JP7435450B2 - 粒子確認方法、粒子捕捉用チップ、及び粒子分析システム - Google Patents
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Description
本技術に従う粒子確認方法は、粒子捕捉領域中のウェルに固定されたリンカーを介して粒子を捕捉する捕捉工程をさらに含みうる。
前記捕捉工程は、前記ウェルに捕捉された粒子を標識して前記粒子に識別情報を付与する標識工程を含んでもよい。
前記標識工程において、前記粒子を蛍光、色、電荷、磁荷、オリゴ核酸、又はペプチドにより標識して前記粒子に識別情報が付与されてもよい。
本技術の一つの実施態様に従い、前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有し、隣り合うウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識されてもよい。
本技術の他の実施態様に従い、前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有し、隣り合う行又は列中のウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識されてもよい。
前記関連付け工程は、前記粒子捕捉領域の画像を取得する画像取得工程を更に含んでよく、前記画像から蛍光、色、又は、粒子の大きさ若しくは形を識別情報として取得し、前記識別情報と前記位置情報とが関連付けられてもよい。
前記排出工程において、識別情報を有する複数の粒子が連続して排出されてよい。
前記確認工程において、前記複数の粒子の排出の順序が参照されてもよい。
前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、一時的に排出が停止されてもよい。
前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、目印となる粒子が排出されてもよい。
前記排出工程において、連続して排出される2以上の粒子が異なる識別情報を有しうる。
本技術の他の実施態様に従い、前記粒子捕捉領域が、複数の場に区分けされており、前記ウェルが、当該ウェルが配置された場を特定するための標識要素を含んでよい。
本技術の一つの実施態様に従い、前記排出工程は、前記ウェルに固定されたリンカーに対して光照射して前記リンカーを切断する光照射工程を更に含みうる。
本技術の一つの実施態様に従い、前記粒子確認方法が、前記排出工程においてウェルから排出された粒子を、流路を通過させる粒子移動工程をさらに含み、前記識別情報取得工程において、前記流路を通過する粒子又は前記流路を通過した粒子から前記識別情報が取得されうる。
本技術の一つの実施態様に従い、前記確認工程において、連続した所定数の粒子群に対し、前記排出工程で排出された粒子の識別情報の順序と、前記識別情報取得工程で取得された粒子の識別情報の順序が異なる時、当該粒子群を廃棄しうる。
本技術の一つの好ましい実施態様に従い、本技術の粒子確認方法は、粒子分取工程をさらに含みうる。
本技術の他の好ましい実施態様に従い、前記関連付け工程においてウェルに捕捉された粒子が、2以上の異なる識別情報を有していてよい。
本技術の他の好ましい実施態様に従い、本技術の粒子確認方法は、前記識別情報取得工程において、前記粒子の識別情報を核酸シークエンス処理により取得する核酸シークエンス工程を更に含みうる。
本技術の一つの実施態様に従い、前記標識要素がリンカーを介して各ウェルに固定されており、前記リンカーを介した前記標識要素の固定が解消可能であってよい。
本技術の一つの実施態様に従い、前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有しうる。
本技術の他の実施態様に従い、前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有しうる。
1.第1の実施形態(粒子確認方法)
(1)第1の実施形態の説明
(2)第1の実施形態の第1の例(本技術の粒子確認方法を行うことを含む粒子分取処理)
(2-1)捕捉工程
(2-2)関連付け工程
(2-3)排出工程
(2-4)粒子移動工程
(2-5)識別情報取得工程
(2-6)確認工程
(2-7)隣接ウェルが異なる識別情報を有する場合の粒子確認方法の例
(2-8)複数の粒子の分取
(3)第1の実施形態の第2の例(合成粒子を用いた粒子確認方法)
(3-1A)捕捉工程
(3-2A)関連付け工程
(3-3A)排出工程
(3-4A)粒子移動工程
(3-5A)識別情報取得工程
(3-6A)確認工程
(4)粒子の例
2.第2の実施形態(粒子捕捉用チップ)
(1)第2の実施形態の説明
(2)標識要素のウェルへの固定の例
(3)標識要素と粒子との結合様式の例
(4)標識要素の配置の例
(5)粒子捕捉用チップの第一の例
(6)粒子捕捉用チップの第二の例
3.第3の実施形態(粒子分析システム)
(1)第3の実施形態の説明
(2)第3の実施形態の例(粒子分析システム)
