CN104619854B - 用于酶介导的蛋白质移位的纳米孔传感器 - Google Patents

用于酶介导的蛋白质移位的纳米孔传感器 Download PDF

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Abstract

本文中描述了用于将蛋白质移位通过纳米孔并监测由蛋白质中的不同氨基酸引起的电子变化的装置和方法。该装置包含膜中的纳米孔，用于在膜的顺侧和反侧之间提供电压的放大器，和处理要移位的蛋白质的NTP驱动的解折叠酶。例示的解折叠酶是来自大肠杆菌的ClpX解折叠酶。

Description

用于酶介导的蛋白质移位的纳米孔传感器
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月16日由Jeffrey Nivala提交的题目为“Unfolding andTranslocation of Proteins Through a Nanopore Sensor and Methods of Use”的美国临时专利申请No.61/599,754，及2012年10月12日由Jeffrey Nivala等提交的题目为“Nanopore Sensor for Enzyme-Mediated Protein Translocation”的美国临时专利申请No.61/713,163的优先权，两者在此通过提及完整并入。
政府支持的声明
本发明在国立健康研究所授予的合同R01HG006321和国立人基因组研究研究所授予的合同24033-444071下在政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
提及序列表、计算机程序或光盘
根据“EFS-Web法律框架(Legal Framework for EFS-Web)”(11年4月06 日)，申请人随本文一起以ASCII文本文件提交序列表。文本文件会充当根据 37CFR 1.821(c)需要的纸质拷贝和根据37CFR 1.821(e)需要的计算机可读形式(CRF)两者。创建文件的日期是2/13/2013，并且以字节计的ASCII文本文件大小是24,576。申请人通过提及完整并入序列表的内容。
发明领域
本发明涉及单分子蛋白质分析领域并且还涉及纳米孔分析领域。
发明背景
下文呈现了关于本发明的某些方面的背景信息，因为它们可以涉及发明详述中提及但不一定详细描述的技术特征。也就是说，本发明中使用的各个组合物或方法可以在下文讨论的出版物和专利中更为详细地描述，该出版物和专利可以为本领域技术人员提供进一步指导以进行或使用如要求保护的本发明的某些方面。下文的讨论不应解释为承认描述的专利或出版物的关联性或现有技术作用。
纳米孔(nanopore)已经用于各种生物感测应用，最普遍的应用是DNA分析(例如测序)。类似地，还设想了蛋白质的纳米孔测序。然而，与核酸不同，蛋白质一般不是均一带电荷的(使得难以通过应用的电压驱动移位)，并且它们还折叠成复杂的，较大的，且稳定的结构，该结构不能横穿纳米孔径。更具体地，蛋白质测序比DNA测序在技术上更具挑战性的原因包括：i)与DNA 测序的4种核苷酸相比蛋白质中存在20种不同的天然氨基酸(不包括翻译后和表遗传(epigenetic)修饰)；ii)必须将三级和二级结构两者解折叠以容许变性的蛋白质以单一行列次序通过纳米孔感应器；以及iii)尽管沿着多肽主链的电荷不一致，但是必须实现变性多肽行进单向移位到纳米孔电场。
纳米孔用于对生物聚合物测序的用途在超过10年前提出(Pennisi,E. Searchfor pore-fection.Science 336,534-537(2012),Church,G.M.,Deamer, D.W.,Branton,D.,Baldarelli,R.&Kasianowicz,J.Characterization of individual polymermolecules based on monomer-interface interaction)。
基于酶的DNA移位控制(Cherf,G.M.,Lieberman,K.R.,Rashid,Hytham, R.,Lam,C.E.,Karplus,K.&Akeson,M.Automated“Forward and reverse ratcheting of DNA in ananopore atprecision,”Nat.Biotechnol.30,344-348 (2012).)及使用改良生物孔的DNA核苷酸解析(Manrao,et al.“DNA at single-nucleotide resolution with amutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase,”Nat.Biotechnol.30,349-353(2012))的最近进展已经为2012年晚期预期用于商业推广的纳米孔DNA测序仪打好基础(Hallam,K.“Oxford nanopore to sell tiny DNA sequencer,”Bloomberg,publishedonline 17 February 2012,Hayden,E.Nanopore genome sequencer makes itsdebut.Nature, published online 17February 2012)。
虽然蛋白质运动通过纳米孔已经得到建立(Mohammadet al..,” Controlling asingle protein in a nanopore through electrostatic traps,”J.Am. Chem.Soc.130,4081-4088(2008),Talaga,D.S.&Li,J.“Single-molecule protein unfolding in solidstate nanopores,”J.Am.Chem.Soc.131,9287-9297 (2009),Merstorf,et al.“Wildtype,mutant protein unfolding and phase transition detected by single-nanopore recording,”ACS Chem.Biol.7,652-658(2012))，直到现在尚未证明用于解折叠蛋白质以实现受控的，序贯移位的技术。
发明概述
以下简要概述并不意图包括本发明的所有特征和方面，它也不暗示本发明必须包括此概述中讨论的所有特征和方面。
本发明提供了用于将蛋白质移位通过纳米孔的装置，其包含：其中具有纳米孔的膜，所述膜将室分成顺侧(cis side)和反侧(trans side)，其中要将所述蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；和在所述室的至少一侧的蛋白质移位酶，其结合所述蛋白质并将所述蛋白质移位通过所述纳米孔。移位会以序贯次序发生，也就是说，以通到纳米孔中的氨基酸残基的限定顺序，这一般会遵循蛋白质的一级氨基酸序列。可以移位多种蛋白质，一次一种。
本发明还提供了用于将蛋白质移位通过纳米孔的装置，其包含：膜中的纳米孔，所述膜将流体室分成顺侧和反侧，其中将要移位的蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；电路，用于提供所述顺侧和所述反侧之间的电压梯度及测量流过所述纳米孔的离子电流(ionic current)电路；和特定的酶，诸如蛋白质移位酶和/或NTP驱动的解折叠酶，其对流体室添加，例如通过容许被附着于顺侧的所述纳米孔，或者通过在溶液中添加至反侧进行。
在本发明的一个实施方案中，纳米孔以孔蛋白限定。在一个优选的实施方案中，孔蛋白是α-溶血素。
在本发明的另一个实施方案中，蛋白质移位酶是NTP驱动的解折叠酶，其对要移位的蛋白质分子起作用。在一个优选的实施方案中，NTP驱动的解折叠酶是AAA+酶。在另一个优选的实施方案中，AAA+酶是大肠杆菌ClpX 的亚基的组合。
在本发明的另一个实施方案中，用于检测蛋白质移位的电路包括对反侧应用正电压的膜片钳放大器。膜片钳放大器维持恒定电压并测量电流变化。在一个优选的实施方案中，装置包含与膜片钳放大器附接的计算机，其用于快速记录通过所述纳米孔的离子电流的变化。随着蛋白质通过纳米孔，获得离子电流标记，其可以检测每秒近似1至100,000次波动，提供关于移位通过孔的个别氨基酸的信息。例如，在100kHz记录可以用于产生每10μS一个数据点。可以将数据与移位的蛋白质的结构特征相关联。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于将蛋白质移位通过纳米孔的系统，其包含将流体室分成顺侧和反侧的膜中的纳米孔，其中将要移位的蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；所述流体室，其在所述顺侧包含含有酶辅因子诸如NTP(核苷5'-三磷酸，例如ATP和/或 GTP)的离子缓冲液和要移位的非变性蛋白质；电路，用于提供所述顺侧和所述反侧之间的电压及测量流过所述纳米孔的离子电流；和在顺侧在室中的溶液中的蛋白质移位酶，诸如NTP驱动的解折叠酶。
在本发明的一个备选实施方案中，纳米孔以孔蛋白诸如多聚体孔蛋白限定，并且将蛋白质移位酶诸如NTP驱动的解折叠酶附着于多聚体孔蛋白。蛋白质移位酶可以共价或非共价附着于孔蛋白，并且可以在膜和孔蛋白的顺侧，反侧或两侧。
在本发明的另一个实施方案中，要移位的蛋白质是非变性蛋白质(即，为其天然状态)，并且进一步包含外源序列，该外源序列包含蛋白质的靶向域，该蛋白质被靶向通过纳米孔，并接触NTP驱动的解折叠酶。在一个优选的实施方案中，NTP驱动的解折叠酶是ClpX，并且纳米孔蛋白是α-溶血素。外源序列中的靶向域用来将蛋白质引导至纳米孔。靶向域可以构造为受到纳米孔间的电压影响。在一个优选的实施方案中，靶向域包含约5个带负电荷的氨基酸或至少约5-30个带负电荷的氨基酸，并且由于顺侧和反侧之间应用的电压梯度而被吸引到室的阳侧。
本发明还提供了用于将非变性蛋白质移位通过纳米孔的方法，其包括下列步骤：提供用于将蛋白质移位通过纳米孔的装置，所述装置包含膜中的纳米孔，所述膜将流体室分成顺侧和反侧，其中将要移位的蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；电路，用于提供所述顺侧和所述反侧之间的电压及测量流过所述纳米孔的离子电流电路；和反侧的在溶液中的蛋白质移位酶；对所述流体室添加含有NTP的缓冲液(其中移位酶是NTP 驱动的)；任选地，将非变性的蛋白质添加至顺侧；容许非变性蛋白质被捕捉或者穿过纳米孔(例如根据电荷)，使得它可以接触蛋白质移位酶；并测量由非变性蛋白质移位通过纳米孔引起的离子电流变化。
在本发明的一个实施方案中，测量电流变化的步骤包括对(i)纳米孔中的开放通道，(ii)所述纳米孔对非变性蛋白质的捕获，和(iii)来自(ii)的蛋白质通过所述纳米孔的状态测量电流变化。在一个优选的实施方案中，所述测量包括检测状态(i)，(ii)和(iii)之间的差异。在另一个优选的实施方案中，所述测量包括测量由通过所述纳米孔的所述蛋白质的氨基酸结构引起的状态 (iii)期间的差异。所述方法可以进一步包括如下步骤：测量所述NTP驱动的解折叠酶结合所述非变性蛋白质并所述解折叠酶向所述纳米孔移位的状态，其作为状态(ii)和(iii)之间的状态发生。这会导致测量4种状态。如例如图2中描述并显示的，可以有在移位完成并且纳米孔返回到初始状态时测量的最终状态(v)。
在另一个优选的实施方案中，纳米孔以孔蛋白限定。在另一个优选的实施方案中，孔蛋白是α-溶血素。在另一个优选的实施方案中，将NTP驱动的解折叠酶附着于孔蛋白。在另一个优选的实施方案中，NTP驱动的解折叠酶是AAA+酶。在另一个优选的实施方案中，AAA+酶是ClpX。在另一个实施方案中，电路包含在顺式室和反式室之间应用恒定电压的膜片钳放大器。
在本发明的某些方面，纳米孔以α-溶血素或另一种多聚体孔蛋白限定。孔蛋白不需要被功能化；也就是说，它可以在其天然环境中用作蛋白质出口；它不需要具有对其添加以附着或结合移位的蛋白质的任何分子结构。也就是说，它对于任何蛋白质序列的移位可以是通用的，并且不特异性结合或识别要移位的蛋白质。优选地，要移位的蛋白质也处于天然形式。在本发明的某些实施方案中，它可以具有对其附着的分子结构以改善蛋白质“穿过”纳米孔。在本发明的某些方面，要移位的蛋白质包含外源序列，该外源序列包含蛋白质移位酶的靶向域。靶向域可以包含至少约5-30个氨基酸，或10-30个氨基酸。氨基酸可以是位于要移位的蛋白质的氨基或羧基端的带负电荷的氨基酸，例如30-100个谷氨酰胺或天冬酰胺残基，或其他带负电荷的合成单体，例如硫酸右旋糖苷(dextran sulfate)。氨基酸也可以是带正电荷的，例如精氨酸或赖氨酸，若电压极性从下文例示的电压极性反转。
在本发明的某些方面，要移位的蛋白质以其天然状态移位，也就是说，不被变性或以其他方式解折叠；移位酶用于解折叠蛋白质，在其横穿纳米孔间的电压梯度时。
附图简述
图1A是具有脂质双层中包埋的单一AHL(α-溶血素)孔的纳米孔感应器的简图(草图)。
图1B是显示纳米孔中捕获的蛋白质的简图。
图1C是显示用于移位的本实施例中使用的工程化蛋白质的简图。
图2A，2B是显示ClpX介导的蛋白质移位期间离子电流迹线的图形表示和图。
