JP4745817B2

JP4745817B2 - 生細胞分離用遠心分離管

Info

Publication number: JP4745817B2
Application number: JP2005369270A
Authority: JP
Inventors: 誠一横尾; 恭子小野; 聡山上; 速雄田中
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: JP2007166977A

Description

本発明は、生細胞、特に体性幹細胞の回収率の高い、生細胞分離用遠心分離管及びこれを用いた生細胞の分離方法に関する。

幹細胞は、組織や臓器に成長する元となる細胞であり、ほとんどの臓器や組織中に存在している。幹細胞のうち、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は万能細胞であり、一方、体性幹細胞は通常一定の組織、器官に分化する能力だけを持つと云われてきた。しかし、最近、骨髄中の間葉系幹細胞が、ＥＳ細胞に近い能力を持っていることが判明している。このような体性幹細胞は、再生医療の面から多くの研究がなされている。

体性幹細胞は、通常組織から幹細胞分離用培地を用いて単離される。また、単離された体性幹細胞はニューロスフェア法等により増殖・分化させ、再生医療への応用が図られている（非特許文献１、２）。

しかし、体性幹細胞を分離するために採取される組織は、通常、極少量であるため、組織から体性幹細胞の単離操作における回収率が低く、多くの場合増殖・分化が不可能なことが多いという問題があった。
天野史郎、"角膜再生医療"、［online］、２００４年度関西眼疾患研究会講演会抄録第２５３回、［平成１７年１０月３１日検索］、インターネット、＜URL:http://www.ophth.kpu-m.ac.jp/eye_disease/shoroku/25302.html＞黒木登志夫ら編、「培養細胞実験ハンドブック」、羊土社、２００４年７月、第１１章

組織から体性幹細胞の単離操作における回収率が悪い原因は不明であり、多くの研究者にとってその解明が待たれていた。
従って、本発明の目的は、組織から生細胞を単離回収する際の回収率を改善する手段を提供することにある。

そこで、本発明者は、体性幹細胞の回収率が低い原因について種々検討したところ、全く意外にも、幹細胞分離用培地組成や増殖・分化手段にあるのではなく、組織から体性幹細胞を単離する際の遠心分離管の表面特性に原因があることを見出した。すなわち、生細胞は遠心分離する際に遠心分離管内壁に付着してしまい、回収率が低くなっていたのである。そこでさらに検討したところ、遠心分離管の表面を水との接触角が０〜１度という高親水性にしたところ、遠心力による遠心分離管内壁への体性幹細胞の付着が顕著に抑制され、体性幹細胞の回収率が飛躍的に向上することを見出した。また、この遠心分離管による細胞回収率の向上は、体性幹細胞だけではなく、生細胞、特に上皮系、内皮系、及び血球系の細胞に対しても高い効果が得られることを見出した。

すなわち、本発明は、水との接触角が０〜１度である表面を有する生細胞分離用遠心分離管を提供するものである。
また、本発明は、上記遠心分離管を用いて生細胞含有液を遠心分離することを特徴とする生細胞の分離方法を提供するものである。

本発明の遠心分離管を用いれば、遠心分離の際、生細胞が内壁に付着せず、生細胞の回収率が飛躍的に向上する。従って、これを用いて体性幹細胞を分離すれば、極少量の組織からの体性幹細胞の回収率が向上し、その後の幹細胞の増殖・分化の収率も向上することから、再生医療への貢献が期待できる。

本発明の生細胞分離用遠心分離管は、該表面の水との接触角が０〜１度である。水接触角は、特に０〜０．５度が好ましい。遠心分離管の表面を超親水性とすることで、生細胞が遠心分離管内壁に付着するのを防止し、生細胞含有液が流れ落ち易くなるため、回収率を向上させることができる。ここで、水接触角は、例えば２５℃において、水平な試験用板の上に２０μＬの水を滴下し、接触角計を用いて公知の方法により測定できるが、超親水性表面の接触角は表面が乾燥した状態と含水した状態では接触角は大きく異なるため、本発明における接触角とは、表面を純水で濡らした後に１分間表面を地面に対して垂直にした状態で静置し、表面に保持された自由水のみを残した状態で前記方法にて測定した結果をいう。
また、遠心分離管の表面のうち、少なくとも内面が前記水接触角を有すればよい。

