JP6965874B2 - 細胞培養方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞培養容器、細胞培養システム、細胞培養キット及び細胞培養方法に関する。
従来、細胞を選別して特定の細胞を培養し、該培養細胞にダメージを与えることなく簡便に回収する方法が求められていた。
例えば、引用文献１には、光照射により物性が変化する光応答性材料を足場依存性細胞の接着表面として用いた細胞培養キュベットが開示されている。引用文献１によれば、該細胞培養キュベットを用いて細胞を培養すると、培養中に他の細胞が混入したとき、逐次混入細胞が存在する位置に光照射して、混入細胞を剥離除去することができるとしている。そして、特定細胞のみを細胞接着表面上に残して培養し、該特定細胞の培養後、細胞接着表面に光照射することにより培養細胞を回収する。
また、特許文献２には、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を成膜した物を用いた細胞の解析分別方法が開示されている。特許文献２によれば、該基材は、光解離反応により細胞接着性から非接着性へと非可逆的に変化できるので、細胞と該基材との接着選択性に優れ、細胞の純度、回収率等を高めることができるとしている。
一方、従来から、目的細胞に遺伝子を導入後、培養する手法が広く行われている。このような細胞加工を一連で行うことができる装置も既に開発されており、例えば、MACS Prodigy（登録商標）（Miltenyl Biotec社）が市販されている。
特許第３９７５２６６号公報 国際公開第２０１１／０５８７２１号パンフレット
しかし、引用文献１や引用文献２では、細胞接着性／非接着性基材を光制御して、細胞選別、培養、回収が可能な手法が提案されているが、細胞加工に関する手法については提案されていなかった。
また、引用文献１や引用文献２等の技術を用いた場合、培養中に細胞密度が高くなると、更に培養するには、小さい培養容器から大きな培養容器に培養細胞を移動しなければならない。そうすると、培養細胞を移動する手間が生じるとともに、移動によるストレスやダメージを細胞に与えるという問題があった。
更に、目的細胞に遺伝子を導入後培養する前記装置は複雑な構成になっており、細胞選別部、培養部等に分かれており、各部はチューブで繋がっている。よって、培養細胞はチューブ移動をすることになり、ストレスやダメージを受け、失われるという問題があった。
また更に、細胞を培養するときは、大きい空間で行うことが好ましいが、細胞の活性化や細胞に遺伝子を導入するときには、効率を考えると、小さい空間で、高濃度条件下で行うことが好ましいと考えられる。
また、セルソーターとしてフローサイト型がよく用いられ、フローサイト型ソーターでは光軸調整のためにビーズを流すことが行われる。しかし、臨床用途では、GMPグレードのビーズを準備する必要があり、更には、このビーズが最終産物に含まれないこと、又は含まれているも人体に影響が出ないことを示す必要があった。
更に、フローサイト型ソーターでは、その細胞を分取するかを決めるため、細胞試料を流してゲート調整する必要があり、その細胞は回収されずに廃棄されてしまうという問題もあった。
本技術では、前記課題を解決すべく、細胞の選別、培養、細胞加工等を１つの空間で行うことができ、その空間の容積を各工程に適した大きさに変えることができる細胞培養容器等を提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本技術は、培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器を提供する。
前記刺激分解性リンカーとして、光分解性リンカーを用いることができる。
また、前記第一の分子は、前記培養目的細胞１個と結合する大きさのスポットで前記細胞培養容器内にアレイ状に固定化されている。
また、前記第一の分子は、そのスポットによって異なる種類の培養目的細胞と結合できる。
更に、前記細胞培養容器はガス透過性にすることができる。
更にまた、前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から選択することができる。
また、本技術の細胞培養容器は、
前記培養目的細胞を含む液を投入する培養細胞投入部、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を供給する第二の分子供給部、
前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を供給する活性化剤供給部、
前記培養目的細胞に導入する遺伝子を供給する遺伝子供給部、
前記培養目的細胞の培養液を供給する培養液供給部、
不要物を洗浄する洗浄液を供給する洗浄液供給部、
前記不要物と洗浄液を貯留する廃液貯留部、及び
前記培養目的細胞の培養細胞を回収する培養細胞回収部
からなる群から選択される部と連結する連結部を有してもよい。