本技術の粒子確認方法により、ウェルに捕捉された粒子がウェル外へと移動された後に、意図された粒子が移動されたことを確認することができる。例えば、本技術の粒子確認方法によって、例えば目的粒子が分取されたかを確認することができる。そのため、本技術の粒子確認方法により、目的粒子が分取されたかを確認するために、カメラによる目的粒子の追跡は行われなくてよい。また、本技術の粒子確認方法により、ウェルに捕捉された粒子がウェル外へと移動された後に、移動前の粒子の位置を確認することもできる。これにより、粒子が分取されていたウェルを特定することができ、分取前の粒子と分取後の粒子とを関連付けることができる。
また、本技術の粒子確認方法によって、1つの目的粒子が分取されたかを確認するための時間及び/又は労力を低減することができる。当該時間及び/又は労力の低減は、複数の目的粒子を分取する局面において特に顕著である。そのため、本技術の粒子確認方法は、複数の目的粒子を連続して分取する局面に特に適している。
また、本技術の粒子確認方法により、ウェルに捕捉された粒子がウェル外へと移動された後に、移動前の粒子の位置を確認することもできる。当該確認は、例えば細胞成分と当該細胞成分を有する細胞の特徴との関連付けにも役立つ。例えば、ウェル内に粒子及び細胞と共存させ、そして、当該細胞を溶解して細胞由来核酸を当該粒子に結合させる。当該核酸を結合した粒子をウェルから排出して回収した後に、前記確認を行うことで、当該細胞由来核酸と当該細胞の特徴とを関連付けることができる。
本技術の粒子確認方法は、粒子捕捉領域中のウェルに捕捉された粒子が有する識別情報と前記ウェルの位置情報とを関連付ける関連付け工程を含み、当該関連付け工程の後に、前記粒子が前記ウェルから排出される。すなわち、当該関連付け工程は、当該ウェルに捕捉された粒子に対して行われ、その後、当該粒子が排出される。そのため、分取する粒子の選択のためにより多くの時間をかけることができ、さらには、より多様な情報に基づく粒子の選択及び分取が可能となる。
当該粒子捕捉領域は、例えば例えば以下「2.第2の実施形態(粒子捕捉用チップ)」において説明される粒子捕捉用チップに設けられている粒子捕捉領域であってよい。当該粒子捕捉用チップに関する説明、及び、当該チップが有する構成要素(例えば粒子捕捉領域及びウェル)に関する説明が、本実施形態においても当てはまる。
粒子捕捉用チャンバ100は、粒子108に対して重力が矢印107の方向に作用するように配置される。
これら4つの流路部にはそれぞれポンプ(図示せず)が接続されている。当該ポンプを駆動させることによって、これら4つの流路部を介して粒子捕捉用チャンバ100内に流体を供給することができ、又は、これら4つの流路部を介して粒子捕捉用チャンバ100内から流体を吸引することができる。これら4つのバルブ及び4つのポンプは、互いに独立に制御されうる。
捕捉工程の結果、2以上の粒子が捕捉されているウェルが存在していてもよい。2以上の粒子が捕捉されているウェルは、以下の関連付け工程において、分取対象から除外されうる。
例えば、ウェルに捕捉された細胞のそれぞれが異なる蛍光標識を有してよい。当該異なる蛍光標識を有することが、図3(b)においては、各細胞が異なる模様を有することによって表されている。
前記導入と同時に、例えば、第二の流体排出流路部114を介した吸引が行われてよい。第二の流体排出流路部114を介した吸引に加えて、第二の流体供給流路部112を介した吸引が行われてもよい。このような吸引により、より効率的に粒子108をウェル105に捕捉することができる。また、当該吸引によって、補足された粒子108がウェル105から出ることが抑制される。
標識要素によって粒子を標識することで、以下で述べる捕捉工程後の工程(例えば関連付け工程、識別情報取得工程、及び確認工程など)において利用される識別情報を粒子に付加することができる。識別情報の付加によって、以下で述べる捕捉工程後の工程をより簡便に実行することができる。
このように各ウェル内に蛍光色素を配置することで、隣り合うウェルが異なる標識要素を有する粒子捕捉領域が形成される。これにより、隣り合うウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される。
このように各ウェル内に2種の蛍光色素を配置することで、隣り合うウェルが異なる標識要素を有する粒子捕捉領域が形成される。これにより、隣り合うウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される。
機械的に前記関連付け工程が行われる場合、前記関連付け工程は、例えば関連付けを行うシステムにより行われてよい。当該システムは、例えば以下で説明する粒子分析システムでありうる。当該粒子分析システムは、例えば粒子捕捉用チャンバ、顕微鏡、撮像装置、及び粒子確認部を含みうる。当該粒子分析システムについては、以下「3.第3の実施形態(粒子分析システム)」において説明する。
ユーザにより前記関連付け工程が行われる場合、ユーザが、例えば顕微鏡観察下の一視野内において或る識別情報を有する粒子を選択し、そして、当該粒子の識別情報と当該粒子が捕捉されているウェルの位置情報とを関連付けうる。当該関連付けにおいて、当該識別情報及び当該位置情報が、ユーザにより記録又は記憶されうる。
位置情報は、座標系の位置情報であってよく、又は、非座標系の位置情報であってもよい。
座標系の位置情報は、例えば一次元又は二次元の座標系により表される位置情報であってよく、より特には直交座標系により表される位置情報であってよい。座標軸及び原点は当業者により又は粒子分析システムにより適宜設定されてよい。
