기 전류값(I₂)과 비교하는 단계; 및 I₁과 I₂ 사이의 차이를 결정하여 차이값(δI)을 얻는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 2개의 풀 사이의 전기 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 유도된 제1 시간에 얻은 전기 전류값(I₁)을 마지막 시간에 얻은 전기 전류값(I₂)과 비교하는 단계 및 I₁과 I₂ 사이의 차이를 결정하여 차이값(δI)을 얻는 단계를 추가로 포함한다.

대안적인 실시양태에서, 이 방법은 효소 활성을 개시하는 시약을 제공하는 단계; 폴리펩타이드 복합체를 포함하는 풀에 시약을 도입하는 단계; 및 적합한 온도에서 풀을 항온처리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 시약은 활성자 및 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

4. 나노기공 박막 디바이스의 제조

단일 채널(나노기공) 박막 디바이스 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 당해 디바이스는 통상적으로 혼합 신호 반도체 웨이퍼, 적어도 하나의 전기화학 층을 포함하고, 전기화학 층은 반도체 재료, 예컨대 이산화규소 등을 포함하고, 반도체 재료는 표면 개질제, 예컨대 탄화수소를 추가로 포함하고, 전기화학 층은 복수의 오리피스를 획정하고, 오리피스는 챔버 및 목(neck)을 포함하고, 오리피스의 챔버는 혼합 신호 반도체 웨이퍼의 제1 금속 조성물과 동시위치하고, 오리피스의 일부는 제2 금속, 예를 들면, 은에 의해 막히고, 제2 금속은 제1 금속과 전자 통신하고, 오리피스는 박막, 예컨대 인지질 이중층을 추가로 포함하고, 박막은 오리피스의 목에서 용매 불투과성 시일을 형성하고, 박막은 기공을 추가로 포함하고, 오리피스는 수상 및 기상을 둘러싼다.

다른 바람직한 실시양태에서, 반도체 재료는 이산화규소(SiO₂), 산질화규소(SiON), 질화규소(SiN), 금속 산화물 및 금속 규화물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 반도체 재료는 이산화규소이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 표면 개질제는 탄화수소이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 금속화 조성물은 니켈, 금, 구리 및 알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 금속은 은이다. 바람직한 실시양태에서, 박막은 분자 이중층이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 박막은 인지질 이중층이다. 대안적인 일 실시양태에서, 오리피스는 크기가 0.5㎛ 내지 3㎛이다. 바람직한 실시양태에서, 오리피스는 크기가 1㎛ 내지 2㎛이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 오리피스는 크기가 1.25㎛ 내지 1.5㎛이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 기공은 생물학적 분자이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 분자는 이온 채널, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운반체, 스냅스 채널, 막관통 수용체 및 핵 기공으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 생물학적 분자는 알파-헤몰리신이다. 바람직한 실시양태에서, 기공 어퍼처는 크기가 약 1㎚ 내지 10㎚이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 기공 어퍼처는 크기가 약 1㎚ 내지 4㎚이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 기공 어퍼처는 크기가 약 1㎚ 내지 2㎚이다. 대안적인 가장 바람직한 실시양태에서, 기공 어퍼처는 크기가 약 2㎚ 내지 4㎚이다.

생물학적 나노기공은 사용되는 낮은 전류(대략 수십 피코암페어)에도 불구하고 폴리펩타이드의 검출에서 유용성을 갖는다. 고속(high-through put) 단일 나노기공 서열분석 디바이스를 사용한 검출은 초당 대략 1000개의 아미노산 잔기로 제한될 수 있다. 예컨대, 집적 회로의 매우 큰 어레이의 제조에서 사용되는 서로 독립적으로 작동될 수 있는 생물학적 나노기공의 어레이를 제조하는 것은 나노기공의 대규모 스케일 어레이가 1초 내에 수백만개의 생물화학 반응 및 분석을 수행하도록 한다.

다양한 나노기공은 당해 시스템에서 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 기공 또는 채널은 중합체를 통과시키기에 적합한 치수를 갖도록 형상화되고 크기화된다. 다른 실시양태에서, 기공 또는 채널은 중합체의 실질적인 부분을 수용한다. 바람직한 실시양태에서, 중합체는 폴리펩타이드이다. 기공 또는 채널은 또한 기공 분자 또는 채널 분자일 수 있고, 생물학적 분자 또는 합성 변형 분자 또는 변경 생물학적 분자, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 분자는 예를 들면 이온 채널, 예컨대 α-헤몰리신, MspA, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운반체, 스냅스 채널, 막관통 수용체, 예컨대 GPCR 등, 수용체 티로신 키나제 등, T 세포 수용체, MHC 수용체, 핵 수용체, 예컨대 스테로이드 호르몬 수용체, 핵 기공, 합성 변이체, 키메라 변이체 등이지만, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직한 일 실시양태에서, 생물학적 분자는 α-헤몰리신이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 분자는 MspA(마이코박테리아 스메그마티스 포린(Mycobacteria smegmatis porin) A)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 기공은 고체 상태 기공이다.

대안에서, 기공 또는 채널은 비-효소 생물학적 활성을 포함한다. 비-효소 생물학적 활성을 갖는 기공 또는 채널은 예를 들면 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, 핵산, 펩타이드 핵산(PNA), 잠긴 핵산(LNA), 모르폴리노, 당, 지질, 글라이코실 포스파티딜 이노시톨, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드 등일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 화합물은 항원 활성을 가질 수 있다. 화합물은 선택적 결합 특성을 가질 수 있고, 이에 의해 중합체는 특정한 제어 환경 조건 하에 화합물에 결합하지만, 환경 조건이 변할 때는 그렇지 않다. 이러한 조건은 예를 들면 [H⁺] 변화, 환경 온도 변화, 엄격도 변화, 소수화도 변화, 친수화도 변화 등일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 기공 또는 채널은 링커 분자를 추가로 포함하고, 링커 분자는 티올기, 설파이드기, 포스페이트기, 설페이트기, 사이아노기, 피페리딘기, Fmoc기 및 Boc기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 화합물은 이작용성 알킬 설파이드 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 기공은 활성자의 통과를 허용하도록 크기화되고 성형되고, 활성자는 ATP, NAD⁺, NADP⁺, 다이아실글라이세롤, 포스파티딜세린, 에이코시노이드, 레티노산, 칼시페롤, 아스코르브산, 뉴로펩타이드, 엔카팔린, 엔도르핀, 4-아미노뷰티레이트(GABA), 5-하이드록시트립타민(5-HT), 카테콜라민, 아세틸 CoA, S-아데노실메티오닌 및 임의의 다른 생물학적 활성자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 기공은 보조인자의 통과를 허용하도록 크기화되고 성형되고, 보조인자는 Mg²⁺, Mn^{2 +}, Ca^{2 +}, ATP, NAD⁺, NADP⁺ 및 임의의 다른 생물학적 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

어레이 구성요소는 집적 회로의 트랜지스터의 제조와 유사한 단계별 동시 방법으로 제조될 수 있다. 각각의 어레이 구성요소의 유사 층의 전부 또는 대부분은 어레이 구성요소의 전부 또는 대부분에서 동시에 발생하는 단일 공정 단계의 순서로 생성된다.

생물학적 시약의 별개의 분자의 활성을 동시화하는 단순한 방식은 없는 것으로 보이고, 그래서 어레이에서의 각각의 구성요소는 다른 구성요소와 독립적으로 작용할 수 있어야 한다. 이는 디지털 논리 회로를 포함함으로써 생물학적 나노기공과 관련된 복합 오프 단일(또는 다중) 분자의 생물화학 상태를 제어하고 감지하는 유한 상태 기계를 실행하는 각각의 단일 생물학적 나노기공으로 성취될 수 있다. 유한 상태 기계는 생물학적 나노기공과 관련된 분자의 복합체의 낮은 반응시간(latency) 제어를 허용함과 동시에 다른 때에 검색에서 얻은 정보를 저장할 수 있다.

어레이에서의 각각의 생물학적 나노기공 구성요소가 최소 수의 유선 연결을 이용하여 서로 통신할 수 있도록 하기 위해, 어레이에 진입하고 배출되는 다량의 데이터를 다중통신하기 위해 직렬 인터페이스 및 주소화 논리를 사용할 수 있다.

어레이 구성요소의 전부가 이의 각각의 오리피스에 걸쳐 박막 또는 이중층을 가질 수 있는 것은 아니다. 비기능적 어레이 구성요소의 존재를 검출하기 위해 유한 상태 기계에 의해 측정되는 나노기공에 존재하는 막의 전기용량을 사용할 수 있다. 박막 또는 이중층이 결여된 어레이 구성요소의 비율이 바람직한 비율과 비교하여 높다고 후속하여 결정되는 경우, 테플론(TEFLON) 필름 및 지질 코트와 같은 막을 오버레이하는 단계를 반복할 수 있다.