图2C是迹线，其显示蛋白质S2-35移位期间离子电流迹线。
图2D是迹线，其显示蛋白质S2-148移位期间离子电流迹线。
图3A，3B和3C是一系列柱形图，其显示了三种模型蛋白质的离子电流状态停留时间(停留时间)的比较。
图4A-D是图形表示和电流迹线，其显示在反式溶液(trans solution)中在不存在ClpX的情况下在电压介导的蛋白质移位期间的离子电流迹线。在高度可变的捕捉持续时间(<5sec–>2min)后，测试的所有物质最终会由于应用的电压而解折叠并移位。没有观察到陡变(ramping)状态，详细的信号特征从 S2-35和S2-148接头状态丧失，并且所有状态与ClpX介导的事件相比都具有更广泛分布的持续时间。图4A显示了电压介导的S1移位期间的离子电流迹线。与图2A相比，状态iii是缺乏的，并且状态iv具有更长且更可变的平均持续时间。图4B显示电压介导的蛋白质移位的模型。图4B显示了4种草图结构。 i.到iv.草图i-iv对应于图4A中的离子电流状态i-iv。图4C显示了电压介导的 S2-35移位期间的离子电流迹线。状态iii和vi的陡变是缺乏的，并且状态v的分辨率(图2C)是减少的。图4D显示了电压介导的S2-148期间的离子电流迹线与S2-35展现出相似的性能，其中省略相应的状态(图2D)。
图5是频率柱形图，其证明了三种模型蛋白质的ClpX依赖性(其中ClpX 存在于反侧)陡变状态iii的离子电流状态停留时间的比较。S1n＝45,S2-35 n＝62,S2-148n＝66。
图6是频率柱形图，其显示了包括ClpX依赖性陡变状态iii和vi的事件中 S2-35(n＝42)和S2-148(n＝41)蛋白的推定第二Smt3域移位状态vii的离子电流状态停留时间的比较。
图7是频率柱形图，其显示了了蛋白S2-35(n＝44)和S2-148(n＝44)的ClpX- 依赖性陡变状态vi的离子电流停留时间的比较。
图8是频率柱形图，其显示了三种模型蛋白的推定Smt3域移位状态iv和 vii的离子电流停留时间的比较。黑色柱形代表包括陡变状态iii(ClpX驱动) 的事件的停留时间。灰色柱形代表不包括陡变状态(非ClpX驱动)的事件。在陡变的情况中n＝254，在无陡变的情况中n＝183。
图9是频率柱形图，其显示了S2-35移位事件的状态v停留时间。黑色柱形代表包括陡变状态iii(ClpX驱动)的事件的停留时间。灰色柱形代表不包括陡变状态(非ClpX驱动)的事件。在陡变的情况中n＝50，不无陡变的情况中 n＝45。
图10是图形表示，其显示了脂膜内包埋的ClpP/α-HL融合蛋白。
发明详述
概述
本文中描述了用于将单独的蛋白质移位通过纳米孔，从而使得能够通过反映蛋白质通过纳米孔的电子信号获得关于蛋白质，例如蛋白质的氨基酸内容物的信息的系统。通过提供在膜中的纳米孔，膜的顺侧和反侧之间的电压，和蛋白质移位酶，本装置使用蛋白质移位酶以如下的方式实现天然蛋白质的酶控制的解折叠和移位通过纳米孔感应器，使得顺侧和反侧之间的电路可以监测并记录指示蛋白质的氨基酸内容物，例如氨基酸序列的信号。对于实践目的，可以提供纳米孔和电路的阵列。这些可以在单一室中或在多个室中。
现在参考图1A，本装置运转为移位底物蛋白101，并且包含在脂质双层 104中包埋的孔蛋白102(α-溶血素，或“AHL”)，该脂质双层104被包含在膜 106中约25μm孔径中，所述膜106将流体区室分成含有蛋白质101的顺侧和蛋白质101将要被移位通过孔102前往的反侧。该装置包括可控放大器108，用于在反侧的正电极110和顺侧的负电极之间应用恒定电压。蛋白质移位酶 109(下文例示为ClpX)存在于室的反侧。放大器108还提供电路，其用于检测且优选记录在蛋白质101移位时非常快速发生的离子电流(即离子诸如描绘的Cl-和K+流动)变化。在例子中，在100kHz收集数据，但是高速数据取样装置是已知的并且可以使用(例如来自Pentek,Inc的200MHz 7150型)。图1B 显示了脂质双层104中AHL孔蛋白102的详细视图，而且还显示了蛋白质移位酶109，其在反侧，并且其作用于蛋白质101，该蛋白质101在草图中被穿过，并且在孔102的两侧。如图1C中显示，在其氨基端携带Smt3域的模型底物蛋白质在其羧基端通过带电荷的柔性接头与ssrA标签偶联。将带电荷的柔性标签穿过纳米孔进入反侧溶液中，而在这点时，折叠的Smt3域阻止捕获的蛋白质的完全移位。存在于反侧溶液中的ClpX结合底物蛋白质的C端ssrA序列。通过ATP水解推动，ClpX沿着蛋白质尾部向通道移位，随后催化Smt3域的解折叠和移位通过孔。Smt3域是折叠的，而接头不是。Smt3进一步记载于US 2009/0280535,“SUMO Fusion Protein Expression System forProducing Native Proteins”。下文实施例中证明了蛋白质解折叠和移位通过α-溶血素纳米孔的酶促控制。每个底物蛋白质的区段在它们通过长约50埃的反式膜孔腔(纳米孔)时基于氨基酸组成得到区别。将使用的酶移位酶选择并控制以使装置能够提供蛋白质序列信息。酶选自本文中一般称作“蛋白质移位酶”的酶类，其是指此类酶引起相对于底物的物理运动的能力。如本文中使用的术语内包括一类经常称为“解折叠酶”的酶，因为它们催化天然蛋白质的解折叠，而不影响一级结构，即蛋白质的一级序列。
在某些实施方案中，对底物蛋白质加标签以被移位酶识别。这样做的一种方式是使用ssrA标签。各种ssrA标签是已知的，因为这是几种细菌物种中用于使蛋白质被ClpX蛋白酶系统降解的机制。在例子中，ssrA标签是C端11 残基AA序列(在SEQ ID NO:5末端显示)，其中此序列的子集被ClpA或ClpX 独特识别。如记录的，可以使用其他序列。在某些实施方案中，如图10中显示的蛋白质纳米孔蛋白或嵌合纳米孔可以包埋于薄绝缘膜(insulting membrane)(例如脂质双层或石墨烯(grapheme)层)，其分开差异电压的两种传导水溶液。通过离子电流流过纳米孔给予感测；在蛋白质移位或以其他方式与孔相互作用时，会发生离子流动的阻断，这为随后分析提供电子信号。此蛋白质纳米孔或嵌合纳米孔也可以在阵列或芯片实验室(lab-on-chip)装置中利用，用于全体靶蛋白平行分析和/或纯化。
本发明可以在用于纳米孔分析的各种装置，诸如阵列或芯片中实施。该装置可以是任一种记载于国际申请No.PCT/GB08/004127(以WO 2009/077734公布，题目为“Formation of layers of amphiphilic molecules”)， PCT/GB10/000789(以WO 2010/122293公布，题目为“Lipid bilayer sensor array”)，国际申请No.PCT/GB10/002206(以WO 00/28132公布，题目为“Biochemical analysis instrument”)或国际申请No.PCT/US99/25679(以WO 2000/28312公布，题目为“Coupling method”)的装置。如从下文描述看会显而易见的，将蛋白质作为单一多肽序列移位，其中各个氨基酸序贯通过孔。可以将许多蛋白质连续移位。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。一般地，与细胞和分子生物学和化学结合使用的名称及细胞和分子生物学和化学的技术是本领域中公知且常用的。没有明确限定的某些实验技术一般依照本领域中公知且如贯穿本说明书中引用和讨论的各个一般性及更具体的参考文献中描述的常规方法实施。为了清楚的目的，下文定义了以下术语：
范围：为了简明，列出的任何范围意图包括叙述范围内的任何子范围，除非另外叙述。作为一个非限制性的例子，120至250的范围意图包括范围 120-121,120-130,200-225,121-250，等等。术语“约”具有其常规意义近似，并且可以根据实验变化性在上下文中测定。在疑惑的情况中，“约”意味着±5％叙述的数值。
术语“纳米孔”在本文中以其常规意义使用，指内径0.5至10纳米级的任何小孔或通道。术语“纳米孔”包括生物学(例如α-溶血素)或人工纳米孔两者。目前的纳米孔可以在尺寸上有所变化，例如它可以具有大小约0.5nm和 10nm之间的直径。例如，直径可以是约0.5nm,1nm,1.25nm,1.5nm,1.75nm, 2nm,2.25nm,2.5nm,2.75nm,3nm,3.5nm,4nm,4.5nm,5nm,6nm,7nm, 8nm,9nm,10nm，或其间的任何尺寸。生物学纳米孔可以由孔蛋白创建。人工纳米孔可以通过微成型或钻孔生成。它们也可以通过在硅片中蚀刻稍大的孔(几十个纳米)，然后在离子束雕刻方法中将其逐渐填充，从而产生小得多的直径的孔生成。
术语“孔蛋白”在本文中以其常规意义使用，指孔形成蛋白(PFP)，其在靶膜附近装配成环样结构以暴露足够的疏水性，从而驱动自发双层插入。孔蛋白通常(但不仅仅)由细菌，诸如败毒梭菌(C.septicum)和金黄色葡萄球菌 (S.aureus)生成。PFP可以是alpha-孔形成毒素，诸如大肠杆菌(E.coli)的溶细胞素A；或beta-孔形成毒素，诸如α-溶血素和PV杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)；或二元毒素(binary toxin)，诸如炭疽毒素；或胆固醇依赖性溶细胞素(CDC)，诸如肺炎球菌溶血素(Pneumolysin)；或小孔形成毒素，诸如短杆菌肽A。优选的孔蛋白是α-溶血素(AHL)。
术语“α-溶血素”在本文中以其常规意义使用，指来自细菌金黄色葡萄球菌的孔形成毒素。α-溶血素通常由beta-片层(68％)组成，仅有约10％alpha- 螺旋。金黄色葡萄球菌染色体上的hla基因编码293残基蛋白质单体，其在细胞膜上形成七聚体单元以形成完整的beta-桶孔。此结构容许毒素实施其主要功能，即在细胞膜中形成孔。
术语“膜”在本文中以其常规意义使用，指薄的膜样结构。分开顺式和反式室的膜包含至少一个孔或通道。膜一般可以分成合成膜和生物膜。任何膜可以依照本发明使用。合适的膜是本领域中公知的。优选地，膜是两亲性层。两亲性层是自具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分两者的两亲性分子，诸如磷脂形成的层。两亲性层可以使单层或双层。两亲性分子可以是合成的或天然存在的。形成单层的非天然存在的两亲性分子 (amphiphile)是本领域中已知的，并且包括例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez et al.,Langmuir,2009,25,10447-10450)。
术语“脂质双层”在本文中以其常规意义使用，指由两层脂质分子制成的极性薄膜，所述两层脂质分子排布为使得亲水性磷酸酯头部“向外”指向双层任一侧的水而疏水性尾部“在内”指向双层的核心。脂质双层的宽度通常是几个纳米，并且它们对于大多数带电荷的水溶性分子是不能透过的。脂质双层是如下的结构，其大得足以具有脂质或固体的一些机械特性。面积压缩模数(area compression modulus)Ka，弯曲模数(bending modulus)Kb，和边缘能量(edge energy)可以用于描述它们。固体脂质双层也具有剪切模数(shearmodulus)，但是与任何液体一样，剪切模数是0(对于液体双层)。脂质双层也可以由具有孔的固体基片，诸如热收缩管(heat shrink tubing)，熔融硅石 (fused silica)，硼硅酸盐玻璃，云母，和氧化硅(oxidized silicon)支持。可以应用脂质，例如通过Langmuir-Blodgett技术，囊泡融合方法(vesicle fusion process)或两种的组合。
术语“NTP”在本文中以其常规意义使用，指核苷三磷酸，即含有与三个磷酸根结合的核苷，使其成为核苷酸的分子。NTP可以是腺苷三磷酸 (ATP)，鸟苷三磷酸(GTP)，胞苷三磷酸(CTP)，5-甲基尿苷三磷酸(m5UTP)，尿苷三磷酸(UTP)，脱氧腺苷三磷酸(dATP)，脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)，脱氧胞苷三磷酸(dCTP)，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)或脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。“NTP”还指其他不太丰富的NTP，诸如核苷酸代谢物的中间体，包括不太常见的天然的。
术语“NTP驱动的解折叠酶”在本文中以其常规的意义使用，指催化蛋白质解折叠的NTP依赖性酶。非常常见的NTP驱动的解折叠酶是ATP依赖性蛋白酶，诸如蛋白酶体ATP酶，AAA蛋白酶，或AAA+酶(下文定义)；膜融合蛋白，诸如NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白)/Sac18p(酵母中的N- 乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白同源物)或p97/VCP/Cdc48p(97-kDa含有缬酪肽(valosin)的蛋白质)；Pex1p和Pex6p(过氧化物酶体ATP酶)；剑蛋白(Katanin)和SKD1(小鼠中的Vps4p同源物)/Vps4p(酵母中的液泡蛋白分选 (Vacuolarprotein sorting)4同源物)；动力蛋白(Dynein)(发动机蛋白)；DNA复制蛋白，诸如ORC(起点识别复合物)，Cdc6(细胞分裂控制蛋白6)，MCM(微型染色体维持蛋白)，DnaA，或RFC(复制因子C)/夹钳装置器(clamp-loader)； RuvB(霍利迪连结体(holliday junction)ATP依赖性DNA螺旋酶RuvB， EC＝3.6.4.12)；TIP49a/TIP49和TIP49b/TIP48(真核RuvB样蛋白)。
