JP2010252635A

JP2010252635A - 細胞処理装置

Info

Publication number: JP2010252635A
Application number: JP2009103107A
Authority: JP
Inventors: Koka Rin; 孔華林; Takahiro Ono; 隆弘大野
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-04-21
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2010-11-11

Abstract

【課題】閉鎖系内においてＴｒｅｇ細胞をより確実に分離する。
【解決手段】可変容積の下部空間６を有する容器本体４と、該容器本体４の下部空間６の上方において、容器本体４内の空間を上下に区画する位置に配置されたフィルタ７と、容器本体４内のフィルタ７より上方の上部空間５に収容され、Ｔｒｅｇ細胞を吸着する吸着物質８と、容器本体４内に洗浄液を供給する洗浄液供給口１２と、下部空間６から洗浄液を排出する洗浄液排出口１３と、下部空間６からＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を排出する細胞排出口１４とを備え、フィルタ７が、吸着物質８の通過を制限し、細胞懸濁液の通過を許容する多数の透孔を有する細胞処理装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞処理装置に関するものである。

従来、自己抗原あるいは外来抗原に対する有害な免疫反応を抑制する能力を有する細胞としてＴｒｅｇ細胞が知られている。このＴｒｅｇ細胞はその数が少ないため、組織から分離した後に治療に必要な細胞数まで体外で増殖を行う必要がある（例えば、特許文献１参照。）。

特表２００８−５１３０１４号公報

しかしながら、従来の分離増殖方法では、単に抗体によってＴｒｅｇ細胞を捕獲することはできるもののこれを分離することは困難である。また、Ｔｒｅｇ細胞の分離、増殖は、塵埃やウィルス等の混入を防止するために外部に対して閉じた閉鎖系において行われることが望まれている。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、閉鎖系内においてＴｒｅｇ細胞をより確実に分離することができる細胞処理装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、可変容積の下部空間を有する容器本体と、該容器本体の前記下部空間の上方において、前記容器本体内の空間を上下に区画する位置に配置されたフィルタと、容器本体内の前記フィルタより上方の上部空間に収容され、Ｔｒｅｇ細胞を吸着する吸着物質と、前記容器本体内に洗浄液を供給する洗浄液供給口と、前記下部空間から前記洗浄液を排出する洗浄液排出口と、前記下部空間からＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を排出する細胞排出口とを備え、前記フィルタが、吸着物質の通過を制限し、細胞懸濁液の通過を許容する多数の透孔を有する細胞処理装置を提供する。

本発明によれば、容器本体の上部空間にＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を収容した状態で、下部空間の容積を比較的ゆっくりと膨張、収縮させて容積を変動させると、細胞懸濁液が上部空間内に収容されている吸着物質の周囲で流動させられる。これにより、細胞懸濁液内に含まれているＴｒｅｇ細胞が吸着物質によって吸着される。

この状態で、洗浄液供給口から洗浄液を供給し、下部空間に開口する洗浄液排出口から細胞懸濁液を含む洗浄液を排出することで、容器本体内には吸着物質に吸着された状態のＴｒｅｇ細胞を残し、細胞懸濁液の他の部分を排出することができる。そして、洗浄液供給口から再度洗浄液を容器本体内に供給し、今度は、下部空間を比較的急速に膨張、収縮させて容積を変動させる。

これにより、吸着物質の周囲に流動する洗浄液の流速が高められ、吸着物質に吸着されているＴｒｅｇ細胞が、洗浄液の流動によるせん断力によって、吸着物質から剥離され、洗浄液内にＴｒｅｇ細胞のみを含む細胞懸濁液が生成される。そして、下部空間に開口する細胞排出口から細胞懸濁液を排出することにより、Ｔｒｅｇ細胞のみを分離回収することができる。

上記発明においては、前記吸着物質が、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体を結合したビーズであることとしてもよい。
このようにすることで、細胞懸濁液内に含まれるＴｒｅｇ細胞をＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体を結合したビーズからなる吸着物質に選択的に吸着させることができ、純度の高いＴｒｅｇ細胞を分離することができる。

また、上記発明においては、前記下部空間の容積を膨張または収縮させる駆動手段を備えていてもよい。
このようにすることで、駆動手段の作動により下部空間の容積を変動させて、吸着物質へのＴｒｅｇ細胞の吸着および吸着物質からのＴｒｅｇ細胞の剥離を行うことができる。