전극, 예를 들면 접지 거시적 AgCl 전극을 제2 용액과 접촉하도록 위치시킬 수 있다. 이중층과 같은 막이 모든 기능적 오리피스에 걸쳐 제자리에 위치하는 경우, 이온 전류는 제2 용액으로부터 제1 용액으로 흐르지 않는다. 소정의 양의 기공 분자 또는 채널 분자, 예를 들면 알파-헤몰리신 독소 또는 MspA 등을 제2 용액에 첨가한다. 기공 분자 또는 채널 분자의 농도는 예를 들면 대략 15분 내에 임의의 박막 또는 이중층에서 단일 채널을 형성하기에 충분하다. 이러한 채널을 형성하는 시간은 예를 들면 30초 내지 1시간, 예를 들면, 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 7분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분 또는 이들 사이의 임의의 시간일 수 있다. 여러 인자 또는 매개변수, 예를 들면 주변 또는 항온처리 온도의 증가 또는 감소, 제2 용액 또는 제1 용액 중의 염 농도의 증가 또는 감소, 제1 용액과 제2 용액 사이의 전위 차이 배치 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 작업자가 형성 시간을 변경할 수 있다. 유한 상태 기계는 회로를 통한 전류(이온)의 흐름에 반응함으로써 상응하는 이중층에서의 단일 채널 형성을 검출하고/하거나 감지할 수 있고, 회로는 임의의 소정의 어레이 구성요소를 위해 거시적 전극, 제2 용액, 단일 나노기공 또는 채널 분자, 제1 용액 및 금속 전극을 포함하다.

생물학적 채널의 형성은 스토캐스틱(stochastic) 과정이다. 단일 채널이 소정의 어레이 구성요소 이중층에서 형성되면, 제2 채널이 이 내부에 이렇게 형성되는 기회가 감소하거나, 바람직하게는 제거되는 것이 바람직하다. 제2 채널 삽입의 가능성은 인가 전위, 즉 이중층에 걸친 전위차로 변조될 수 있다. 단일 채널 감지 시, 유한 상태 기계는 금속 전극에 대한 전위를 조정하여 동일한 이중층으로의 제2 채널 삽입의 가능성을 감소시킬 수 있다.

이전 단계(들)에 취한 주의에도 불구하고, 제2 채널은 소정의 이중층을 형성할 수 있다. 유한 상태 기계는 제2 채널의 형성을 검출할 수 있다. 정확히 제어되는 저전압의 펄스는 2개 중 1개의 채널을 강제하여 단일 채널이 이중층에 임베딩된 채 있도록 할 수 있다.

생물화학 액츄에이션 및 검출을 위해 생물학적 나노기공을 사용하는 과정에서, 기공은 영구적으로 파괴될 수 있다. 유한 상태 기계는 이 파괴된 상태를 검출하고 감지할 수 있고, 가열 부재를 불활성화하여 이중층에 흡인(감암)을 가하여 이중층으로부터 차단된 채널을 제거할 수 있다.

대안적인 실시양태에서, 각각의 어레이 구성요소는 오리피스를 둘러싸는 금 전극을 포함할 수 있다. 이 금 전극은 환원 또는 산화 반응을 이용하여 화학 시약을 활성화하도록 작용할 수 있고, 특정한 오리피스의 위치에서 특이적으로 작용할 수 있다.

예를 들면, 타이완 세미컨덕터 매뉴팩쳐링 컴퍼니(Taiwan Semiconductor Manufacturing Company)(대만)로부터 예를 들면 상업적으로 구입 가능한 최신의 65㎚ 공정 기술을 이용하여 유한 상태 기계를 생성할 수 있다. 나노기공의 600 x 600 어레이는 1000㎐의 속도로 360,000개의 생물화학 반응 및 검출/감지 단계를 수행할 수 있다. 이는 예를 들면 반도체 웨이퍼로부터 절단된 1㎝ x 1㎝ 다이당 초당 360백만 베이서(baser)의 속도로 진행하도록 폴리뉴클레오타이드의 서열분석이 가능하게 할 수 있다.

시스 챔버와 트랜스 챔버 사이에 전기장을 인가하는 예시적인 수단은 예를 들면, 전압원에 연결된, 액침된 애노드 및 액침된 캐소드를 포함하는 전극이다. 이러한 전극은 예를 들면 염화은 또는 유사한 물리적 특성 및/또는 화학적 특성을 갖는 임의의 다른 화합물로부터 제조될 수 있다.

5. 장비

작업 실시예에서, 몰레큘러 다바이시스 악소패치(Molecular Devices AxoPatch) 200B인 패치 클램프 증폭기는 인가 전압을 조절하고, 채널을 통한 이온 전류를 측정한다. 데이터는 몰레큘러 다바이시스 디지데이터(Molecular Devices Digidata) 1440A 디지타이저를 사용하여 기록되고, 50㎑에서 샘플링되고, 4극 베젤 필터로 5㎑에서 로우 패스(low-pass) 여과된다. 스테이션 중 하나는 A-M 시스템즈 모델 2400인 상이한 패치 클램프를 사용한다.

다른 설비를 하기한 바대로 사용할 수 있다:

제어 논리: 하드웨어 및 소프트웨어

전압 제어 논리는 LabVIEW 8 소프트웨어 내에 유한 상태 기계(FSM)를 사용하여 프로그래밍된다. FSM 논리는 National Instruments PCI-7831R인 필드 프로그래머블 게이트 어레이(field-programmable gate array: FPGA) 하드웨어 시스템에서 실행된다. FPGA는 신속한 측정 및 전압 반응 시간(1μ초 출력 샘플 시간)을 허용하는 재설정 가능한 하드웨어 플랫폼이다. FSM은 프로그램 실행이 일련의 개별 상태로 분산되는 논리 구성이다. 각각의 상태는 이와 관련된 명령을 갖고, 상태 사이의 전이는 시스템 측정의 기능이다. 기공 전류의 측정은 입력으로서 FSM으로 진행되고 통과한다. FPGA에서 실행되는 설계를 재컴파일하고 재라우팅할 필요 없이 FSM 제어 논리의 변화를 필요한 대로 만들 수 있다. 시스템이 마이크로초의 차수로 사건에 반응하게 하고, 또한 제어 논리가 실험 사이에 필요한 대로 재구성되게 함으로써, 이는 속도와 융통성 사이의 균형을 성취한다.

중합체에 대한 분자의 결합을 검출하고 제어하기 위해 유한 상태 기계를 사용할 수 있다. 분자는 단백질이고, 바람직하게는 단백질은 효소이다. 유한 상태 기계는 또한 나노기공을 통한 중합체 화합물의 전위를 억제하는 구조 구성요소를 갖는 중합체 화합물을 검출할 수 있다. 일 실시양태에서, 중합체 화합물은 펩타이드 핵산을 포함한다.

유한 상태 기계는 약 5㎐ 내지 2000㎐의 속도로 중합체에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 유한 상태 기계는 예를 들면 약 5㎐, 약 10㎐, 약 15㎐, 약 20㎐, 약 25㎐, 약 30㎐, 약 35㎐, 약 40㎐, 약 45㎐, 약 50㎐, 약 55㎐, 약 60㎐, 약 65㎐, 약 70㎐, 약 75㎐, 약 80㎐, 약 85㎐, 약 90㎐, 약 95㎐, 약 100㎐, 약 110㎐, 약 120㎐, 약 125㎐, 약 130㎐, 약 140㎐, 약 150㎐, 약 160㎐, 약 170㎐, 약 175㎐, 약 180㎐, 약 190㎐, 약 200㎐, 약 250㎐, 약 300㎐, 약 350㎐, 약 400㎐, 약 450㎐, 약 500㎐, 약 550㎐, 약 600㎐, 약 700㎐, 약 750㎐, 약 800㎐, 약 850㎐, 약 900㎐, 약 950㎐, 약 1000㎐, 약 1125㎐, 약 1150㎐, 약 1175㎐, 약 1200㎐, 약 1250㎐, 약 1300㎐, 약 1350㎐, 약 1400㎐, 약 1450㎐, 약 1500㎐, 약 1550㎐, 약 1600㎐, 약 1700㎐, 약 1750㎐, 약 1800㎐, 약 1850㎐, 약 1900㎐, 약 950㎐ 및 약 2000㎐로 중합체에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유한 상태 기계는 약 25㎐ 내지 약 250㎐의 속도로 중합체에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 유한 상태 기계는 약 45㎐ 내지 약 120㎐의 속도로 중합체에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 유한 상태 기계는 약 50㎐의 속도로 중합체에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다.

이동하는 평균 필터

매 5.3μ초마다, FPGA는 이온 전류를 샘플링하고, 0.75밀리초의 윈도우 크기를 이용하여 윈도우 내 평균 진폭을 컴퓨팅한다. 평균이 선택된 역치(threshold) 범위에 해당하는 경우, FPGA는 항목을 검출하고 평균을 계속해서 모니터링하고, 매 0.2초마다 역치를 재확인한다. 평균이 4회 연속 확인에 역치 범위 내 있는 경우, FSM 논리는 선택된 역치와 일치하는 것으로 공지된 사건 유형으로서 봉쇄를 진단한다.