术语“AAA+酶”在本文中以其常规意义使用，指AAA+酶超家族。AAA+ 是与多样的细胞活性有关的ATP酶的缩写。它们共享约230个氨基酸残基的共同保守模块。这是一种较大的，功能上多样的蛋白质家族，其属于AAA+环形P环NTP酶超家族，其通过能量依赖性大分子重塑或移位施加其活性。例子包括细菌中的ClpAP，ClpXP，ClpCP，HslVU和Lon及其在线粒体和叶绿体中的同源物。除了Lon外，AAA+酶(有时称为解折叠酶或蛋白酶)由调节 (ATP酶)和蛋白水解亚基组成，而Lon是一种含有调节和蛋白水解域两者的单一多肽。ClpX和ClpA与ClpP对接以形成ClpXP和ClpAP蛋白酶，而HslU与 HslV对接以形成另一种蛋白酶HslVU。ClpA和ClpX形成六聚体，与形成七聚体的ClpP形成对比。HslU和HslV各自形成六聚体，尽管也已经报告了HslU 七聚体。调节亚基ClpA、ClpX和HslU发挥蛋白伴侣功能。关于ClpX的进一步详情可以参见Maillard et al.,“ClpX(P)generates mechanical force to unfoldand translocate its protein substrates,”Cell 145:459-4669(2011年4月29日)。如那里报告的，ClpX发动机与其它AAA+酶，包括原核ClpA、ClpB、HsIu、FtsH 或Lon共享基本设计。AAA+酶又称为“AAA+分子发动机”。AAA+超家族的进一步描述参见Ogura et al.“AAA+superfamily ATPases”common structure-diverse function,”Genes to Cells,6:575-597(2001)。如那里描述的，与线粒体有关的AAA+家族成员是Bcs1p、Lon/Pim1p、ClpX和Hsp78。
术语“HsIU”在本文中以其常规意义使用，指ATP依赖性蛋白酶ATP酶亚基HsIU，又称作解折叠酶HsIU。HsIU是Hsp100和Clp ATP酶家族的成员。它也可以与HsIV形成复合物以充当解折叠酶(参见Bochtler et al.,“The structures of HsIU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV,”Nature 403(6771):800-805(2000)。
术语“Lon蛋白酶”在本文中以其常规意义使用，指存在于古细菌 (archaea)、细菌和真核生物中的蛋白酶家族。Lon蛋白酶是属于MEROPS肽酶家族S16(lon蛋白酶家族，clanSF)的ATP依赖性丝氨酸肽酶。在真核生物中，大多数Lon蛋白酶位于线粒体基质中。在酵母中，Lon蛋白酶PIM1位于线粒体基质中。它是线粒体功能需要的，它是组成性表达的，但是在热应激后升高，提示了PIM1可以在热休克应答中发挥作用。
术语“蛋白质移位酶”在本文中以其常规意义使用，意指蛋白质结合多肽，诸如能够控制蛋白质底物运动的多肽，例如作用于蛋白质底物并且将其以行进性方式相对于酶移动，即作为酶促活性功能的酶，酶复合物，或酶复合物的一部分。术语“行进性”在本领域中理解为指逐步活性，其中酶在多个步骤中“加工”底物。在目前的情况中，蛋白质移位酶一般以序贯方式加工要移位的蛋白质，也就是说，沿着一级氨基酸序列移动。为了方便，此定义中包括通常又称作“解折叠酶”的许多酶，特别是NTP驱动的解折叠酶。此定义中还明确包括AAA+酶超家族和此超家族的ClpX成员。
作为一般性术语“蛋白质移位酶”的例子还包括蛋白酶诸如Lon蛋白酶和HsIU，该酶经过修饰以消除酶的酶促切割活性或排布为使得在序列被移位通过纳米孔后发生切割。
其他例示性的蛋白质移位酶也ClpX(其也是解折叠酶)，例如ClpA，线粒体蛋白质移位酶TOM(外膜的移位酶)或其他TOM和TIM蛋白相关。选择的蛋白质移位酶也可以是线粒体蛋白质移位酶复合物的任何部分，诸如伴侣蛋白，TOM进口受体，TOM通道复合物，和“发动机”蛋白。
术语“ClpX”的“ClpX酶”在本文中以其常规意义使用，指HSP(热休克蛋白)100家族成员，其具有Uniprot名称clpX并且具有那里给出的424个氨基酸序列，其被加工成作为亚基的成熟形式。ClpX亚基联合以形成6成员(同六聚体)环，其通过结合ATP或ATP的不可水解性类似物稳定化。ClpX的N端域是涉及底物识别的C4型锌结合域(ZBD)。ZBD形成非常稳定的二聚体，其对于促进一些典型的ClpXP底物诸如lO和MuA的降解是必需的。Wawrzynow etal,“The ClpX heat-shock protein of Escherichia coli,the ATP-dependentsubstrate specificity component of the ClpP-ClpX protease,is a novelmolecular chaperone,”EMBO J.1995May 1；14(9):1867–1877中进一步描述了氨基酸序列还在eclowiki.net在“clpX：基因产物”下给出。
类似地，ClpA指UniProt/Swiss-Prot条目clpA，其具有那里对ClpA亚基给出的758个氨基酸的序列。它形成在存在ATP的情况中装配成六聚体环的6个 ClpA亚基的复合物。它是ClpAP复合物的组分，该ClpAP复合物由在存在ATP 的情况中装配成六聚体环的6个ClpA亚基和排列成两个七聚体环的14个ClpP 亚基组成。结合ClpS。
术语“非变性蛋白质”在本文中以其常规意义使用，即至少部分折叠成天然二级和三级结构的蛋白质，任何天然的半胱氨酸键，氢键键合和多聚体形式基本上完整。这与变性的蛋白质形成对比，该变性的蛋白质通常是不溶性的且聚集的。
术语“带负电荷的氨基酸”在本文中以其常规意义使用，即意味着具有富含带负电荷的氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸的表面的蛋白质。
通用方法和装置
蛋白质移位通过纳米孔感应器装置提供许多可能的应用，包括测序，结构/折叠分析，纯化/分离，胞内蛋白质投递，以及对酶驱动移位多肽的机械学的了解。与核酸不同，蛋白质一般不是一致带电荷的(使得难以通过应用的电压驱动移位)，并且折叠成复杂的，较大的，且稳定的结构，其不能横穿纳米孔的孔径。为了解决这些问题，天然折叠蛋白质的解折叠和移位通过蛋白质纳米孔可以通过以大肠杆菌ClpX(或其他类型的蛋白质移位酶/解折叠酶)例示的多种酶实现。
可以使用本方法和装置测量被移位的蛋白质的一种或多种特征。
可以进行多种不同类型的测量。这包括但不限于电学测量和光学测量。可能的电学测量包括：电流测量，阻抗测量，隧道效应测量(Ivanov AP et al., Nano Lett.2011Jan12；11(1):279-85)，和FET测量(国际申请WO 2005/124888)。光学测量可以与电学测量组合(Soni GV et al.,Rev Sci Instrum. 2010Jan；81(1):014301)。测量可以是跨膜电流测量，诸如流过孔的离子电流的测量。
电学测量可以使用标准的单通道记录设备进行，如记载于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc. 2010；132(50):17961-72及国际申请WO-2000/28312的。或者，电学测量可以使用多通道系统进行，例如如记载于国际申请WO-2009/077734和国际申请 WO-2011/067559的。
信号测量通常指示蛋白质或蛋白质中的氨基酸的身份。因此，信号可以用于表征(诸如测序)蛋白质，如上文讨论的。
1.用于移位的酶
大肠杆菌ClpX在本装置的工作例中使用；它选择用于初始工作，因为它产生足够的机械力(>20pN)来变性稳定的蛋白质折叠，并且由于其以适合于纳米孔感应器的一级序列分析(每秒多达80个氨基酸)的速率沿着蛋白质移位。ClpX是ClpXP蛋白酶体样复合物的一部分。ClpP由在一个或两个末端结合调节六聚体ATP依赖性解折叠酶/移位酶复合物(例如ClpX)的二七聚体圆筒样蛋白酶构成。ClpX起门的作用，该门容许有标签的蛋白质进入ClpP蛋白酶复合物的内腔，随后降解。采用六聚体蛋白质复合物ClpX的ATP依赖性解折叠酶/移位酶活性解折叠并穿过纳米孔。
可以制备ClpX(并且在本文制备)，如记载于Martin et al.“Rebuilt AAA+Motors reveal operating principles for ATP-fuelled machines,”Nature 437:1115-1120(2005)的。多种备选酶可以发挥本方法和装置中的蛋白质移位酶的功能。如那里描述的，用长20个氨基酸的接头连接的2，3或6种 ClpX-deltaN亚基(其缺乏N端氨基酸1-60)的组合以单一多肽链制备。
牵涉AAA+ATP酶的细胞功能的全集是多样的。AAA+蛋白质的亚组没有作为ATP酶的活性，并且一些甚至不结合ATP。然而，似乎这些蛋白质与确实充当ATP酶的其他家族成员形成复合物。然而，所有已知的ATP依赖性蛋白酶的ATP酶亚基或域属于AAA+家族。
合适的AAA+酶的一个例子是Clp/Hsp100ATP酶。Clp/Hsp100ATP酶负责选择蛋白质靶物。例如，两种不同细菌ATP酶ClpX和ClpA对ClpP肽酶赋予独特的底物偏爱。ssrA降解序列，一种对核糖体上停顿的多肽附加的11个残基的肽，被ClpX和ClpA两者识别。对ssrA序列的突变分析揭示了此相同的标签经由两个残基被两种解折叠酶识别，这进一步确认每种ATP酶的独特结合偏爱。
使用来自ATP水解的能量，Clp/Hsp100酶活跃地指导其底物的结构变化。这些ATP驱动的结构变化导致蛋白质底物的两种独特的生物学结果：降解或重塑(remodeling)。ClpA基于其降解酪蛋白的能力是功能上鉴定的第一种原核Clp/Hsp100蛋白。因而，Clp/Hsp100蛋白的降解途径是两种过程中较好表征的。在Clp/Hsp100促进的蛋白质降解过程中，首先，Clp/Hsp100组分识别并选择靶蛋白。该酶结合较短的肽序列(例如ssrA降解标签)，其通常位于底物的C或N端附近。然后，在需要ATP水解的多个周期的反应中，酶解折叠并定向移位靶底物到肽酶区室，在那里其被降解。
也可以使用线粒体蛋白质移位酶。这些可以是移位酶TOM或来自人或真核细胞的TIM，诸如TOMM20(线粒体外膜移位酶20同源物)，TOMM22(线粒体进口受体亚基22同源物)，TOMM40(线粒体外膜移位酶40同源物)， TOM7(线粒体外膜移位酶7)，TOMM7(线粒体外膜移位酶7同源物)， TIMM8A(线粒体内膜移位酶8同源物A)，TIMM50(线粒体内膜移位酶50同源物)。例如，TOMM40包埋到线粒体外膜中，并且是蛋白质运动到线粒体中需要的。更精确地，TOMM40是蛋白质转运到线粒体中的线粒体外膜(TOM) 的移位酶的通道形成亚基。
另一种备选的蛋白质移位酶可以从Sec移位酶家族制备。这些包括SecB (伴侣蛋白)，SecA(ATP酶)，SecY(原核生物中的内膜复合物)，SecE(原核生物中的内膜复合物)，SecG(原核生物中的内膜复合物)或Sec61(真核生物中的内膜复合物)，SecD(膜蛋白)，和SecF(膜蛋白)。
另一种备选的蛋白质移位酶是III类分泌系统(TTS)移位酶，诸如HrcN和 TTS移位酶的20种亚基之任一，或不依赖于Sec的周质蛋白质移位酶TatC。
其他备选的蛋白质移位酶是蛋白伴侣。这些是帮助非共价折叠或解折叠和其他大分子结构的装配或分解，但是在该结构实施其正常的生物学功能，已经完成折叠和/或装配过程时在这些结构中不存在的蛋白质。大多数伴侣蛋白是热休克蛋白，也就是说，蛋白质响应升高的温度或其他细胞应激而表达。如已知的Hsp 70指70-kDa热休克蛋白(Hsp70s)，诸如原核生物中的DnaK， HscA(Hsc66)，和HscC(Hsc62)，和真核生物体中的Hsc70，Hsp70，BiP或Grp78 (结合免疫球蛋白蛋白)，mtHsp70或Grp75，和人Hsp70蛋白，诸如Hsp70, Hsp70-2,Hsp70-4,Hsp70-4L,Hsp70-5,Hsp70-6,Hsp70-7,Hsp70-8,Hsp70-9, Hsp70-12a,Hsp70-14。Hsp70蛋白是分子蛋白伴侣和折叠催化剂的细胞网络的中心组分。Hsp70s帮助一大批折叠过程，包括新合成的蛋白质的折叠和装配，错折叠且聚集的蛋白质的重折叠，细胞器和分泌性蛋白质中的膜移位，和调节蛋白活性的控制。ATP结合和水解在体外和在体内对于Hsp70蛋白的蛋白伴侣活性是必需的。