非座標系の位置情報は、例えば顕微鏡観察下での1視野内における粒子が捕捉されているウェルの位置を特定するために利用可能な情報であればよい。例えば当該1視野内にウェルが複数の列及び行を形成している場合において、当該1視野内の左から又は右から何番目の列に当該ウェルがあり又は当該1視野内の上から又は下から何番目の行に当該ウェルがあるかが、非座標系の位置情報として用いられてよい。非座標系の位置情報は、相対的な位置情報であってもよい。相対的な位置情報は、例えば或る粒子が捕捉されているウェルの周囲のウェルに捕捉されている粒子の識別情報に基づく位置情報でありうる。例えば、或る識別情報を有する粒子を捕捉しているウェルが、当該或る識別情報と異なる識別情報を有する粒子又は当該或る識別情報を有さない粒子を捕捉しているウェルによって囲まれていることが、当該或る識別情報を有する粒子を捕捉しているウェルの位置情報として用いられてよい。代替的には、或る識別情報を有する粒子を捕捉しているウェルが、当該或る識別情報と異なる識別情報を有する粒子又は当該或る識別情報を有さない粒子を捕捉しているウェルの近くにあることが、当該或る識別情報を有する粒子を捕捉しているウェルの位置情報として用いられてよい。
ウェル105の位置情報が二次元直交座標系により表される場合、例えば(X、Y)=(6、4)の位置情報が取得されうる。さらに、細胞108の識別情報が取得され、例えば細胞108は緑の蛍光を有するという識別情報が取得されうる。当該位置情報及び識別情報が関連付けられ、(X、Y)=(6、4)の位置情報を有するウェル内に捕捉された粒子が緑の蛍光を有することが機械的に(例えば粒子分析システムの制御部により)記録され、又は、ユーザにより記録若しくは記憶されうる。
当該画像取得工程において、例えばカメラなどの撮像装置により画像データを取得し、当該画像データを処理することで、前記識別情報及び/又は前記位置情報が取得されうる。
代替的には、当該排出のために、例えばマイクロマニュピレータ又はマイクロピペットなどの粒子操作装置を用いて、目的粒子がウェルから排出されてもよい。
代替的には、当該排出のために、粒子捕捉領域のウェルを封止するシートが用いられてもよい。粒子捕捉後に、当該シートによって、粒子捕捉領域内のウェルが封止されうる。次に、目的粒子を捕捉しているウェルを覆うシート部分だけに穴が開けられる。粒子捕捉用チャンバ内に、当該ウェルから目的粒子が排出される流れが形成される。これにより、他の粒子をウェル内に捕捉したまま、目的粒子をウェルから排出することができる。
当該穴を開けることを可能とするために、当該シートは例えば光線(例えば赤外線など)吸収性材料から形成されていてよい。当該シート部分に光線(例えば赤外線など)を照射することで、前記穴が開けられる。
本技術の好ましい実施態様において、前記処理工程は、前記ウェルに固定されたリンカーに対して光照射して前記リンカーを切断する光照射工程を含みうる。例えば当該リンカーが紫外線照射により切断されるものである場合、当該切断処理は紫外線照射でありうる。
例えば、前記排出工程は、同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されないように行われてよい。すなわち、連続して排出される2つの粒子が互いに異なる識別情報を有するように、前記排出工程が行われうる。例えば、赤色の蛍光を有する粒子、青色の蛍光を有する粒子、そして次に赤色の蛍光を有する粒子がこの順に排出されうる。このような排出される粒子の識別情報の順序が、以下の確認工程において、例えば、識別情報取得工程において取得された識別情報の順序と比較されうる。このように、前記排出工程において、連続して排出される2以上の粒子が異なる識別情報を有してよい。
代替的には、前記排出工程は、同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されるように行われてよい。例えば、赤色の蛍光を有する粒子が連続して3つ排出されうる。同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されていることも、以下の確認工程において、識別情報取得工程において取得された識別情報の順序と比較されうる。
代替的には、前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、目印となる粒子が排出されてもよい。当該目印となる粒子を、例えば粒子が回収されるべき容器又はウェルの変更の合図として利用することができる。当該目印となる粒子は、例えば、所定の識別情報を有する粒子であってよい。当該所定の識別情報は、当業者により設定されてよく、好ましくは分取されるべき粒子を特定するための識別情報とは異なる識別情報であってよい。
また、細胞108がリンカーを介してウェルに固定されている場合、当該排出の前にリンカーの切断処理が、例えば紫外線照射などにより行われうる。
本技術の一つの実施態様に従い、前記粒子移動工程において、ウェルから排出された粒子は、流路を通過させられる。当該流路は、例えば粒子回収用の容器又はプレートへと粒子を導くものであってよい。当該流路の通過の間に又は当該流路の通過後に、後述する識別情報取得工程及び/又は確認工程が行われてよい。