전압 변화 부재의 경우, 사건 시작과 사건 진단 사이의 예상된 시간 지연은 1.35밀리초이고; 처음에 역치에 해당하는 윈도우 내 평균의 경우 0.75밀리초이고, 더 확인된 3회 시험의 경우 0.6밀리초이다. 실제로, 진단 시간은 1.1밀리초 내지 2.5밀리초 범위이다. 본 발명의 최초 실행에서 평균 필터를 실행한다.

지수 가중 이동 평균 필터

마지막 단계의 오류 검출에 대한 FSM의 응용성(robustness)을 개선하기 위해, 평균 필터를 대체하기 위해 지수 가중 이동 평균(EWMA) 필터를 사용할 수 있다. EWMA 필터는 전기 공학 분야에서 신호 미세조정에 통상 사용되는 아날로그 RC 필터의 디지털 실행을 나타낸다. 필터는 지난 샘플에 대한 지수적으로 더 적은 유의성을 부여하는 이동 평균을 계산하고, 여과된 신호가 실제 신호를 더 잘 추적하도록 한다. EWMA 필터링은 또한 이의 순환적 실행으로 인해 단순한 이동 평균보다 더 효율적으로 신호 미세조정을 수행한다:

i^bar(t) = (1-a)i^bar(t) + ai(t-1) (1)

식 중, i 및 i^bar는 각각 비여과된 전류 신호 및 여과된 전류 신호이고, t는 샘플 번호이다. α = 0.9로 마지막 단계 검출 실험 오프라인으로부터 데이터를 필터링하면 평균 필터에 대한 긍정 오류에 대한 실질적인 응용성 개선을 나타낸다. 평균 필터에서처럼, 4회 연속 역치 시험은 사건 진단에 사용되고, 역치 사이에 0.2밀리초 동안 대기한다.

전압 변화 부재의 경우, 사건 시작과 사건 진단 사이의 예상된 시간 지연은 0.7밀리초이고; 처음에 역치에 해당하는 EWMA의 경우 0.1밀리초이고, 더 확인된 3회 시험의 경우 0.6밀리초이다. EWMA 검출 시간의 더 엄격한 평가는 본 발명의 추후의 작업의 일부이다.

FSM / FPGA 를 사용한 전압 제어

나노기공 시스템은 0.3mM KCl 용액 중에 설정될 수 있다. 몰레큘러 다바이시스 악소패치 200B인 패치 클램프 증폭기는 인가 전압을 조절하고, 채널을 통한 이온 전류를 측정한다. 데이터는 몰레큘러 다바이시스 디지데이터 1440A 디지타이저를 사용하여 기록되고, 50㎑에서 샘플링되고, 4극 베젤 필터로 5㎑에서 로우 패스 여과된다.

전압 제어 논리는 LabVIEW 8 소프트웨어 내에 FSM을 사용하여 프로그래밍된다. FSM 논리는 National Instruments PCI-7831R인 필드 프로그래머블 게이트 어레이 하드웨어 시스템에서 실행된다. FPGA는 신속한 측정 및 전압 반응 시간(1μ초 출력 샘플 시간)을 허용하는 재설정 가능한 하드웨어 플랫폼이다. FSM은 프로그램 실행이 일련의 개별적인 상태로 분산되는 논리 구성이다. 각각의 상태는 이와 관련된 명령을 갖고, 상태 사이의 전이는 시스템 측정의 기능이다. 기공 전류의 측정은 입력으로서 FSM으로 진행되고 통과한다. FPGA에서 실행되는 설계를 재컴파일하고 재라우팅할 필요 없이 FSM 제어 논리의 변화를 필요한 대로 만들 수 있다. 시스템이 마이크로초의 차수로 사건에 반응하게 하고, 또한 제어 논리가 실험 사이에 필요한 대로 재구성되게 함으로써, 이는 속도와 융통성 사이의 균형을 성취한다.

6. 예시적인 분야

본 명세서에 개시된 본 발명의 분야 및/또는 용도는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 1). mRNA, rRNA 및 DNA에서의 단백질-핵산 복합체의 검정. 2). 펩타이드 분석을 통한 식품 및 환경 샘플에서의 미생물 또는 바이러스 함량의 존재의 검정. 3). 펩타이드 분석을 통한 식품 및 환경 샘플에서의 미생물 또는 바이러스 함량의 확인. 4). 펩타이드 분석을 통한 식물, 인간, 미생물 및 동물에서의 병원균의 확인. 5). 의학 진단에서의 펩타이드의 검정. 6). 법의학적 검정.

세포 증식에서 중요한 용도를 갖는 프로테아제, 키나제 및 포스파타제와 같은 효소의 턴오버(turnover)를 모니터링하도록 본 발명 나노기공 디바이스를 사용할 수 있다.

본 발명 나노기공 디바이스는 바이오센서로서 작용하여 가용성 물질, 예컨대 효소 기질 또는 신호전달 분자 사이의 상호작용을 모니터링할 수 있다. 예로는 혈액 성분, 예컨대 포도당, 요산 및 유레아, 호르몬, 예컨대 스테로이드 및 사이토카인 및 수용체 분자에 대한 결합에 의해 이의 기능을 발휘하는 약제학적 물질을 포함한다.

본 발명 나노기공 디바이스는 실시간으로 중요한 생물학적 구조, 예컨대 리보솜의 기능을 모니터링하고, 단일 기능 단위로 이 조작을 수행할 수 있다.

본 방법 및 디바이스는 또한 변경된 단백질 발현, 단백질의 과도한 발현에 대한 발현의 부재/존재를 검출하고 정량화하거나 치료학적 중재 동안 단백질 수치를 모니터링하도록 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 나노기공 디바이스의 어레이를 사용하여 소정의 샘플에서의 단백질의 양을 추정할 수 있다. 폴리펩타이드 또는 전위시키고자 하는 단백질은 또한 수일 내지 수달에 걸친 기간 동안 상기 기재된 질환 및 다른 뇌 장애, 병증 및 질환에 대한 치료 효율의 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 비교를 위한 정성적 또는 정량적 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

진단

당해 시스템에 의해 전위될 수 있는 폴리펩타이드, 단편, 올리고펩타이드 및 PNA는 변경된 단백질 발현, 단백질의 과도한 발현에 대한 발현의 부재/존재를 검출하고 정량화하거나 치료학적 중재 동안 단백질 수치를 모니터링하도록 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 병증, 질환 또는 장애는 특발성 폐동맥 고혈압, 이차성 폐 고혈압, 세포 증식성 장애, 특히 악성 뇌교종, 미분화성 회돌기교종, 성상세포종, 올리고 성상 세포종, 악성뇌교종, 수막종, 신경절 신경종, 뉴런 신생물, 다발성 경화증, 헌팅턴병, 유방 선암, 전립선 선암, 위 선암, 전이성 신경내분비 암종, 비증식성 섬유낭성 및 증식성 섬유낭성 유방 질환, 쓸개 담낭염 및 담석증, 골관절염 및 류마티스성 관절염; 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 애드슨병, 성인 호흡 곤란 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 아밀로이드증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 양성 전립선 비대증, 기관지염, 첵디아크-히가시(Chediak-Higashi) 증후군, 담낭염, 크론씨병, 아토피 피부염, 피부근염, 당뇨병, 폐기종, 태아 적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체신염, 구드패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 통풍, 만성 육아종성 질환, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 호산구증가증, 과민성 대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심막 또는 심근 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소 증후군, 다발성 근염, 건선, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 강피증, 중증 복합형 면역결핍 질환(SCID), 쇼그렌 증후군, 전신 과민증, 전신 홍반 루푸스, 전신 경피증, 혈소판 감소성 자반증, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 혈액투석, 체외 순환, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원생동물 및 장내 기생충 감염; 프로락틴 생성 장애, 나팔관 질환, 배란 장애 및 자궁내막증을 포함하는 불임, 발정 주기 파괴, 생리 주기 파괴, 다낭성 난소 증후군, 난소 과잉자극 증후군, 자궁내막 또는 난소 종양, 자궁 섬유종, 자가면역 장애, 자궁 외 임심 및 기형발생; 유방암, 섬유낭성 유방 질환 및 유루증; 정자 형성 파괴, 비정상 정자 생리학, 양성 전립선 비대증, 전립선염, 페이로니병, 발기부전, 여성형 유방; 광선 각화증, 동맥경화증, 점액낭염, 간경변, 간염, 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 골수섬유증, 발작성, 야행성 혈색소증, 진선 다혈증, 원발성 혈소판 증가증, 암의 합병증, 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종을 포함하는 암 및 특히, 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 자궁경부, 쓸개, 신경절, 위장관, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 난소, 췌장, 부갑상선, 음경, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 고환, 흉선, 갑상선 및 자궁의 암을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드.

