DE60035490T2

DE60035490T2 - Methode zur Identifizierung von Verbindungen, die die Trennung von Schwesterchromatide modulieren

Info

Publication number: DE60035490T2
Application number: DE60035490T
Authority: DE
Inventors: Frank Uhlmann; Kim Nasmyth; Jan-Michael Peters; Irene Waizenegger; Sara Buonomo; Rosemary Clyne
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1999-02-15
Filing date: 2000-02-14
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2020-02-15
Also published as: WO2000048627A1; ATE366585T1; US7410774B1; CA2362794C; EP1029547A1; DE60035490D1; CA2362794A1; MXPA01008214A; EP1154788B1; ES2290016T3; EP1154788A1; JP2002538781A; EP1154788B9; JP4377073B2

Description

Die Erfindung betrifft Verbindungen, die die Mitose und Meiose in eukaryontischen Zellen beeinflussen, sowie Verfahren zur Identifizierung derartiger Verbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung allgemein die Therapie und Prophylaxe von Zuständen bei Menschen durch Modulation der Schwesterchromatid-Segregation.
Während des Vorgangs der Zellteilung werden Schwesterchromatide durch Mikrotubuli, die von Spindelpolen an gegenüberliegenden Seiten der Zelle ausgehen, zu gegenüberliegenden Hälften der Zelle gezogen. Ein Satz von Mikrotubuli ist mit anderen Mikrotubuli, die vom entgegengesetzten Pol ausgehen, verzahnt. Ihre Rolle besteht darin, die beiden Pole auseinander zu halten (und zu treiben). Währenddessen heftet sich ein zweiter Satz von Mikrotubuli über spezialisierte Strukturen, die als Kinetochoren bezeichnet werden, an Chromosomen an und stößt sie in Richtung der Pole. Schwesterchromatide segregieren auseinander, da ihre Kinetochoren an Mikrotubuli, die von gegenüberliegenden Polen ausgehen, haften (Rieder et al., 1998). Chromosomen sind während dieses Vorgangs keine reinen Passagiere. Während der Metaphase wird der Tendenz der Mikrotubuli, die Schwestern auseinander zu bewegen, durch ein kohäsives Festhalten der Schwestern aneinander entgegengewirkt. Die Kohäsion erzeugt daher die Spannung, mit der Zellen Schwesterchromatide an der Metaphasenplatte ausrichten. Sollten sich die Schwestern vor der Spindelbildung trennen, kann man sich nur schwer vorstellen, wie Zellen Schwestern aus Chromatiden, die nur homolog wären, unterscheiden können. Es wird angenommen, dass der plötzliche Verlust der Kohäsion und nicht eine zunehmende Aktivität der Mikrotubuli die Trennung der Schwestern während der Anaphase auslöst (Miyazaki et al., 1994). Die Kohäsion verhindert auch, dass Chromosomen aufgrund von Doppelstrangbrüchen auseinanderfallen, und erleichtert ihre Reparatur unter Anwendung von Rekombination.
Um eine fehlerhafte Segregation von Chromosomen zu vermeiden, darf die Anaphase erst eingeleitet werden, nachdem Schwesterchromatide eines jeden duplizierten Chromosoms an entgegengesetzten Polen der mitotischen Spindel haften. Es wird angenommen, dass Mikrotubuli Kinetochore durch einen "Such- und Einfang"-Mechanismus auffinden, der nicht gleichzeitig für sämtliche Chromosomen beendet werden kann (Hayden et al., 1990; Merdes und De Mey, 1990). Zellen besitzen daher regulatorische Mechanismen, die eine Verzögerung der Trennung von Schwesterchromatiden bewirken, bis das letzte Chromosom seine bipolare Anhaftung erreicht hat. Die Loslösung der Schwesterchromatid-Kohäsion beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase stellt daher während des eukaryontischen Zellzyklus einen hochgradig regulierten Schritt dar.
Die Schwesterchromatid-Kohäsion hängt von einem Komplex mit zahlreichen Untereinheiten mit der Bezeichnung Cohesin ab (Losada et al., 1998), der mindestens 4 Untereinheiten enthält: Smc1p, Smc3p, Scc1p und Scc3p, die alle zwischen Hefe und Menschen konserviert sind. Es ist wahrscheinlich (jedoch noch nicht bewiesen), dass Cohesin einen Schlüsselbestandteil der Halterung darstellt, die Schwesterchromatide zusammenhält. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Assoziation zwischen Cohesin und Chromosomen vom Scc2 (Mis4)-Protein abhängt. Während der DNA-Replikation besteht eine Kohäsion (Uhlmann und Nasmyth, 1998). Kürzlich wurde gezeigt, dass das Eco1 (Ctf7)-Protein für die Ausbildung der Kohäsion während der S-Phase erforderlich ist, während dagegen Cohesin nicht notwendig ist, um die Kohäsion während der G2- und M-Phasen aufrechtzuerhalten. In Hefe bleibt Cohesin bis zur Metaphase fest mit Chromosomen assoziiert; d. h. es ist an Chromosomen während deren Ausrichtung in der Metaphase vorhanden. In tierischen Zellen dissoziiert jedoch der Großteil des Cohesins von Chromosomen während der Prophase (Losada et al., 1998). Es ist unklar, welche Menge an Cohesin (wenn überhaupt) während der Metaphase an den Chromosomen verbleibt. Die Natur der Bindung, die Schwesterchromatide während der Metaphase in tierischen Zellen zusammenhält, ist daher ungeklärt. Es könnte entweder eine kleine Fraktion von Cohesin, die mit Chromosomen assoziiert bleibt, oder irgendein anderer Proteinkomplex beteiligt sein.
In Hefe verschwinden mindestens zwei Cohesin-Untereinheiten, nämlich Scc1p und Scc3p, plötzlich aus den Chromosomen, und zwar genau zu dem Zeitpunkt, an dem sich die Schwesterchromatide trennen (Michaelis et al., 1997). Dies hat zu der Auffassung geführt, dass eine plötzliche Veränderung des Zustands von Cohesin das Einsetzen der Anaphase auslösen könnte, zumindest in Hefe. In Drosophila verschwindet das meiS332-Protein, das während der Prometaphase an Chromosomen bindet, ebenfalls beim Einsetzen der Anaphase. MeiS332 ist für die Schwesterchromatid-Kohäsion während der Meiose erforderlich, jedoch nicht während der Mitose (Moore et al., 1998; Kerrebrock et al., 1995). MeiS332 ist vermutlich keine Cohesin-Untereinheit, und es ist nicht ersichtlich, ob bei Menschen homologe Proteine existieren.
Sowohl die Dissoziation von Scc1p von Chromosomen als auch die Trennung von Schwesterchromatiden hängen von einem spezialisierten Schwestertrennungsprotein (ein Separin) mit der Bezeichnung Esp1p ab (Ciosk et al., 1998). Zu Esp1 homologe Separine existieren in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe, im Pilz Aspergillus nidulans, im Nematodenwurm Caenorhabditis elegans, der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, im Frosch Xenopus laevis, in der Pflanze Arabidopsis thaliana und beim Menschen. Dies lässt stark darauf schließen, dass Separinen eine grundlegende Rolle bei der Chromosomen-Segregation zukommt, die unter Pflanzen, Pilzen und Tieren konserviert ist. Esp1 ist eng an ein Hemmprotein mit der Bezeichnung Pds1p gebunden, dessen Zerstörung kurz vor dem Übergang von der Metaphase zur Anaphase durch eine Ubiquitinierung ausgelöst wird, die durch den Anaphasen-Promotionskomplex (APC) gefördert wird (Cohen-Fix et al., 1996). APC ist ein großer Komplex mit mehreren Untereinheiten, wobei die meisten Untereinheiten zwischen Hefe und Menschen konserviert sind. Zusammen mit Aktivatorproteinen mit den Bezeichnungen Cdc20p und Cdh1p vermittelt es die Ubiquitinierung und dadurch die Zerstörung zahlreicher unterschiedlicher Zellzyklusproteine, einschließlich der Anaphase-Inhibitoren, wie Pds1 und mitotische Cycline. Die Zerstörung von Pds1 wird durch eine Form des APC, das vom Aktivator Cdc20 gebunden wird, vermittelt. Diese Form wird als APC^cdc20 bezeichnet (vergl. den Übersichtsartikel von Peters, 1998).
Proteine mit ähnlichen Eigenschaften wie Pds1 wurden in Spalthefe (Cut2p), in Xenopus und bei Menschen gefunden (Funabiki et al., 1996; Zou et al., 1999). APC ist essentiell für die Schwesterchromatid-Separation bei den meisten, wenn nicht bei allen eukaryontischen Organismen. In Hefe ist klar ersichtlich, dass seine Hauptrolle bei der Förderung der Schwesterseparation darin besteht, Pds1 zu zerstören, das Esp1 freisetzt und es diesem ermöglicht, die Schwesterchromatid-Kohäsion zu zerstören, möglicherweise durch Zerstörung der physikalischen Bindungen zwischen Schwestern, die durch Cohesin vermittelt wird.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, den Mechanismus der Trennung von Schwesterchromatiden weiter aufzuklären.
Insbesondere besteht eine Aufgabe der Erfindung, den Mechanismus aufzuklären, mit dem Esp1p die Dissoziation von Scc1p von Chromosomen in sich entwickelnder Hefe vermittelt, um diesen Mechanismus auszunützen, indem man ihn als Ziel bei der Humantherapie verwendet, insbesondere bei der Krebstherapie, sowie als Ziel bei sämtlichen anderen Situationen, bei denen eine Modulation der Trennung von Schwesterchromatiden von therapeutischem oder anderweitigem Nutzen ist.