第一の流体排出流路部113は、例えば図3(e)に示される粒子回収流路130と接続されており、粒子回収流路130は、例えば96ウェルプレート131のいずれか1つのウェルに粒子を排出することができるように構成されている。細胞108は、粒子回収流路130を通過した後、96ウェルプレート131のいずれか1つのウェルに回収される。
代替的には、前記識別情報取得工程において、図3(f)に示される流路130を通過している粒子から識別情報が取得されてもよい。例えば、流路130を通過している粒子に対する光照射により生じた蛍光及び/又は散乱光が、識別情報として取得されうる。このように識別情報を取得するために、例えばフローサイトメータ又はセルソータにおいて利用されている光検出技術を適用することができる。
機械的に前記確認工程が行われる場合、前記確認工程は、例えば以下「3.第3の実施形態(粒子分析システム)」で説明する粒子分析システムにより行われてよく、特には当該システムに含まれる確認部及び/又は制御部により行われてよい。
ユーザにより前記確認工程が行われる場合、ユーザが、例えば粒子回収容器に回収された粒子の識別情報に基づき、当該粒子が捕捉されていたウェルの位置を確認しうる。
例えば、排出工程において赤色の蛍光を有する粒子、青色の蛍光を有する粒子、そして赤色の蛍光を有する粒子がこの順番で排出され、そして、識別情報取得工程において赤色、赤色、及び青色という識別情報が取得された場合を想定する。確認工程において、排出工程における排出の順序と識別情報工程において取得された蛍光の順序とが比較され、両者が異なることが確認される。これにより、確認工程において、目的粒子が取得されていないことが確認されうる。
また、排出工程において赤色の蛍光を有する粒子が連続して3つ排出され、そして、識別情報取得工程において赤色、青色、及び赤色という識別情報が取得された場合も想定される。確認工程において、排出工程における排出の順序と、識別情報工程において取得された蛍光の順序とが比較され、両者が異なることが確認される。これにより、確認工程において、目的粒子が取得されていないことが確認されうる。
取得された粒子群が目的粒子でないと確認された場合、当該取得された粒子は廃棄されうる。
当該比較の結果、これらの識別情報が一致する場合は、前記識別情報取得工程において識別情報が取得された粒子が、前記関連付け工程における関連付けの対象となった粒子と同じであることが確認されうる。前記関連付け工程における関連付けの対象となった粒子に関して識別情報と位置情報とが関連付けられているので、前記識別情報取得工程において識別情報が取得された粒子が、前記関連付け工程において関連付けられた位置情報を有するウェルに捕捉されていたことが確認されうる。
当該比較の結果、これらの識別情報が一致しない場合は、前記識別情報取得工程において識別情報が取得された粒子が、前記関連付け工程における関連付けの対象となった粒子と同じでないことが確認され、さらには、前記関連付け工程において関連付けられた位置情報を有するウェルに捕捉されていなかったことが確認されうる。
以上のとおり、前記確認工程において、分取されるべき粒子が分取されたかを確認することができる。
代替的には、前記確認工程において、分取されるべき粒子が分取されなかったことが確認された場合は、粒子が96ウェルプレート131のウェルに回収されずに、当該粒子は廃棄されてもよい。このように粒子を廃棄するためには、流路130内を粒子が流れている間に前記識別情報取得工程及び前記確認工程を行うことが好ましい。
まず、捕捉工程において、緑色蛍光色素G2を有するウェルに粒子が捕捉される。当該捕捉によって、緑色蛍光色素G2は当該粒子へと移行する。その後、関連付け工程において、当該粒子の位置情報と当該粒子が有する緑色蛍光色素G2の識別情報(蛍光情報)とが関連付けられる。関連付け工程後に、排出工程が行われて、当該粒子がウェルから排出される。排出工程後、当該粒子が、粒子回収用の容器又はプレートへと移動される。当該移動の途中において又は当該移動後に、識別情報取得工程が行われて、当該粒子の蛍光情報が識別情報として取得される。確認工程において、識別情報取得工程において取得された識別情報に基づき、粒子回収容器又はプレートに回収された粒子が、前記ウェル内に捕捉されていた粒子であるかが確認される。例えば、識別情報取得工程において取得された識別情報が、G2以外の蛍光情報である場合(例えばG1またはR2などである場合)、緑色蛍光色素G2を有するウェルに捕捉された粒子が排出されなかったことが確認される。また、識別情報取得工程において取得された識別情報が、G2の蛍光情報である場合は、前記ウェル内に捕捉されていた粒子が分取されたことが確認される。
同じ識別情報を有する粒子を連続して排出した場合、前記確認工程において当該識別情報と異なる識別情報を有する粒子の存在が確認された場合には、当該連続して排出した複数の粒子には目的外の粒子が含まれていることが分かる。これは、当該連続して排出した複数の粒子を回収するか又は廃棄するかの選択に役立つ。
異なる識別情報を有する粒子を連続して排出する場合、当該排出される複数粒子の有する識別情報と当該複数粒子の排出順序とが、排出工程の前に(例えば関連付け工程において又は関連付け工程後に)定められていることが好ましい。これにより、例えば前記粒子移動工程において流路内を通過している粒子に対して識別情報取得工程が行われる場合、前記確認工程において、当該流路内と通過する粒子の識別情報と前記排出順序とを対比することで、目的粒子が前記排出順序のとおりに回収されているかを確認することができる。このように、前記確認工程において、前記複数の粒子の排出の順序が参照されてよい。