Hsp70蛋白伴侣家族与Hsp60蛋白伴侣家族一起被公认为最常见的重塑酶。Hsp70s和Hsp60s通过为折叠的蛋白质提供分离的环境在蛋白质折叠过程阻止脱途径(off-pathway)相互作用。比较而言，Clp/Hsp100解折叠酶活跃地指导其底物的结构变化。Clp/Hsp100s作用于折叠且装配的复合物，以及不正确折叠且聚集的蛋白质。
HSP90以ATP依赖性过程帮助将线粒体前蛋白递送到TOM复合物。
Hsp100(大肠杆菌中的Clp家族)蛋白已经在体内和在体外研究其靶向和解折叠有标签且错折叠的蛋白质的能力。Hsp100/Clp家族中的蛋白质在存在 ATP的情况下形成具有解折叠酶活性的较大六聚体结构。认为这些蛋白质发挥伴侣蛋白功能，通过将客户蛋白进行性穿过小的(2nm)孔，由此对每个客户蛋白给予第二次折叠机会。这些中的一些Hsp100蛋白伴侣，如ClpA 和ClpX与双环的十四聚体丝氨酸蛋白酶ClpP联合；代替催化客户蛋白的重折叠，这些复合物负责对有标签且错折叠的蛋白质的靶向破坏。
Hsp104(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Hsp100)对于许多酵母朊病毒的增殖是必需的。HSP104基因的缺失导致不能增殖某些朊病毒的细胞。
工作例中使用的酶具有序列：
MGSSHHHHHHSSHMSALPTPHEIRNHLDDYVIGQEQAKKVLAVAVYNHYKRLRNGDTSNGVELGKSNILLIGPTGSGKTLLAETLARLLDVPFTMADATTLTEAGYVGEDVENIIQKLLQKCDYDVQKAQRGIVYIDEIDKISRKSDNPSITRDVSGEGVQQALLKLIEGTVAAVPPQGGRKHPQQEFLQVDTSKILFICGGAFAGLDKVISHRVETGSGIGFGATVKAKSDKASEGELLAQVEPEDLIKFGLIPEFIGRLPVVATLNELSEEALIQILKEPKNALTKQYQALFNLEGVDLEFRDEALDAIAKKAMARKTGARGLRSIVEAALLDTMYDLPSMEDVEKVVIDESVIDGQSKPLLIYGKPEAQQASGEASGAGGSEGGGSEGGTSGATMSALPTPHEIRNHLDDYVIGQEQAKKVLAVAVYNHYKRLRNGDTSNGVELGKSNILLIGPTGSGKTLLAETLARLLDVPFTMADATTLTEAGYVGEDVENIIQKLLQKCDYDVQKAQRGIVYIDEIDKISRKSDNPSITRDVSGEGVQQALLKLIEGTVAAVPPQGGRKHPQQEFLQVDTSKILFICGGAFAGLDKVISHRVETGSGIGFGATVKAKSDKASEGELLAQVEPEDLIKFGLIPEFIGRLPVVATLNELSEEALIQILKEPKNALTKQYQALFNLEGVDLEFRDEALDAIAKKAMARKTGARGLRSIVEAALLDTMYDLPSMEDVEKVVIDESVIDGQSKPLLIYGKPEAQQASGEASGAGGSEGGGSEGGSSGATMSALPTPHEIRNHLDDYVIGQEQAKKVLAVAVYNHYKRLRNGDTSNGVELGKSNILLIGPTGSGKTLLAETLARLLDVPFTMADATTLTEAGYVGEDVENIIQKLLQKCDYDVQKAQRGIVYIDEIDKISRKSDNPSITRDVSGEGVQQALLKLIEGTVAAVPPQGGRKHPQQEFLQVDTSKILFICGGAFAGLDKVISHRVETGSGIGFGATVKAKSDKASEGELLAQVEPEDLIKFGLIPEFIGRLPVVATLNELSEEALIQILKEPKNALTKQYQALFNLEGVDLEFRDEALDAIAKKAMARKTGARGLRSIVEAALLDTMYDLPSMEDVEKVVIDESVIDGQSKPLLIYGKPEAQQASGE.(SEQ ID NO:8)
它是一种合成设计的ClpX亚基三聚体，其以单链表达。如上文记录的，许多移位酶构建体可以在本系统中使用。
2.酶可以与纳米孔偶联，在一侧的溶液中游离，和/或存在于纳米孔的两侧
顺侧(与底物蛋白质相同侧)的移位酶
在某些实施方案中，例如如图10中所示，ClpA或Clp X可以与纳米孔偶联。可以装配工程化的alpha-溶血素/ClpP融合蛋白孔以形成活性七聚体蛋白纳米孔，其在其N端帽域与ClpP七聚体复合物的ClpX结合域共价融合。ClpP 的ClpX结合域与纳米孔顶部的融合会使ClpX在溶液中装配，附着于ClpP域，并对纳米孔的顶部发挥功能。
图10显示了融合蛋白，其包含与ClpP蛋白的亚基融合的α-溶血素孔蛋白亚基。然后，ClpX蛋白质移位酶可以非共价“对接(dock)”到ClpP亚基上。在此实施方案中，蛋白质移位酶在纳米孔的顺侧并与其融合。
在图10的实施方案中，移位酶和纳米孔的轴向孔必须以正确取向排列；也就是说，ClpX必须以如下的方式与纳米孔结合，使得在蛋白质底物从溶液中被捕获并且驱动到ClpX中心空穴时，其然后直接进入AHL(alpha溶血素) 上腔中，并且最终被迫通过整个纳米孔(参见图10)。为了实现此目的，ClpX 结合域可以与AHL的头部融合。实际上，ClpX六聚体天然结合十四聚体(双七聚体环)蛋白酶ClpP的每个开口的头部域，并且起门的作用，该门仅容许有标签的蛋白质进入蛋白水解区室。通过将ClpP的ClpX结合域融合到AHL 的头部上，它会使ClpX能够经由天然蛋白质-蛋白质相互作用在纳米孔顶部以高亲和力直接结合。幸运的是，AHL和ClpP两者装配成具有明显相似直径的同七聚体环；因此，ClpP单体的ClpX结合域与每个AHL单体的头部的融合会创建七聚体纳米孔复合物，其由这些ClpP/AHL融合单体构成。先前的研究已经研究了AHL单体的融合，显示了AHL确实容许在N和C端两者处融合。另外，研究调查了ClpP的C端的缺失，显示了它不是对于七聚体形成或ClpX 结合至关重要的区域。此数据提示了ClpP会容许AHL与其C端的融合，而与 ClpP N端的融合几乎肯定会抑制ClpX的结合，因为N端环已经显示了对于此类活性是至关重要的。基于这些先前的研究，AHL/ClpP融合单体设计为具有与截短的ClpP单体的C端融合的单一AHL单体(以柔性的5-15Gly-Ser接头分开以容许每个蛋白质单体正确折叠)。可以将这些ClpP—肽接头—AHL融合蛋白DNA序列经由PCR装配构建，用His加标签，并在pT7-SC1表达载体内部插入。将融合蛋白的表达使用先前用于表达AHL融合的T7-S30表达系统通过偶联的体外转录和翻译完成，并用Ni-NTA亲和层析纯化。
移位酶在装置顺侧的另一个实施方案牵涉使用辅助蛋白。在此情况中，使用结合底物蛋白质的蛋白质促进对底物蛋白质移动到或通过纳米孔的控制。例如，反侧中存在的蛋白质(如在图1中)不需要是活性移位酶/解折叠酶，而是非特异性结合多肽的解折叠部分的另一种蛋白质(例如触发因子)。触发因子是核糖体关联分子伴侣，并且是与初生多肽相互作用的第一种蛋白伴侣。它通过将新合成的蛋白质维持为开放构象起蛋白伴侣作用。可以使用其他蛋白伴侣或热休克蛋白。
此反侧蛋白(例如触发因子)由此会序贯捕捉解折叠的底物蛋白质，在其被顺侧移位酶/解折叠酶移位到反式溶液中时，这阻止底物蛋白质返回运动到顺侧中。
在另一个实施方案中，给底物蛋白质提供阻断其被解折叠酶解折叠的因子，直到达到预先确定的状态。在此实施方案中，将底物蛋白和解折叠酶两者添加至顺侧。将底物蛋白质在一端用解折叠酶结合基序(例如对于ClpX为 ssrA标签)，孔靶向域(例如，带电荷的多肽尾部，其在应用电压下会被拉入孔中)，和解折叠酶抗性蛋白(例如在存在稳定化配体的情况下二氢叶酸还原酶或芽孢杆菌RNA酶(barnase)对ClpX的解折叠有抗性；参见Hoskins,JR et al. ClpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in theinterior of the primary sequence.PNAS August 20,2002vol.99no.1711037-11042)加标签。因此，底物蛋白质受到其折叠域和孔靶向和解折叠酶结合基序域之间的此“阻断域”针对解折叠酶提供保护。
阻断域蛋白(与孔靶向域和解折叠酶靶向基序域融合)可以在翻译后化学或酶促附着于底物蛋白质。
在大量顺式溶液中，解折叠酶结合解折叠酶结合基序，并且沿着孔靶向域移位。解折叠酶沿着有标签的底物移位在酶接近解折叠酶抗性蛋白(“阻断域”)后停止。在此有标签的底物蛋白/解折叠酶复合物被纳米孔捕获时，启动阻断域的解折叠和移位。它由额外的脱稳定化力催化，该脱稳定化力由孔处的电压和/或反式溶液中存在的其他蛋白质移位酶/解折叠酶赋予，所述其他蛋白质移位酶/解折叠酶在捕获底物尾部及将其穿过孔后与有标签的底物蛋白尾部相互作用。然后，整个底物蛋白被顺式结合的解折叠酶解折叠并移位通过纳米孔在催化阻断域的孔活化解折叠后是有可能的。
阻断域序列策略实例序列的例子如下：
N-端—底物蛋白—阻断域—有电荷的尾部—解折叠酶结合基序—C端。
反侧的移位酶
将ClpX复合物置于纳米孔反侧的溶液中，并且会迫使纳米孔顺侧溶解的底物蛋白在N或C端开始穿过纳米孔(例如，通过将几个带电荷的氨基酸工程化改造到蛋白质末端(诸如5-10个Asp，Lys或Arg残基)电压驱动，其中ClpX 复合物会捕获此有标签的多肽尾部，并且开始机械牵引/移位底物向下穿过纳米孔。使用有标签蛋白质的天然ClpX结合，解折叠，和移位活性以控制蛋白质移动穿过纳米孔感应器以供后续分析。若ClpX或另一种移位酶诸如ClpA 置于装置的反侧在溶液中，在那里容许它捕捉加标签的蛋白质尾部，其从顺侧穿过纳米孔到反侧溶液(也就是，ClpX的“捕鱼”)，则可以利用野生型蛋白质纳米孔或其他固状纳米孔。在捕获此有标签的尾部后，ClpX复合物会能够开始对蛋白质从孔间的机械牵引，直到它最终能够解折叠整个多肽并将其穿过孔并进入反侧溶液中。有标签的尾部的初始穿过可以通过在靶蛋白的N 或C端添加标签序列近端的几个带电荷的残基实现，其中电压差异会驱动有电荷的尾部穿过纳米孔，使其可用于ClpX的“钓鱼”。
如例如下文实施例1和实施例2中显示的，将蛋白质移位酶以溶液添加至室的反侧；它用来解折叠要移位的蛋白质，通过将其拉过纳米孔，其过窄以至于不能容许折叠的蛋白质通过。相同或不同的蛋白质移位酶可以位于纳米孔的顺侧，用于解折叠蛋白质。
3.纳米孔感测
本方法和装置中的感测方法可以牵涉测量蛋白质的1、2、3、4或5种或更多种特征。一种或多种特征优选选自(i)蛋白质的长度，(ii)蛋白质的身份， (iii)蛋白质的序列，(iv)蛋白质的二级或三级结构和(v)蛋白质是否经过修饰。 (i)至(v)的任何组合可以依照本发明测量。
对于特征(i)，可以使用蛋白质和孔之间的相互作用数目，和/或蛋白质在其移位通过孔时的停留时间测量蛋白质的长度。
对于特征(ii)，蛋白质的身份可以以多种方式测量。蛋白质的身份可以结合蛋白质序列测量或不结合蛋白质序列测量来测量。前一种是直接的；对蛋白质测序，并且由此鉴定。后一种可以以几种方式完成。例如，可以测量蛋白质中的特定基序的存在(不测量蛋白质的剩余序列)。或者，在该方法中特定电学和/或光学信号的测量可以鉴定如正来自特定来源的蛋白质。
对于特征(iii)，可以如本文中描述的那样测定蛋白质的序列。序列可以按各个氨基酸残基与残基为基础测定，或者可以在氨基酸区组中读出，该氨基酸区组可以定位到已知的蛋白质序列，其方式类似于DNA的再测序。因此，方法不需要解析每个单独的氨基酸，而是可以仅仅解析氨基酸的“词”或区组/组块(例如2至10个aa)，其仍会实现蛋白质/多肽序列的鉴定。
对于特征(iv)，二级和三级结构可以以多种方式测量。例如，若该方法牵涉电学测量，则可以使用停留时间的变化或流过孔的电流的变化测量二级结构(例如检测alpha螺旋区对环区或beta片层区)。
对于特征(v)，可以测量任何修饰的存在或缺乏。该方法优选包括测定蛋白质是否通过甲基化磷酸化，氧化，通过损伤(例如氨基酸的错折叠或共价修饰)，通过糖基化或用一种或多种标记物，标签或间隔物修饰。特定的修饰可以导致与纳米孔的特异性相互作用，其可以使用下文描述的方法测量。
如下文讨论的，本方法和装置可以通过分析通过纳米孔测量的离子电流从移位的蛋白质提取蛋白质序列信息。这部分依赖于使用灵敏性电子设备(electronics)，诸如膜片钳放大器、有限状态机(finite state machine)、和信号加工诸如加权平均法，均在下文描述。另外，本方法牵涉分析各种电流状态，其现在已经发现为与蛋白质运输通过纳米孔和伴随的电流阻断，未阻断或调控有关。如下文描述的，通过酶介导的蛋白质横穿检测的信号会进入所谓的“陡变状态”(其是酶结合底物蛋白的特征)，然后是在蛋白质移位通过纳米孔时一系列分开的振幅过渡，接着是与移位前通过孔的电流等同的开放状态。总之，使用例示的实验设置，可以观察到下列各项的独特状态(参见图 2)：
(i)移位前的开放通道电流–约30-35pA，或32-36pA；
(ii)在捕获要移位的蛋白质(即蛋白质阻断纳米孔打开)后降低至约11-15 (例如约13-15)pA；
(iii)降低到或低于10pA和各种振幅变化(包括下文讨论的“陡变”效应)，因为酶结合蛋白质，并且沿着蛋白质尾部向纳米孔移位(即，酶阻断更多的纳米孔开放)；
(iv)在蛋白质的解折叠后，整个蛋白质被移位通过纳米孔，产生独特的电流样式；
(v)返回到开放通道状态。