遠心分離管表面を超親水性表面とするには、その表面に親水性樹脂による被覆層、又は側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を硬化した被覆層を形成させればよい。
ここで、親水性樹脂としては、例えばポリヒドロキシアルキルメタクリレート又はこれを含む共重合体、ポリオキシＣ₂−Ｃ₄アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体及びメタクリロイルオキシアルキルホスホコリン重合体又はこれを含む共重合体等が挙げられる。ポリヒドロキシアルキルメタクリレートとしては、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート等のポリヒドロキシＣ₁−Ｃ₆アルキルメタクリレートが挙げられる。ポリオキシＣ₂−Ｃ₄アルキレン基含有メタクリレート重合体としては、（ポリオキシエチレン）オキシＣ₁−Ｃ₆アルキルメタクリレート重合体、（ポリオキシプロピレン）オキシＣ₁−Ｃ₆アルキルメタクリレート重合体等の（ポリオキシＣ₂−Ｃ₄アルキレン）オキシＣ₁−Ｃ₆アルキルメタクリレート重合体等が挙げられる。メタクリロイルオキシアルキルホスホコリン重合体としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン重合体、３−メタクリロイルオキシプロピルホスホコリン重合体等のメタクリロイルオキシＣ₁−Ｃ₆アルキルホスホコリン重合体が挙げられる。またこれらの共重合体における他のモノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、アルキル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの中でも、特にメタクリロイルオキシアルキルホスホコリン重合体又はメタクリロイルオキシアルキルホスホコリン−アルキル（メタ）アクリレート共重合体が好ましい。

前記親水性樹脂の平均重合度は、特に限定されないが、１００〜１００，０００が好ましく、特に１０００〜５０，０００が好ましい。平均重合度が１００未満であると分離管表面に均一に皮膜を形成するのが困難となる場合があり、他方１００，０００を超えると水溶性樹脂の粘度が高くなり作業性が低下する場合がある。これらの親水性樹脂は、水に対して不溶性であるのが望ましい。

側鎖に官能基を有する水溶性樹脂の官能基としては、感光性の反応基が挙げられ、例えば窒素原子を含む官能基、硫黄原子を含む官能基、臭素原子を含む官能基、塩素原子を含む官能基等が挙げられる。これらの中でも、特に窒素原子を含む官能基が好ましい。具体的には、アジド基を含む官能基、ジアゾ基を含む官能基、ジアジド基を含む官能基等が挙げられる。これらの中でもアジド基を含む官能基が好ましい。これにより、実用的な３００〜５００ｎｍの波長で反応させることができ、更に優れた解像性により被膜の形成性を向上することができる。

側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を構成する水溶性樹脂としては、例えばポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラアクリレート、ポリペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ポリジエチレングリコールジアクリレート、及びそれらを構成するモノマー同士の共重合体、またメタクリロイルオキシアルキルホスホリンコリンと他のモノマー（例えばアルキルメタクリレート等）との共重合体等が挙げられる。これらの中でも、特にポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールの中から選ばれる１種以上が好ましい。
なお、ここで水溶性樹脂とは、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能なものをいう。

ポリ酢酸ビニルのケン化物とは、ポリビニルアルコール又はビニルアルコールと他の化合物との共重合体をいう。さらには、ビニルアルコールと、親水基変性、疎水基変性、アニオン変性、カチオン変性、アミド基変性又はアセトアセチル基のような反応基変性等の変性酢酸ビニルのケン化物等も含まれる。ポリ酢酸ビニルのケン化物のケン化度は特に限定されないが、該ポリ酢酸ビニル全体の２０〜１００ｍｏｌ％、特に５０〜９５ｍｏｌ％ケン化したものが好ましい。

前記水溶性樹脂の平均重合度は、特に限定されないが、１００〜１０，０００が好ましく、特に２００〜５，０００が好ましい。平均重合度が１００未満であると分離管表面に均一に皮膜を形成するのが困難となる場合があり、他方１０，０００を超えると水溶性樹脂の粘度が高くなり作業性が低下する場合がある。