また、本技術は、培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器と、
前記刺激分解性リンカーに刺激を付与する刺激付与装置と、
を備える細胞培養システムを提供する。
前記刺激付与装置は、光源、励起フィルター、吸収フィルター及び撮像素子を備えることができる。
また、前記刺激付与装置は、前記第一の分子のスポットごとに前記刺激分解性リンカーを刺激することを制御する刺激制御部を備えてもよい。
更に、本技術は、培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器と、
前記培養目的細胞を含有する試料液、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を含有する試薬液、
前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を含有する活性化液、
前記培養目的細胞に導入する遺伝子を含有する遺伝子導入液、
前記培養目的細胞の培養液、及び
不要物を洗浄する洗浄液
からなる群から選択される液と、
を含む細胞培養キットを提供する。
更にまた、本技術は、培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され容積が可変である細胞培養容器に、培養目的細胞を含有する試料を投入する工程と、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を前記培養目的細胞に適用する工程と、
前記標識により前記培養目的細胞を選別し、前記培養目的細胞以外の細胞を除去する工程と、
前記培養目的細胞を培養する工程と、
を含む細胞培養方法を提供する。
前記細胞培養方法は、前記培養目的細胞を活性化する工程及び／又は前記培養目的細胞に遺伝子を導入する工程を更に含んでもよい。
更に、前記工程のうち少なくとも１つの工程において、前記細胞培養容器の容積を変化させることができる。
本技術によれば、細胞の選別、細胞培養、細胞加工等の一連の工程において、培養細胞に対するストレス、ダメージ等を低減できる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本技術に係る細胞培養システムの模式図である。 本技術に係る細胞培養容器の模式図である。 本技術に係る固定化された第一の分子の模式図である。 本技術に係る細胞培養容器の構成の一例を示す模式図である。 本技術に係る刺激付与装置の構成の一例を示す模式図である。 本技術に係る実施態様の工程を示すブロック図である。 本技術に係る実施態様の細胞培養容器内を示す模式図である。 本技術に係る細胞培養容器の容積の変化を示す模式図である。 本技術に係る細胞培養容器の動きを示す模式図である。 本技術に係る細胞培養容器の動きを示す模式図である。
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞培養システム
１−１．細胞培養容器
１−２．刺激付与装置
２．実施態様
３．細胞培養キット
＜１．細胞培養システム＞
本技術の細胞培養システムを図１に示す。
該細胞培養システム１０００は、細胞培養容器１００と刺激付与装置２００を備える。
細胞培養容器１００は、培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化されている。細胞培養容器１００はその容積が増加・減少するように可変である。
刺激付与装置２００は、前記刺激分解性リンカーに対応する刺激を付与する。例えば、刺激分解性リンカーが光分解性リンカーの場合、刺激付与装置２００は刺激分解性リンカーに光を照射する。
＜１−１．細胞培養容器＞
細胞培養容器１００の模式図を図２に示す。
細胞培養容器１００は、容器１０１に培養目的細胞が投入されると、その内部に固定化された第一の分子１０４で培養目的細胞を捕捉する。捕捉された培養目的細胞は、その容器１０１内で培養される。
細胞培養容器１００の容器１０１の内部には、例えばポリマー１０２と、刺激分解性リンカー１０３とを介して第一の分子１０４が固定化されている。ポリマー１０２は省いて刺激分解性リンカー１０３を直接固定化してもよい。固定化は、容器１０１の底面に限定されず内壁にされてもよいし、容器１０１内部に平面的、立体的内部構造を有している場合、その構造表面に固定化されてもよい。容器１０１の内部表面には、細胞が生存しやすい物質（例えば、collagen、fibroblastなど）がコーティングされていることが望ましい。
ポリマー１０２を用いる場合、ポリマーは細胞にストレスを与えず、無毒、生体適合性等があるものが好ましい。例えばポリエチレングリコール（PEG）、2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholineポリマー（MPCポリマー）が挙げられる。