폴리펩타이드, 단편, 올리고펩타이드 및 PNA 또는 이의 단편은 변경된 단백질 발현, 단백질의 과도한 발현에 대한 발현의 부재/존재를 검출하고 정량화하거나 치료학적 중재 동안 단백질 수치를 모니터링하도록 사용될 수 있다. 변경된 발현과 관련된 병증, 질환 또는 장애는 좌불안석증, 알츠하이머병, 기억상실, 근위축성 측색 경화, 운동 실조, 양극성 장애, 긴장증, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트 야콥병, 치매, 우울증, 다운 증후군, 지연성 운동장애, 긴장 이상, 뇌전증, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경병증, 파킨슨병, 피크병, 망막 색소 변성증, 정신분열증, 계절성 우울증, 노인성 치매, 뇌졸중, 뚜렛 증후군 및 선암, 흑색종 및 기형암종을 포함하는 암, 특히 뇌의 암을 포함한다. 이 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 수일 내지 수달에 걸친 기간 동안 상기 기재된 질환 및 다른 뇌 장애, 병증 및 질환에 대한 치료 효율의 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 비교를 위한 정성적 또는 정량적 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

예를 들면, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 표준 방법에 의해 표지되고 하이브리드화 복합체의 형성을 위한 조건 하에 환자로부터의 생물학적 샘플에 첨가될 수 있다. 항온처리 기간 후, 샘플을 세척하고, 표지(또는 신호)의 양을 정량화하고 표준값과 비교한다. 환자 샘플에서의 표지의 양이 표준값과 비교하여 유의적으로 변경된 경우, 관련 병증, 질환 또는 장애의 존재가 표시된다.

단백질 발현과 관련된 병증, 질환 또는 장애의 진단을 위한 기초를 제공하기 위해, 정상 또는 표준 발현 프로파일을 확립한다. 동물 또는 인간인 정상 피험체로부터 취한 생물학적 샘플을 하이브리드화 또는 증폭을 위한 조건 하에 펩타이드 태그와 조합함으로써 이를 성취할 수 있다. 정상 피험체를 사용하여 얻은 값을 실질적으로 정제된 표적 서열의 공지량이 사용되는 실험으로부터의 값과 비교함으로써 표준 하이브리드화를 정량화할 수 있다. 이러한 방식으로 얻은 표준값을 특정한 병증, 질환 또는 장애에 증상을 나타내는 환자로부터의 샘플로부터 얻은 값과 비교할 수 있다. 특정한 병증과 관련된 값에 대한 표준값으로부터의 편차를 이용하여 이 병증을 진단한다.

동물 연구 및 임상 실험에서 특정한 치료학적 치료 섭생의 효율을 평가하거나 개별 환자의 치료를 모니터링하기 위해 이러한 검정은 또한 이용할 수 있다. 병증의 존재가 확립되고 치료 프로토콜이 개시되면, 규칙적으로 진단학적 검정을 반복하여 환자에서의 발현 수준이 정상 피험체에서 발견되는 수치에 근사해지는지를 결정할 수 있다. 연속 검정으로부터 얻은 결과를 이용하여 수일 내지 수달에 걸친 기간 동안의 치료 효율을 나타낼 수 있다.

실시예 1: 단백질 전위를 모니터링하기 위한 나노기공 디바이스의 구축

이 실시예의 나노기공 디바이스는 도 1a에 도시되어 있고, 이는 사용된 설정을 나타낸다. 각각 100㎕의 0.2M KCl 용액(30℃)을 포함하는 2개의 테플론(Teflon)(등록상표) PTFE 중합체 웰을 분리시키는 지질 이중층에 인베딩된 단일 AHL 기공을 갖는 나노기공 센서를 제조하였다. 전압을 웰(트랜스 측 +180mV) 사이에 인가하여, 채널을 통해 이온 전류가 흐르게 하였다. 전류는 포획된 단백질 분자의 존재 하에 감소하였다.

간단히 말하면, 각각의 실험의 경우 각각 100㎕의 PD 완충제(pH 7.6)를 포함하는 2개의 웰(시스 및 트랜스라 칭함)을 분리시키는 30㎛ 직경 지질 이중층에 단일 AHL 나노기공을 삽입하였다. 모든 ClpX 나노기공 실험을 위해 N 말단 절두된 ClpX 변이체(ClpX-ㅿN₃)의 공유 연결된 3합체를 사용하였다. 안드레아스 마틴(Andreas Martin)(UC Berkeley)으로부터 ClpX-ㅿN₃ BLR 발현 균주를 얻었다. 0.5mM IPTG를 첨가하고 3-4시간 동안 진탕시키면서 23℃에서 항온처리함으로써 약 1의 OD 600에서 ClpX 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 펠렛화하고, 용리 완충제(50mM NaH₂PO₄(pH 8), 300mM NaCl, 100mM KCl, 20mM 이미다졸, 10% 글라이세롤, 10mM BME) 중에 재현탁시키고, 유리 비드로 와류시켜 용리시켰다. 용리물의 원심분리 및 여과 후, 단백질을 Ni2+ -NTA 친화도 칼럼(Thermo) 및 Uno-Q 음이온 교환 칼럼(Bio-Rad)에서 정제하였다.

시스 구획 및 트랜스 구획 둘 다를 ClpX 기능에 최적화된 100㎕의 200mM KCl 완충제로 충전하였다. 이 완충제는 표시된 바대로 5mM ATP로 보충된다. 패치 클램프 증폭기(악소패치 200B, 몰레큘러 다바이시스)는 2개의 Ag/AgCl 전극(트랜스 측 +) 사이에 일정한 180mV 전위를 인가하고, 시간의 함수로서 나노기공을 통한 이온 전류를 기록하였다. 기질 단백질을 약 1μM의 최종 농도로 시스 용액에 첨가하고, 약 100nM ClpX가 트랜스 용액 중에 존재한다.

일정한 180mV 전위를 이중층에 걸쳐 인가하고, 전압 클램프 모드의 일체형 패치 클램프 증폭기(악소패치 200B, 몰레큘러 다바이시스)와 직렬로 Ag/AgCl 전극 사이의 나노기공을 통해 이온 전류를 측정하였다. 전체 세포 구성(β=1)에서 100㎑ 밴드폭에서 아날로그 대 디지털 변환기(디지데이터 1440A, 몰레큘러 다바이시스)를 사용하여 데이터를 기록하고, 아날로그 로우 패스 베젤 필터를 사용하여 5㎑에서 여과시켰다. PD/ATP 5mM 및 PD/ATP 4mM의 매일 제조에 의해 실험 조건을 준비시켰다. ClpX를 4.5mM ATP(최종) 중의 30 내지 100nM ClpX의 최종 농도를 위해 PD/ATP 5mM 중에 1:10 희석하였다. 단일 AHL 나노기공의 단리 전에 전체 시스템을 충전하기 위해 ClpX 용액을 사용하였다. 삽입 시, 시스 웰을 약 6㎖의 PD/ATP 4mM으로 관류시켰다. 30℃에서 실험을 수행하고, 1 내지 2μM 기질이 시스 웰에 첨가되었다. 단백질 기질 포획 사건을 기공 막힘으로 인한 또는 소정 기간 후의 역극성으로 유출한다. 전압 유도 전위를 자주 유출하여 막힘을 방지하고 데이터 수집의 효율을 증가시킨다. 단일 나노기공 실험은 이중층 파열, 채널 전도율 손실 또는 전위 사건의 프리셋 수의 완료에 의한 종료 전에 온전한 이중층에서의 하나의 나노기공으로부터 이온 전류 데이터가 획득되는 시간으로 정의된다.

실시예 2: 전위를 위한 공학적 조작 단백질 S1 , S2 -35 및 S2 -148

전위에 사용된 기질 단백질은 도 1c에 도식적으로 예시되어 있고, 이는 (ⅰ) S1(11개 아미노산 ClpX 표적 도메인(ssrA 태그)을 갖는 이의 카복시 말단에서 캡핑된 65개 아미노산 길이의 하전된 가요성 분절에 커플링된 단일 N 말단 Smt3 도메인을 보유하는 단백질); (ⅱ) S2-35(S1과 유사하지만 35개 아미노산 링커 및 제2 Smt3 도메인에 의해 이의 N 말단에서 부착됨); (ⅲ) S2-148(Smt3 도메인 사이의 연장된 148개 아미노산 링커를 제외하고 S2-35과 동일함)을 나타낸다.

본 발명의 최초 실험의 경우, 본 발명자들은 유비퀴틴 유사 단백질 Smt3의 변형 버전을 사용하였다. Smt3은 4개의 β-스트랜드 및 단일 α-나선으로 배열된 약 100개 아미노산으로 이루어진다. 본 발명자들은 Smt3을 S1로 추가로 공학적으로 조작하였다. 기질 단백질 S1을 작제하기 위해, 76개 아미노산 꼬리(GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDDAANDENYALAA)(서열 번호 1)를 코딩하는 DNA를 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 작제하고, T/A-클로닝 자리에서 pET-SUMO 벡터(인비트로겐(Invitrogen))로 클로닝하여, 꼬리 서열을 Smt3 서열 3' 말단에 융합하였다.