例えば、前記関連付け工程において識別情報を取得するために蛍光検出装置が用いられる場合、前記関連付け工程において取得される識別情報は蛍光であり、且つ、前記識別情報取得工程において識別情報を取得するためにシークエンサ(核酸配列又はアミノ酸配列のシークエンサ)が用いられる場合、前記識別情報取得工程において取得される識別情報は配列情報(核酸配列又はアミノ酸配列)でありうる。
以下で、この実施態様のより具体的な例を説明する。
核酸92は、例えば図9の点線領域内に示されるとおり、例えばUMI(Universal Molecular Identifier)配列93及びポリT配列94などを有しうる。
図9に示されるとおり、1つの粒子本体91に複数の核酸92が結合されている場合、当該複数の核酸は互いに異なるUMI配列94を有する。これにより、当該複数の核酸を互いに区別することができる。
ポリT配列95は、例えばmRNAのポリA配列との結合によって当該mRNAを捕捉するために用いられうる。
本技術の一つの実施態様に従い、粒子は、例えば細胞、微生物、生体由来固形成分、及びリポソームなどの生物学的微小粒子であってよく、特には細胞であってよい。例えば、本技術の粒子分取方法は、細部を分取するために用いられうる。
本技術の他の実施態様に従い、粒子は、ラテックスビーズ、ゲルビーズ、及び磁気ビーズなどの合成粒子であってよく、特には蛍光標識を有する合成粒子でありうる。本技術の粒子確認方法は、例えば当該合成粒子を用いた核酸シークエンシング処理において行われうる。
本技術において、粒子は、好ましくは流体に含まれた状態で本技術の粒子分取方法に付されうる。当該流体は液体及び気体を包含する。好ましくは、流体は液体である。液体の種類は、粒子の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。粒子が例えば細胞である場合、液体として、例えば水、水溶液(例えば緩衝液)、又は培養液が用いられてよい。
前記標識要素を遊離可能なリンカーは、当該リンカーと前記標識要素との結合が切断可能であるリンカーでありうる。前記分解可能又は切断可能なリンカーは、リンカー自体の化学構造が分解可能であること又はリンカー自体の化学構造の内部の少なくとも1か所が切断可能であることによって、標識要素の固定を解消可能なリンカーでありうる。
FITC404は、消光の早い蛍光色素の一つである。蛍光色素は、消光時にラジカル化し、ラジカル化した当該色素が、近傍に存在する物質と結合しうる。そこで、FITC404が、粒子結合性物質として用いられる。
細胞262は、その表面抗原に結合する抗体263を有している。抗体263には核酸264が結合している。一方で、ウェル261は、例えば光分解性リンカー265を介してバーコード配列領域266を有するオリゴ核酸267が固定されている。細胞262が、ウェル261の外部から、ウェル261内へと入る。そして、ウェル261に固定されているオリゴ核酸267と細胞262が有する核酸264とがハイブリダイゼーションすることによって、細胞262がウェル261内に捕捉される。ハイブリダイゼーションした領域は符号268により示されている。
バーコード配列は、バーコーディング技術に基づき生成された配列であってよく、より具体的にはDNAバーコード配列又はRNAバーコード配列でありうる。例えば各ウェル毎に異なるバーコード配列が割り当てられうる。
ステップS106において、さらに、図17(c)に示されるとおり、バーコード配列領域266を有するオリゴ核酸267が、核酸264から解離される。当該解離は、例えば核酸ハイブリッド含有液の温度を下げて暫く静置することにより行われてよい。当該解離後、バーコード配列領域266を有するオリゴ核酸267の配列がシークエンス処理により取得される。当該シークエンス処理は、例えばいわゆる次世代シークエンシング処理により行われうる。当該シークエンス処理により、ハイブリダイゼーションした領域268の配列が取得される。
ステップS106において、前記蛍光及び/又は前記画像が、前記配列と関連付けられうる。
細胞262が有する蛍光及び/又は細胞262の画像と前記配列との組み合わせが、識別情報として以下の確認工程において用いられる。
本技術のさらに他の実施態様に従い、前記粒子捕捉領域が複数の領域に分けられていてよい。さらに、当該複数の領域を構成するウェルが異なる標識要素を有していてよい。
これらの実施態様についても、上記1.の「(2-1)捕捉工程」における説明があてはまる。
なお、図15は粒子508がウェル505内に捕捉されている状態を示す模式図であり、粒子捕捉処理の開始前には粒子508はウェル505内に存在しなくてよい。
粒子捕捉用チャンバ500は、粒子508に対して重力が矢印507の方向に作用するように配置される。
これら4つの流路部にはそれぞれポンプ(図示せず)が接続されている。当該ポンプを駆動させることによって、これら4つの流路部を介して粒子捕捉用チャンバ500内に流体を供給することができ、又は、これら4つの流路部を介して粒子捕捉用チャンバ500内から流体を吸引することができる。これら4つのポンプは、互いに独立に制御されうる。