側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を硬化させる方法としては、特に限定されず、例えば光照射により硬化させることができる。光照射により硬化させる場合の光源は、特に限定されず、照度が５．０ｍＷ／ｃｍ²程度の超高圧水銀灯、又は０．１ｍＷ／ｃｍ²程度のＵＶランプ等を使用することができる。光照射による硬化は、照度と照射時間で制御することができるため、照度の低い光源を用いる場合は照射時間を長くすればよく、反応性の高い感光基を選択した場合は、蛍光灯下で硬化させることも可能である。
例えば５．０ｍＷ／ｃｍ²の超高圧水銀灯を使用した場合は、１乃至１０秒の照射で、０．１ｍＷ／ｃｍ²のＵＶランプを使用した場合は、３乃至１０分の照射で充分に硬化させることができる。

本発明において、遠心分離管表面に、親水性樹脂による被覆層、又は側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を硬化した被覆層を形成させる方法は、特に制限されないが、例えば予め得た遠心分離管を斯かる樹脂液に浸漬し、又は浸漬後硬化することにより形成させることができる。なお、これらの被覆層は、遠心分離管の少なくとも内面に形成させればよい。

遠心分離管自体の材質としては、ガラス、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、エチレンープロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂；ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン系樹脂等のポリスチレン系樹脂；ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂；塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリテトラフルオロエチレン樹脂等のフッ素系樹脂；ポチメチルペンテン樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂；プロピオネート樹脂等の繊維素系樹脂等が挙げられる。

前記樹脂材料の重量平均分子量は、特に制限されないが、１０，０００〜５００，０００が好ましく、特に２０，０００〜１００，０００が好ましい。
前記樹脂材料には、成形性向上、耐候性向上を目的として、本発明の目的を損なわない範囲で炭素水素系、脂肪酸アミド系の滑剤やフェノール系、アミン系の酸化防止剤等の添加剤を添加することができる。

前記樹脂材料から、遠心分離管を製造する場合、例えば射出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形により製造することができる。

本発明の遠心分離管を用いて遠心分離する生細胞としては、特に限定されないが、ヒト又はヒト以外の哺乳類動物由来の組織、器官から得られる生細胞が好ましく、特にＥＳ細胞、体性幹細胞等の未分化型細胞が好ましく、さらに体性幹細胞が好ましい。生細胞としては、例えば神経細胞、星状膠細胞、希突起膠細胞、感覚器細胞（水晶体、網膜、内耳等）、角膜内皮、皮膚表皮細胞、毛包等の外胚葉系細胞；血管、骨、軟骨、骨格筋、靱帯、心筋等の中胚葉系細胞；肝臓、膵外分泌細胞、膵内分泌細胞、口腔、食道、気管、異、腸等の内胚葉系細胞が挙げられる。また、体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、骨髄幹細胞、皮膚幹細胞、網膜幹細胞等が挙げられる。

遠心分離管に分注される生細胞含有液には、前記生細胞の他、特に限定されず、細胞分離用酵素、緩衝液、生理食塩液、培地、血清等が含まれていてもよい。

本発明において、生細胞含有液を遠心分離する方法は、特に限定されず、公知の方法、例えば５００〜２０００ｒ／ｍｉｎで１〜１０分行うことができる。
遠心分離は、例えば細胞回収時に生細胞から溶解用の培地を取り除く目的で、あるいは細胞分散時にトリプシン／ＥＤＴＡ等の細胞分散液を取り除く目的で行われ、極めて高い回収率で生細胞を回収できる。

体性幹細胞を含有する生細胞は、本発明方法により遠心分離した後、通常のニューロスフェア法により分離・増殖させることにより、多量のニューロスフェアを得ることができる。このニューロスフェア法は、例えば脳組織の場合、採取細胞を浮遊培養することで単一細胞起源の細胞塊（スフェア）を得る。得られたスフェアは単一細胞起源であるにも関わらず、ニューロンの他グリア細胞などの細胞マーカーを発現し多様な細胞へ分化する能力を備えていると考えられる。