76개 아미노산 꼬리는 약 10개의 음으로 하전된 잔기 및 11개의 아미노산 Clpx 결합 도메인 ssrA를 포함하였다.

나노기공 분석을 수월하게 하기 위해, S1인 공학적으로 조작된 Smt3 단백질을 2의 방식으로 변형시켰다, 1) 이것은 13개 배치된 음으로 하전된 아스파르테이트 잔기(서열 번호 6)를 포함하는 65개 아미노산 길이의 글라이신/세린 꼬리에 부착되었다. 이 비구조화 다중음이온은 나노기공에 걸쳐 전기장에서 S1의 포획 및 보유를 촉진하도록 설계되었다. 이의 결정 구조¹³에 기초하여, Smt3 폴딩된 도메인은 AHL 연결통로(vestibule)의 상부에 위치하는 것으로 예상된다(도 1b). 2) 부착된 다중음이온을 11개 아미노산 ClpX 표적화 모티프¹⁴인 ssrA 태그와 이의 C 말단에서 캡핑하였다. 이 ssrA 펩타이드 태그는 기공을 통해 트랜스 구획으로 트레딩되면서 ClpX가 단백질의 C 말단에 특이적으로 결합하도록 하였다.

S1 Smt-3 서열의 5' 말단에 대한 35개 아미노산 링커(GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG)(서열 번호 2)를 코딩하는 DNA의 PCR 기반 첨가에 의해 S2-35(서열 번호 5)를 작제하였다. 이후, 이 링커 변형 S1 유전자를 BsaI 자리에서 pE-SUMO 벡터(LifeSensors)에 클로닝하여, 첨가된 링커 및 S1 서열을 pE-SUMO Smt3 서열의 3' 말단에 융합하였다.

S2-148(서열 번호 6) 링커 첨가(GGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGSGASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGS)(서열 번호 3)를 위한 DNA를 PCR에 의해 작제하고, 깁슨(Gibson) 어셈블리 방법에 의해 35개 아미노산 링커 구역 내의 S2-35 벡터에 클로닝하였다. 이 공학적으로 조작된 단백질을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)*에서 발현시켰다. 발현을 0.5mM IPTG 첨가로 약 0.6 OD 600에서 유도하고 4 내지 6시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 항온처리하였다. 배양물을 펠렛화하고, 용리 완충제 중에 재현탁시키고, 유리 비드로 와류시켜 용리시켰다. 용리물의 원심분리 및 여과 후, 단백질을 Ni^{2 +} -NTA 친화도 칼럼(Thermo)에서 정제하였다.

실시예 3: 단백질 S1 의 전위의 검출

ClpX 및 ATP의 존재 하의 단백질 S1의 포획 및 전위를 위한 대표적인 이온 전류 파형이 도 2a에 도시되어 있다. 도 2a는 S1 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸다. (ⅰ) 표준 조건(약 34±2㎀, RMS 노이즈 1.2±0.1㎀) 동안 AHL 나노기공을 통한 개방 채널 전류. (ⅱ) S1 기질의 포획. 단백질 포획 시, 이온 전류는 약 14㎀(약 0.7㎀ RMS 노이즈)로 하강한다. (ⅲ) ClpX 매개 상승 상태. 이온 전류는 10㎀ 미만으로 감소하고 하나 이상의 점진적 진폭 전이를 특징으로 한다. 이 패턴은 오직 ClpX 및 ATP(트랜스 구획)의 존재 하에 관찰되었다. (ⅳ) 나노기공(약 3.8 ㎀, 1.7㎀ RMS 노이즈)을 통한 Smt3 도메인 비폴딩 및 전위. (ⅴ) 트랜스 구획으로 기질 전위의 완료 시 개방 채널 전류로의 복귀, 약 34±2㎀(도 2a, ⅰ)의 개방 채널 전류로부터, S1 포획은 약 14㎀(도 2a, ⅱ)로 전류를 하강시켰다. 이 안정한 전류는 수십 초 동안 지속되었고, 트랜스 구획에 첨가된 ClpX 및 ATP의 존재 또는 부재 하에 관찰되었다(도 4). 이는 기공 전기장에서 하전된 폴리펩타이드 꼬리에 작용하는 전기력에 의한 기공 연결통로의 정상(stationary) 상부에 보유된 Smt3 구조와 일치한다. ClpX 및 ATP의 존재 하에, 이 최초 전류 상태는 대개 4.3초의 중앙 기간으로 약 10㎀의 평균에 도달하는 진행성 하향 전류 상승에 따른다(도 2a, ⅲ 및 도 5). 이 전류 상승은 ClpX 및 ATP가 존재할 때 약 5.5시간 실험 동안 전체 45배로 단백질 S1로 관찰되었고; 반대로, ClpX 및 ATP가 약 2.3시간 실험 동안 트랜스 용액으로부터 부재할 때, 상승은 상태 ⅱ를 따르는 것으로 결코 관찰되지 않았다. 대부분의 사건에서, ClpX 독립적 상승 상태는 약 3㎀로의 갑작스런 이온 전류 감소로 종료되었다(도 2a, ⅳ). 상태 ⅳ에 대한 중앙 기간은 약 700ms(도 3A)이고, 이후 이것은 개방 채널 전류로의 신속한 증가로 종료되었다(도 2a, ⅴ).

이 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 ClpX가 나노기공을 통해 S1 단백질을 당기도록 ATP 가수분해로부터 유도된 화학 에너지를 이용하는 분자 기계로서 작용한다고 가정하였다. 이 과정은 하전된 아미노산이 기공 전기장으로 진입하면서 전기력에 의해 간헐적으로 보조되었다.

도 2b는 S1의 ClpX 매개 전위의 작업 모델을 예시한다. 카툰 ⅰ-ⅴ는 a 패널에서 이온 전류 상태 ⅰ-ⅴ에 상응한다. 이 과정에서 제안된 단계는 도 2b에 도식화되어 있다: ⅰ) 개방 채널; ⅱ) Stm3 분절을 갖는 기공에 의한 단백질 S1 포획은 연결통로(가느다란 하전된 폴리펩타이드 꼬리 분절은 기공 루멘으로 연장됨) 및 트랜스 구획에서의 ssrA 태그 위에 위치한다. 이 이온 전류 상태에서, ClpX는 S1에 결합되지 않거나, 대안적으로, 결합하지만 기공으로부터 여전히 멀리 있고; ⅲ) ClpX는 접촉할 때까지 AHL 기공의 트랜스 측 오리피스를 향해 S1 스트랜드를 따라 진전한다. 이온 전류는 ClpX의 인접성으로 인해 기공으로 감소한다; ⅳ) ClpX 및 기공 전기장에 의해 발휘되는 조합된 힘 하에, 기공 상부의 Stm3 구조는 순차적으로 변형되어 폴리펩타이드가 나노기공에 대해 진전하도록 한다. 이 상태에서, 더 큰 아미노산(또는 Smt3 2차 구조)가 기공 루멘에 진입하므로, 이온 전류는 감소한다. 이 이온 전류 상태는 S1 단백질이 트랜스 구획에 의해 완전히 당겨질 때까지 지속되어 개방 채널 전류 ⅴ로 복귀시킨다.

실시예 4: 단백질 S2 -35 및 S2 -148의 전위의 검출

이 모델은 시험 가능한 예측을 만든다. 관찰된 전류 상태가 부분적으로 ClpX에 의해 추진된 기공 루멘으로의 폴리펩타이드 분절의 진행성 이동으로 인할 때, 단백질 1차 구조를 변화시키면 후속하여 ClpX/ATP 독립적인 이온 전류 패턴을 변화시킨다. 특히, 제2 Smt3 도메인의 첨가는 제2 상승 상태(도 2a, ⅲ)를 발생시키고, 이후 제2 상태는 3㎀에 집중되었다(도 2a, ⅳ). 시험으로서, 본 발명자들은 가요성 세린/세린 농후 35개 아미노산 링커를 S1 단백질의 N 말단에 융합하고, 이것을 제2 Smt3 도메인(단백질 S2-35, 도 1c, ⅱ 및 서열 목록, S2-35)과 캡핑하였다. 따라서, S1의 단일 폴딩된 성분 서열(C 말단>하전된 가요성 꼬리>Smt3>N 말단)은 S2-35(C 말단>하전된 가요성 꼬리>Smt3>가요성 링커>Smt3>N 말단)에서 2회 반복된다.

단백질 S2-35가 ClpX/ATP가 트랜스 구획에 존재하는 나노기공에서 포획될 때, 8개의 재현 가능한 상태를 갖는 이온 전류 패턴이 관찰되었다(도 2c).