ウェル505内に捕捉された粒子は、ウェル505内にリンカーを介して固定されている標識要素によって標識されてよい。標識要素は、例えば蛍光色素、色、電荷、磁荷、オリゴ核酸、又はペプチドでありうる。
粒子捕捉用チャンバ100の構成要素のうち、第一の流体供給流路部111には、バルブ121を介して、給液タンク1001が接続されている。給液タンク1001には、微小圧ポンプ1011が接続されている。
また、第二の流体供給流路部112には、バルブ122を介して、給液タンク1002が接続されている。給液タンク1002には、微小圧ポンプ1012が接続されている。
第一の流体排出流路部113には、バルブ123を介して分取制御部1020が接続されている。分取制御部1020は、目的粒子であると確認された粒子を、粒子回収部1022へと進行させる。分取制御部1020は、目的粒子であると確認されなかった粒子を、廃液タンク1003へと進行させる。粒子捕捉用チャンバ100から分取制御部1020へと向かって粒子を進行させるために、例えば廃液タンク1003には微小圧ポンプ1013が接続されている。また、分取制御部1020に微小圧ポンプ(図示せず)が含まれていてよく、当該微小圧ポンプによって、粒子回収部1022又は廃液タンク1003への粒子の進行が制御されうる。
また、第二の流体排出流路部114には、バルブ124を介して廃液タンク1004及び微小圧ポンプ1014が設けられている。
これらのバルブは、好ましくは電動式のピンチバルブでありうる。また、これらの微小圧ポンプは、好ましくは10Pa~3000Pa、より好ましくは100Pa~2000Pa、例えば100~1000Paの間で、好ましくは10Pa~300Pa間隔、より好ましくは20Pa~200Pa間隔で、圧力を調整することができることが好ましい。
顕微鏡1041の対物レンズ1043は、電気的な制御によって移動させることができ、例えばZ方向に移動することができる。対物レンズ1043は、粒子捕捉用チャンバ100の上から、粒子捕捉用チャンバ100の粒子捕捉面を観察できるように構成されている。
顕微鏡1041には、例えば、光源(例えばレーザ、ハロゲンランプ、水銀ランプ、又はLEDなど)、フィルター(例えば励起フィルター及び/又は蛍光フィルターなど)、目的に応じた倍率を有する対物レンズ、電動XYステージ、及び電動Zステージ(対物レンズを移動させるものであってよく又はチャンバが置かれるステージであってもよい。)が備えられていてよい。 顕微鏡1041にはカメラ1044が接続されている。カメラ1044は、対物レンズ1043を介して粒子捕捉用チャンバ100の粒子捕捉面を撮像できるように構成されている。カメラ1044は、例えばCMOS又はCCDのイメージセンサを含む。カメラ1044は、以下で述べる撮影データ処理部に撮影データを送信できるように構成されている。
ポンプ制御部1052は、微小圧ポンプの動作及び/又は微小圧ポンプにより付与される差圧を制御する。
バルブ制御部1053は、バルブの開閉を制御する。
ステージ制御部1055は、ステージ1042及び/又は対物レンズ1043を制御する。ステージ制御部1055により、撮影される領域を移動し及び/又はフォーカスを調整されうる。
センサ制御部1056は、カメラ1044を制御する。センサ制御部1056により、例えば粒子捕捉面の撮影のタイミング、露光期間、及び/又は撮影回数などが制御されうる。
観察及び撮影制御部1054によって、ステージ制御部1055によるステージの制御とセンサ制御部1056によるカメラ動作の制御とが同期されうる。また、観察及び撮影制御部1054は、複数の対物レンズ1043が取り付けられている電動リボルバーの回転を制御しうる。すなわち、観察及び撮影制御部1054は、対物レンズ1043を切り替えることができる。
確認部1059は、粒子確認の結果に応じて分取制御部1020を制御しうる。例えば、確認部1059による粒子確認の結果、粒子が目的粒子であると確認された場合は、確認部1059は、分取制御部1020を制御して、粒子を粒子回収部1022へと進行させる。確認部1059による粒子確認の結果、粒子が目的粒子でない場合は、確認部1059は、分取制御部1020を制御して、粒子を廃液タンク1003へと進行させる。
代替的には、粒子回収部1022の代わりに、1つの空間に粒子を回収する粒子回収容器が用いられてもよい。
〔1〕粒子捕捉領域中のウェルに捕捉された粒子が有する識別情報と前記ウェルの位置情報とを関連付ける関連付け工程と、
前記粒子をウェルから排出する排出工程と、
前記排出工程後に前記粒子の識別情報を取得する識別情報取得工程と、
取得された前記識別情報に基づいて、前記粒子が、前記位置情報を有するウェルに捕捉されていたかを確認する確認工程と、
を含む粒子確認方法。
〔2〕粒子捕捉領域中のウェルに固定されたリンカーを介して粒子を捕捉する捕捉工程をさらに含む、〔1〕に記載の粒子確認方法。
〔3〕前記捕捉工程が、前記ウェルに捕捉された粒子を標識して前記粒子に識別情報を付与する標識工程を含む、〔2〕に記載の粒子確認方法。
〔4〕前記標識工程において、前記粒子を蛍光、色、電荷、磁荷、オリゴ核酸、又はペプチドにより標識して前記粒子に識別情報を付与する、〔3〕に記載の粒子確認方法。