ポリマー１０２を用いた場合、容器１０１との結合の反対側の端に、刺激分解性リンカー１０３が結合する。刺激分解性リンカーは、特定の外部からの刺激で分解する接続分子である。例えば、特定の波長の光で分解されるリンカー、酵素で分解されるリンカー、温度で分解されるリンカー等がある。
前記刺激分解性リンカーは特に限定されないが、シングルセル（単一細胞）ごとの制御が可能な点および分解時間が短い点から、光分解性リンカーを用いることが好ましい。
光分解性リンカーは、特定の波長によって分解される構造を持つ分子である。
例えば、以下のものを挙げることができる：メトキシノトロベンジル基、ニトロベンジル基（特開2010-260831号公報）、パラヒドロキシフェナシル基（テトラヘドロンレターズ、1962年、1巻、1頁）、7-ニトロインドリン基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1976年、98巻、843頁）、2-(2-ニトロフェニル)エチル基（テトラヘドロン、1997年、53巻、4247頁）及び（クマリン-4-イル）メチル基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1984年、106巻、6860頁）等。
また、本技術に用いられ得る光分解性リンカーの構造式を以下の表１に示す。
Figure 0006965874
光分解性リンカーが分解される波長は、その分子の吸収波長とほぼ一致する。
例えば、光分解性リンカーに用いられるメトキシノトロベンジル基の場合、346nmでの吸収を1とすると、364nmでは0.89、406nmでは0.15、487nmでは0.007の吸収を示す。すなわち、365nmの光源を用いれば、光分解性リンカーの分解効率がよく、488nmの光源ではほぼ分解されないという性質を有する。
このように、光分解性リンカーに照射する光の波長は、各光分解性リンカーに対応する波長であればよい。例えば330〜450nm付近の波長である。また、細胞にダメージを与えない、例えば、30mW/cm^2,100sec.→3J/cm^2で照射することが好ましい。特に300nm以下の波長は、細胞にダメージを与える可能性があるので使用しないことが好ましい。
UVによる細胞毒性に関しては、細胞の種類にもよるが、500J/cm^2でDNAにダメージが生じて細胞成長を阻害すると言われている（Callegari, A. J. & Kelly, T. J. Shedding light on the DNA damage checkpoint. Cell Cycle 6, 660-6 (2007)）。また、42J/cm^2では細胞毒性が生じない、という報告もある（Masato T, et al, Optical cell separation from three-dimensional environment in photodegradable hydrogels for pure culture techniques, Scientific Reports 4, Article number. 4793(2014)）。
本技術に係る前記第一の分子１０４は、細胞と結合可能な部位を有する。細胞と結合可能な部位として、例えば、オレイル基、抗体、アプタマー、分子認識ポリマー等を用いることができる。
オレイル基は、疎水性であり、浮遊する細胞表面と接着する。オレイル基に、例えばPEG等のスペーサーを付与し、その末端にNHS基（N-ヒドロキシスクシンイミド基）を含めて、第一の分子としてもよい。
抗体は、培養目的細胞に存在する細胞表面分子抗原と結合する。例えば、各種ガン特異的抗原に対する抗体、主要組織適合抗原に対する抗体、糖鎖に対する抗体等が挙げられる。
アプタマーは、培養目的細胞が有する分子と特異的に結合する核酸分子やペプチドである。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、ペプチドアプタマー、核酸骨格や塩基に修飾を導入して特異性を向上させた修飾アプタマー等が挙げられる。
分子認識ポリマーは、培養目的細胞の細胞表面分子に似た物理化学特性を持つ化合物の存在下でも、高い選択性で目的の細胞表面分子を捕捉する。モレキュラーインプリントポリマーとも呼ばれ、選択的に合成された化合物認識領域を有する。
前記第一の分子１０４が、容器１０１内に固定化された例を図３に示す。容器１０１の底面にポリマー１０２と刺激分解性リンカー１０３を介して第一の分子１０４が固定化されている。図３では、第一の分子１０４は刺激分解性リンカー１０３と直接結合しているが、ポリマーを介してもよい。
上記構成を採用することにより、第一の分子１０４と容器１０１に投入された細胞とが接近、接触すると、第一の分子１０４は細胞を捕捉することができる。
第一の分子１０４は、培養目的細胞１個と結合する大きさのスポットで容器１０１内にアレイ状に固定化されていることが好ましい。１スポットにつき細胞１個が捕捉されるので、全てのスポットに第一の分子１０４と結合可能な分子（抗体、糖鎖など）を有する細胞をシングルセルレベルで選別することができる。