도 2c는 단백질 S2-35 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸다. 개방 채널 전류(상태 ⅰ)가 도시되어 있지 않다. 상태 ⅱ-ⅳ는 a 패널에서 상태 ⅱ-ⅳ와 동일하다. (ⅴ) 약 10㎀로의 점진적 이온 전류 증가. 본 발명의 작업 모델에서, 이는 Smt3 도메인 전위로부터 링커 구역 전위로의 전이에 해당한다. ⅵ) 상승 상태 ⅲ과 매우 닮은 제2 추정상 상승 상태. ⅶ) 상태 ⅳ와 매우 닮은 이온 전류 특성을 갖는 제2 추정상 Smt3 전위 상태. ⅷ) 개방 채널 전류로의 복귀. 처음 4개의 상태(도 2c, ⅰ-ⅳ)는 S1 전위에 의해 발생한 상태 ⅰ-ⅳ와 동일하다(도 2a 및 도 2c 비교). 이 유사성은 ClpX 확대에 진단된 상승 상태 ⅲ 및 Smt3 독립적 상태 ⅳ를 포함한다. 그러나, 상태 ⅴ에서 시작하여, S2-35 패턴은 S1 패턴에서 벗어난다(도 2a 및 도 2c 비교). 즉, Smt3 상태 ⅳ 후에, 통상적인 S2-35 이온 전류 파형은 개방 채널 전류로 진행하지 않지만, 대신에 1.5초의 중앙 기간으로 약 6㎀ 상태로 전이한다(도 2c, ⅴ 및 도 3B). 이는 상승 상태 ⅲ과 매우 닮은 약 8.5㎀ 상태(도 2c, ⅵ) 및 추정상 Smt3 전위 상태 ⅳ와 매우 닮은 후속하는 이온 전류 상태(도 2c, ⅶ)를 따른다. 즉, 본 발명의 모델과 일치하게, S1 사건(도 2a) 동안 관찰된 추정상 ClpX 결합 및 Smt3 독립적 상태가 S2-35 사건(도 2c) 동안 2회 관찰되었다. 2개의 작제물에 대한 이 유사한 상태는 거의 동일한 진폭, RMS 노이즈값 및 기간을 공유한다(도 3A, 도 5 및 도 6).

단백질 구조에 대한 이온 전류의 이 의존성은 나노기공을 통한 ClpX 추진 단백질 전위와 일치한다. 추가의 시험으로서, 본 발명자들은 S2-35 전위 동안 관찰된 이온 전류 상태 ⅴ를 재시험하였다. 이 상태는 2의 관찰에 기초하여 나노기공을 통한 35개 아미노산 링커의 이동과 일치한다: 1) 이의 평균 이온 전류는 몇몇 벌키한 측쇄를 갖는 아미노산 서열에 예상된 것처럼 주변 상태(도 2c)보다 측정 가능하게 높았고; 2) 시간 도메인에서, S2-35 1차 서열(도 1c, ⅱ 및 관련 서열)을 따른 이의 위치를 고려하여 예상된 것처럼 Smt3 독립적 이온 전류 상태 ⅳ와 ⅵ 사이에 이온 전류 상태 ⅴ가 존재한다.

상태 ⅴ가 ClpX 제어 하에 폴리펩타이드 링커의 전위에 상응하는 경우, 이 링커의 길이 및 조성 변화는 기간 및 전류 진폭을 변화시켜야 한다. 본 시험의 경우, 본 발명자들은 S2-35 링커 구역이 추가의 113개 아미노산과 부착된 제3 단백질을 설계하여, 연장된 148개 아미노산 가요성 링커(단백질 S2-148, 도 1c, ⅲ 및 서열 S2-148)에 의해 분리된 2개의 Smt3 도메인으로 이루어진 최종 작제물을 생성하였다.

도 2d는 단백질 S2-148 전위 동안의 이온 전류 파형을 나타낸다. 이온 전류 상태 ⅰ-ⅴ 및 ⅵ-ⅷ는 S2-35 전위(c 패널)에 대해 이 상태와 거의 동일하다. (ⅴ) 본 발명의 작업 모델에서, 이 이온 전류 상태는 148개 아미노산 링커의 전위에 상응한다. 이의 진폭은 S2-35 링커 진폭(약 9㎀)보다 약 3㎀ 높고, 이것은 비교 가능한 S2-35 상태 ⅴ보다 약 2.5 배 긴 중앙 기간을 갖는다. ClpX 및 ATP가 존재할 때, 상승 상태 ⅲ을 포함하는 전위 사건이 단백질 S2-35(7.3시간 실험)에 62배 관찰되고 단백질 S2-148(4.3시간 실험)에 66배 관찰되었다. ClpX/ATP의 부재 하에, 이 상승 상태는 S2-35(1.7시간 실험)에도 관찰되지 않고, S2-148(1.2시간 실험)에도 관찰되지 않았다.

도 3A는 상태 ⅳ(추정상 Smt3 전위 상태)를 나타낸다. 이 사건은 ClpX 독립적 상승 상태 ⅲ을 증명하는 것만을 포함하였다. S1 n=45, S2-35 n=60, S2-148 n=65. 도 3B는 S2-35 및 S2-148 단백질에 대한 링커 구역 상태 ⅴ 지체 시간의 비교를 나타낸다. 이 히스토그램에 포함된 사건은 상승 상태 ⅲ을 입증한다. S2-35 n=50, S2-148 n=50. 도 3C는 S2-148 전위 사건에 대한 상태 ⅴ 전위 지체 시간을 나타낸다. 검정색 막대는 상승 상태 ⅲ(ClpX 추진)을 포함하는 사건에 대한 지체 시간을 나타낸다. 회색 막대는 상승 상태를 포함하지 않는(ClpX 추진이 아님) 사건을 나타낸다. n=50 상승으로, n=45 상승되지 않음.

예상된 바대로, 이 단백질이 ClpX/ATP의 존재 하에 표준 조건 하에 나노기공에서 포획될 때, S2-35 사건과 유사한 8개의 재현 가능한 상태가 관찰되었다(도 2d, 도 3A, 도 5, 도 6 및 도 7).

그러나, 중요한 것은, S2-35 및 S2-148 사건은 상태 ⅴ에서 유의적으로 다르다는 것이다(도 2c 및 2d 비교). 즉, S2-148 상태 ⅴ는 S2-35보다 더 높은 평균 잔류 전류(각각 약 9㎀ 대 약 6㎀) 및 S2-35 상태 ⅴ보다 약 2.5배 긴 중앙 기간(도 3B)를 갖는다. 추가의 아미노산을 진행시키기에 더 긴 ClpX를 취해야 하므로 S2-35에 대한 S2-148 상태 ⅴ에 대한 기간 증가가 예상되고, 증가된 전류 수준은 2개의 단백질 사이의 링커 아미노산 조성(S2-35 링커: 51% Gly, 34% Ser, 15% 기타; S2-148 링커: 34% Gly, 32% Ser, 19% Ala, 15% 기타) 차이로 인할 것이다. 그러나, 본 발명자들은 링커 길이로 인해 반드시 달라야 하는 나노기공 오리피스에 대한 단백질의 Smt3 도메인의 상대 근접성을 배제할 수 없었다.

본 발명자들은 모든 3개의 모델 단백질의 전압 구동 전위가 ClpX/ATP 부재 시 관찰된다는 것에 주의하였다(도 4). 그러나, 이 ClpX 마이너스 전위 사건은 도 2에 도시된 진단학적 상승 상태가 결여되고, ClpX 매개 전위 사건(도 3C, 도 8 및 도 9)보다 기간에서 유의적으로 더 길고 더 가변적이었다. 이는 포획된 단백질 분자의 무작위 구조 변동 및 가변적인 전하 밀도로 중합체에 작용하는 간헐적 전기력에 의존하는 비조절 전위 과정과 일치한다. 이는 비교적 일정한 ATP 가수분해 속도 및 ClpX 모터에 의해 부여되는 기계력과 일치한다.