また、上記発明においては、前記細胞排出口に接続された培養容器本体と、該培養容器本体内に収容されたＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体を結合した部材とを備えていてもよい。
このようにすることで、細胞懸濁液から分離された純度の高いＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を培養容器本体内に導入すると、培養容器本体内に収容されている部材に結合されているＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体の作用によって、培養容器本体内に収容されたままの閉鎖系においてＴｒｅｇ細胞の増殖が促進され、所望の細胞数まで簡易に増殖させることができる。

本発明によれば、閉鎖系内においてＴｒｅｇ細胞をより確実に分離することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞処理装置を示す模式図である。図１の細胞処理装置による処理の前準備段階を説明する図である。図１の細胞処理装置における細胞懸濁液の供給工程を示す図である。図３の状態からの細胞の吸着工程を示す図である。図４と同様に細胞懸濁液を吸着ビーズの周囲に流動させる工程を示す図である。図５とは逆方向に細胞懸濁液を流動させる工程を示す図である。図６の後の容器本体内への洗浄液の供給工程を示す図である。図７の後の容器本体内の洗浄工程を示す図である。図５とは逆方向に洗浄液を流動させる工程を示す図である。図９により洗浄されることによって、吸着ビーズから剥離されたＴｒｅｇ細胞の回収工程を示す図である。

本発明の一実施形態に係る細胞処理装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞処理装置１は、図１に示されるように、細胞分離部２と、細胞培養部３とを備えている。

細胞分離部２は、脂肪組織内に含まれる単核球細胞を分離して得られた細胞懸濁液Ａから、Ｔｒｅｇ細胞のみを分離抽出するもので、容器本体４と、該容器本体４を上部空間５と下部空間６とに区画する位置に配置されたフィルタ７と、上部空間５に収容された吸着ビーズ８とを備えている。

上部空間５に収容されている吸着ビーズ８は、細胞よりも十分に大きな粒径を有し、その表面に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体が結合されている。これにより、吸着ビーズ８には、その周囲を流動させられる単核球細胞の内、Ｔｒｅｇ細胞のみが選択的に吸着されるようになっている。

下部空間６を構成する容器本体４の部分は、上下方向に伸縮可能な蛇腹９により構成されている。そして、容器本体４の下部には、該容器本体４の下部空間６を構成している蛇腹９を上下方向に伸縮させるように駆動するピストン等の直動機構（駆動手段）１０が備えられている。

フィルタ７は、上部空間５に収容されている吸着ビーズ８の外径寸法よりも小さく、細胞懸濁液の自由な通過を許容する程度の口径の多数の透孔（図示略）を有している。これにより、下部空間６の拡大、縮小により、細胞懸濁液が容器本体４内において流動させられても、吸着ビーズ８が上部空間５内に保持されるようになっている。

また、容器本体４の上部空間５には、単核球細胞を含む細胞懸濁液の懸濁液供給口１１と、洗浄液を供給する洗浄液供給口１２とが開口している。
容器本体４の下部空間６には、容器本体４内を洗浄した後の洗浄液の廃液を排出する洗浄液排出口１３と、Ｔｒｅｇ細胞のみを含む細胞懸濁液を排出するための懸濁液排出口１４とが開口している。

細胞培養部３は、細胞分離部２と同様の構造を有し、フィルタ１５によって上部空間１６と下部空間１７とに区画された培養容器本体１８と、上部空間１６内に収容されたＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体を表面に結合したビーズ１９とを備えている。下部空間１７は上下方向に伸縮可能な蛇腹２０により構成されている。また、培養容器本体１８の下部には、該培養容器本体１８の下部空間１７を構成している蛇腹２０を上下方向に伸縮させるように駆動するピストン等の直動機構（駆動手段）２１が備えられている。

フィルタ１５は、上部空間１６に収容されているビーズ１９の外径寸法よりも小さく、細胞懸濁液の自由な通過を許容する程度の口径の多数の透孔（図示略）を有している。これにより、下部空間１７の拡大、縮小により、細胞懸濁液が培養容器本体１８内において流動させられても、ビーズ１９が上部空間１６内に保持されるようになっている。