重要地，状态(iv)(图2A和2B)呈现了可以与蛋白质结构关联的电流样式。如下文描述的，在例子中使用的人工接头显示不同的电流振幅和持续时间。在分析蛋白质以测定未知特征，诸如序列时，可以将观察到的振幅和RMS 噪音变化与移位蛋白质的氨基酸依赖性特征联系起来。这包括但不限于三级和二级结构，氨基酸序列和翻译后修饰。
纳米孔生物感测技术基于离子电流的阻断，其在分子在应用电压下移位通过孔和/或与孔相互作用时发生。因此，电流阻断依赖于应用电压和相互作用分子的特性(例如电荷，大小)。
可以通过任何合适的技术测量纳米孔径的时间依赖性转运特性。转运特性可以是用于转运多肽，液体中的溶质(例如离子)，多肽(例如，单体的化学结构)，或多肽上的标记物的介质的功能。例示性的转运特性包括电流，电导，电阻，电容，电荷，浓度，光学特性(例如荧光和喇曼(Raman)散射)，和化学结构。期望地，转运特性是电流。
用于检测顺和反式室之间的电流的例示性手段已经记载于WO 00/79257, 美国专利No.6,46,594,6,6736,673,615,6,627,067,6,464,842,6,362,002, 6,267,872,6,015,714,6,428,959,6,617,113和5,795,782及美国公开文本No. 2004/0121525,2003/0104428,和2003/0104428，并且可以包括但不限于在孔径处或附近与通道或孔直接连接的电极，置于顺反式室内的电极，和绝缘玻璃微电极。电极可以能够但不限于检测两个室间的离子电流差异或穿过孔孔径或通道孔径的电子隧穿电流。在另一个实施方案中，转运特性是穿过孔径直径的电子流，其可以通过在纳米孔周长附近或邻接布置的电极监测。此类电极可以附接于Axopatch 200B放大器以放大信号。
在一个实施方案中，介质是电传导的。在另一个优选的实施方案中，介质是水溶液。在另一个优选的实施方案中，方法进一步包括下列步骤：测量两个池(pool)之间的电流；比较第一次诱导第一极性获得的电流数值(I1)与第二次诱导第二极性时获得的电流数值(I2)；并测定I1和I2之间的差异，由此获得差异数值δI。在另一个优选的实施方案中，方法进一步包括下列步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱导第一极性获得的电流数值(I1)与后来的时间获得的电流数值(I2)，并测定I1和I2之间的差异，由此获得差异数值δI。
在一个备选的实施方案中，方法进一步包括下列步骤：提供启动酶活性的试剂；将试剂引入包含多肽复合物的池；并且于合适的温度温育该池。在另一个优选的实施方案中，试剂选自下组：活化剂和辅因子。
4.纳米孔薄膜装置的制造
提供了单通道(纳米孔)薄膜装置和其使用方法。主题装置通常包括混合信号半导体晶片，至少一个电化学层，包含半导体材料，诸如二氧化硅等的电化学层，其中半导体材料进一步包含表面改性剂(modifier)，诸如碳氢化合物，其中电化学层限定多个孔板(orifices)，该孔板包含室和颈部，且其中孔板的室与混合信号半导体晶片的第一金属组分共定位，其中孔板的一部分用第二金属，例如银堵住，其中第二金属与第一金属处于电子通信中，且其中孔板进一步包含薄膜，诸如磷脂双层，该薄膜在孔板的颈部形成溶剂不能渗透的密封，该薄膜进一步包含孔，且其中孔板封闭水相和气相。
在另一个优选的实施方案中，半导体材料选自下组：二氧化硅(SiO2)，氧氮化硅(silicon oxy nitride,SiON)，氮化硅(SiN)，金属氧化物，和金属硅酸盐。在另一个优选的实施方案中，半导体材料是二氧化硅。在另一个优选的实施方案中，表面改性剂是碳氢化合物。在另一个优选的实施方案中，金属化组分选自下组：镍、金、铜、和铝。在一个最优选的实施方案中，金属是银。在一个优选的实施方案中，薄膜是分子双层。在另一个优选的实施方案中，薄膜是磷脂双层。在一个备选的实施方案中，孔板是0.5-3μm的大小。在一个优选的实施方案中，孔板是1-2μm的大小。在一个最优选的实施方案中，孔板是1.25-1.5μm的大小。在另一个优选的实施方案中，孔是生物学分子。在另一个优选的实施方案中，生物学分子选自下组：离子通道，核苷通道，肽通道，糖转运蛋白，突触通道，跨膜受体，和核孔。在一个最优选的实施方案中，生物学分子是alpha-溶血素。在一个优选的实施方案中，孔径的大小是约1-10nm。在另一个优选的实施方案中，孔径的大小是约1-4nm。在一个最优选的实施方案中，孔径的大小是约1-2nm。在一个备选的最优选的实施方案中，孔径的大小是约2-4nm。
生物学纳米孔在多肽检测中具有效应，但是由于使用较低的电流(约为几十皮安)所致。使用高通量的单一纳米孔测序装置进行的检测可以限于每秒约1000个氨基酸残基。制造可以彼此独立运行的生物学纳米孔的阵列(诸如用于非常大的集成电路阵列的制造)容许非常大规模的纳米孔阵列以在一秒中实施数百万次生物化学反应和分析。
可以在本系统中使用多个纳米孔。在一个实施方案中，孔或通道是成形并分大小的，具有适合于通过聚合物的尺寸。在另一个实施方案中，孔或通道容纳聚合物的实质性部分。在一个优选的实施方案中，聚合物是多肽。孔或通道也可以是孔分子或通道分子，并且包含生物学分子，或合成的修饰分子，或改变的生物分子，或其组合。此类生物分子例如但不限于离子通道，诸如α-溶血素，MspA，核苷通道，肽通道，糖转运蛋白，突触通道，跨膜受体，诸如GPCR等，受体酪氨酸激酶等，T细胞受体，MHC受体，核受体，诸如类固醇激素受体，核孔，合成变体，嵌合变体，等等。
在一个优选的实施方案中，生物学分子是α-溶血素。在另一个优选的实施方案中，生物学分子是MspA(横裂分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis)孔蛋白A)。在又一个优选的实施方案中，孔是固态孔。
在一个备选中，孔或通道包含非酶生物学活性。具有非酶生物学活性的孔或通道可以是例如但不限于蛋白质，肽，抗体，抗原，核酸，肽核酸(PNA)，锁式核酸(lockednucleic acid,LNA)，morpholinos，糖，脂质，糖基磷脂酰肌醇，糖磷酸肌醇(glycophosphoinositol)，脂多糖，等等。化合物可以具有抗原性活性。化合物可以具有选择性结合特性，由此聚合物在特定受控环境条件下，而非在环境条件变化时结合化合物。此类条件可以是例如但不限于[H+] 变化，环境温度变化，严格性变化，疏水性变化，亲水性变化，等等。
在另一个实施方案中，孔或通道进一步包含接头分子，该接头分子选自下组：硫醇基团，硫化物基团，磷酸根基团，硫酸盐基团，氰基基团，哌啶基团，Fmoc基团，和Boc基团。在另一个实施方案中，化合物选自下组：双官能性烷基硫化物和金。
在一个实施方案中，将孔分级并定形以容许活化剂通过，其中活化剂选自下组：ATP，NAD+，NADP+，甘油二酯，磷脂酰丝氨酸，类花生酸 (eicosinoids)，视黄酸，钙化醇(calciferol)，抗坏血酸，神经肽，脑啡肽，内啡呔(endorphins)，4-氨基丁酸酯(GABA)，5-羟基色胺(5-HT)，儿茶酚胺，乙酰CoA，S-腺苷甲硫氨酸，及任何其它生物学活化剂。在另一个实施方案中，将孔分级并定形以容许辅因子通过，其中辅因子选自下组：Mg2+,Mn2+,Ca2+,ATP,NAD+,NADP+，及任何其它生物学活化剂。
阵列元件可以以逐步平行方式制造，其类似于在集成电路上制造晶体管。每个阵列元件的所有或大多数类似的层以在所有或大多数阵列元件上同时发生的单一过程步骤的顺序创建。
似乎没有同步化生物试剂的不同分子的活性，从而阵列中的每个元件应当能够不依赖于其他元件起作用的简单方式。这可以通过包括具有每个单一生物学纳米孔的数字逻辑电路实现，所述数字逻辑电路执行有限状态机，该有限状态机控制并感测离开与生物学纳米孔有关的单一(或多个)分子的复合物的生物化学状态(This may be accomplishedby including a digital logic circuit with each single biological nanoporethat implements a finite state machine that controls and senses thebiochemical state of the complex off single (or multiple)molecules associatedwith the biological nanopore.)。有限状态机容许与生物学纳米孔有关的分子复合物的低等待时间(latency)控制，并且同时可以存储为了另一时间检索而收集的信息。
以阵列中的每个生物学纳米孔元件可以使用最少数目的有线连接彼此通信的次序，可以使用串行接口和可寻址逻辑来多路复用(multiplex)大量进入和离开阵列的数据。
不是所有阵列元件可以具有穿过其相应孔板的薄膜或双层。如通过有限状态机测量的纳米孔中存在的膜的电容可以用于检测非官能性阵列元件的存在。若随后确定缺乏薄膜或双层的阵列元件比例在与优选的比例相比时更大，则可以重复将膜诸如TEFLON膜和脂质涂层重叠的步骤。
可以将电极(例如接地宏观AgCl电极)置于与第二溶液接触中。在将膜诸如双层跨越所有可发挥官能的孔板适当放置时，没有离子电流会从第二溶液流到第一溶液。将预先确定量的孔分子或通道分子，诸如例如alpha-溶血素毒素或MspA添加到第二溶液。孔分子或通道分子的浓度足以在约例如15分钟中在任何薄膜或双层中形成单一通道。形成此类通道前的时间可以是介于例如半分钟和1小时之间，例如约半分钟，1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5 分钟，7分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，50分钟，55分钟，60分钟，或其间的任何时间。形成的时间可以由操作人员根据几个因素或参数，例如，提高或降低周围或温育温度，提高或降低第二溶液或第一溶液中的盐浓度，在第一溶液和第二溶液之间放置势差，或本领域技术人员已知的其它方法改变。有限状态机可以通过对电流 (离子)通过电路的流动做出反应检测和/或感测单一通道在其相应双层中的形成，该电路包含宏观电极，第二溶液，单一纳米孔或通道分子，第一溶液，和金属电极，用于任何给定的阵列元件。
生物学通道的形成是随机过程。在单一通道已经在给定的阵列元件双层中形成后，优选的是，在其中如此形成的第二通道的机会是降低的或优选是消除的。第二通道插入的可能性可以通过双层间应用的电势，即势差调控。在感测单一通道后，有限状态机可以调节金属电极上的电势以降低第二通道插入到相同双层中的可能性。
尽管在先前的步骤中采取防范，第二通道可以在给定的双层中形成。有限状态机可以检测第二通道的形成。精确控制的低压的脉冲可以推动两个通道之一，容许单一通道保持在双层中包埋。
在使用生物学纳米孔进行生物化学刺激和检测的过程中，孔可以被永久阻塞。有限状态机可以检测并感测此阻塞状态，并且可以从双层中除去阻断通道，通过灭活热元件，由此在双层上应用吸力(降低的压力)进行。
在一个备选的实施方案中，每个阵列元件可以包含围绕孔板的金电极。此金电极可以用来活化化学试剂，其使用还原或氧化反应进行，并且可以对特定孔板的位置特异性起作用。
可以例如使用现有技术的商品化65nm工艺技术(例如来自Taiwan SemiconductorManufacturing Company,Taiwan)创建有限状态机。600x 600 纳米孔阵列可以实施360,000个生物化学反应和1000Hz速率的检测/感测步骤。这可以实现多核苷酸的测序，例如从而以每秒每1cm x 1cm从半导体晶片切出的电路小片(die)3.6亿个碱基的速率行进。
用于在顺和反式室之间应用电场的例示性手段是例如包含浸入阳极和浸入阴极的电极，其与电压源连接。此类电极可以例如由氯化银，或具有类似的物理和/或化学特性的任何其它化合物制成。
5.设备
在工作例中，膜片钳放大器(Molecular Devices AxoPatch 200B)调节应用的电压，并且测量通过通道的离子电流。将数据使用Molecular Devices Digidata 1440A数字转换器记录，以50kHz取样，并用四极Bessel滤器以5kHz 低通过滤。一个站使用不同膜片钳，A-M系统2400型。
可以使用如下其它设备：
控制逻辑：硬件和软件
使用LabVIEW 8软件内的有限状态机(FSM)编程电压控制逻辑。在现场可编程门阵列(FPGA)硬件系统，National Instruments PCI-7831R上执行FSM 逻辑。FPGA是一种可再配置的硬件平台，其容许快速测量和电压反应时间 (1μsec输出样品时间)。FSM是一种逻辑构建体，其中程序执行分解成一系列单独状态。每个状态具有与其关联的命令，并且状态间的过渡是系统测量的函数。将孔电流的测量加工并通到FSM作为输入。必要时进行FSM控制逻辑的变化，而不需要再编译和重新路由(re-route)FPGA上运行的设计。这实现速度和灵活性之间的平衡，通过使系统能够以微秒级对事件做出反应，同时还容许控制逻辑在必要时在实验间再配置。
可以使用有限状态机检测并控制分子对聚合物的结合。分子是蛋白质，优选的是，蛋白质是酶。有限状态机也可以检测具有结构元件的聚合物化合物，该结构元件抑制该聚合物化合物变换通过纳米孔。在一个实施方案中，聚合物化合物包含肽核酸。