〔5〕前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有し、隣り合うウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される、〔3〕又は〔4〕に記載の粒子確認方法。
〔6〕前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有し、隣り合う行又は列中のウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される、〔3〕又は〔4〕に記載の粒子確認方法。
〔7〕前記関連付け工程が、前記粒子捕捉領域の画像を取得する画像取得工程を更に含み、
前記画像から蛍光、色、又は、粒子の大きさ若しくは形を識別情報として取得し、前記識別情報と前記位置情報とが関連付けられる、
〔1〕~〔6〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔8〕前記排出工程において、識別情報を有する複数の粒子が連続して排出される、〔1〕~〔7〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔9〕前記確認工程において、前記複数の粒子の排出の順序が参照される、〔8〕に記載の粒子確認方法。
〔10〕前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、一時的に排出が停止される、〔8〕又は〔9〕に記載の粒子確認方法。
〔11〕前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、目印となる粒子が排出される、〔8〕又は〔9〕に記載の粒子確認方法。
〔12〕前記排出工程において、連続して排出される2以上の粒子が異なる識別情報を有する、〔8〕又は〔9〕に記載の粒子確認方法。
〔13〕前記粒子捕捉領域が、複数の場に区分けされており、
前記ウェルが、当該ウェルが配置された場を特定するための標識要素を含む、
〔3〕に記載の粒子確認方法。
〔14〕前記排出工程は、前記ウェルに固定されたリンカーに対して光照射して前記リンカーを切断する光照射工程を更に含む、〔2〕~〔13〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔15〕前記粒子確認方法が、前記排出工程においてウェルから排出された粒子を、流路を通過させる粒子移動工程をさらに含み、
前記識別情報取得工程において、前記流路を通過する粒子又は前記流路を通過した粒子から前記識別情報が取得される、〔1〕~〔14〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔16〕前記確認工程において、連続した所定数の粒子群に対し、前記排出工程で排出された粒子の識別情報の順序と、前記識別情報取得工程で取得された粒子の識別情報の順序が異なる時、当該粒子群を廃棄する、〔1〕~〔15〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔17〕粒子分取工程をさらに含む、〔1〕~〔16〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔18〕前記関連付け工程においてウェルに捕捉された粒子が、2以上の異なる識別情報を有している、〔1〕~〔16〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔19〕前記識別情報取得工程において、前記粒子の識別情報を核酸シークエンス処理により取得する核酸シークエンス工程を更に含む、〔1〕~〔16〕のいずれか一つに記載の粒子確認方法。
〔20〕少なくとも一つのウェルを有する粒子捕捉領域を備えており、
前記少なくとも一つのウェルのそれぞれが、ウェルから粒子へ移行可能な標識要素を有する、
粒子捕捉用チップ。
〔21〕前記標識要素がリンカーを介して各ウェルに固定されており、前記リンカーを介した前記標識要素の固定が解消可能である、〔20〕に記載の粒子捕捉用チップ。
〔22〕前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有する、〔20〕又は〔21〕に記載の粒子捕捉用チップ。
〔23〕前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有する、〔20〕~〔22〕のいずれか一つに記載の粒子捕捉用チップ。
〔24〕少なくとも一つのウェルを有する粒子捕捉領域を備えており、前記少なくとも一つのウェルのそれぞれが、ウェルから粒子へ移行可能な標識要素を有する、粒子捕捉用チップと、
前記少なくとも一つのウェルから排出された粒子を回収する粒子回収部と、
前記排出された粒子が有する識別情報を取得する識別情報取得部と、
を含む粒子分析システム。
101 粒子捕捉用チップ
104 粒子捕捉領域
105 ウェル
108 粒子
Claims (24)
- 粒子捕捉領域中のウェルに捕捉された粒子が有する識別情報と前記ウェルの位置情報とを関連付ける関連付け工程と、
前記粒子をウェルから排出する排出工程と、
前記排出工程後に前記粒子の識別情報を取得する識別情報取得工程と、
取得された前記識別情報に基づいて、前記粒子が、前記位置情報を有するウェルに捕捉されていたかを確認する確認工程と、