Zur Lösung der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe wurde der folgende Weg eingeschlagen:
Die Beobachtung, dass die Dissoziation von Scc1p von Chromosomen beim Einsetzen der Anaphase von Esp1 abhängig ist, ließ darauf schließen, dass Esp1 entweder eine direkte Rolle bei diesem Vorgang spielt oder dass Esp1 indirekt durch Initiierung eines Vorgangs beteiligt ist, der zur Scc1p-Dissoziation führt. In den erfindungsgemäßen Experimenten wurde festgestellt, dass Esp1 ferner die Assoziation von Scc1p mit Chromosomen während G1 verhindert (vergl. Beispiel 1), was stark darauf schließen lässt, dass die Rolle von Esp1 sehr direkt ist. Scc1p ist ein instabiles Protein, das im Anschluss an seine Dissoziation aus Chromosomen beim Einsetzen der Anaphase rasch zerstört wird und das während des späten G1 im Verlauf des nächsten Zellzyklus resynthetisiert werden muss, um für die Kohäsion bei der nächsten Runde der DNA-Replikation zu sorgen (Michaelis et al., 1997). Es wurde festgestellt, dass Scc1p, das während G2 synthetisiert worden ist, ebenfalls zur Bindung an Hefechromosomen befähigt ist, dass es aber nicht unter diesen Umständen eine Kohäsion erzeugt (Uhlmann und Nasmyth, 1998). Es wurde jedoch festgestellt, dass Scc1p, das während des frühen G1 synthetisiert worden ist, nur schlecht (wenn überhaupt) an Chromosomen bindet. Wie in 1 dargestellt, erlaubt eine Inaktivierung von Esp1 die wirksame Assoziation zwischen Scc1p und Chromosomen während des frühen G1. Daraus wird gefolgert, dass Esp1 nicht nur die Dissoziation von Scc1p aus Chromosomen beim Einsetzen der Anaphase auslöst, sondern auch die stabile Assoziation von Scc1p mit Chromosomen während der anschließenden G1-Periode verhindert. Dies lässt stark darauf schließen, dass Esp1 eine recht direkte Rolle bei der Steuerung der Assoziation zwischen Scc1p und Chromosomen ausübt.
Ausgehend von diesem Befund wurde ein Test entwickelt, mit dem die Aktivität von Esp1 in vitro gemessen werden kann. Ein rohes Präparat von Hefe-Chromatin, das aus Zellen isoliert worden war, die durch Nocodazol in einem metaphasenartigen Zustand angehalten worden waren, wurde mit einem löslichen Extrakt inkubiert, der aus Zellen hergestellt worden war, die eine Überproduktion an Esp1 aus dem GAL-Promotor aufwiesen (2). Zum Nachweis wurden Scc1p-Zellen verwendet, deren Scc1-Protein an seinem C-Terminus mit mehrfachen HA- oder Myc-Epitopen markiert war, das dann leicht mit monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden kann. Etwa 70 % des gesamten Scc1p in mit Nocodazol blockierten Zellen ist eng mit Chromatin assoziiert und ist daher in der Chromatin-Fraktion, die verwendet wurde, vorhanden. Der Großteil des Scc1p bleibt im Anschluss an eine Inkubation mit einem Extrakt, der aus mutanten esp1-1-Zellen hergestellt worden ist, eng mit Chromatin assoziiert, jedoch verschwindet der Großteil aus der Chromatin-Fraktion bei Inkubation mit Extrakten, die hohe Konzentrationen an Wildtyp-Esp1-Protein enthalten. Es war einigermaßen überraschend, dass Scc1p-Protein, das durch Esp1 zur Dissoziation aus Chromatin induziert worden war, in der "löslichen" Überstandsfraktion als ein gespaltenes Produkt auftrat. Die C-terminalen Fragmente dieser Spaltung wurden unter Verwendung eines C-terminal markierten Scc-Proteins als Substrat nachgewiesen und N-terminale Fragmente wurden unter Verwendung eines N-terminal markierten Scc1-Proteins als Substrat nachgewiesen. Die Größen dieser Spaltungsprodukte ließen darauf schließen, dass Esp1 eine oder mehrere spezifische Spaltungen von Scc1p innerhalb eines 10 kd-Intervalls induziert. Diese Esp1-abhängige Spaltung wurde durch Zugabe von Reticulatlysat gehemmt, das Pds1 translatiert hatte, wurde jedoch nicht durch ein ansonsten identisches Lysat gehemmt, das ein nicht-einschlägiges Kontrollprotein translatiert hatte. Die durch den Spaltungstest nachgewiesene Esp1-Aktivität wird daher durch Pds1 gehemmt, was erstmals direkt den Nachweis erbringt, dass Pds1 tatsächlich ein Inhibitor von Esp1p ist.
Um festzustellen, ob eine Esp1-induzierte Spaltung von Scc1p auch in vivo beim Einsetzen der Anaphase auftritt, wurde ein Hefestamm konstruiert, bei dem die Expression des APC-Aktivators Cdc20p unter der Kontrolle des durch Galactose induzierbaren GAL1-10-Promotors steht. Der Stamm exprimierte ebenfalls ein Scc1-Protein, das an seinem C-Terminus mit mehrfachen HA- oder myc-Epitopen markiert war. Zellen von diesem Stamm wurden durch Inkubation in galactosefreiem Medium in der Metaphase arretiert und sodann durch Zugabe von Galactose in hochgradig synchroner Weise zur Einleitung der Anaphase induziert. 3 zeigt, dass sich Schwesterchromatide in den meisten Zellen innerhalb von 15 Minuten trennen und dass Scc1p von Chromosomen mit ähnlicher, wenn nicht identischer Kinetik dissoziiert. Eine geringe Konzentration an Scc1-Spaltungsprodukt wurde nachgewiesen, das identisch mit dem Produkt ist, das in vitro in zyklisierenden Zellen festgestellt wird, jedoch nicht in Zellen, die in der Metaphase arretiert sind. Das Spaltungsprodukt trat plötzlich nach Induktion mit Galactose mit einer Kinetik auf, die ähnlich, wenn nicht identisch mit der Trennung von Schwesterchromatiden und der Dissoziation von Scc1p aus Chromosomen war. Um festzustellen, ob diese in vivo-Spaltung von der Esp1-Aktivität abhängig war, wurde das Ausmaß der Scc1p-Spaltung im Wildtyp und in esp1-1-Mutanten bei Freigabe aus der cdc20-Arretierung bei 35,5°C verglichen (die restriktive Temperatur für esp1-1). Das Ausmaß der Scc1p-Spaltung war in der esp1-1-Mutante stark verringert. Es wurde der Schluss gezogen, dass Esp1 die Spaltung von Scc1p und dessen Dissoziation aus Chromosomen sowohl in vivo als auch in vitro fördert.
Bezüglich der Frage, ob die durch Esp1 vermittelte Spaltung von Scc1 für die Trennung von Schwesterchromatiden oder für die Dissoziation von Scc1p aus Chromosomen von Bedeutung ist, wurde die Spaltungsstelle kartiert, um sie anschließend einer Mutation unterwerfen zu können. Ein epitopmarkiertes Scc1p-Protein aus Zellen, die so stimuliert worden waren, dass sie durch Induktion der Cdc20-Expression in die Anaphase eintraten, wurde immunopräzipitiert und die immunopräzipitierten Proteine wurden an SDS-PAGE getrennt. Eine kurze Strecke der N-terminalen Aminosäuresequenz vom C-terminalen Spaltungsfragment wurde sodann durch Edman-Abbau bestimmt. Es ergab sich, dass die in vivo-Spaltung zwischen einem Paar von Argininen in den Positionen 268 und 269 eingetreten war. Der N-terminale Rest dieser Argininreste wurde sodann zu Asparaginsäure mutiert und eine HA-markierte Version wurde anschließend aus dem GAL1-10-Promotor in Hefezellen exprimiert, deren endogenes Scc1-Protein mit myc markiert war. Eine durch Galactose induzierte Expression dieses einzelnen mutanten Proteins hatte einen geringen Einfluss auf die Zellproliferation. Um festzustellen, ob die Mutation tatsächlich die Spaltung beseitigt hatte, wurde Chromatin aus Zellen, die das mutante Protein exprimieren, isoliert und als Substrat im Esp1-Test verwendet. Es ergab sich, dass die Spaltung an Position 268 tatsächlich durch die Asparaginsäure-Mutation beseitigt worden war. Jedoch wurde das mutierte Protein immer noch in einer Esp1-abhängigen Weise gespalten. Das C-terminale Spaltungsprodukt des mutanten Proteins war etwa 10 kDa länger als das des Wildtyps. Diese Ergebnisse werden so interpretiert, dass Scc1p tatsächlich an zwei Stellen im Abstand von etwa 10 kDa gespalten wird. Die Spaltung an der näher am C-Terminus liegenden Stelle ist sehr wirkungsvoll, was den Grund dafür darstellt, dass C-terminale, markierte Proteine, die nur an der näher am N-Terminus liegenden Stelle gespalten worden waren, kaum nachgewiesen wurden.
Um die zweite Spaltungsstelle zu identifizieren, wurde nach Sequenzen innerhalb von Scc1p gesucht, die in ihrer Sequenz ähnlich wie die Umgebung der bekannten C-terminalen Spaltungsstelle sind. Es wurde festgestellt, dass 5 von 7 Aminosäuren in Position 180 übereinstimmten. Ferner ist der Abstand zwischen dieser potentiellen Stelle und der bekannten Spaltungsstelle konsistent mit der größeren Länge des Spaltungsprodukts, das in vitro aus Protein erzeugt wird, dessen C-terminale Stelle (R268) mutiert worden ist. Die übereinstimmende Sequenz enthielt auch ein Paar von Argininresten und daher wurde das näher am N-Terminus liegende Arginin zu Asparaginsäure mutiert. Anschließend wurde der Einfluss der Expression von HA-markierten Versionen von Wildtyp-Scc1p, von beiden Proteinen mit der einzelnen Mutation und dem Protein mit der doppelten Mutation aus dem GAL1-Promotor in Hefe verglichen. Als Wirt für diese Studien wurde ein Stamm verwendet, dessen endogenes Scc1p mit myc markiert war. Weder der Wildtyp noch das Produkt mit einer einzigen Mutation blockierte die Zellproliferation, während die Expression des doppelt mutierten Proteins letal war. Chromatin aus Zellen, die vorübergehend diese Proteine exprimieren, wurde hergestellt und es wurde gezeigt, dass mit HA markiertes, doppelt mutiertes Protein nicht mehr gespalten wurde, wenn es in Esp1 enthaltenden Extrakten inkubiert wurde, während das myc-markierte Wildtypprotein in wirksamer Weise gespalten wurde.