有限状态机可以以约5Hz-2000Hz的速率控制分子对聚合物的结合。有限状态机可以以例如约5Hz，约10Hz，约15Hz，约20Hz，约25Hz，约30Hz，约35Hz，约40Hz，约45Hz，约50Hz，约55Hz，约60Hz，约65Hz，约70 Hz，约75Hz，约80Hz，约85Hz，约90Hz，约95Hz，约100Hz，约110Hz，约120Hz，约125Hz，约130Hz，约140Hz，约150Hz，约160Hz，约170Hz，约175Hz，约180Hz，约190Hz，约200Hz，约250Hz，约300Hz，约350Hz，约400Hz，约450Hz，约500Hz，约550Hz，约600Hz，约700Hz，约750Hz，约800Hz，约850Hz，约900Hz，约950Hz，约1000Hz，约1125Hz，约1150 Hz，约1175Hz，约1200Hz，约1250Hz，约1300Hz，约1350Hz，约1400Hz，约1450Hz，约1500Hz，约1550Hz，约1600Hz，约1700Hz，约1750Hz，约1800Hz，约1850Hz，约1900Hz，约950Hz，及约2000Hz控制分子对聚合物的结合。在一个优选的实施方案中，有限状态机可以以约25Hz-约250Hz 的速率检测分子对聚合物的结合。在一个更优选的实施方案中，有限状态机可以以约45Hz-约120Hz的速率检测分子对聚合物的结合。在一个最优选的实施方案中，有限状态机可以以约50Hz的速率检测分子对聚合物的结合。
移动平均值滤器(Moving Average Filter)
每5.3μsec，FPGA取样离子电流，并计算有窗均值振幅(windowed meanamplitude)，其使用窗大小0.75msec进行。若均值进入选择的阈值范围，则 FPGA检测进入，并继续监测均值，每0.2msec再检查阈值。若对于四次连续检查，均值仍然在阈值范围内，则FSM逻辑诊断阻断为已知与选择的阈值一致的事件类型。
在缺乏电压变化的情况中，事件开始和事件诊断之间的预期时间延迟是1.35msec；0.75msec用于有窗均值第一次进入阈值，及0.6msec用于再三次确认测试。实际上，诊断时间范围为1.1至2.5msec。均值滤器在我们发明的初始演示中执行。
指数加权移动平均值滤器
为了针对终步骤的假检测(false detection)改善FSM的稳健性 (robustness)，可以使用指数加权移动平均值(EWMA)滤器替换均值滤器。 EWMA滤器代表通常用于电工程应用中的信号平滑法的模拟RC滤器的数字实现。滤器计算移动平均值，其对过去的样品放置指数上较小的重要性，并且容许过滤的信号更好追踪实际信号。EWMA过滤由于其递归实现而也比简单的移动平均值更有效实施信号平滑法：
ibar(t)＝(1-a)ibar(t)+ai(t-1), (1)
其中i和ibar分别是未过滤的和过滤的电流信号，并且t是样品数目。以α＝0.9离线过滤来自终步骤检测实验的数据显示相对于均值滤器在针对假阳性的稳健性的实质性改善。与均值滤器一样，会使用4个连续阈值测试进行事件诊断，阈值测试之间等待0.2msec。
在缺乏电压变化的情况中，事件开始和事件诊断之间的预期时间延迟是0.7msec；0.1msec用于EWMA第一次进入阈值，及0.6msec用于再三次的确认测试。EWMA检测时间的更严格评估会是我们正在进行的工作的一部分。
使用FSM/FPGA的电压控制
纳米孔系统可以在0.3mM KCl溶液中设置。膜片钳放大器(Molecular DevicesAxoPatch 200B)调节应用的电压，并测量通过通道的离子电流。将数据使用MolecularDevices Digidata 1440A数字转换器记录，以50kHz取样，并用四极Bessel滤器以5kHz低通过滤。
使用LabVIEW 8软件内的FSM编程电压控制逻辑。在现场可编程门阵列 (FPGA)硬件系统，National Instruments PCI-7831R上执行FSM逻辑。FPGA是一种可再配置的硬件平台，其容许快速测量和电压反应时间(1μsec输出样品时间)。FSM是一种逻辑构建体，其中程序执行分解成一系列单独状态。每个状态具有与其关联的命令，并且状态间的过渡是系统测量的函数。将孔电流的测量加工并通到FSM作为输入。必要时进行FSM控制逻辑的变化，而不需要再编译和重新路由(re-route)FPGA上运行的设计。这实现速度和灵活性之间的平衡，通过使系统能够以微秒级对事件做出反应，同时还容许控制逻辑在必要时在实验间再配置。
6.例示性应用
本文中公开的本发明的应用和/或使用可以包括但不限于下列各项：1). mRNA，rRNA，和DNA中的蛋白质-核酸复合物的测定法。2).通过肽分析进行的食物和环境样品中微生物或病毒含量存在的测定法。3).通过肽分析鉴定食物和环境样品中的微生物或病毒含量。4).在植物，人，微生物和人中通过肽分析鉴定病理学。5).医学诊断中的肽测定法。6).法医测定法。
本纳米孔装置可以用于监测酶诸如蛋白酶，激酶，和磷酸酶(其在细胞增殖中具有重要应用)的周转。
本纳米孔装置可以发挥生物传感器的功能以监测可溶性物质诸如酶底物或信号传导分子之间的相互作用。例子包括血液组分诸如葡萄糖，尿酸和尿液，激素诸如类固醇和细胞因子，和通过对受体分子结合施加其功能的药剂。
本纳米孔装置可以实时监测重要生物结构诸如核糖体的功能，并且用单一功能单元实时此操作。
本方法和装置也可以用于检测并量化改变的蛋白质表达，缺乏/存在对过量，蛋白质表达或监测治疗性干预期间的蛋白质水平。可以使用依照本发明的纳米孔装置的阵列评估给定样品中的蛋白质量。也可以利用要移位的多肽或蛋白质在范围为几天至数月的时段里作为针对上文记录的疾病和其它脑病症，状况，和疾病的治疗效力的标志物。用于此比较的定性或定量方法是本领域中公知的。
诊断学
可以使用可通过本系统移位的多肽，片段，寡肽，和PNA检测并量化改变的蛋白质表达，缺乏/存在对过量，蛋白质的表达或监测治疗性干预期间的蛋白质水平。与改变的表达有关的状况，疾病或病症包括特发性肺动脉高血压(idiopathic pulmonary arterialhypertension)，继发性肺高血压(secondary pulmonary hypertension)，细胞增殖性病症(cell proliferative disorder)，特别是间变性少突星形细胞瘤(anaplasticoligodendroglioma)，星细胞瘤 (astrocytoma)，少突星形细胞瘤(oligoastrocytoma)，成胶质细胞瘤 (glioblastoma)，脑膜瘤(meningioma)，神经节细胞瘤(ganglioneuroma)，神经元新生物(neuronal neoplasm)，多发性硬化，亨丁顿(Huntington)氏病，乳腺癌(breastadenocarcinoma)，前列腺癌(prostate adenocarcinoma)，胃腺癌 (stomachadenocarcinoma)，转移性神经内分泌癌(metastasizing neuroendocrine carcinoma)，非增殖性纤维囊性和增殖性纤维囊性乳房疾病(nonproliferative fibrocystic andproliferative fibrocystic breast disease)，胆囊胆囊炎(gallbladdercholecystitis)和胆石病(cholelithiasis)，骨关节炎(osteoarthritis)，和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)；获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiencysyndrome,AIDS)，阿狄森(Addison)氏病，成人呼吸窘迫综合征(adult respiratorydistress syndrome)，变态反应，强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，淀粉样变性病(amyloidosis)，贫血，哮喘，动脉粥样硬化，自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehemolytic anemia)，自身免疫性甲状腺炎 (autoimmune thyroiditis)，良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)，支气管炎(bronchitis)，切-东二氏综合征(Chediak-Higashi syndrome)，胆囊炎，克罗恩(Crohn)氏病，特应性皮炎(atopic dermatitis)，皮肌炎(dermatomyositis)，糖尿病，气肿，胎儿成红血细胞增多症(erythroblastosisfetalis)，结节性红斑 (erythema nodosum)，萎缩性胃炎(atrophic gastritis)，肾小球性肾炎 (glomerulonephritis)，古德帕斯丘(Goodpasture)氏综合征，痛风(gout)，慢性肉芽肿性疾病(chronic granulomatous diseases)，格里夫氏病(Graves’ disease)，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)，嗜曙红细胞过多 (hypereosinophilia)，过敏性肠综合征(irritable bowel syndrome)，多发性硬化，重症肌无力(myasthenia gravis)，心肌或心包炎症，骨关节炎，骨质疏松，胰腺炎，多囊性卵巢综合征(polycystic ovarysyndrome)，多肌炎(polymyositis)，银屑病(psoriasis)，赖特尔(Reiter)氏综合症，类风湿性关节炎，硬皮病，重度组合免疫缺陷疾病(severe combined immunodeficiencydisease,SCID)，斯耶格伦(Sjogren)氏综合征，系统性过敏性(systemic anaphylaxis)，系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus)，系统性硬化(systemic sclerosis)，血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，葡萄膜炎(uveitis)，沃纳综合征(Werner syndrome)，血液透析(hemodialysis)，身体外循环(extracorporeal circulation)，病毒，细菌，真菌，寄生物，原生动物，和蠕虫感染；催乳激素生成病症，不育(infertility)，包括输卵管疾病(tubal disease)，排卵缺陷(ovulatorydefect)，和子宫内膜异位，动情周期破坏 (disruption of the estrous cycle)，月经周期破坏(disruption of the menstrual cycle)，多囊性卵巢综合征(polycystic ovarysyndrome)，卵巢过度刺激综合征 (ovarian hyperstimulation syndrome)，子宫内膜或卵巢肿瘤，子宫纤维瘤 (uterine fibroid)，自身免疫性病症(autoimmune disorder)，子宫外孕(ectopic pregnancy)，和畸形生长(teratogenesis)；乳腺癌，纤维囊性乳房疾病，和乳漏(galactorrhea)；精子发生破坏(disruption of spermatogenesis)，异常精子生理学(abnormal sperm physiology)，良性前列腺增生，前列腺炎，佩罗尼(Peyronie) 氏病，阳萎(impotence)，男性乳房发育(gynecomastia)；光线性角化病(actinic keratosis)，动脉硬化(arteriosclerosis)，粘液囊炎(bursitis)，硬化(cirrhosis)，肝炎，混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease,MCTD)，骨髓纤维化(myelofibrosis)，阵发性夜间血红蛋白尿(paroxysmal,nocturnal hemoglobinuria)，真性红细胞增多(polycythemiavera)，原发性血小板增多症(primary thrombocythemia)，癌症并发症(complications ofcancer)，癌症，包括腺癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸胎癌和特别是肾上腺，膀胱，骨，骨髓，脑，乳腺，宫颈，胆囊，神经节(ganglia)，胃肠道，心脏，肾，肝，肺，肌肉，卵巢，胰腺，副甲状腺，阴茎，前列腺，唾腺，皮肤，脾，睾丸，胸腺，甲状腺，和子宫癌。在另一个方面，本发明的多核苷酸。