培養容器本体１８の上部空間１６には、細胞分離部２において分離されたＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液の懸濁液供給口２２と、培養液を供給する培養液供給口２３とが開口している。
培養容器本体１８の下部空間１７には、使用後の培養液の廃液を排出する培養液排出口２４と、Ｔｒｅｇ細胞のみを含む細胞懸濁液を排出するための懸濁液排出口２５とが開口している。培養液排出口２４には、培養液の通過を許容しＴｒｅｇ細胞の通過を禁止するフィルタ２６が配置されている。

各供給口１１，１２，２２，２３および排出口１３，１４，２４，２５には、これらを開閉するバルブ２７〜３３が設けられている。また、洗浄液排出口１３および培養液排出口２４にはバルブ３０，３３を介して廃液容器３４，３５がそれぞれ接続されている。また、図中、符号３６，３７は、容器本体４および培養容器本体１８内への塵埃の流入を防止しつつ換気を可能とするフィルタである。

このように構成された本実施形態に係る細胞処理装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞処理装置１を用いて脂肪組織から分離された単核球細胞から所望の細胞数のＴｒｅｇ細胞を回収するには、まず、図２に示されるように、直動機構１０を作動させて容器本体４の下部空間６を膨張させておく。この時点で、全てのバルブ２７〜３０は閉鎖しておく。以下、図中黒塗りのバルブは閉止状態、白抜きのバルブは開放状態をそれぞれ示している。

次いで、脂肪組織を消化酵素液で分解して得られた脂肪由来細胞内の単核球細胞を公知のフィルタによって分離して得られた細胞懸濁液を、図３に示されるように、バルブ２７を開くことにより懸濁液供給口１１から容器本体４内に供給する。

容器本体４内への細胞懸濁液の供給量は、下部空間６を最も収縮させた状態における容器本体４の内容積よりも少ない量に設定されている。
この状態で、図４に示されるように、直動機構１０を比較的ゆっくりと作動させて下部空間６を収縮させると下部空間６内に収容されていた細胞懸濁液Ａがフィルタ７を介して上部空間５内に流入し、上部空間５に収容されている吸着ビーズ８の周辺を流動させられる。

吸着ビーズ８の表面には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体が結合されているので、その周囲を流動させられる細胞懸濁液Ａとの接触の機会が増大させられて、細胞懸濁液Ａ内に含まれているＴｒｅｇ細胞が選択的に吸着される。この場合に、図５に示されるように、直動機構１０の往復動作によって、下部空間６の膨張、収縮を繰り返すことにより、細胞懸濁液Ａ内に含まれているＴｒｅｇ細胞が漏れなく吸着ビーズ８に吸着される。

そして、所定回数あるいは所定の時間にわたる直動機構の往復動作の終了後に、図６に示されるように、洗浄液供給口１２のバルブ２８を開いて洗浄液を容器本体４内に供給する一方で、洗浄液排出口１３のバルブ３０を開いて細胞懸濁液Ａ’を排出する。このとき排出される細胞懸濁液Ａ’内には最初の細胞懸濁液ＡからＴｒｅｇ細胞が取り除かれた他の細胞や組織が含まれているので、これらが、廃液として洗浄液排出口１３から排出されることにより、容器本体４内には、吸着ビーズ８に吸着された状態のＴｒｅｇ細胞のみが残される。必要により、洗浄液の供給、下部空間６の膨張、収縮による容器本体４内の洗浄および洗浄液の排出を複数回繰り返すことにより、容器本体４内に残るＴｒｅｇ細胞の純度を向上することができる。

細胞懸濁液Ａ’が排出された時点で、図７に示されるように、洗浄液排出口１３のバルブ３０を閉止し、洗浄液供給口１２のバルブ２８を開いて再度洗浄液を供給する。そして、図８に示されるように、直動機構１０を作動させて、下部空間６の膨張、収縮を行う。このとき、上述した洗浄工程における直動機構１０の動作速度よりも十分に速い動作速度で往復動作を行う。これにより、吸着ビーズ８の周囲における洗浄液の流速を高めて、吸着ビーズ８に吸着されているＴｒｅｇ細胞を剥離させることができる。