Um zu untersuchen, warum Zellen, die ein nicht-spaltbares Scc1p-Protein exprimieren (die R180D-R268D-Doppelmutante), sich nicht vermehren können, bediente man sich einer zentrifugalen Schlämmung, um G1-Zellen aus einer Kultur, die in Abwesenheit von Galactose wächst, zu isolieren, wobei die Zellen anschließend in Gegenwart und Abwesenheit von Galactose inkubiert wurden (4). Um die Dauer der Expression des mutanten Proteins auf ein Minimum zu beschränken, wurden die in Gegenwart von Galactose gezüchteten Zellen auf ein Glucose enthaltendes Medium übertragen, nachdem der Großteil der Zellen ihre DNA repliziert hatte (nach 135 Minuten). In Abwesenheit von Galactose erfolgten die Schwestertrennung und die Dissoziation von Chromosomen von endogenem, myc-markiertem Scc1p gleichzeitig, etwa 60 Minuten nach der DNA-Replikation. Eine vorübergehende Expression von doppelt mutiertem Protein verringerte in starkem Maße die Trennung von Schwesterchromatiden (4b), beeinflusste auch nicht die Dissoziation von endogenem, myc-markiertem Wildtypprotein (4c und d). Ferner blieb das mutante Protein lange nach Verschwinden des endogenen Wildtypproteins in enger Assoziation mit Chromosomen. Die Expression des mutanten Proteins verzögerte nicht in starkem Maße das Ablaufen des Zellzyklus und die meisten Zellen unterlagen einer Cytokinese unter Erzeugung einer Nachkommenschaft mit geringen (0–0,5C) Mengen an DNA und Zellen mit weniger als 2C DNA-Gehalt (4a). Die planmäßige Dissoziation des Wildtypproteins von Chromosomen zeigt, dass die fehlende Schwestertrennung in Zellen, die nicht-spaltbares Scc1p exprimieren, nicht auf einen Mangel an Esp1-Aktivität zurückzuführen ist. Zusammengenommen lassen die erhaltenen Daten darauf schließen, dass die Spaltung von Scc1p an einer von beiden Stellen sowohl für die Trennung von Schwesterchromatiden als auch für die Dissoziation von Scc1p aus Chromosomen notwendig ist.
Aus den erhaltenen Ergebnissen lässt sich der Schluss ziehen, dass Cohesin direkt die Verknüpfung zwischen Schwesterchromatiden vermittelt, die während der DNA-Replikation besteht und bis zur Metaphase aufrechterhalten wird. Ferner lässt sich der Schluss ziehen, dass die Aktivierung von Esp1 durch Proteolyse von Pds1 (und durch noch zu identifizierende andere Mechanismen) eine Aktivität im Innern von Zellen erzeugt, die die Scc1p-Untereinheiten von Cohesin spaltet, und dass dieses Ereignis sowohl die Kohäsion von Schwesterchromatiden zerstört als auch bewirkt, dass Scc1p und möglicherweise andere Cohesin-Untereinheiten von Chromosomen dissoziieren.
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist klar ersichtlich, dass die Trennung von Schwesterchromatiden von der Spaltung von an Chromosomen gebundenem Scc1 durch eine Esp1-abhängige proteolytische Aktivität abhängt, die in Zellen beim Einsetzen der Anaphase auftritt. Anschließend stellte sich die Frage, ob Scc1 als ein isoliertes Protein (und nicht im chromosomalen Zusammenhang) ebenfalls als ein Substrat für die von Esp1 abhängige Spaltungsreaktion dienen kann. 5 beschreibt die Reinigung von rekombinantem Scc1 nach Überexpression in Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind. Scc1 wurde entweder aus einer asynchron wachsenden Population von infizierten Insektenzellen (5a, Bahnen 1–4) oder aus infizierten Insektenzellen, die mit dem Phosphatase-Inhibitor Okadainsäure behandelt worden waren, gereinigt. Die Behandlung mit Okadainsäure induziert einen metaphasenartigen Zustand innerhalb der Insektenzellen, als dessen Folge Scc1 in einer mitotisch phosphorylierten Form erhalten wird (5a, Bahn 5). Scc1 in Hefe tritt ebenfalls in einer auf mitosespezifische Weise phosphorylierten Form auf. Diese Scc1-Fraktionen, die gemäß SDS-PAGE unter anschließender Färbung des Gels mit Coomassie-Brillantblau eine Reinheit von mehr als 90 % aufwiesen, wurden sodann im Scc1-Spaltungstest gemäß den vorstehenden Angaben verwendet (5b). Sowohl unphosphoryliertes als auch phosphoryliertes, gereinigtes Scc1 wurden in vitro in einer von Esp1 abhängigen Weise gespalten, jedoch war der Wirkungsgrad der Spaltung wesentlich höher, wenn Scc1 im mitotisch phosphorylierten Zustand verwendet wurde. Aus diesem Experiment wurde der Schluss gezogen, dass isoliertes Scc1, das weder ein Bestandteil des Cohesin-Komplexes ist, noch an Chromosomen gebunden ist, ein Substrat für die Spaltung durch Esp1 darstellt, zumindest wenn es in seinem mitotisch phosphorylierten Zustand vorliegt.
Sodann wandte man sich der Frage zu, ob Esp1 selbst die Protease darstellt, die Scc1 spaltet. Inhibitorstudien zeigten, dass die in vitro-Spaltungsaktivität durch N-Ethylmaleinimid, einen für Proteasen spezifischen Inhibitor unter Verwendung eines katalytischen Cysteinrestes, gehemmt werden konnte. Eine Prüfung der Aminosäuresequenz innerhalb der evolutionär konservierten C-terminalen Hälfte von Esp1 ergab, dass genau ein Cysteinrest und ein Histidinrest in sämtlichen bekannten Separase-Homologen konserviert sind. Diese beiden Reste könnten daher die katalytische Diade einer neuen Unterklasse von Cystein-proteasen bilden. Bei weiterer Analyse der die potentielle katalytische Diade umgebenden Aminosäuresequenzen wurde festgestellt, dass sowohl dem Cystein- als auch dem Histidinrest eine Sequenzfolge vorausgeht, von der vorherzusagen ist, dass sie ein hydrophobes beta-Blatt bildet. Ferner ist der Histidinrest in unveränderlicher Weise von zwei Glycinresten flankiert und dem Cystein geht ein Glycin voraus, das die Möglichkeit für enge Windungen vor oder nach den katalytischen Resten bietet. Diese Anordnung eines Histidin- und eines Cysteinrestes einer katalytischen Diade, die an den Enden von zwei benachbarten Strängen eines hydrophoben beta-Blattes fixiert sind, wird in der Caspase-Familie von Proteasen verwendet und es ist wahrscheinlich, dass die gleiche Anordnung auch in Separasen, wie Esp1, verwendet wird.
Um den Nachweis zu führen, dass Esp1 tatsächlich diese zwei Aminosäurereste Histidin (Aminosäureposition 1505) und Cystein (Position 1531) als eine katalytische Diade zur Spaltung von Scc1 verwendet, wurde jede dieser Aminosäuren zu Alanin mutiert. Beide Mutationen beseitigten vollständig die proteolytische Aktivität in Hefeextrakten nach Überproduktion der Proteine (6). Wildtyp-Esp1, das in einem ähnlichen Ausmaß überexprimiert wurde, verursachte eine vollständige Spaltung des Scc1-Substrats. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass Histidin 1505 und Cystein 1531 höchstwahrscheinlich die katalytische Diade bilden, die Esp1 mit ihrer proteolytischen Aktivität zur Spaltung von Scc1 ausstattet.
Zusammen belegen diese Ergebnisse zwingend, dass eine proteolytische Reaktion, bei der Esp1-Separase das Cohesin Scc1 spaltet, das einleitende Ereignis für die Trennung von Schwesterchromatiden beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase bei der Mitose in S. cerevisiae darstellt.
Anschließend wurde die Frage gestellt, ob möglicherweise der gleiche proteolytische Mechanismus den Beginn der Chromosomentrennung während der beiden meiotischen Kernteilungen bewirkt. Während der prämeiotischen DNA-Replikation ersetzt ein Scc1-Homologes, als Rec8 bezeichnet, das Scc1 im Cohesinkomplex (Klein et al., 1999). Rec8 enthält ebenso wie Scc1 zwei Separase-Erkennungsstellen, was darauf schließen lässt, dass Esp1/Separase möglicherweise Rec8 während der Meiose spaltet, um eine meiotische Chromosomentrennung einzuleiten. Um dies zu testen, wurden beide Separase-Spaltungsstellen innerhalb von Rec8 mutiert, um eine nicht-spaltbare Version dieses Proteins zu erzeugen. Die Expression des nicht-spaltbaren Rec8 während der Meiose führte zu einer Blockierung der ersten meiotischen Kernteilung (7A), was zeigt, dass die Spaltung von Rec8 notwendig ist, um Schwester-Chromatidarme bei der ersten meiotischen Teilung zu trennen. Bei Verfolgung der Meiose in einem Hefestamm mit einem Gehalt an der esp1-2-Mutation, einer temperaturempfindlichen Mutation im ESP1-Gen, wurde gleichermaßen eine temperaturabhängige Blockierung der ersten meiotischen Kernteilung beobachtet (7B). Es wurde der Schluss gezogen, dass Separase das Cohesin Rec8 während der meiotischen Kernteilungen spaltet, wie es Scc1 während der mitotischen Teilung spaltet.