可以使用多肽，片段，寡肽，和PNA或其片段检测并量化改变的蛋白质表达，缺乏/存在对过量，蛋白质的表达或监测治疗性干预期间的蛋白质水平。与改变的表达有关的病症包括静坐不能(akathesia)，阿耳茨海默(Alzheimer) 氏病，健忘症(amnesia)，肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)，共济失调(ataxias)，双相障碍(bipolar disorder)，紧张症(catatonia)，脑性麻痹 (cerebral palsy)，脑血管疾病，克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)，痴呆，抑郁，唐氏综合征(Down's syndrome)，迟发性运动障碍(tardive dyskinesia)，肌张力障碍(dystonias)，癫痫(epilepsy)，亨丁顿(Huntington)氏病，多发性硬化，肌肉萎缩症(muscular dystrophy)，神经痛(neuralgias)，神经纤维瘤病 (neurofibromatosis)，神经病(neuropathies)，帕金森氏病(Parkinson’s disease)，皮克氏病(Pick’s disease)，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，精神分裂症 (schizophrenia)，季节性情感障碍(seasonal affectivedisorder)，老年性痴呆 (senile dementia)，中风(stroke)，图列特氏综合症(Tourette’ssyndrome)和癌症，包括腺癌，黑素瘤，和畸胎癌，特别是脑的。也可以利用这些多肽或蛋白质在范围为几天至数月的时段里作为针对上文记录的疾病和其它脑病症，状况，和疾病的治疗效力的标志物。用于此比较的定性或定量方法是本领域中公知的。
例如，可以将多肽或肽通过标准方法标记，并在杂交复合物形成的条件下添加到来自患者的生物学样品。在温育期后，将样品清洗，并将标记物(或信号)的量量化并与标准值比较。若患者样品中的标记物量与标准值相比显著改变，则指示关联状况，疾病或病症的存在。
为了提供与蛋白质表达有关的状况，疾病或病症的诊断的基础，建立正常或标准的表达概况。这可以通过在杂交或扩增条件下组合从正常受试者 (动物或人)采集的生物学样品与肽标签实现。可以通过比较使用正常受试者获得的数值与使用已知量的基本上纯化的靶序列的实验的数值量化标准杂交。可以比较以此方式获得的标准值与从来自在特定状况，疾病或病症方面有症状的患者的样品获得的数值。从标准值向那些与特定状况有关的数值的偏离用于诊断所述状况。
还可以使用此类测定法在动物研究中及在临床试验中评估特定治疗性处理方案的效力或监测个别患者的治疗。在将状况的存在建立并启动治疗方案后，可以定期重复诊断测定法，以测定患者中的表达水平是否开始接近在正常受试者中观察到的水平。可以使用从连续测定法获得的结果在范围为几天或几个月的时段里显示治疗效力。
实施例1：用于监测蛋白质移位的纳米孔装置的构建
图1A中图解此实施例的纳米孔装置，其代表使用的设置。纳米孔感应器制备为具有脂质双层中包埋的单一AHL孔，所述脂质双层分开两个 PTFE聚合物孔，其各自含有100μl 0.2M KCl溶液(30℃)。在孔间应用电压(反侧+180mV)，引起离子电流流过通道。电流在存在捕捉的蛋白质分子的情况下下降。
简言之，对于每个实验，将单一AHL纳米孔插入30μm直径脂质双层，其分开两个各含有100μl PD缓冲液(pH7.6)的孔(称作顺式和反式)。使用N端截短的ClpX变体的共价连接三聚体(ClpX-ΔN3)进行所有ClpX纳米孔实验。 ClpX-ΔN3BLR表达菌株获自AndreasMartin(UC Berkeley)。在OD 600为约1 时通过添加0.5mM IPTG诱导ClpX蛋白表达，并于23℃在摇动的情况下温育 3-4小时。将培养物沉淀，在裂解缓冲液(50mM NaH2PO4pH 8,300mMNaCl, 100mM KCl,20mM咪唑,10％甘油,10mM BME)中重悬，通过用玻璃珠涡旋振荡裂解。在裂解物的离心和过滤后，将蛋白质在Ni2+-NTA亲和柱(Thermo) 和Uno-Q阴离子交换柱(Bio-Rad)上纯化。
给顺式区室和反式区室两者填充针对ClpX功能优化的100μl 200mM KCl缓冲液。根据指示，此缓冲液补充有5mM ATP。膜片钳放大器(Axopatch 200B,Molecular Devices)在两个Ag/AgCl电极之间应用恒定的180mV电势 (反侧+)，并记录通过纳米孔的离子电流作为时间的函数。将底物蛋白质添加到约1μM终浓度的顺式溶液，而约100nM ClpX存在于反式溶液中。
在双层间应用恒定的180mV电势，并通过与电压钳模式的集成膜片钳放大器(Axopatch 200B,Molecular Devices)串联的Ag/AgCl电极间的纳米孔测量离子电流。将数据在全细胞构造(β＝1)中以100kHz带宽使用模拟至数字转换器(Digidata 1440A,Molecular Devices)记录，然后以5kHz使用模拟低通Bessel 滤器过滤。通过PD/ATP 5mM和PD/ATP 4mM的每日制备准备实验条件。将 ClpX以1:10在PD/ATP 5mM中稀释，在最终4.5mMATP中实现终浓度30-100 nM ClpX。使用ClpX溶液填充整个系统，之后分离单一AHL纳米孔。在插入后，给顺式孔灌注约6mL PD/ATP 4mM。于30℃用瞬时孔添加的1-2μM底物进行实验。蛋白质底物捕捉事件由于孔阻塞或在预先确定的持续时间后用反极性喷出。通常将电压诱导的移位排出以阻止堵塞并且提高数据收集的效率。单一纳米孔实验定义为离子电流数据在由于双层破裂，通道电导丧失或完成预置数目的移位事件而终止前在完整双层中从一个AHL纳米孔获得的时间。
实施例2：用于移位的工程化蛋白S1，S2-35和S2-148
图1C中示意性显示了用于移位的底物蛋白质，其显示了(i)S1，即一种蛋白质，该蛋白质携带偶联的单一N端Smt3域和长65个氨基酸的带电荷柔性的区段，其在其羧基端用11个氨基酸的ClpX-靶向域(ssrA tag)加帽；(ii) S2-35，其类似于S1，但是在其N端附加有35个氨基酸的接头和第二Smt3域； (iii)S2-148，其与S2-35相同，只是在Smt3域间的延长的148个氨基酸接头。
对于我们的初步实验，我们使用泛素样蛋白质Smt3的修饰形式。Smt3 由安排成4个β-链和单一α-螺旋的约100个氨基酸构成。我们进一步将Smt3工程化改造成S1。为了构建底物蛋白S1，将编码76个氨基酸尾部的DNA(GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDDAANDENYALAA)(SEQ ID NO:1)通过聚合酶链式反应(PCR)进行，并在T/A克隆位点克隆到pET-SUMO载体(Invitrogen)中，将尾部序列融合到Smt3序列3’端上。
76个氨基酸的尾部含有约10个带负电荷的残基和11个氨基酸的Clpx结合域ssrA。
为了便于纳米孔分析，以两种方式修饰工程化Smt3蛋白S1，1)它附加有长65个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸尾部，包括13个散布的带负电荷的天冬氨酸残基(SEQ ID NO:6)。此非结构化聚阴离子设计为促进纳米孔间的电场中S1 的捕捉和保留。基于其晶体结构13，预测Smt3折叠域位于AHL通道(vestibule) 顶部(图1B)。2)附加的聚阴离子在其C端加帽有ssrA标签，即一种11个氨基酸的ClpX靶向基序14。此ssrA肽标签容许ClpX在其穿过孔进入顺式区室中时特异性结合蛋白质的C端。
通过编码35个氨基酸的接头的DNA (GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG)(SEQ ID NO:2)对S1 Smt-3序列的5’端的基于PCR的添加构建S2-35(SEQ ID NO:5)。然后，将此接头修饰的S1基因在BsaI位点克隆到pE-SUMO载体(LifeSensors)中，将添加的接头和S1序列与pE-SUMO Smt3序列的3’端融合。
将用于S2-148(SEQ ID NO:6)接头添加的DNA(GGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGSGASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSA GSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGS)(SEQID NO:3)通过PCR构建，并通过 Gibson装配方法克隆到S2-35载体中，在35个氨基酸的接头区内。将这些工程化蛋白质在大肠杆菌菌株BL21(DE3)*中表达。在约0.6OD 600通过添加0.5 mM IPTG诱导表达，并于37℃在摇动的情况中温育4-6小时。将培养物沉淀，在裂解缓冲液中重悬，通过用玻璃珠涡旋振荡裂解。在裂解物的离心和过滤后，将蛋白质在Ni2+-NTA亲和柱(Thermo)上纯化。
实施例3：蛋白S1移位的检测
图2A中显示了在存在ClpX和ATP的情况中蛋白S1的捕捉和移位的代表性离子电流迹线。图2A显示了S1移位期间的离子电流迹线。(i)在标准条件(约 34±2pA,RMS噪音1.2±0.1pA)下通过AHL纳米孔的开放通道电流。(ii) S1底物的捕捉。在蛋白质捕捉后，离子电流下降到约14pA(约0.7pA RMS 噪音)。(iii)ClpX介导的陡变状态。离子电流降低到低于10pA，并且特征在于一个或多个逐渐的振幅过渡。此样式仅在存在ClpX和ATP的情况中观察到 (反式区室)。(iv)Smt3域折叠和移位通过纳米孔(约3.8pA,1.7pA RMS噪音)。 (v)在完成底物移位到反式区室后返回到开放通道电流。从开放通道电流约34 ±2pA(图2A,i)，S1捕捉导致电流下降到约14pA(图2A,ii)。此稳定的电流持续数十秒，并且在存在或缺乏对反式区室添加的ClpX和ATP的情况中观察到(图4)。这与由在孔电场中作用于有电荷的多肽尾部的电场力在孔通道顶部保持固定的Smt3结构一致。在存在ClpX和ATP的情况中，此初始电流状态经常继之以进行性向下电流斜坡，达到平均值约10pA，中值持续时间是4.3 秒(图2A,iii和图5)。用蛋白S1观察到此电流斜坡(current ramp)，在ClpX和ATP 存在时在约5.5小时的实验里总共45次；比较而言，在ClpX和ATP从反式溶液中缺乏时在约2.3小时的实验里在状态ii后从来没有观察到斜坡。在大多数的事件中，ClpX依赖性陡变状态以突然的离子电流降低至约3pA结束(图2A, iv)。状态iv的中值持续时间是约700ms(图3A)，之后其以快速升高到开放通道电流结束(图2A,v)。
基于这些数据，我们假设ClpX充当分子装置，其使用从ATP水解衍生的化学能量将S1蛋白拉过纳米孔。在带电荷的氨基酸进入孔电场时，此过程通过电学力间歇性辅助。
图2B显示了ClpX介导的S1移位的工作模型。草图i-v对应于小图a中的离子电流状态i-v。图2B中图解此过程中提出的步骤：i)开放通道；ii)孔对蛋白 S1的捕捉，所述孔具有位于通道上的Stm3区段，细长的带电荷的多肽尾部区段延伸到孔腔中，和反式区室中的ssrA标签。在此离子电流状态中，ClpX不结合S1或，备选地已经结合但是仍然远离孔；iii)ClpX沿着S1链向AHL孔的反侧孔板行进，直至它产生接触。离子电流由于ClpX接近孔而下降；iv)在由ClpX和孔电场施加的组合力下，孔顶部的Stm3结构受到序贯变性，如此容许多肽相对于纳米孔进行。在此状态中，离子电流由于较大的氨基酸(或Smt3 二级结构)已经进入孔腔而下降。此离子电流状态一直持续到S1蛋白被完全拉入反式区室中，导致回到开放通道电流v。
实施例4：检测蛋白S2-35和S2-148的移位
此模型进行可测试的预测。若观察到的电流状态是由于部分由ClpX驱动的将多肽区段进行性运动到孔腔中所致，则改变蛋白质一级结构应当导致 ClpX/ATP依赖性的离子电流样式的序贯变化。具体地，第二Smt3域的添加应当导致第二陡变状态(图2A，iii)，接着是以3pA为中心的第二状态(图2A, iv)。作为一项测试，我们将富含甘氨酸/丝氨酸的35个氨基酸的柔性接头与 S1蛋白的N端融合并将这用第二Smt3域(蛋白S2-35，图1C,ii和序列表，S2-35) 加帽。因此，将S1(C-端>带电荷的柔性尾部>Smt3>N-端)的单一折叠组分序列在S2-35(C-端>带电荷的柔性尾部>Smt3>柔性接头>Smt3>N-端)中重复两次。
在蛋白S2-35在反式区室中存在ClpX/ATP的情况下在纳米孔中被捕获时，观察到具有8个可再现状态的离子电流样式(图2C)。
图2C显示了蛋白S2-35移位期间的离子电流迹线。没有显示开放通道电流(状态i)。状态ii–iv与小图a中的状态ii-iv相同。(v)离子电流逐渐增加到约10 pA。在我们的工作模型中，这对应于从Smt3域移位过渡到接头区移位。vi)第二推定陡变状态，其紧密类似于陡变状态iii。vii)第二推定Smt3移位状态，具有紧密类似于状态iv的离子电流特性。viii)返回到开放通道电流。前4种状态(图2C,i-iv)与由S1移位引起的状态i-iv相同(比较图2A和2C)。此相似性包括ClpX接合诊断性的陡变状态iii，和Smt3依赖性状态iv。然而，在状态v开始，S2-35样式与S1样式分歧(比较图2A和图2C)。也就是说，在Smt3状态iv 后，典型的S2-35离子电流迹线没有进行到开放通道电流，而是取而代之，转变到约6pA状态，中值持续时间为1.5秒(图2C,v和图3B)。这继之以紧密类似于陡变状态iii的约8.5pA状态(图2C,vi)，及随后的离子电流状态，其紧密类似于推定的Smt3移位状态iv(图2C,vii)。换言之，与我们的模型一致，在S 事件期间观察到一次(图2A)的推定ClpX结合的且Smt3依赖性的状态在S2-35 事件期间观察到两次(图2C)。两种构建体的这些类似的状态共享几乎相同的振幅，RMS噪音数值，和持续时间(图3A，图5，和图6)。