以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。

実施例１
樹脂材料としてポリプロピレン樹脂（住友ノーブレン社製、ＷＰ７０８）を用いて、射出成形（成形機：日精樹脂工業製６０ｔ、シリンダー温度：２２５℃−２２０℃−１９５℃−１８５℃、射出速度：２５％−２０％−１５％、射出圧力：４０％−３０％−２５％、金型冷却：３０℃）により５０ｍＬ遠心分離管を形成した。
得られた遠心分離管の形状は、高さ１１５ｍｍ、外径３０ｍｍ、容量５０ｍＬのＶ底チューブであった。
得られた遠心分離管にプラズマ処理装置（ＢＲＡＮＳＯＮ／ＩＰＣ社製ＳＥＲＩＥＳ７０００）を用いてプラズマ処理（酸素プラズマ５分）を行った。次いで、側鎖に官能基を有する水溶性樹脂として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（東洋合成工業社製ＡＷＰ、水溶性樹脂の平均重合度１，８００、第１の官能基の変性率０．６ｍｏｌ％）をアルミ箔で遮光をしたガラス容器中で、２０容量％エタノール水溶液に溶解し、１．０重量％の溶液を調整した。前記のプラズマ処理を行った遠心分離管を前記アルミ箔で遮光をしたガラス容器に１分間、浸漬した後、取り出し、４０℃で６０分一次乾燥した後、ＵＶランプでＵＶ光を０．１ｍＷ／ｃｍ²×５分間照射して前記側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を硬化した後純水で洗浄して、本発明の生細胞分離用遠心分離管を得た。

得られた遠心分離管の内表面の水接触角を以下の方法にて測定した結果、水接触角は０度であった。
◎水接触角の測定
遠心分離管を１ｃｍ角で切り出し、超純水に３〜５秒間浸漬した後に取り出して作業台の上で１分間表面を地面に対して垂直にした状態で静置したものを試験片とし、２５℃の室温において接触角計を用いて試験片の上に２０μＬの水を滴下して測定した。

比較例１
プラズマ処理と官能基を有する水溶性樹脂の反応工程を行っていない、実施例１と同一の材料で同一の条件で形成した５０ｍＬ遠心分離管を比較例とした。
得られた遠視分離官の水接触角を上記と同様に測定した結果、水接触角は８１度であった。

試験例
アメリカアイバンクより提供された研究用輸入角膜から角膜内皮組織を採取し、０．０２％コラゲナーゼを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、培地添加物Ｂ−２７、成長因子ｂＦＧＦ４０ｎｇ／ｍＬ、成長因子ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ、抗生剤の組成からなる幹細胞分離用培地を用いて角膜内皮組織の角膜内皮細胞を単離した。
得られた細胞含有液を、実施例１及び比較例１で製造した遠心分離管にそれぞれ２．５ｍＬずつ分注し、さらにＰＢＳ（−）５ｍＬでディッシュを共洗いし、２．５ｍＬずつ分注した。この操作を３回繰り返した。次いで、１２００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清を除去した後、ＰＢＳ（−）１０ｍＬで洗浄し、再び１２００ｒｐｍ、５分間の遠心を行って細胞を回収した。
次いで、トリプシン／ＥＤＴＡで３７℃、５分間処理し、凝集した細胞をピペッティングにて分散し、細胞数をコールターカウンターＺ１（ベックマンコールター社製）を用いて測定した。その結果を図１に示す。
図１から明らかなように、実施例１で製造した本発明の遠心分離管は高い回収率で組織中の細胞を回収できることが確認された。

試験例２
試験例１で得られた角膜内皮細胞から、公知技術に従い幹細胞の採取を行った。すなわち、角膜内皮細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に、培地添加物Ｂ−２７、成長因子ｂＦＧＦ４０ｎｇ／ｍＬ、成長因子ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬを加えた無血清培地で、球状の細胞塊浮遊として幹細胞を選択的に浮遊状態で分離培養させることで、幹細胞の採取を行った。その結果、表１に示すとおり、有効に幹細胞・前駆細胞の特徴をもった細胞集団を採取できた。

遠心分離により回収できた細胞数を示す図である。

Claims

水との接触角が０〜１度である表面を有する体性幹細胞を含む生細胞分離用遠心分離管。
水との接触角が０〜１度である表面が、親水性樹脂による被覆層、又は側鎖に官能基を有する水溶性樹脂を硬化した被覆層である請求項１記載の遠心分離管。
親水性樹脂が、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート又はこれを含む共重合体、ポリオキシＣ₂−Ｃ₄アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体及びメタクリロイルオキシアルキルホスホコリン重合体又はこれを含む共重合体から選ばれる樹脂である請求項２記載の遠心分離管。
側鎖に官能基を有する水溶性樹脂が、感光性の官能基を有する、ポリ酢酸ビニルのケン化物、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコールである請求項２記載の遠心分離管。
請求項１〜４のいずれか１項記載の遠心分離管を用いて体性幹細胞を含む生細胞含有液を遠心分離することを特徴とする体性幹細胞を含む生細胞の分離方法。