Die Sequenzen von humanen Homologen von sprossender Hefe Esp1, Pds1 und Scc1 sind bereits in öffentlichen Datenbanken vorhanden. Die humanen Homologen von Esp1 und Pds1 werden auch als Separin oder Separase bezeichnet (Nagase et al., 1996; Proteinsequenz: NCBI Acc. No. BAA11482; DNA-Sequenz: NCBI Acc. No. D79987) bzw. als Securin (Zou et al., 1999; Dominguez et al., 1998), und das humane Homologe von Scc1 als SCC1 (McKay et al., 1996; DNA-Sequenz: NCBI Acc. No. X98294; Proteinsequenz: NCBI Acc. No. CAA66940). In Tierzellen wurde gezeigt, dass der Großteil von SCC1 aus Chromatin in der Prophase dissoziiert, lange bevor Schwesterchromatide in der Anaphase getrennt werden, und es wurde keine Spaltung von SCC1 während dieses Vorgangs beobachtet (Losada et al., 1999).
Ein weiteres Ziel der Experimente der vorliegenden Anmeldung bestand darin zu testen, ob ein Teil von SCC1 an kondensierten Chromosomen gebunden bleibt und die Schwesterchromatid-Kohäsion bis zur Einleitung der Anaphase aufrechterhält, und zu analysieren, ob die chromosomengebundene Form von SCC1 beim Einsetzen der Anaphase einer proteolytischen Spaltung unterlag.
Um diese Fragen zu beantworten, wurde der folgende Weg eingeschlagen: humane HeLa-Zellen wurden in der Interphase durch logarithmisches Wachstum und in der Metaphase durch Behandlung mit Nocodazol angereichert und rohes Chromatin und Überstandfraktionen wurden durch differentielle Zentrifugation erzeugt und auf die Anwesenheit von SCC1 durch quantitatives Immunoblotting analysiert (8). Die Menge des gesamten zellulären SCC1 in Assoziation mit Chromatin verringerte sich von 56 % in logarithmisch wachsenden Zellen auf 13 % in Zellen, die in der Metaphase verharrten. Es wurde der Schluss gezogen, dass der Großteil, aber nicht das gesamte SCC1 aus Chromatin vor der Metaphase dissoziiert, was mit der Möglichkeit, dass SCC1 möglicherweise für die Aufrechterhaltung der Schwesterchromatid-Kohäsion bis zum Einsetzen der Anaphase erforderlich ist, übereinstimmt.
Um festzustellen, ob die Form von SCC1, die mit Chromosomen in der Metaphase assoziiert ist, in der Anaphase abgespalten wird, wurden HeLa-Zellen beim Einsetzen der S-Phase durch doppelte Thymidinbehandlung arretiert und gleichzeitig in den Zellzyklus freigegeben. Das Durchlaufen des Zellzyklus wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Freigabe durch Analyse des DNA-Gehalts unter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und durch Analyse der Gesamtzelllysate in Immunoblotexperimenten überwacht. 9 zeigt, dass ein mutmaßliches SCC1-Spaltungsprodukt, entsprechend 100 kDa, durch Antikörper, die für den C-Terminus von SCC1 spezifisch waren, erkannt wurde. Von Bedeutung ist, dass diese Bande spezifisch auftrat, wenn die HeLa-Zellen die Anaphase durchliefen, wie durch FACS-Analyse und das Verschwinden von Securin, Cyclin B und CDC20 (Proteine, von denen bekannt ist, dass sie spezifisch in der Anaphase abgebaut werden) festgestellt wurde.
Um zu bestätigten, dass die anaphasenspezifische 100 kDa-Bande ein Spaltungsprodukt von SCC1 und nicht ein unspezifisches Kreuzreaktionsprodukt der verwendeten Antikörper ist, wurden die folgenden beiden Experimente durchgeführt: Zunächst wurden für den N-Terminus von SCC1 spezifische Antikörper erzeugt und durch Immunoblotting zur Analyse der HeLa-Zellzyklusfraktionen verwendet. Eine Bande mit 25 kDa wurde spezifisch in der Anaphase erkannt (9), was mit der Interpretation übereinstimmt, dass SCC1 in ein C-terminales 100 kDa-Fragment und ein N-terminales 25 kDa-Fragment gespalten wird. Zweitens wurde eine HeLa-Zelllinie, die in stabiler Weise Mäuse-SCC1 in Fusion mit einer myc-Epitopmarkierung am C-Terminus (SCC1-myc) durch Zellsynchronisation auf die vorstehende Weise analysiert. Die Menge des in diesen Zellen exprimierten SCC1-myc beträgt weniger als 10 % des endogenen SCC1 und das ektopische Protein ist vollständig in 14S-Cohesin-Komplexe eingebaut (10A). in synchronisierten Zellen erkennen Antikörper gegen das myc-Epitop eine Bande der erwarteten Größe (120 kDa), die in der Anaphase mit einer ähnlichen Kinetik wie die durch SCC1-Antikörper erkannten 100 kDa- und 25 kDa-Banden auftritt, was zweifelsfrei zeigt, dass Säugetier-SCC1 in der Anaphase gespalten wird (10B). Ferner ergaben diese Immunoblots ein zweites anaphasenspezifisches Fragment von SCC1-myc, was darauf schließen lässt, dass die SCC1-Spaltung an mindestens zwei Stellen auftritt (10B, unteres Feld).
Biochemische Experimente in Xenopus haben gezeigt, dass die Einleitung der Anaphase von der Proteolyse von Securin, die durch APC^CDC20 vermittelt wird, abhängt (Zou et al., 1999). Wie Pds1 und Esp1 von sprossender Hefe bilden Securin und Separase einen Komplex, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass die von APC^CDC20 abhängige Securin-Proteolyse Separase aktiviert. Um festzustellen, ob die SCC1-Spaltung von der Aktivierung von APC^CDC20 und der anschließenden Securin-Proteolyse abhängt, wurden HeLa-Zellen durch doppelte Thymidinbehandlung synchronisiert und in Gegenwart von Nocodazol in den Zellzyklus freigesetzt. Nocodazol ist ein Arzneistoff, von dem bekannt ist, dass er indirekt die Hemmung von APC^CDC20 und dadurch den Stillstand der Zellen in der Metaphase hervorruft (Übersichtsartikel von Peters, 1998). Gegen humanes Securin spezifische Antikörper wurden erzeugt, und es wurde gezeigt, dass Securin unter diesen Bedingungen nicht abgebaut wurde (11). Von Bedeutung ist, dass keine Spaltung von SCC1 in Gegenwart von Nocodazol festgestellt werden konnte. Der Einfluss des Arzneistoffes war reversibel, da die Freisetzung von mit Nocodazol arretierten Zellen in die Anaphase mit dem Abbau von Securin und der Bildung der SCC1-Spaltungsprodukte korrelierte (12). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die SCC1-Spaltung von der Aktivierung von APC^CDC20 abhängt, und sie stimmen mit der Hypothese überein, dass der Abbau von Securin und die anschließende Aktivierung von Separase für die SCC1-Spaltung erforderlich sind.
Zur weiteren Analyse der Regulierung der SCC1-Spaltung und als ein erster Schritt zur Entwicklung eines Screeningtests auf Inhibitoren dieser Reaktion wurde ein in vitro-Test unter Verwendung von SCC1-myc und Zellzyklusextrakten, die aus Xenopus-Eiern hergestellt worden waren, entwickelt. Diese Extrakte können so manipuliert werden, dass sie entweder einen stabilen Interphasenzustand, bei dem APC^CDC20 inaktiv ist, oder einen stabilen mitotischen Zustand, bei dem APC^CDC20 aktiv ist und bei dem eine Trennung von Schwesterchromatiden in vitro erfolgen kann, repräsentieren (Murray et al., 1991). Wenn aus HeLa-Zellen, die in stabiler SCC1-myc exprimieren, isoliertes Chromatin in Xenopus-Extrakten inkubiert wurde, konnte eine Spaltung von SCC1 an zwei getrennten Stellen im mitotischen Extrakt, jedoch nicht im Interphasenextrakt nachgewiesen werden, was eine weitere Bestätigung dafür darstellt, dass die APC^CDC20-Aktivität für dieses Ereignis erforderlich ist (13). Bei SDS-PAGE wanderten die gebildeten Spaltungsprodukte in vitro gemeinsam mit den in vivo gebildeten Spaltungsprodukten, was darauf schließen lässt, dass die Spaltung im Extrakt an physiologisch relevanten Stellen erfolgt. Von Bedeutung ist, dass eine gewisse SCC1-Spaltung auch beobachtet wurde, wenn chromatinfreie Überstandfraktionen aus HeLa-Zellen mit mitotischen Extrakten vermischt wurden (13). Dies belegt, dass lösliches, humanes SCC1 ein Substrat für die Spaltung darstellen kann und somit die Entwicklung eines vereinfachten, chromatinfreien Spaltungstests für Arzneistoff-Screeningzwecke möglich macht.