离子电流对蛋白质结构的此依赖性与ClpX驱动的蛋白质移位通过纳米孔一致。作为一项额外的测试，我们再检查S2-35移位过程中观察到的离子电流状态v。基于两个如下的观察，此状态与35个氨基酸的接头移动通过纳米孔一致：1)其平均离子电流可测量地高于周围状态(图2C)，如对具有少许的大体积侧链的氨基酸序列预期的；和2)在时间域中，离子电流状态v在Smt3 依赖性离子电流状态iv和vi之间发生，如预期的，鉴于其沿着S2-35一级序列的位置(图1C，ii及相关序列)。
若状态v对应于ClpX控制下多肽接头的移位，则此接头的长度和组成的变化应当导致持续时间和电流振幅变化。对于此测试，我们设计第三种蛋白质，其中S2-35接头区附加有额外的113个氨基酸，产生最终的构建体，其由以延长的148个氨基酸柔性接头分开的两个Smt3域组成(蛋白S2-148，图1C， iii，和序列S2-148)。
图2D显示了蛋白S2-148移位期间的离子电流迹线。离子电流状态i-v和 vi-viii与S2-35移位的那些状态(小图c)几乎相同。(v)在我们的工作模型中，此离子电流状态对应于148个氨基酸的接头的移位。其振幅比S2-35接头振幅(约 9pA)高约3pA，并且它具有比相当的S2-35状态v长约2.5倍的中值持续时间。在存在ClpX和ATP时，包括陡变状态iii的移位事件对蛋白S2-35观察到62次 (7.3小时的实验)，及对蛋白S2-148观察到66次(4.3小时实验)。在缺乏ClpX/ATP的情况中，这些陡变状态对S2-35从未观察到(1.7小时的实验)，对S2-148也没有观察到(1.2小时的实验)。
图3A显示了状态iv(推定的Smt3移位状态)。这些事件仅仅包括那些表现 ClpX依赖性陡变状态iii的。S1n＝45,S2-35n＝60,S2-148n＝65。图3B显示了对S2-35和S2-148蛋白比较接头区状态v停留时间。这些直方图中包括的事件表现陡变状态iii。S2-35n＝50,S2-148n＝50。图3C显示了S2-148移位事件的状态v移位停留时间。黑色柱形代表包括陡变状态iii(ClpX驱动)的事件的停留时间。灰色柱形代表不包括陡变状态(非ClpX驱动)的事件。在陡变的情况下n＝50，在没有陡变的情况下n＝20。
如预测的，在存在ClpX/ATP的情况中在标准条件下在纳米孔中捕获此蛋白质时，观察到与S2-35事件类似的8个可再现状态(图2d，图3A，图5,6和7)。
然而，重要的是，S2-35和S2-148事件在状态v方面显著不同(比较图2C 和2D )。也就是说，S2-148状态v比S2-35具有更高的均值剩余电流(mean residual current)(分别为约9对约6pA)，及比S2-35状态v具有高约2.5倍的中值持续时间(图3B)。预期S2-148状态v相对于S2-35的持续时间增加，因为它应当更长采取ClpX加工额外的氨基酸，而升高的电流水平可能是由于两种蛋白质间的接头氨基酸组成的差异(S2-35接头：51％Gly,34％Ser,15％其它； S2-148接头；34％Gly,32％Ser,19％Ala,15％其它)。然而，我们不能排除蛋白质的Smt3域与纳米孔孔板的相对接近性，其必然一定由于接头长度而不同。
我们注意到在缺乏ClpX/ATP的情况下观察到所有三种模式蛋白的电压驱动的移位(图4)。然而，这些ClpX-负移位事件缺乏图2中显示的诊断性陡变状态，并且它们比ClpX介导的移位事件在持续时间上是显著更长的且更可变的(图3C，图8，和图9)。这与依赖于捕获蛋白质分子的随机结构波动和作用于具有可变电荷密度的聚合物的间歇电学力的未调节移位过程一致。这与由 ClpX发动机赋予的相对恒定ATP水解率和机械力形成对比。
序列表：
SEQ ID NO 1:
GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSDGDSDGSDGDGDSDGDDAANDENYALAA
SEQ ID NO 2:
GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG
SEQ ID NO 3:
GGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGS
GASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGS
SEQ ID NO 4(S1):MGSSHHHHHHGSG←亲和力纯化标签区
LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHR EQIGG←Smt3域
GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSD GDSDGSDGDGDSDGDD←带电荷的尾部
AANDENYALAA←ssrA标签
SEQ ID NO 5(S2-35):
MGHHHHHHGS←亲和力纯化标签区
LQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGSGSGGSGSGGSG←Smt3域
MGSSHHHHHHGSG←亲和力纯化标签区
LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHR EQIGG←Smt3域
GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSD GDSDGSDGDGDSDGDD←带电荷的尾部
AANDENYALAA←ssrA标签
SEQ ID NO 6(S2-148):
MGHHHHHHGS←亲和力纯化标签区
LQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG← Smt3域
GGSGSGGSGSGGSGSQNEYRSGGGGSGSAGSGASGSSGSEGSGASGSAGSGSAGSRGSGASGSAGSGSAGSGGAEAAKEAAKEAAKEAAKEAAKAGGSGSAGSAGSASSGSDGSGASGSAGSGSAGSKGSGASGSAGSGSSGSSGGS G←接头区
MGSSHHHHHHGSG←亲和力纯化标签区
LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHR EQIGG←Smt3域
GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSD GDSDGSDGDGDSDGDD←带电荷的尾部
AANDENYALAA←ssrA标签
SEQ ID NO:7(S1-RQA):
MGSSHHHHHHGSG←亲和力纯化标签区
LVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHR EQIGG←Smt3域
GGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGSGSSGDGGSSGGSGGDGSSGDGGSD GDSDGSDGDGDSDGDD←带电荷的尾部
AANDENYALAA←ssrA标签
RQA←添加以隐藏ssrA标签的额外残基
结论
上述具体描述意图例示并阐明本发明，而不应看作限制本发明的范围，其以所附权利要求书的文字和等同范围限定。本说明书中提及的任何专利或出版物意图传达可用于本发明的某些方面的方法和材料的详情，其不能明确列出但会是本领域技术人员理解的。此类专利或出版物在此通过提及并入，其程度就像每篇通过提及明确且个别并入并纳入本文中一样，如描述和实现提及的方法或材料的目的需要的。

Claims (22)

1.用于将蛋白质移位通过纳米孔的装置，其包含：
(a)其中具有纳米孔的膜，所述膜将室分成顺侧(cis side)和反侧(trans side)，其中要将所述蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；
(b)在所述室的至少一侧的蛋白质移位酶，其结合所述蛋白质并将所述蛋白质以序贯方式移位通过所述移位酶和通过所述纳米孔，其中所述蛋白质移位酶是作用于蛋白质底物并且使其以行进性方式相对于所述酶移动作为酶促活性功能的酶，酶复合物，或酶复合物的一部分；和
(c)电路，用于提供所述膜的顺侧和反侧之间的电压及用于基于移位时间段期间流过所述纳米孔的离子电流测量信号，其中所述电路检测所述信号的变化，该变化反映所述蛋白质在其被移位时的特征。
2.权利要求1的装置，其中所述纳米孔以孔蛋白限定。
3.权利要求2的装置，其中所述孔蛋白是α-溶血素。
4.权利要求2的装置，其中所述孔蛋白不特异性结合所述蛋白质。
5.权利要求1的装置，其中所述蛋白质移位酶是NTP驱动的解折叠酶。
6.权利要求5的装置，其中所述NTP驱动的解折叠酶是AAA+酶。
7.权利要求6的装置，其中所述AAA+酶是ClpX。
8.权利要求1的装置，其中所述电路包含(i)将正电压应用于所述反侧的放大器和/或(ii)用于感测在100mHz发生的离子电流的变化的传感器。
9.用于将蛋白质移位通过纳米孔的系统，其包含：
(a)将流体室分成顺侧和反侧的膜中的纳米孔，其中将要移位的蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；
(b)所述流体室，其在所述顺侧含有(i)包含NTP的离子缓冲液和(ii)要移位的蛋白质；
(c)电路，用于在移位时间段期间提供所述顺侧和所述反侧之间的电压及测量流过所述纳米孔的离子电流，其中所述电路检测所述信号的变化，该变化反映所述蛋白质在其被移位时的特征；和
(d)所述室中的蛋白质移位酶，其安排为使得它将所述蛋白质以序贯方式移位通过所述移位酶和通过所述纳米孔，
其中所述蛋白质移位酶是作用于蛋白质底物并且使其以行进性方式相对于所述酶移动作为酶促活性功能的酶，酶复合物，或酶复合物的一部分。
10.权利要求9的系统，其中所述纳米孔以多聚体孔蛋白限定，并且所述移位酶是NTP驱动的解折叠酶。
11.权利要求9的系统，其中所述蛋白质包含外源序列，该外源序列包含所述蛋白质移位酶的靶向域。
12.权利要求9的系统，其中所述蛋白质移位酶是ClpX，并且所述纳米孔以α-溶血素限定。
13.用于将蛋白质移位通过纳米孔的方法，其包括下列步骤：
(a)提供装置，该装置包含将流体室分成顺侧和反侧的膜中的纳米孔；
(b)对所述流体室添加含有NTP的缓冲液和NTP驱动的移位酶；
(c)将要移位的蛋白质添加至所述顺侧；并
(d)容许所述蛋白质通过NTP驱动的移位酶以序贯方式移位通过所述NTP驱动的移位酶和通过所述纳米孔，
其中所述蛋白质移位酶是以作用于蛋白质底物并且使其以行进性方式相对于所述酶移动作为酶促活性功能的酶，酶复合物，或酶复合物的一部分。
14.用于将蛋白质移位通过纳米孔的方法，其包括下列步骤：
(a)提供用于将蛋白质移位通过纳米孔的装置，其包含：
(i)将流体室分成顺侧和反侧的膜中的纳米孔，其中将要移位的蛋白质添加到所述顺侧，并移位通过所述纳米孔到所述反侧；和
(ii)电路，用于提供所述顺侧和所述反侧之间的电压及测量流过所述纳米孔的离子电流；
(b)对所述流体室添加含有NTP的缓冲液和NTP驱动的移位酶；
(c)将要移位的蛋白质添加至所述顺侧；
(d)容许所述蛋白质接触所述NTP驱动的移位酶；
(e)容许所述蛋白质通过NTP驱动的移位酶以序贯方式移位通过所述NTP驱动的移位酶和通过所述纳米孔；和
(f)测量由蛋白质移位通过所述纳米孔引起的离子电流变化，
其中所述蛋白质移位酶是作用于蛋白质底物并且使其以行进性方式相对于所述酶移动作为酶促活性功能的酶，酶复合物，或酶复合物的一部分。
15.权利要求14的方法，其中测量电流变化的步骤包括对(i)开放通道，(ii)所述纳米孔对蛋白质的捕获，和(iii)来自(ii)的蛋白质通过所述纳米孔的状态测量电流变化。
16.权利要求15的方法，其中所述测量包括检测状态(i)，(ii)和(iii)之间的差异。
17.权利要求15的方法，其中所述测量包括测量由通过所述纳米孔的所述蛋白质的氨基酸结构引起的状态(iii)期间的差异和/或进一步包括如下步骤：测量所述NTP驱动的移位酶结合所述蛋白质并使所述NTP驱动的移位酶向所述纳米孔移位的状态，其作为状态(ii)和(iii)之间的状态发生。
18.权利要求14的方法，其中所述纳米孔以孔蛋白限定。
19.权利要求18的方法，其中所述孔蛋白是α-溶血素。
20.权利要求18的方法，其中将所述NTP驱动的移位酶附着于所述孔蛋白。
21.权利要求19或20的方法，其中所述NTP驱动的移位酶是AAA+酶。
22.权利要求21的方法，其中所述AAA+酶是ClpX。
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