アレイ状にスポットする手法としては、マイクロコンタクトプリント法やスポット法、あるいは前記光分解性リンカーの特徴を利用して全面配置した後に不要な部分を分解する手法等がある。細胞が捕捉されないようにしたい部分には、上記PEGや上記MPCポリマーを容器１０１の内部をコーティング又は結合させ、細胞の非特異的吸着を抑制するように処理することが好ましい。そして、前記光分解性ポリマーに光を照射して不要な細胞を遊離後、遊離したスポットに細胞が非特異的吸着しないように、PEGやMPCポリマーが残るようにすることが好ましい。
なお、スポットする第一の分子は、このように一の種類の細胞のみ特異的に捕捉するよう、１種類としてもよい。
あるいは、スポットごとになる特異性の異なる第一の分子を固定化し、スポットごとに異なる細胞を捕捉するようにしてもよい。
また、容器１０１内を区画分けし、それぞれの区画ごとに特異性の異なる第一の分子をスポットすれば、同一の容器で区画ごとに異なる細胞を捕捉することができる。
もしくは、あらゆる種類の細胞を捕捉する第一の分子を固定化しておき、後述する標識された第二の分子で細胞の選別を行ってもよい。複数種の標識された第二の分子を利用するとマルチカラー解析が可能となる。
前記容器１０１は、その容積が変化する。容器１０１は、可変部が柔軟性のある材質で形成されることが好ましく、上下及び／又は左右に伸縮できることが好ましい。容積の変化は、容器１０１に備える連結部１０５から入れる液の量、空気の量等を調節することにより行うことができる。
容器１０１に培養目的細胞を含む試料を投入後、培養目的細胞を第一の分子１０４に効率よく捕捉させるためには、容器１０１の容積を小さくすることが好ましい。容積が小さいと、培養目的細胞と第一の分子１０４との接触確率が高くなるからである。
また、第一の分子１０４に捕捉された培養目的細胞を培養後、細胞密度が高くなったら、容器１０１の容積を大きくすることが好ましい。容積を大きくすれば、細胞培養スペースを大きくして、更に培養液を追加できるからである。
なお、細胞培養において、酸素の供給、二酸化炭素の排出が求められ、細胞培養に適した環境（最適CO2濃度、最適温度等）にするため、容器１０１はガス透過性を有することが好ましい。特に、細胞が増殖する面は、例えば多孔質膜、酸素透過性膜で形成されることが好ましい。
容器１０１は、上記培養目的細胞を含む試料や上記培養液が入った容器と連結部１０５により連結してもよい。
例えば図４に示すように、培養細胞投入部１０６、第二の分子供給部１０７、活性化剤供給部１０８、遺伝子供給部１０９、培養液供給部１１０、洗浄液供給部１１１及び廃液貯留部１１２、培養細胞回収部のうちいずれか１つあるいは複数を、容器１０１と連結することができる。
これら全体を細胞培養に好適な条件下に設置してもよいし、容器１０１のみを細胞培養に好適な条件下に設置してもよい。
培養細胞投入部１０６は、培養目的細胞を含む試料液を保持しており、容器１０１に試料液を投入する。培養目的細胞の種類は特に限定されず、ヒト由来細胞、動物由来細胞、植物由来細胞、微生物由来細胞、ガン細胞、正常細胞、幹細胞、上皮細胞等のいずれでもよい。
第二の分子供給部１０７は、その中に第二の分子を保持しており、容器１０１に第二の分子を投入する。複数の第二の分子が必要な場合は、その分だけ、第二の分子供給部１０７を増やすこともできる。
第二の分子は、培養目的細胞と結合可能な分子であって、蛍光物質等で標識されている。第一の分子と第二の分子とで培養目的細胞のサンドイッチ構造を形成させ、標識で認識することができる。
前記培養目的細胞と結合可能な分子は、第一の分子と同様、例えば、オレイル基、抗体、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から細胞と結合可能な部位として選択することができる。第二の分子は、第一の分子に捕捉された細胞のうち、所望の細胞のみに特異的に結合させることができる。
第二の分子の標識は、例えば１種類の蛍光物質を用いて１種類の培養目的細胞を認識しもよいし、複数の蛍光物質を用いて、複数の種類の培養目的細胞を認識する、いわゆるマルチカラー分析のような手法を用いてもよい。
第二の分子が認識できなかった細胞は、該細胞が捕捉されているスポットの刺激分解性リンカーに刺激を付与し、刺激によりリンカーが切断され、細胞が遊離する。遊離細胞は不要物として、洗浄液で容器１０１から洗い流すことができる。
洗浄液供給部１１１は、前記洗浄液を保持する。容器１０１における不要物等を洗浄するときに洗浄液を供給する。
洗浄液は、細胞培養等に一般的に用いられるものでよく、特に限定されない。例えば、生理食塩水、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、精製水等が挙げられる。
活性化剤供給部１０８は、細胞を活性化させる活性化液を保持する。活性化剤は培養目的細胞に合わせて選択でき、特に限定されないが、例えば、各種サイトカイン、抗体等が挙げられる。培養目的細胞を培養する前に細胞を活性化することができる。