Um die weiter N-terminale Spaltungsstelle in SCC1 zu kartieren, wurden eine Reihe von N- und C-terminalen Deletionsmutanten erzeugt und die elektrophoretische Beweglichkeit der geschnittenen Proteine wurde mit der Beweglichkeit der N- und C-terminalen Spaltungsprodukte, die in vivo entstanden, verglichen (14). cDNAs, die für Deletionsmutanten kodierten, wurden durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) erzeugt und rekombinante, S³⁵-markierte Proteine wurden aus den PCR-Produkten durch in vitro-Transkription und -Translation erzeugt. Diese Analyse zeigte, dass SCC1 zwischen den Aminosäureresten 169 und 183 gespalten wird. Diese Stelle enthält das Sequenzmotiv ExxR¹⁷², das in zahlreichen SCC1-Homologen in unterschiedlichen Spezies konserviert ist und auch in beiden N-terminalen Spaltungsstellen von Scc1 von sprossender Hefe auftritt. Vorläufige Ergebnisse unter Anwendung der gleichen Kartierungsstrategie zeigen, dass die C-terminale Spaltungsstelle in SCC1 sich um den Aminosäurerest 450 herum befindet, wo sich erneut das Motiv ExxR findet.
Auf der Grundlage der erfindungsgemäß durchgeführten Experimente lässt sich der Schluss ziehen, dass die von Separase abhängige SCC1-Spaltung einem Mechanismus folgt, der von knospenden Hefen bis zum Menschen konserviert ist und dass der gleiche Mechanismus höchstwahrscheinlich in sämtlichen eukaryontischen Organismen existiert. Die Befunde, die bei den an knospender Hefe durchgeführten Experimenten erzielt wurden, gelten daher auch in höheren eukaryontischen Organismen, insbesondere beim Menschen.
Die Interpretation der bei den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten erhaltenen Daten liefert ferner den Beweis, dass Esp1/Separase selbst die Protease ist, die für die Spaltung von Scc1p/SCC1 verantwortlich ist.
Aus den Ergebnissen, die bei den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten erhalten wurden, lässt sich unter anderem der Schluss ziehen, dass Scc1p/SCC1 die einzige Untereinheit der Kohäsionspaare ist, die durch Esp1/Separase gespalten wird. Dies schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass andere Typen von Proteinen, beispielsweise andere Kohäsionsproteine oder Proteine, die mitotische Spindeln regulieren, ebenfalls Ziele/Substrate von Separase sein können. Eine Möglichkeit, sich dieser Frage zuzuwenden, besteht in der Herstellung einer Version von Scc1p, bei dem eine Spaltungsstelle durch eine Stelle für eine fremde Protease ersetzt ist (wobei die andere Spaltungsstelle entfernt worden ist). Ein Beispiel für eine in zweckmäßiger Weise zu verwendende Protease ist die TEV-Protease (Daugherty et al., 1989), die eine sehr spezifische Spaltungsstelle aufweist (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly). Ein Stamm kann konstruiert werden, der folgende Bestandteile enthält: das SCC1-Gen mit einem Gehalt an einer TEV-Protease-Spaltungsstelle, eine chromosomale cdc20-3-Mutation und das TEV-Proteasegen unter GAL1-10-induzierbarer Kontrolle. In Gegenwart von Galactose bei der restriktiven Temperatur (wenn cdc20-3-Zellen in der Metaphase aufgrund ihres Versagens zur Zerstörung von Pds1 arretiert sind) kann der Einfluss der künstlichen Spaltung von Scc1p auf dessen Entfernung aus Chromosomen bestimmt werden (gemessen durch dessen Anwesenheit in sedimentierten, chromosomalen DNA-Fraktionen). Ob dies für die Trennung von Schwesterchromatiden ausreicht oder nicht, kann ebenfalls mikroskopisch unter Verwendung des CenV-GFP-Systems geprüft werden (Ciosk et al., 1998; vergl. Beispiel 3). Diese Experimente ermöglichen die Bestimmung, ob der Rest der Mitose unter diesen Bedingungen in Abwesenheit der Separase-Funktion ablaufen kann (es ist darauf hinzuweisen, dass Separase in cdc20-3-Mutanten bei der restriktiven Temperatur aufgrund der Anwesenheit ihres Inhibitors Pds1 inaktiv ist). Wenn die fremde Protease die Dissoziation von Scc1p aus Chromatiden unter diesen Umständen auslöst und Schwesterchromatide einer Segregation zu entgegengesetzten Polen der Hefezelle unterliegen, kann der Schluss gezogen werden, dass die Spaltung von Scc1 die einzige Funktion von Separase ist, die für die Segregation von Schwesterchromatiden notwendig ist. Wenn jedoch Schwesterchromatide nicht zu entgegengesetzten Polen der Zelle segregieren können, obgleich das variante Scc1p aus dem Chromatin entfernt worden ist, lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass Separase zusätzlich zur Spaltung von Scc1p eine oder mehrere Funktionen aufweist. Aufschlüsse bezüglich dieser Funktionen lassen sich aus dem Phänotyp dieser Zellen erhalten und diese können zur Identifizierung anderer potentieller Substrate für Esp1 herangezogen werden.
Die Befunde der erfindungsgemäß durchgeführten Experimente haben zu ersten entscheidenden Einsichten über den molekularen Mechanismus geführt, gemäß dem eukaryontische Zellen Schwesterchromatide trennen. Im Hinblick auf die veröffentlichte Literatur, die keine Hinweise über den Mechanismus, gemäß dem Schwesterchromatide getrennt werden, enthält, ist der Befund, dass Separasen durch Herbeiführung einer proteolytischen Aktivität wirken, hochgradig überraschend.
Die Identifizierung von Esp1/Separase als die für die Scc1/SCC1-Spaltung verantwortliche Protease und die Identifizierung von potentiellen Cofaktoren sind die Voraussetzung zur Entwicklung von Testmethoden, die das Auffinden von Verbindungen ermöglichen, die die Trennung von Schwesterchromatiden, die die Grundlage neuer therapeutischer Wege darstellt, stören.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von als Kandidaten in Frage kommenden Verbindungen, die das Potential zur Modulation der Trennung von Schwesterchromatiden besitzen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Separase in Gegenwart eines Substrats, das die Separase-Spaltstelle ExxR enthält, mit Testverbindungen inkubiert wird, und dass der modulierende Effekt der Testverbindungen auf die proteolytische Aktivität der Separase bestimmt wird.
Durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen, die ihre Wirkung durch direkte Modulation ausüben, insbesondere durch Hemmung der proteolytischen Aktivität von Separase, d. h. aufgrund ihrer Beschaffenheit als für Separase spezifische Protease-Inhibitoren, stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Störung des Mechanismus der Trennung von Schwesterchromatiden und somit einen neuen Weg zur Hemmung der Proliferation von sich rasch teilenden tierischen Zellen, insbesondere von Tumorzellen, bereit.
Nachstehend wird, sofern nichts anderes angegeben ist, der Ausdruck "Separase" als ein Synonym für beliebige Cystein-endopeptidasen mit Separase-artiger Aktivität, einschließlich des Hefehomologen Esp1, verwendet. Gleichermaßen ist der Ausdruck "SCC1" nicht auf das humane Separase-Substrat beschränkt, sondern soll beliebige homologe Substrate vom Cohesintyp umfassen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform kann für Anwendungen im Kleinmaßstab der Test, der in Beispiel 2 für Hefekomponenten beschrieben wird, zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die die Separase-Aktivität hemmen. Aufgrund der Existenz von Esp1-Homologen beim Menschen, d. h. Separase, kann der Schluss gezogen werden, dass die Separase-Aktivität eine wichtige Rolle bei der Auslösung des Einsetzens der Anaphase auch beim Menschen spielt. Daher kann unter Anwendung der Prinzipien, die in den Experimenten für Hefekomponenten beschrieben sind, ein von Separase abhängiger Spaltungstest unter Verwendung von humaner Separase und von SCC1 anstelle von Hefekomponenten entwickelt werden. Ein derartiger Test umfasst als wesentliche Merkmale die Inkubation eines rohen Präparats von Chromatin mit einem Präparat mit einem Gehalt an Separase-Aktivität und die Bestimmung von SCC1-Spaltungsprodukten in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testsubstanz.
Im allgemeinen kann es bei der Entwicklung eines Screeningtests wertvoll sein, den Test zunächst mit Hefebestandteilen als Testkomponenten durchzuführen und den Test anschließend unter Verwendung der Protease und/oder von Substrat aus mittleren Organismen, z. B. aus S. pombe oder Xenopus laevis, weiter zu entwickeln und schließlich gleichwertige humane Substrate einzusetzen. Beispielsweise enthält das S. pombe-Homologe von Scc1 (mit der Bezeichnung Rad21) zwei Sequenzen, die ähnlich den beiden bekannten Spaltungsstellen in Scc1 sind. Daher können von Rad21 abgeleitete Sequenzen zur Erzeugung eines Substrats für S. pombe-Esp1 (bezeichnet als Cut1) verwendet werden. Dieser Vorgang der Übertragung auf höhere Organismen kann stufenweise bis zum Erreichen eines humanen Systems angewandt werden. Die Spaltungsstelle eines jeden neuen Substrats für humane Separase kann bestimmt werden, indem man das Spaltungsprodukt reinigt und die N-terminalen Sequenzen durch Edman-Abbau auf die vorstehend angegebene Weise bestimmt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem Maßstab mit hohem Durchsatz durchgeführt. Für diese Ausführungsform werden die Haupttestkomponenten, insbesondere Separase, in rekombinanter Form verwendet.
Je nach der angestrebten Verwendung des zu identifizierenden Separase-Inhibitors können die verwendeten Testkomponenten in Bezug auf die Spezies, von der sie sich ableiten, variieren. Im Hinblick auf therapeutische Anwendungen bei Tieren oder Menschen stammen die Testkomponenten vorzugsweise von Säugetieren oder Menschen. Bei vorgesehenen landwirtschaftlichen Anwendungen stammen die Testkomponenten von Pflanzen.