そして、図９に示されるように、下部空間６を最大限に膨張させて、容器本体４内のＴｒｅｇ細胞を含む洗浄液からなる細胞懸濁液の多くを下部空間６に収容した状態で、図１０に示されるように、バルブ２９を開いて細胞懸濁液を容器本体４から排出し、後段に配置されている細胞培養部３の培養容器本体１８内に供給する。

次いで、細胞培養部３においては、直動機構２１を比較的ゆっくりした速度で往復動作させて、下部空間１７を膨張、収縮させる。これにより、Ｔｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液がＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体が結合されているビーズ１９の周囲において流動させられて、Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体によって刺激され、増殖が促進される。

バルブ３１を開いて培養液供給口２３から培養液を供給し、培養液排出口２４からバルブ３３を介して廃液容器３５内に廃液となった使用済みの培養液を排出する。これにより、Ｔｒｅｇ細胞は、ビーズ１９の周囲を流動させられる間に、所望の細胞数まで増殖させられる。
この状態で、バルブ３２を開いて懸濁液排出口２５から、十分な細胞数のＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を外部に回収することができる。

このように、本実施形態に係る細胞処理装置１によれば、直動機構１０の作動により容器本体４の下部空間６の容積を増加、減少させるだけで、吸着ビーズ８にＴｒｅｇ細胞を吸着させ、さらに速い速度で下部空間６の容積を増加、減少させるだけで、吸着ビーズ８に吸着されたＴｒｅｇ細胞を剥離させることができる。したがって、閉鎖された空間内においてＴｒｅｇ細胞のみを選択的に抽出することができ、純度の高いＴｒｅｇ細胞を得ることができる。

さらに、本実施形態に係る細胞処理装置１によれば、直動機構２１の作動により培養容器本体１８の下部空間１７の容積を増加、減少させるだけで、Ｔｒｅｇ細胞を刺激して増殖促進を図ることができる。したがって、閉鎖された空間内においてＴｒｅｇ細胞を所望の細胞数まで増殖させることができ、治療に必要十分な細胞数のＴｒｅｇ細胞を得ることができる。

なお、本実施形態においては、脂肪組織から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液ＡからＴｒｅｇ細胞を分離、増殖させる場合について説明したが、細胞ソースはこれに限定されるものではなく、血液、骨髄あるいは臍帯血から単離された単核球細胞を含む細胞懸濁液Ａを用いることにしてもよい。

また、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体およびＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体をビーズ８，１９の表面に結合することとしたが、これに代えて、他の任意の部材に結合することとしてもよい。表面積を大きくすることができ、かつその表面にむらなく抗体を結合することができる点でビーズ８，１９が好ましいが、多孔質体の外表面および気孔内表面に結合することにしてもよい。

また、容器本体４および培養容器本体１８の下部空間６，１７を蛇腹９，２０によって容積可変に構成したが、これに代えて、容積固定の空間にシリンジ（図示略）を接続してピストンの往復移動によって容積をシリンダ内の空間を含めて容積可変に構成してもよい。

１細胞処理装置
４容器本体
５上部空間
６下部空間
７フィルタ
８吸着ビーズ（吸着物質）
１０ピストン（駆動手段）
１２洗浄液供給口
１３洗浄液排出口
１４細胞排出口
１８培養容器本体
１９ビーズ（部材）
２５細胞排出口

Claims

可変容積の下部空間を有する容器本体と、
該容器本体の前記下部空間の上方において、前記容器本体内の空間を上下に区画する位置に配置されたフィルタと、
容器本体内の前記フィルタより上方の上部空間に収容され、Ｔｒｅｇ細胞を吸着する吸着物質と、
前記容器本体内に洗浄液を供給する洗浄液供給口と、
前記下部空間から前記洗浄液を排出する洗浄液排出口と、
前記下部空間からＴｒｅｇ細胞を含む細胞懸濁液を排出する細胞排出口とを備え、
前記フィルタが、吸着物質の通過を制限し、細胞懸濁液の通過を許容する多数の透孔を有する細胞処理装置。
前記吸着物質が、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋抗体を結合したビーズである請求項１に記載の細胞処理装置。
前記下部空間の容積を膨張または収縮させる駆動手段を備える請求項１に記載の細胞処理装置。
前記細胞排出口に接続された培養容器本体と、
該培養容器本体内に収容されたＣＤ３^＋ＣＤ２８^＋抗体を結合した部材とを備える請求項１に記載の細胞処理装置。