遺伝子供給部１０９は、培養目的細胞に導入したい遺伝子を保持する。遺伝子は、内在性遺伝子、外来遺伝子のいずれでもよく、遺伝子導入に適したファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター等に組み込まれていてもよい。例えば、目的遺伝子を組み込んだウイルスベクターを容器１０１に投入し、培養目的細胞に感染させて遺伝子導入することができる。
培養液供給部１１０は、培養目的細胞に適した培養液を保持し、容器１０１に供給する。培養液は培養目的細胞に適したものを選択でき、例えば、イーグル培地、D-MEM培地、E-MEM培地、RPMI-1640培地、ダルベッコPBS培地等を用いることができる。
なお、培養液をフェノールレッド等で着色しておけば、容器１０１で培養目的細胞を培養中、培養液のpH至適範囲（例えばpH6.8〜7.2）を管理することができる。
廃液貯留部１１２は、前記不要物を含む廃液、培養液等をいったん受け入れる。廃液は必要に応じて滅菌処理等を行い、廃棄する。
培養細胞回収部１１３は、容器１０１で培養した細胞を回収し、保持する。回収方法は特に限定されないが、吸引や押出し、培養細胞回収部１１３を容器１０１の下方に配置すること等により可能である。
連結部１０５は、容器１０１と上記各部１０６〜１１３のいずれか又は複数の部とをつなぎ、液が流れる。連結部１０５には、例えばチューブが用いられる。送液手法としては、接液しないペリスタポンプが好ましい。
＜１−２．刺激付与装置＞
本技術に係る刺激付与装置の一例を図５に示す。該刺激付与装置例は、前記刺激分解性リンカーが光分解性リンカーの場合である。
刺激付与装置２００は、光源２０１、集束レンズ２０２、励起フィルター２０３、デジタルミラーデバイス２０４、映写レンズ２０５、吸収フィルター２０６、マクロレンズ２０７及び撮像素子２０８を備える。
前記構成を有することにより、不要細胞の分析、選択、遊離を行うことができる。
光源２０１は、前記光分解性リンカーに対応する波長の光を発する。集束レンズ２０２は該光を集束し、励起フィルター２０３は特定の波長の光のみを抽出し、透過させる。
デジタルミラーデバイス２０４は、可動式のマイクロミラーで構成され、各マイクロミラーを傾斜させることにより、前記第一分子が固定化されたスポットごとに選択的に光照射することができる。
映写レンズ２０５は、デジタルミラーデバイス２０４で反射した光を、前記第一分子が固定化されたスポットがある容器１０１の面に向けて光を照射する。
前記刺激付与装置による選択的な光照射により、遊離させたい細胞が捕捉されているスポットの刺激分解性リンカーを選択的に分解することができる。
容器１０１の面に向けて照射された光は、更に、特定の波長の光を吸収する吸収フィルター２０６やマクロレンズ２０７等を通し、撮像素子２０８は、その光を受けて撮像する。撮像データは、例えば、前記第一の分子と結合した細胞のうちの遊離したい細胞が、所望どおりに遊離したか、培養目的細胞が第一の分子との結合を維持しているか等の確認に用いることができる。
前記刺激付与装置は、前記第一のスポットごとに刺激分解性リンカーを刺激することを可能とする刺激制御部を備えることができる。
前記刺激付与装置が光照射装置の場合、例えば、数十μmオーダーの間隔で容器１０１に配置された細胞に、個々に照射できればよいので、例えば、Digital Micromirror Device（DMD）や液晶パネル、MEMSシャッター等が利用できる。光源２０１とDMD２０４の間に励起フィルター２０３を、励起／蛍光対象と撮像素子２０８の間に吸収フィルター２０６を配置し、目的に応じて最適なフィルター構成となるように、フィルターが回転するなどの機構を入れることで多色解析に対応可能である。フルHD数のマイクロミラーを備えたDMDが市販されているので、これを用いた光照射装置の刺激制御部は、1920×1080個のサイトを同時に制御（照射のON/OFF）できる。従って、約2×106個の細胞への個別制御が同時に可能になる。例えば、1920×1080で30μmピッチで細胞（Φ30um以下）を整列させた場合、約58×33mmの面積が必要となる。107個の細胞を処理したい場合は、これを10面用意する。2列に5面並べた場合、116×165mmであり、これはB6サイズよりも一回り小さいサイズであり、2×107個の細胞解析にも実現可能なサイズである。
更に、本技術に係る刺激付与装置は、第二の分子の標識の検出に用いることができる。例えば、光源２０１から第二の分子の標識に用いた蛍光物質に対応する波長の光を容器１０１に照射し、その画像を撮像して、どのスポットに細胞が捕捉されているかを分析することができる。また、複数の蛍光物質を用いれば、どのスポットにどのような細胞が捕捉されているかをマルチカラー分析することができる。
以上に述べたように、本技術に係る細胞培養システムによれば、同一空間で細胞を解析し、選別し、加工し、培養、品質管理をすることができる。
＜２．実施態様＞