Separase lässt sich gemäß üblichen Verfahren auf rekombinante Weise erzeugen, z. B. in Hefe- oder Insektenzellen oder in anderen geeigneten Wirtszellen, und zwar auf der Grundlage der Sequenzinformationen in der Literatur oder in Datenbanken. Das erhaltene Protein kann durch herkömmliche biochemische Fraktionierung aus Hefezellen, die eine Überproduktion von Separase zeigen, oder durch Markierung des überproduzierten Proteins mit Polypeptidsequenzen, die eine spezielle Affinität für einen definierten Liganden aufweisen (Affinitätsreinigung), gereinigt werden. Beispielsweise kann Separase an Nickel-Agarose-Säulen gereinigt werden, wenn sie mit mehrfachen Histidinresten markiert worden ist, während sie an Glutathion-Agarose-Säulen gereinigt werden kann, wenn sie mit GST markiert worden ist. Eine derartige Affinitätsreinigung beinhaltet die Spaltung von Separase von ihrer Markierungsstelle unter Verwendung von stellenspezifischen Proteasen oder selbstspaltenden Inteinen. Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Protein kann gemäß bekannten Verfahren zum Testen von proteolytischer Aktivität zur Beantwortung der Frage herangezogen werden, ob Separase allein zur Spaltung von Scc1p oder von davon abgeleiteten Peptidsubstraten befähigt ist. Für den Fall, dass Separase allein zur Spaltung von SCC1 oder eines von SCC1 abgeleiteten Peptids befähigt ist, lässt sich ein Test auf der Basis von (vorzugsweise rekombinanter) Separase als Protease und von dessen Substrat SCC1 leicht an ein Format mit hohem Durchsatz anpassen, wobei man Verfahren einsetzt, die für andere definierte Proteasen üblich sind, wie nachstehend ausgeführt wird.
Bei dem im Test geeigneten Proteasesubstraten kann es sich um solche handeln, die gleichwertig mit den natürlich auftretenden Substraten sind oder diese nachahmen, z. B. um rohe Chromatinpräparate, SCC1, vorzugsweise auf rekombinantem Wege hergestellt, oder SCC1-Peptid, das die proteolytische Spaltungsstelle enthält.
Auf der Grundlage der Informationen über die Sequenzspezifität der proteolytischen Separase-Spaltungsstelle in Hefe und beim Menschen lassen sich weitere potentielle Substrate für die Protease in anderen Organismen, einschließlich Menschen, auffinden, was ebenfalls die Entwicklung von Peptiden, die sich von diesen Substraten ableiten, ermöglicht, die sich als Substrate beim erfindungsgemäßen Screeningtest eignen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim Substrat um ein Peptid, das die Spaltungsstelle des natürlich auftretenden Substrats enthält. Die Sequenzspezifität der proteolytischen Spaltung kann durch Testen einer Vielzahl von unterschiedlichen Peptiden bestimmt werden. Das Peptid kann natürlichen Ursprungs sein, d. h. es kann sich von natürlichem SCC1 oder einer Variante ableiten. Ein Beispiel für ein natürliches Peptid ist das humane SCC1-Peptid, wie es in SEQ ID NO: 1 aufgeführt ist, oder ein Fragment davon, das die Separase-Spaltungsstelle enthält. Varianten können entweder durch Synthese von varianten Peptiden oder durch Mutieren von DNA-Sequenzen aus Genen, die für Kohäsionsproteine kodieren, erzeugt werden. Speziell lassen sich weitere Substrate für Separase identifizieren, indem man nach kleinen DNA-Fragmenten aus dem Hefegenom oder einer Oligonucleotidbibliothek sucht, die die normalen Scc1-Spaltungsstellen ersetzen können. Oligonucleotide lassen sich in das SCC1-Gen (dem beide natürliche Spaltungsstellen fehlen) unter der Kontrolle des GAL-Promotors am zentromeren Plasmid inserieren. Hefezellen lassen sich mit einer Bibliothek von derartigen Konstrukten transformieren und nur Plasmide, deren modifiziertes Scc1-Protein durch die Separase-Aktivität gespalten werden kann, ermöglichen ein Wachstum in Gegenwart von Galactose. Die durch die positiven Konstrukte kodierten Peptide eignen sich als Substrate für Separase beim erfindungsgemäßen Screeningtest.
In Bezug auf das Substrat, z. B. das SCC1-Protein oder ein Peptidfragment davon, muss dafür gesorgt werden, dass das Substrat in wirksamer Weise gespalten wird. Es ist zu berücksichtigen, insbesondere bei Verwendung des Hefehomologen von SCC1, dass eine wirksame Spaltung nur dann erfolgt, wenn das Substrat sich in seinem phosphorylierten Zustand, wie er bei der Mitose vorliegt, befindet. Daher ist bei der Entwicklung eines Peptidsubstrats oder bei der Erzeugung von SCC1 auf rekombinantem Wege zu testen, ob das Substrat in wirksamer Weise durch Separase gespalten wird. Im Fall des rekombinanten Proteins lässt es sich in seiner phosphorylierten Form erhalten, indem man es in infizierten Insektenzellen, die mit einem Phosphatase-Inhibitor, z. B. Okadainsäure, behandelt worden sind, erzeugt. Dieses Verfahren wird in Beispiel 5 (Methodenteil e) für das Hefe-Scc1-Protein beispielhaft belegt und kann, wenn es für andere SCC1-Moleküle benötigt wird, an diese Moleküle angepasst werden.
Für den Fall, dass Separase nicht von sich aus wirkt, sondern in Zusammenarbeit mit Cofaktoren, kann anstelle einer Inkubation von SCC1 (oder von Peptidsubstraten) mit Separase allein eine Inkubation mit einem Gemisch aus Separase und seinen Cofaktoren durchgeführt werden. Sämtliche Komponenten lassen sich gemäß üblichen Verfahren erzeugen und reinigen, wie sie vorstehend für Separase beschrieben wurden.
Für das Format mit hohem Durchsatz werden die erfindungsgemäßen Screeningverfahren zur Identifizierung von Separase-Inhibitoren gemäß aus dem Stand der Technik zur Identifizierung von Protease-Inhibitoren bekannten Testverfahren durchgeführt. Derartige Tests beruhen auf dem Nachweis der Spaltungsprodukte des Substrats. Um dies zu erreichen, wird ein SCC1-Peptid oder Proteinsubstrat, das Spaltungsstellen für die Separase-Protease enthält, mit einer nachweisbaren Markierung, z. B. einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung, derivatisiert. Bei Spaltung des Substrats durch die Protease kann das Spaltungsprodukt gemessen werden. Wenn es sich bei einer Testsubstanz um einen Inhibitor der Protease handelt, kommt es je nach dem Nachweissystem und je nach dem, ob die Testsubstanz eine hemmende oder eine aktivierende Wirkung ausübt, zu einer Abnahme oder zu einer Zunahme des nachweisbaren Signals.
Beim Format mit hohem Durchsatz können Verbindungen mit einer Modulationswirkung auf Separase oder eine Separase-artige Cystein-endopeptidase durch Screening von Testsubstanzen aus Verbindungsbibliotheken gemäß bekannten Testprinzipien, z. B. in einem automatisierten System auf Mikrotiterplatten, identifiziert werden.
Kürzlich wurden verschiedene Testverfahren zur Identifizierung von Protease-Inhibitoren beschrieben, die einer Automatisierung in einem Format mit hohem Durchsatz zugänglich sind, z. B. das radiometrische Verfahren gemäß Cerretani et al., 1999, für Hepatitis C-Virus NS3-Protease, das Verfahren auf der Basis der Fluoreszenzauslöschung gemäß Ambrose et al., 1998, oder gemäß Taliani et al., 1996, der kolorimetrische Mikrotitertest für die HIV-1-Protease gemäß Stebbins und Debouck, 1997, der Fluoreszenz-Polarisationstest gemäß Levine et al., 1997 (Übersichtsartikel von Jolley, 1996), das Verfahren unter Verwendung von immobilisierten Peptidsubstraten gemäß Singh et al., 1996, der Test zur Untersuchung der Hemmung von Cathepsin G unter Verwendung von biotinylierten und cysteinmodifizierten Peptiden gemäß Brown et al., 1994. Ein weiteres Beispiel für einen geeigneten Test beruht auf der Erscheinung der Fluoreszenz-Resonanzenergie-Übertragung (FREI) gemäß Gershkovich et al., 1996, oder gemäß Matayoshi et al., 1990. Weitere Beispiele für Tests, die erfindungsgemäß für ein mit hohem Durchsatz ablaufendes Screeningverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Separase-Aktivität verwendet werden können, werden von Gray et al., 1994, Murray et al., 1993 und Sarubbi et al., 1991, beschrieben.
Fluoreszierende oder radioaktive Markierungen und die übrigen Reagenzien zur Durchführung der enzymatischen Reaktion in einem Maßstab mit hohem Durchsatz sind handelsüblich und können gemäß den Anweisungen des Herstellers (z. B. Molecular Probes, Wallac) eingesetzt werden. Das spezifische Testkonzept hängt von verschiedenen Parametern ab, z. B. von der Größe des verwendeten Substrats. Im Fall der Verwendung eines kurzen Peptids stellen die Verfahren unter Fluoreszenzauslöschung oder Fluoreszenz-Resonanzenergie-Übertragung Beispiele für geeignete Testtechniken dar. Der Test unter Fluoreszenzauslöschung (Resonanzenergie-Übertragung "RET") stützt sich auf synthetische Substrate, die zur Erzeugung eines direkten, kontinuierlichen Signals befähigt sind, das proportional zum Ausmaß der Substrathydrolyse ist. Das Substratpeptid trägt einen Fluoreszenzdonator nahe an einem Ende und einen Akzeptor nahe am anderen Ende. Die Fluoreszenz des Substrats wird zunächst durch intramolekulare RET zwischen dem Donator und dem Akzeptor ausgelöscht. Bei Spaltung des Substrats durch die Protease werden die Spaltungsprodukte der RET-Auslöschung entzogen und es lässt sich eine Fluoreszenz feststellen, die proportional zur Menge des gespaltenen Substrats ist.