を含む粒子確認方法。 - 粒子捕捉領域中のウェルに固定されたリンカーを介して粒子を捕捉する捕捉工程をさらに含む、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 前記捕捉工程が、前記ウェルに捕捉された粒子を標識して前記粒子に識別情報を付与する標識工程を含む、請求項2に記載の粒子確認方法。
- 前記標識工程において、前記粒子を蛍光、色、電荷、磁荷、オリゴ核酸、又はペプチドにより標識して前記粒子に識別情報を付与する、請求項3に記載の粒子確認方法。
- 前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有し、隣り合うウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される、請求項3に記載の粒子確認方法。
- 前記標識工程において、前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有し、隣り合う行又は列中のウェルに捕捉された粒子が異なる標識要素により標識される、請求項3に記載の粒子確認方法。
- 前記関連付け工程が、前記粒子捕捉領域の画像を取得する画像取得工程を更に含み、
前記画像から蛍光、色、又は、粒子の大きさ若しくは形を識別情報として取得し、前記識別情報と前記位置情報とが関連付けられる、
請求項1に記載の粒子確認方法。 - 前記排出工程において、識別情報を有する複数の粒子が連続して排出される、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 前記確認工程において、前記複数の粒子の排出の順序が参照される、請求項8に記載の粒子確認方法。
- 前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、一時的に排出が停止される、請求項8に記載の粒子確認方法。
- 前記排出工程において、所定数の粒子を連続して排出した後に、目印となる粒子が排出される、請求項8に記載の粒子確認方法。
- 前記排出工程において、連続して排出される2以上の粒子が異なる識別情報を有する、請求項8に記載の粒子確認方法。
- 前記粒子捕捉領域が、複数の場に区分けされており、
前記ウェルが、当該ウェルが配置された場を特定するための標識要素を含む、
請求項3に記載の粒子確認方法。 - 前記排出工程は、前記ウェルに固定されたリンカーに対して光照射して前記リンカーを切断する光照射工程を更に含む、請求項2に記載の粒子確認方法。
- 前記粒子確認方法が、前記排出工程においてウェルから排出された粒子を、流路を通過させる粒子移動工程をさらに含み、
前記識別情報取得工程において、前記流路を通過する粒子又は前記流路を通過した粒子から前記識別情報が取得される、
請求項1に記載の粒子確認方法。 - 前記確認工程において、連続した所定数の粒子群に対し、前記排出工程で排出された粒子の識別情報の順序と、前記識別情報取得工程で取得された粒子の識別情報の順序が異なる時、当該粒子群を廃棄する、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 粒子分取工程をさらに含む、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 前記関連付け工程においてウェルに捕捉された粒子が、2以上の異なる識別情報を有している、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 前記識別情報取得工程において、前記粒子の識別情報を核酸シークエンス処理により取得する核酸シークエンス工程を更に含む、請求項1に記載の粒子確認方法。
- 少なくとも一つのウェルを有し、前記ウェルの位置情報を特定できる粒子捕捉領域を備えており、
前記少なくとも一つのウェルのそれぞれが、ウェルから粒子へ移行可能な標識要素を有し、
前記粒子を前記ウェルから排出した後に、
前記粒子の識別情報を取得し、取得された前記識別情報に基づいて、前記粒子が、前記位置情報を有するウェルに捕捉されていたかを確認できる、
粒子捕捉用チップ。 - 前記標識要素がリンカーを介して各ウェルに固定されており、前記リンカーを介した前記標識要素の固定が解消可能である、請求項20に記載の粒子捕捉用チップ。
- 前記粒子捕捉領域中の隣り合うウェルが異なる標識要素を有する、請求項20に記載の粒子捕捉用チップ。
- 前記粒子捕捉領域中のウェルが複数の行又は列を形成するように配され、隣り合う2つの行又は列が互いに異なる標識要素を有する、請求項20に記載の粒子捕捉用チップ。
- 少なくとも一つのウェルを有し、前記ウェルの位置情報を特定できる粒子捕捉領域を備えており、前記少なくとも一つのウェルのそれぞれが、ウェルから粒子へ移行可能な標識要素を有する、粒子捕捉用チップと、
前記少なくとも一つのウェルから排出された粒子を回収する粒子回収部と、
前記排出された粒子が有する識別情報を取得する識別情報取得部と、
を含み、
前記識別情報に基づいて、前記粒子が、前記位置情報を有するウェルに捕捉されていたかを確認できる、
粒子分析システム。
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