以下、実施態様の一例を説明するが、本技術は当該実施態様に限定されるものではない。
以下、図６の本実施態様の各工程を示すブロック図、図７の本実施態様の細胞培養容器内の模式図、図８の細胞培養容器の容積の変化を示す模式図、及び図９と図１０の細胞培養容器の動きを示す模式図を参照して説明する。
容器１０１の二次元面である底面に、ポリマー１０２及び刺激分解性リンカー１０３である光分解性リンカーを介して、第一の分子１０４である抗体が結合されている（図７の(a)）。
ここに、培養目的細胞含有試料を培養細胞投入部１０６から投入する（S1）。第一の分子１０４は特異的に細胞３０１を捕捉する（S2）。これが、最初の細胞選択となる。第一の分子１０４と結合しなかった細胞やその他の不要物は、洗浄液供給部１１１からの洗浄液で下流に流し、廃液貯留部１１２にて貯留する。
この段階で、細胞が捕捉されたかどうかについて、例えば顕微鏡等の明視野観察によって識別し、捕捉された細胞の数を調べてもよい（S3）。
次に、蛍光物質で標識された第二の分子４０１である抗体を、第二の分子供給部１０７から投入して、第一の分子１０４に捕捉された細胞３０１と特異的に結合させる（S4）。これにより、第一の分子１０４、細胞３０１及び第二の分子４０１でサンドイッチ構造が形成される（図７の(b)）。未結合の第二の分子は、洗浄して除去できる。次に、第二の分子４０１の蛍光標識の蛍光測定を行うことにより、捕捉された細胞３０１の識別を行う（S5）。
このとき、複数の第二の分子を用いて細胞を選別したい場合は、第一の分子１０４に捕捉された細胞３０１に対して、別々の蛍光で標識した複数の抗体を細胞に結合させて、蛍光を検出又は蛍光の強さを測定する。いわゆるマルチカラー分析が可能となる。蛍光測定において励起フィルター、蛍光フィルターを変えることにより、各種蛍光色に対応した検出又は測定ができる。
なお、前記第一の分子１０４と細胞とを結合させる工程及び前記第二の分子４０１と細胞とを結合させる工程は、図８の(a)に示すように、容器１０１の容積を小さくすると互いに接触する機会が増すため、効率的に結合する。
容器１０１の可変な空間の構成としては、ポートが底面近くに配置されているとし、培養以外の工程の際には、容器の上部を降下させてあり、培養時には上昇させて容積を拡大する方法が考えられる。その他の方法としては、例えば、容器をクランプして容積を小さくする方法、硬い上面を降下させて側面からの圧力で抑える方法、などが挙げられる。
ここで、容器１０１の容積を変化させるための構造の例を図９、図１０に示す。
図９は、容器１０１の側面に蛇腹構造を有する例を示す。図９の(a)に、容器１０１の上面から圧力をかけることによって、蛇腹が縮んで容積が小さくなった様子を示す。図９の(b)に、容器１０１の上面を引く力を付与することによって、蛇腹が伸びて容積が大きくなった様子を示す。
図１０は、容器１０１の上面を押し込み、側面からも押し込んで容積を変化させる例を示す。図１０の(a)に、容器１０１の上面と側面から押し込んで容積を小さくした様子を示す。図１０の(b)に、容器１０１の上面を引く力を付与することによって容積が大きくなった様子を示す。
なお、細胞培養以外の工程は、なるべく狭い空間で実施したほうが、反応効率が良く、試薬の無駄が無くなる。例えば、細胞の捕捉、細胞活性化、遺伝子導入のときは、高さを低くした空間とすることで狭い空間を作る。一方、細胞培養の際は、細胞が増えるスペースが必要となるので大きな空間が望ましい。細胞培養の段階で、それまでの小さな空間から大きな空間に移す拡大培養という方法もあるが、移動によるダメージやロスが生じる可能性がある。従って、本技術のように、同一空間で培養が実施できることが望ましい。
前記細胞３０１が第一の分子１０４と第二の分子４０１にサンドイッチされた後、蛍光識別を行い、培養目的細胞ではない（不要細胞）と判断された場合、該細胞が捕捉されているスポットの光分解性リンカーに、刺激付与装置２００を用いて光を照射し、リンカーを分解させ、細胞を遊離する（S6、図７の(c)）。
ここで使用する光分解性リンカーの選択としては、蛍光測定に使用する励起波長と重ならないことが好ましい。励起波長としては、405nm〜638nmがよく用いられるので、これ以外の波長が好ましい。また、細胞によっては短波長が細胞毒性や傷害を与える場合があるので、ターゲットとする細胞種によって、最適な光分解性リンカーを用いる必要がある。
また、上述したDMDを用いた光照射装置を用いれば、細胞の遊離時に使用するのみではなく、蛍光検出時にも使用できる。この利点としては、目的細胞のみに光照射ができるため、全体的なバックグラウンドノイズが低減される。その結果、S/Nが上がる。また、隣接するすべての細胞に励起するとクロストークが気になる場合は、分割して照射することにより回避することも可能となる。
前記光照射により光分解性リンカーを分解して不要細胞を遊離した後、不要細胞は容器１０１から洗浄、除去される。