Ein Test dieses Typs kann folgendermaßen durchgeführt werden: die Lösung des markierten Substrats (z. B. eines Peptids, das an einem Ende mit 4-[[4'-(Dimethylamino)-phenyl]-azo]-benzoesäure (DABCYL) und am anderen Ende mit 5'-[(2'-Aminoethyl)-amino]-naphtalinsulfonsäure (EDANS) markiert ist oder an einem Ende mit Benzyloxycarbonyl und am anderen Ende mit 4-Aminomethylcumarin markiert ist) in Testpuffer wird in die einzelnen Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert. Nach Zugabe der Testsubstanzen in der definierten Konzentration wird die Separase-Lösung in die Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die für die proteolytische Spaltungsreaktion ausreichen, z. B. 1 Stunde bei Raumtemperatur, wird die Fluoreszenz in einem Fluorimeter bei der Anregungswellenlänge, z. B. bei 340 nm, und bei der Emissionswellenlänge, z. B. 485 nm, gemessen.
Im Fall der Anwendung des FREI-Tests eignen sich die folgenden handelsüblichen Markierungspaare für das erfindungsgemäße Verfahren: Europium (Eu) und Allophycocyanin (APC), Eu and Cy5, Eu und PE (Wallac, Turku, Finnland).
Die bei den vorstehenden Verfahren identifizierten Verbindungen besitzen die Fähigkeit, die Trennung von Schwesterchromatiden durch Modulation der proteolytischen Aktivität einer Separase zu stören.
Separase-Inhibitoren eignen sich für die Humantherapie, insbesondere für die Krebstherapie.
Bei den Separase-Inhibitoren kann es sich um kleine chemische Moleküle handeln, die im erfindungsgemäßen Screeningverfahren als Separase-Inhibitoren identifiziert worden sind.
Alternativ kann es sich bei den Separase-Inhibitoren um biologische Moleküle handeln, z. B. um Peptide oder von Peptiden abgeleitete Moleküle, wie Peptidomimetika.
Proteasen aus der Capsase-Familie, zu denen Separase vermutlich gehört, wurden als gute Ziele für eine irreversible Bindung und Hemmung durch von Peptiden abgeleitete Inhibitoren ermittelt (Nicholson et al., 1995; Faleiro et al., 1997). Im Prinzip kann der beschriebene Weg für Capsase-Inhibitoren, die als "Erkennungsstellenpeptide" wirken, da sie so modifiziert worden sind, dass sie eine Aldehyd-, Halogenmethyl- oder Acyloxymethylgruppe an der Spaltungsposition enthalten, so angepasst werden, dass der Cysteinrest am aktiven Zentrum in Separase irreversibel gebunden und gehemmt wird. Inhibitor-Peptidderivate dieses Typs können den Ausgangspunkt für eine rationale Inhibitorentwicklung sein, z. B. von Derivaten des Peptids, die die Aminosäuresequenz an der Protease-Erkennungsstelle in SCC1 oder einem anderen Separase-Substrat überspannen. Ein Beispiel für ein Peptid, das für eine derartige Entwicklung in Betracht zu ziehen ist, ist das von humanem SCC1 abgeleitete Peptid MDDREIMREGSAFEDDDM (SEQ ID NO: 1), das die Separase-Spaltungsstelle enthält, oder eine Mutation oder ein Fragment davon. Die Inhibitorentwicklung kann auch durch Gewinnung struktureller Informationen über die katalytische Domäne von Esp1 unter Anwendung von Röntgenkristallographie unterstützt werden. Zunächst kann die Struktur der katalytischen Esp1-Domäne auch auf die bereits bekannten Strukturen von zwei Mitgliedern der Capsase-Familie von Proteasen modelliert werden.
Die Wirksamkeit der als Separase-Inhibitoren identifizierten Verbindungen kann bezüglich ihrer in vivo-Wirksamkeit entweder an Hefezellen oder an Säugetierzellen getestet werden. Wirksame Verbindungen sollten die Trennung von Schwesterchromatiden blockieren (oder zumindest in gewisser Weise stören) was beispielsweise unter Verwendung von CenV-GFP in Hefe gemäß den Angaben von Ciosk et al., 1998, oder durch übliche zytologische Techniken mit Säugetierzellen gemessen werden kann. Wirksame Verbindungen sollten entweder zytostatisch oder zytotoxisch sein. Substanzen, deren Potential für eine therapeutische Verwendung in einem derartigen sekundären Screening bestätigt worden ist, können ferner bezüglich ihrer Wirkung auf Tumorzellen getestet werden. Zum Testen der Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen werden primäre humane Tumorzellen mit der beim Screening identifizierten Verbindung inkubiert und die Hemmung der Tumorzellen-Vermehrung wird durch herkömmliche Verfahren getestet, z. B. durch Bromdesoxyuridin- oder ³H-Einbau. Verbindungen, die eine antiproliferative Wirkung bei diesen Tests aufweisen, können ferner in Tumor-Tiermodellen getestet und für die Therapie von Tumoren eingesetzt werden.
Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit der Verbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als Arzneistoffkandidaten identifiziert worden sind, können nach üblichen pharmazeutischen Verfahren bestimmt werden, wozu die Durchführung von Zellkulturen und Tierexperimenten zur Bestimmung der IC₅₀-, LD₅₀- und ED₅₀-Werte gehören. Die erhaltenen Daten werden zur Bestimmung des humanen Dosisbereiches verwendet, der auch von der Dosierungsform (Tabletten, Kapseln, Aerosolsprays, Ampullen und dergl.) und dem Verabreichungsweg (oral, bukkal, nasal, parenteral oder rektal) abhängt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung als Wirkstoff enthält, lässt sich auf herkömmliche Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch aktiven Trägern und Exzipientien zubereiten. Verfahren zur Herstellung derartiger Zubereitungen finden sich in Handbüchern, wie "Remington Pharmaceutical Sciences".
Die Beeinflussung des Vorgangs der Trennung von Schwesterchromatiden kann sich auch günstig auswirken bei der Verhinderung von Geburtsdefekten, die durch Misssegregation von Chromosomen bei humanen Meiosen verursacht werden. Da beispielsweise Fälle von humaner Aneuploidie, wie Down-Syndrom durch eine vorzeitige Trennung von Schwesterchromatiden hervorgerufen werden können (Griffin, 1996), könnte die Verwendung eines Arzneistoffes, der die Separase-Aktivität hemmt, dazu befähigt sein, die vorzeitige Trennung von Schwesterchromatiden zu verringern und dadurch das Auftreten von Aneuploidie bei humanen Föten vermindern.
Separase-Inhibitoren können auch wertvoll bei Anwendungen sein, die die bewusste Polyploidisierung von Pflanzenzellen für die Entwicklung von Kulturpflanzen anstreben. Bei Hefe wurde gezeigt, dass eine Hemmung der Separase-Aktivität die Chromosomentrennung ohne Blockierung des Zellzyklusablaufs verhindert und daher zu Zellen mit erhöhter Ploidie führt. Inhibitoren, die die Separase-Protease-Aktivität hemmen, könnten daher zur Erhöhung der Ploidie beliebiger eukaryontischer Zellen, einschließlich sämtlicher Pflanzenzellen, verwendet werden. Eine Erhöhung der Ploidie von Pflanzenzellen eignet sich 1) zur Erzeugung größerer Pflanzen, 2) zur Erhöhung der Ploidie von Züchtungsexemplaren und 3) zur Erzeugung von fruchtbaren Hybriden.
Zur Identifizierung von Separase-Inhibitoren, die sich für die vorerwähnten landwirtschaftlichen Zwecke eignen, lässt sich das erfindungsgemäße Screening-Verfahren leicht anpassen, indem man Pflanzenkomponenten verwendet, d. h. eine Pflanzen-Separase und ein Pflanzen-Homologes von SCC1. Sequenzhomologe von Pflanzen-Separase und -SCC1 sind in Datenbanken vorhanden, z. B. aus dem Arabidopsis thaliana-Genom.
Separase-Inhibitoren, die die Trennung von Schwesterchromatiden behindern, können ferner bei zytologischen Analysen von Chromosomen verwendet werden, beispielsweise bei medizinischen Diagnosen der Chromosomenstruktur.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Die Chromosomenassoziation von Scc1p in G1 ist Esp1-abhängig.
2: In vitro-Test für die Scc1p-Spaltung und -Dissoziation aus Chromatin.
3: In vivo-Nachweis des Scc1p-Spaltungsprodukts in Zellen, die synchron den Übergang von der Metaphase zur Anaphase durchlaufen.
4: Eine Expression einer nicht-spaltbaren Variante von Scc1p verhindert in vivo die Scc1p-Dissoziation aus Chromosomen und die Trennung von Schwesterchromatiden.
5: Gereinigtes Scc1 ist ein Substrat für die von Esp1 abhängige Spaltungsreaktion.
6: Mutationen in der mutmaßlichen katalytischen Diade der Esp1-Proteasedomäne beseitigen die Spaltungsaktivität.
7: Eine Separase-Spaltung des Cohesins Rec8 ist während meiotischer Kernteilungen notwendig.
8: Assoziation von humanem SCC1 mit Chromatin.
9: Humanes SCC1 wird bei der Mitose gespalten.
10: Ektopisch exprimiertes SCC1-myc wird in den Cohesinkomplex eingebaut und bei der Mitose gespalten.
11: Humanes SCC1 wird in humanen Zellen, die in der Metaphase durch Behandlung mit Nocodazol arretiert sind, nicht gespalten.