서열 목록:

서열 번호 1:

GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDDAANDENYALAA

서열 번호 2:

GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG

서열 번호 3:

GGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGS GASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGS

서열 번호 4( S1 ): MGSSHHHHHHGSG ← 친화도 정제 태그 구역

LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG ← Smt3 도메인

GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDD ← 하전 꼬리

AANDENYALAA ← ssrA 태그

서열 번호 5( S2 -35):

MGHHHHHHGS ← 친화도 정제 태그 구역

LQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG ← Smt3 도메인

MGSSHHHHHHGSG ← 친화도 정제 태그 구역

LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG ← Smt3 도메인

GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDD ← 하전 꼬리

AANDENYALAA ← ssrA 태그

서열 번호 6( S2 -148):

MGHHHHHHGS ← 친화도 정제 태그 구역

LQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG ← Smt3 도메인

GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGGGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGSGASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGSSGGSG ← 링커 구역

MGSSHHHHHHGSG ← 친화도 정제 태그 구역

LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG ← Smt3 도메인

GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDD ← 하전 꼬리

AANDENYALAA ← ssrA 태그

서열 번호 7( S1 - RQA ):

MGSSHHHHHHGSG ← 친화도 정제 태그 구역

LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG ← Smt3 도메인

GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDD ← 하전 꼬리

AANDENYALAA ← ssrA 태그

RQA ← ssrA 태그를 모호하게 하도록 첨가된 추가의 잔기

결론

상기 상세한 설명은 본 발명을 예시하고 기재하도록 의도되고, 특허청구범위의 문자상 및 등가 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 볼 수 없다. 본 명세서에 언급된 임의의 특허 또는 공보는 명확히 기재될 수 없지만 당해 분야의 당업자가 이해하는 본 발명의 특정한 양태를 실행하는 데 유용한 방법 및 재료의 설명을 수행하도록 의도된다. 이러한 특허 또는 공보는, 방법 또는 재료를 기술하고 이들이 언급되게 하는 목적으로 필요한 것처럼, 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 포함되고 본 명세서에 삽입된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 의해 참조문헌으로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> Nanopore Sensor for Enzyme-Mediated Protein Translocation <130> WO2013/123379 <140> PCT/US2013/026414 <141> 2013-02-15 <150> US 61/713,163 <151> 2012-10-12 <150> US 61/599,754 <151> 2012-02-16 <160> 8 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser 35 40 45 Asp Gly Asp Ser Asp Gly Ser Asp Gly Asp Gly Asp Ser Asp Gly Asp 50 55 60 Asp Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Ala 65 70 75 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gln 1 5 10 15 Asn Glu Tyr Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Ser Gly 35 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Gly Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ser Gly Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser 20 25 30 Arg Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Ala Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Glu 50 55 60 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Ala Gly Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser 65 70 75 80 Ala Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ser Asp Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser 85 90 95 Ala Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser 100 105 110 Ala Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser 115 120 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys 20 25 30 Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys 35 40 45 Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr 50 55 60 Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu 65 70 75 80 Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp 85 90 95 Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala 100 105 110 His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly 145 150 155 160 Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Ser Asp Gly Ser Asp Gly 165 170 175 Asp Gly Asp Ser Asp Gly Asp Asp Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala 180 185 190 Leu Ala Ala 195 <210> 5 <211> 338 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr 20 25 30 His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys 35 40 45 Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys 50 55 60 Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn 85 90 95 Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gln Asn Glu Tyr Arg 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Met 130 135 140 Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Gly Leu Val Pro Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro 165 170 175 Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val 180 185 190 Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro 195 200 205 Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met 210 215 220 Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln 225 230 235 240 Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His 245 250 255 Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser 290 295 300 Ser Gly Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Ser Asp Gly Ser Asp Gly Asp 305 310 315 320 Gly Asp Ser Asp Gly Asp Asp Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala Leu 325 330 335 Ala Ala <210> 6 <211> 451 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 6 Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr 20 25 30 His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys 35 40 45 Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys 50 55 60 Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn 85 90 95 Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gln Asn Glu Tyr Arg 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser 130 135 140 Ser Gly Ser Glu Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Gly Ser Arg Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser 165 170 175 Ala Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Glu Ala 180 185 190 Ala Lys Glu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Lys Ala Gly Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ser Asp Gly Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ala 225 230 235 240 Ser Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Gly Leu Val Pro 260 265 270 Arg Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys 275 280 285 Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys 290 295 300 Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr 305 310 315 320 Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu 325 330 335 Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp 340 345 350 Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala 355 360 365 His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly 405 410 415 Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Ser Asp Gly Ser Asp Gly 420 425 430 Asp Gly Asp Ser Asp Gly Asp Asp Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala 435 440 445 Leu Ala Ala 450 <210> 7 <211> 198 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys 20 25 30 Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys 35 40 45 Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr 50 55 60 Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu 65 70 75 80 Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp 85 90 95 Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala 100 105 110 His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly 145 150 155 160 Ser Ser Gly Asp Gly Gly Ser Asp Gly Asp Ser Asp Gly Ser Asp Gly 165 170 175 Asp Gly Asp Ser Asp Gly Asp Asp Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala 180 185 190 Leu Ala Ala Arg Gln Ala 195 <210> 8 <211> 1145 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser His Met Ser Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro His Glu Ile Arg Asn His Leu Asp Asp Tyr Val Ile 20 25 30 Gly Gln Glu Gln Ala Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Val Tyr Asn His 35 40 45 Tyr Lys Arg Leu Arg Asn Gly Asp Thr Ser Asn Gly Val Glu Leu Gly 50 55 60 Lys Ser Asn Ile Leu Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu 65 70 75 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Tyr Gln Ala Leu Phe Asn Leu Glu Gly Val Asp Leu Glu Phe Arg 290 295 300 Asp Glu Ala Leu Asp Ala Ile Ala Lys Lys Ala Met Ala Arg Lys Thr 305 310 315 320 Gly Ala Arg Gly Leu Arg Ser Ile Val Glu Ala Ala Leu Leu Asp Thr 325 330 335 Met Tyr Asp Leu Pro Ser Met Glu Asp Val Glu Lys Val Val Ile Asp 340 345 350 Glu Ser Val Ile Asp Gly Gln Ser Lys Pro Leu Leu Ile Tyr Gly Lys 355 360 365 Pro Glu Ala Gln Gln Ala Ser Gly Glu Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser 370 375 380 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ala Thr Met Ser Ala 385 390 395 400 Leu Pro Thr Pro His Glu Ile Arg Asn His Leu Asp Asp Tyr Val Ile 405 410 415 Gly Gln Glu Gln Ala Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Val Tyr Asn His 420 425 430 Tyr Lys Arg Leu Arg Asn Gly Asp Thr Ser Asn Gly Val Glu Leu Gly 435 440 445 Lys Ser Asn Ile Leu Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu 450 455 460 Leu Ala Glu Thr Leu Ala Arg Leu Leu Asp Val Pro Phe Thr Met Ala 465 470 475 480 Asp Ala Thr Thr Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Val Gly Glu Asp Val Glu 485 490 495 Asn Ile Ile Gln Lys Leu Leu Gln Lys Cys Asp Tyr Asp Val Gln Lys 500 505 510 Ala Gln Arg Gly Ile Val Tyr Ile Asp Glu Ile Asp Lys Ile Ser Arg 515 520 525 Lys Ser Asp Asn Pro Ser Ile Thr Arg Asp Val Ser Gly Glu Gly Val 530 535 540 Gln Gln Ala Leu Leu Lys Leu Ile Glu Gly Thr Val Ala Ala Val Pro 545 550 555 560 Pro Gln Gly Gly Arg Lys His Pro Gln Gln Glu Phe Leu Gln Val Asp 565 570 575 Thr Ser Lys Ile Leu Phe Ile Cys Gly Gly Ala Phe Ala Gly Leu Asp 580 585 590 Lys Val Ile Ser His Arg Val Glu Thr Gly Ser Gly Ile Gly Phe Gly 595 600 605 Ala Thr Val Lys Ala Lys Ser Asp Lys Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu 610 615 620 Ala Gln Val Glu Pro Glu Asp Leu Ile Lys Phe Gly Leu Ile Pro Glu 625 630 635 640 Phe Ile Gly Arg Leu Pro Val Val Ala Thr Leu Asn Glu Leu Ser Glu 645 650 655 Glu Ala Leu Ile Gln Ile Leu Lys Glu Pro Lys Asn Ala Leu Thr Lys 660 665 670 Gln Tyr Gln Ala Leu Phe Asn Leu Glu Gly Val Asp Leu Glu Phe Arg 675 680 685 Asp Glu Ala Leu Asp Ala Ile Ala Lys Lys Ala Met Ala Arg Lys Thr 690 695 700 Gly Ala Arg Gly Leu Arg Ser Ile Val Glu Ala Ala Leu Leu Asp Thr 705 710 715 720 Met Tyr Asp Leu Pro Ser Met Glu Asp Val Glu Lys Val Val Ile Asp 725 730 735 Glu Ser Val Ile Asp Gly Gln Ser Lys Pro Leu Leu Ile Tyr Gly Lys 740 745 750 Pro Glu Ala Gln Gln Ala Ser Gly Glu Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser 755 760 765 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Ser Gly Ala Thr Met Ser Ala 770 775 780 Leu Pro Thr Pro His Glu Ile Arg Asn His Leu Asp Asp Tyr Val Ile 785 790 795 800 Gly Gln Glu Gln Ala Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Val Tyr Asn His 805 810 815 Tyr Lys Arg Leu Arg Asn Gly Asp Thr Ser Asn Gly Val Glu Leu Gly 820 825 830 Lys Ser Asn Ile Leu Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu 835 840 845 Leu Ala Glu Thr Leu Ala Arg Leu Leu Asp Val Pro Phe Thr Met Ala 850 855 860 Asp Ala Thr Thr Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Val Gly Glu Asp Val Glu 865 870 875 880 Asn Ile Ile Gln Lys Leu Leu Gln Lys Cys Asp Tyr Asp Val Gln Lys 885 890 895 Ala Gln Arg Gly Ile Val Tyr Ile Asp Glu Ile Asp Lys Ile Ser Arg 900 905 910 Lys Ser Asp Asn Pro Ser Ile Thr Arg Asp Val Ser Gly Glu Gly Val 915 920 925 Gln Gln Ala Leu Leu Lys Leu Ile Glu Gly Thr Val Ala Ala Val Pro 930 935 940 Pro Gln Gly Gly Arg Lys His Pro Gln Gln Glu Phe Leu Gln Val Asp 945 950 955 960 Thr Ser Lys Ile Leu Phe Ile Cys Gly Gly Ala Phe Ala Gly Leu Asp 965 970 975 Lys Val Ile Ser His Arg Val Glu Thr Gly Ser Gly Ile Gly Phe Gly 980 985 990 Ala Thr Val Lys Ala Lys Ser Asp Lys Ala Ser Glu Gly Glu Leu Leu 995 1000 1005 Ala Gln Val Glu Pro Glu Asp Leu Ile Lys Phe Gly Leu Ile Pro 1010 1015 1020 Glu Phe Ile Gly Arg Leu Pro Val Val Ala Thr Leu Asn Glu Leu 1025 1030 1035 Ser Glu Glu Ala Leu Ile Gln Ile Leu Lys Glu Pro Lys Asn Ala 1040 1045 1050 Leu Thr Lys Gln Tyr Gln Ala Leu Phe Asn Leu Glu Gly Val Asp 1055 1060 1065 Leu Glu Phe Arg Asp Glu Ala Leu Asp Ala Ile Ala Lys Lys Ala 1070 1075 1080 Met Ala Arg Lys Thr Gly Ala Arg Gly Leu Arg Ser Ile Val Glu 1085 1090 1095 Ala Ala Leu Leu Asp Thr Met Tyr Asp Leu Pro Ser Met Glu Asp 1100 1105 1110 Val Glu Lys Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Asp Gly Gln Ser 1115 1120 1125 Lys Pro Leu Leu Ile Tyr Gly Lys Pro Glu Ala Gln Gln Ala Ser 1130 1135 1140 Gly Glu 1145