培養目的細胞は、容器１０１の底面に残される。この細胞に対して適切な細胞加工を実施する（図７の(d)）。細胞加工の例として、前述のサイトカインや刺激を与える抗体等を活性化剤供給部１０８から供給し、細胞を活性化すること（S7）、また、遺伝子供給部１０９からウイルスベクター等を投入して遺伝子導入を行うこと等（S8）が挙げられる。
次に、培養目的細胞の培養を行う（S9、図７の(e)）。
容器１０１に、培養液供給部１１０から培養液を供給する。例えば、ヒトや動物細胞を培養するときは、CO2濃度5%、湿度90〜95%、温度37℃の条件下にすることが好ましい。
培養時の容器１０１は、図８の(b)に示すように、容積を大きくすることが好ましい。
細胞培養後は、細胞を別の容器、例えば、容器１０１と連結部１０５により連結された培養細胞回収部１１３に回収する（S10、図７の(f)）。この時、容器１０１の底面には細胞が捕捉されたままである。この細胞に対して、再度、蛍光標識抗体（標識された第二の分子）と結合させ、蛍光解析することで、品質管理ができる（S11）。
従って、本技術によれば、細胞選別、加工（活性化、遺伝子導入など）、培養、品質検査までが同一空間で実施可能である。
＜３．細胞培養キット＞
本技術に係る細胞培養キットは、前記容器１０１と、前記培養目的細胞含有試料、前記第二の分子を含有する試薬液、前記活性化剤を含有する活性化液、前記導入する遺伝子を含有する遺伝子導入液、前記培養液及び前記洗浄液のいずれか又は複数の液、あるいはすべての液とを含む。
これらの液は、例えばパックに封入すれば、ディスポーザブルで必要に応じパックごと交換することができ、輸送、保管しやすく、コンタミネーション等も防ぐことができる。
なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器。
〔２〕前記刺激分解性リンカーは光分解性リンカーである、〔１〕に記載の細胞培養容器。
〔３〕前記第一の分子は、前記培養目的細胞１個と結合する大きさのスポットで前記細胞培養容器内にアレイ状に固定化されている、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞培養容器。
〔４〕前記第一の分子は、そのスポットによって異なる種類の培養目的細胞と結合する、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の細胞培養容器。
〔５〕ガス透過性を有する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の細胞培養容器。
〔６〕前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から選択される、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の細胞培養容器。
〔７〕前記培養目的細胞を含む液を投入する培養細胞投入部、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を供給する第二の分子供給部、
前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を供給する活性化剤供給部、
前記培養目的細胞に導入する遺伝子を供給する遺伝子供給部、
前記培養目的細胞の培養液を供給する培養液供給部、
不要物を洗浄する洗浄液を供給する洗浄液供給部、
前記不要物と洗浄液を貯留する廃液貯留部、及び
前記培養目的細胞の培養細胞を回収する培養細胞回収部
からなる群から選択される部と連結する連結部を有する、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の細胞培養容器。
〔８〕培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器と、
前記刺激分解性リンカーに刺激を付与する刺激付与装置と、
を備える細胞培養システム。
〔９〕前記刺激付与装置は、光源、励起フィルター、吸収フィルター及び撮像素子を備える、〔８〕に記載の細胞培養システム。
〔１０〕前記刺激付与装置は、前記第一の分子のスポットごとに前記刺激分解性リンカーを刺激することを制御する刺激制御部を備える、〔８〕又は〔９〕に記載の細胞培養システム。
〔１１〕培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され、容積が可変である細胞培養容器と、
前記培養目的細胞を含有する試料液、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を含有する試薬液、
前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を含有する活性化液、
前記培養目的細胞に導入する遺伝子を含有する遺伝子導入液、
前記培養目的細胞の培養液、及び
不要物を洗浄する洗浄液
からなる群から選択される液と、
を含む細胞培養キット。
〔１２〕培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され容積が可変である細胞培養容器に、培養目的細胞を含有する試料を投入する工程と、
前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を前記培養目的細胞に適用する工程と、
前記標識により前記培養目的細胞を選別し、前記培養目的細胞以外の細胞を除去する工程と、
前記培養目的細胞を培養する工程と、
を含む細胞培養方法。
〔１３〕前記培養目的細胞を活性化する工程及び／又は
前記培養目的細胞に遺伝子を導入する工程
を含む、〔１２〕に記載の細胞培養方法。
〔１４〕前記工程のうち少なくとも１つの工程において、前記細胞培養容器の容積を変化させることを含む、〔１２〕又は〔１３〕に記載の細胞培養方法。
１００ 細胞培養容器
１０１ 容器
１０２ ポリマー
１０３ 刺激分解性リンカー
１０４ 第一の分子
１０５ 連結部
１０６ 培養細胞投入部
１０７ 第二の分子供給部
１０８ 活性化剤供給部
１０９ 遺伝子供給部
１１０ 培養液供給部
１１１ 洗浄液供給部
１１２ 廃液貯留部
１１３ 培養細胞回収部
２００ 刺激付与装置
２０１ 光源
２０２ 集束レンズ
２０３ 励起フィルター
２０４ デジタルミラーデバイス
２０５ 映写レンズ
２０６ 吸収フィルター
２０７ マクロレンズ
２０８ 撮像素子
３０１ 細胞
４０１ 第二の分子
１０００ 細胞培養システム

Claims (10)

  1. 培養目的細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化され容積が可変である細胞培養容器に、培養目的細胞を含有する試料を投入する工程と、
    前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を前記培養目的細胞に適用する工程と、
    前記標識により前記培養目的細胞を選別し、前記培養目的細胞以外の細胞を除去する工程と、
    前記培養目的細胞を培養する工程と、
    前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を供給する工程及び／又は前記培養目的細胞に遺伝子を導入する工程と、
    を含み、
    前記培養目的細胞を培養する工程における前記細胞培養容器は、前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を供給する工程及び／又は前記培養目的細胞に遺伝子を導入する工程における前記細胞培養容器よりも容積が大きくなるよう構成され、及び
    前記活性化剤は、各種サイトカイン及び／又は抗体である、
    細胞培養方法。
  2. 前記刺激分解性リンカーは、光分解性リンカーである、請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 前記第一の分子は、前記培養目的細胞１個と結合する大きさのスポットで前記細胞培養容器内にアレイ状に固定化されている、請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
  4. 前記第一の分子は、そのスポットによって異なる種類の培養目的細胞と結合する、請求項３に記載の細胞培養方法。
  5. 前記細胞培養容器は、ガス透過性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  6. 前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  7. 前記細胞培養容器は、
    前記培養目的細胞を含む液を投入する培養細胞投入部、
    前記培養目的細胞と結合可能な標識された第二の分子を供給する第二の分子供給部、
    前記培養目的細胞を活性化する活性化剤を供給する活性化剤供給部、
    前記培養目的細胞に導入する遺伝子を供給する遺伝子供給部、
    前記培養目的細胞の培養液を供給する培養液供給部、
    不要物を洗浄する洗浄液を供給する洗浄液供給部、
    前記不要物と洗浄液を貯留する廃液貯留部、及び
    前記培養目的細胞の培養細胞を回収する培養細胞回収部
    からなる群から選択される部と連結する連結部を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  8. 前記刺激分解性リンカーに刺激付与装置を用いて刺激を付与する工程、を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  9. 前記刺激付与装置は、光源、励起フィルター、吸収フィルター及び撮像素子、を備える、請求項８に記載の細胞培養方法。
  10. 前記刺激付与装置は、前記第一の分子のスポットごとに前記刺激分解性リンカーを刺激することを制御する刺激制御部、を備える、請求項８又は９に記載の細胞培養方法。
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