Claims (30)

1. 나노기공(nanopore)을 통해 단백질을 전위시키기 위한 디바이스로서,
   (a) 내부에 나노기공을 갖고 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막으로서, 상기 단백질은 상기 시스 측에 첨가되고 상기 나노기공을 통해 상기 트랜스 측으로 전위되는 것인, 상기 막; 및
   (b) 상기 챔버의 적어도 하나의 측에서, 상기 단백질에 결합하고 상기 단백질을 순차적인 순서로 상기 나노기공을 통해 전위시키는 단백질 전위효소(protein translocase)를 포함하는 디바이스.
2. 제1항에 있어서, 상기 막의 상기 시스 측과 상기 트랜스 측 사이에 전압을 제공하고, 전위 기간 동안 상기 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류에 기초한 신호를 측정하기 위한 회로를 추가로 포함하되, 상기 회로는 상기 단백질이 전위되면서 상기 단백질의 특성을 반영하는 신호 변화를 검출하는 것인 디바이스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노기공은 기공 단백질에 의해 획정되는 것인 디바이스.
4. 제3항에 있어서, 상기 기공 단백질은 α-헤몰리신인 것인 디바이스.
5. 제3항에 있어서, 상기 기공 단백질은 상기 단백질에 특이적으로 결합하지 않는 것인 디바이스.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 전위효소는 NTP-추진 언폴다제(NTP driven unfoldase)인 것인 디바이스.
7. 제6항에 있어서, 상기 NTP-추진 언폴다제는 AAA+ 효소인 것인 디바이스.
8. 제7항에 있어서, 상기 AAA+ 효소는 ClpX인 것인 디바이스.
9. 제2항에 있어서, 상기 회로는 상기 트랜스 측에 양의 전압을 인가하는 증폭기를 포함하는 것인 디바이스.
10. 제9항에 있어서, 상기 나노기공을 통한 이온 전류 변화를 기록하기 위한 패치 클램프 증폭기(patch clamp amplifier)에 부착된 컴퓨터를 포함하는 디바이스.
11. 제10항에 있어서, 상기 컴퓨터는 전위시키고자 하는 단백질의 구조 특징에 대한 이온 전류 변화를 비교하는 명령으로 프로그래밍된 것인 디바이스.
12. 제2항에 있어서, 상기 회로는 100m㎐에서 발생하는 이온 전류 변화를 감지하는 센서를 포함하는 것인 디바이스.
13. 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 시스템으로서,
    (a) 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에서의 나노기공으로서, 전위시키고자 하는 단백질은 상기 시스 측에 첨가되고 상기 나노기공을 통해 상기 트랜스 측으로 전위된 것인, 상기 나노기공;
    (b) 상기 시스 측에 (ⅰ) NTP를 포함하는 이온 완충제 및 (ⅱ) 전위시키고자 하는 비변성 단백질을 포함하는, 상기 유체 챔버;
    (c) 상기 시스 측과 상기 트랜스 측 사이에 전압을 제공하고 상기 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류를 측정하기 위한 회로; 및
    (d) 상기 시스 측에서 상기 나노기공과 접촉할 수 있도록 배열된 챔버에서의 단백질 전위효소를 포함하는 시스템.
14. 제13항에 있어서, 상기 나노기공은 다합체 기공 단백질에 의해 획정되고, 상기 단백질 전위효소는 NTP-추진 언폴다제인 것인 시스템.
15. 제13항에 있어서, 상기 전위시키고자 하는 단백질은 상기 단백질 전위효소에 대한 표적 도메인을 포함하는 외인성 서열을 포함하는 것인 시스템.
16. 제15항에 있어서, 상기 표적 도메인은 적어도 5개의 음으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 시스템.
17. 제13항에 있어서, 상기 단백질 전위효소는 ClpX이고, 상기 나노기공은 α-헤몰리신에 의해 획정된 것인 시스템.
18. 나노기공을 통해 단백질을 전위시키는 방법으로서,
    (a) 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에 나노기공을 포함하는 디바이스를 제공하는 단계;
    (b) NTP 및 NTP-추진 전위효소를 포함하는 완충제를 상기 유체 챔버에 첨가하는 단계;
    (c) 전위시키고자 하는 단백질을 상기 시스 측에 첨가하는 단계; 및
    (d) 상기 전위시키고자 하는 단백질을 NTP-추진 전위효소와 접촉하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
19. 나노기공을 통해 단백질을 전위시키는 방법으로서,
    (a) (ⅰ) 유체 챔버를 시스 측 및 트랜스 측으로 분리시키는 막에서의 나노기공으로서, 전위시키고자 하는 단백질은 상기 시스 측에 첨가되고 상기 나노기공을 통해 상기 트랜스 측으로 전위된 것인, 상기 나노기공; 및
    (ⅱ) 상기 시스 측과 상기 트랜스 측 사이에 전압을 제공하고 상기 나노기공을 통해 흐르는 이온 전류를 측정하기 위한 회로
    를 포함하는, 나노기공을 통해 단백질을 전위시키기 위한 디바이스를 제공하는 단계;
    (b) NTP 및 NTP-추진 전위효소를 포함하는 완충제를 상기 유체 챔버에 첨가하는 단계;
    (c) 상기 시스 측에 전위시키고자 하는 단백질을 첨가하는 단계;
    (d) 상기 단백질이 상기 NTP-추진 전위효소와 접촉하도록 하는 단계; 및
    (e) 상기 나노기공을 통한 상기 단백질의 전위에 의해 발생한 이온 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 전류 변화를 측정하는 단계는 (ⅰ) 개방 채널 상태, (ⅱ) 상기 나노기공에 의한 상기 단백질의 포획 상태 및 (ⅲ) 상기 나노기공을 통한 (ⅱ)로부터의 단백질의 통과 상태에 대한 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 측정 단계는 (ⅰ) 상태, (ⅱ) 상태 및 (ⅲ) 상태 사이의 차이를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 측정 단계는 상기 나노기공을 통과하는 단백질의 아미노산 구조에 의해 발생한 (ⅲ) 상태 동안의 차이를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, (ⅱ) 상태와 (ⅲ) 상태 사이의 상태로서 발생하는, 상기 단백질에 대한 NTP-추진 전위효소의 결합 및 상기 나노기공 쪽으로 상기 단백질의 전위의 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
24. 제19항에 있어서, 상기 나노기공은 기공 단백질에 의해 획정된 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 기공 단백질은 α-헤몰리신인 것인 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 NTP-추진 전위효소는 상기 기공 단백질에 부착된 것인 방법.
27. 제19항에 있어서, 상기 NTP-추진 전위효소는 AAA+ 효소인 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 AAA+ 효소는 ClpX인 것인 방법.
29. 제19항에 있어서, 상기 회로는 상기 시스 챔버와 상기 트랜스 챔버 사이에 정전압을 인가하는 패치 클램프 증폭기를 포함하는 것인 방법.
30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 단백질은 비변성된 상태에서 첨가되는 것인 방법.

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