12: Humanes SCC1 wird in der Anaphase gespalten.
13: Humanes SCC1-myc wird in vitro gespalten.
14: Kartierung der N-terminalen Spaltungsstelle von humanem SCC1.
Sofern nichts anderes angegeben ist, werden bei den erfindungsgemäßen Experimenten die folgenden Materialien und Methoden eingesetzt.
a) Hefeplasmide und -stämme
Die Scc1p-Kodierungssequenz (Saccharomyces-Genom-Datenbank YDL003W) wurde unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors in einen von Yiplac128 abgeleiteten Vektor (Gietz und Sugino, 1988) und unter Kontrolle seines eigenen Promotors in YCplac111 (Gietz und Sugino, 1988) unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert. DNA-Fragmente, die für mehrfache HA- und myc-Epitope kodierten, wurden in die durch PCR an den N- und C-Terminus von SSC1 eingeführten Restriktionsstellen inseriert. Eine positionsgerichtete Mutagenese wurde durch PCR unter Verwendung von Primern mit einem Gehalt an den angestrebten Nucleotidänderungen durchgeführt. Die korrekte Beschaffenheit sämtlicher Konstrukte wurde durch Nucleotidsequenzierung bestätigt.
Bei sämtlichen Stämmen handelte es sich um Derivate von W303 (HMLa HMRa ho ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3,112 his3-11,15 ura3). Epitopmarkierungen am endogenen Scc1p wurden durch ein einstufiges PCR-Markierungsverfahren erzeugt (Michaelis et al., 1997). Ein Stamm mit Überexpression von Esp1p aus dem GAL1-10-Promotor wurde beschrieben (Ciosk et al., 1998) und mit einem Stamm mit einem Gehalt an der esp1-1-Mutation gekreuzt (McGrew et al., 1992). Ein Stamm, der die einzige Quelle von Cdc20p unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors exprimierte, wurde von Lim et al., 1998, beschrieben. Zur Sichtbarmachung von Schwesterchromatiden wird ein Tet-Repressor-GFP-Fusionsprotein in den Zellen synthetisiert, die an einen Cluster von Tet-Operatorsequenzen binden, die am URA3-Locus in der Nähe des Zentromers von Chromosom V integriert sind (vergl. Michaelis et al., 1997).
Sämtliche in Beispiel 7 verwendeten meiotischen Hefestämme sind Derivate des rasch sporenbildenden Stammes SKI. Die REC8-431/453-Mutante (E428R R431E R453E) wurde durch positionsspezifische mutagene PCR eines integrativen REC8-Wildtypplasmids erzeugt. Dieses von Ylplac128 abgeleitete Plasmid (Gietz und Sugino, 1988) enthält das REC8-Gen und -Promotor sowie 3HA-Epitopsequenzen am C-Terminus. Dieses Plasmid wurde am rc8::KanMX4-Locus durch Transformation mit dem Mlul-linearisierten Plasmid integriert.
Die esp1-2-Allele (McGrew et al., 1992) wurde aus dem Stamm K8493 unter Verwendung einer Lücken-Reparaturstrategie gemäß Guthrie und Fink, 1991, gewonnen. Die gewonnene Allele wurde durch Transformation und 5-FOA-Gegenselektion in Ski übertragen (Guthrie und Fink, 1991). Der erhaltene temperaturempfindliche Stamm wurde durch Transformation mit dem Plasmid c1743 mit einem Gehalt an dem HO-Gen diploidisiert. Für Sporenbildungsexperimente wurden die Stämme zunächst aus dem bei –80°C gehaltenen Vorratsmaterial auf eine YEP-Glycerinplatte ausgestrichen und 60 Stunden bei 25°C gezüchtet. Eine einzelne Kolonie wurde als Flecken auf YEPD aufgebracht und 48 Stunden bei 25°C gezüchtet. Der Zellflecken wurde auf flüssiges YEPD überimpft und 8 Stunden bis zur stationären Phase gezüchtet. Sodann wurde die Kultur mit YEPA gewaschen und über Nacht in YEPA gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen mit 2 % Kaliumacetat gewaschen und 14 bis 24 Stunden im gleichen Medium inkubiert. Alle 2 Stunden wurden Proben entnommen und mit 70 % Ethanol zur Sichtbarmachung der Kerne durch DAPI-Färbung fixiert.
b) Hefe-Zellwachstum und -Zellzyklusexperimente
Zellen wurden in Komplettmedium (Rose et al., 1990) bei 25°C gezüchtet, sofern nichts anderes angegeben ist. Stämme, die Cdc20p, Esp1p oder Scc1p aus dem GAL1-10-Promotor exprimierten, wurden in Komplettmedium mit einem Gehalt an 2 % Raffinose als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Der GAL1-10-Promotor wurde durch Zusatz von 2 % Galactose induziert. Ein G1-artiger Stillstand wurde durch Zugabe von 1 μg/ml des Pheromon-alpha-Faktors zum Medium erreicht. Für einen Metaphasenstillstand wurden 15 μg/ml Nocodazol mit 1 % DMSO zugesetzt. Der Metaphasenstillstand aufgrund von Cdc20p-Verarmung wurde in Zellen mit der einzigen Quelle von Cdc20p unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors erreicht. Eine logarithmisch wachsende Kultur in Komplettmedium mit einem Gehalt an Raffinose und Galactose wurde filtriert, mit Medium, das nur Raffinose enthielt, gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert. Zur Freisetzung aus dem Stillstandsprodukt wurden 2 % Galactose wieder zu der Kultur gegeben.
c) In vitro-Test auf Hefe-Esp1p-Aktivität
Ein rohes, in Triton X-100 unlösliches Chromatin-Präparat wurde aus Hefezellen gemäß den Angaben von Liang und Stillman, 1997. erhalten. Das pelletisierte Chromatin wurde in Hefezellextrakten resuspendiert, die auf ähnliche Weise wie die Überstandsfraktion des Chromatin-Präparats hergestellt worden waren. 1/10 Volumenteil eines ATP-Regenerationssystems wurde zugesetzt (50 mM HEPES/KOH, pH-Wert 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 600 mM Creatinphosphat, 1,5 mg/ml Phosphocreatin-kinase, 1 mM DTT, 10 % Glycerin). Die Reaktionsgemische wurden 10 Minuten bei 25°C unter Schütteln inkubiert und auf Eis gestoppt. Die Chromatin-Fraktion wurde erneut vom Überstand durch Zentrifugation abgetrennt und in Puffer EBX (Lang und Stillman, 1997) resuspendiert. Äquivalente Aliquotmengen von Überstand und Chromatin-Pellet wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Scc1-HA wurde mit monoklonalem anti-HA-Antikörper 16B12 (Boehringer Mannheim) nachgewiesen.
Da eine Überexpression von Esp1p aus dem GAL1-10-Promotor für Zellen toxisch ist, wurden Extrakte mit im Übermaß produzierten Esp1p 2 Stunden nach Induktion einer Kultur, die in Medium, das nur Raffinose enthielt, vorgezüchtet worden war, mit Galactose hergestellt.
d) Proteinsequenzierung der Hefe-Scc1p-Spaltungsstelle
Das C-terminale Scc1p-Spaltungsfragment wurde aus Zellen isoliert, die Scc1p enthielten, das mit 18 Tandem-myc-Epitopen am C-Terminus markiert war. Eine Cdc20-Arrest/Freigabestrategie wurde angewandt, um Zellen mit einem hohen Anteil an Scc1p in der gespaltenen Form zu erhalten. Ein Proteinextrakt von 5 × 10⁹ Zellen wurde durch Aufbrechen mit Glasperlen 15 Minuten nach Freisetzung aus dem Metaphasen-Stillstand hergestellt. Mit myc epitopmarkiertes Protein wurde mit 20 mg monoklonalem anti-myc-9E11-Antikörper unter denaturierenden Bedingungen immunopräzipitiert und an SDS-PAGE mit Größenmarkern aufgetrennt. Proteine wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und mit Coomassie-Brillantblau R250 gefärbt. Die N-terminale Sequenzierung der dem Scc1p-Spaltungsfragment entsprechenden Bande ergab die Aminosäuresequenz RLGESIM (Scc1p-Aminosäuren ab 269).
e) Reinigung von in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen exprimiertem Hefe-Scc1
Die Scc1-Kodierungssequenz wurde in den Baculovirus-Transfervektor pFastBac1 (Gibco Life Technologies) kloniert. Am C-Terminus wurde eine FLAG-Epitopmarkierung addiert, woran sich eine Kassette mit einem Gehalt an dem Hefe-VMA-Intein und eine Chitin-Bindungsdomäne anschlossen (New England Biolabs). Rekombinante Baculoviren wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers erhalten. HiFive-Insektenzellen (Invitrogen) wurden in einlagigen Zellschichten bis zur Konfluenz gezüchtet und mit einer Infektionsmultiplizität von 2 mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert. Um eine metaphasenartige Phosphorylierung zu erzielen, wurde 40 Stunden nach der Infektion 0,1 μM Okadainsäure zugesetzt. 43 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet. Zytoplasma- und Kernextrakte wurden gemäß den Angaben von Cai et al., 1996, erhalten. Scc1 wurde aus den vereinigten Extrakten durch Chitin-Affinitätschromatographie gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt und einer weiteren Reinigung durch zwei anschließende Ionenaustauschchromatographie-Stufen an einer MonoQ-Säule (Amersham Pharmacia) unterzogen.
f) Mutationen in der katalytischen Hefe-Esp1-Diade
Esp1 wurde gemäß den Angaben im Abschnitt a) überexprimiert. Die konservierten Reste Histidin 1505 und Cystein 1531, die die mutmaßliche katalytische Diade der Esp1-Protease bilden, wurden durch ein Mutationsschema auf PCR-Basis in Alanin abgeändert. Die mutanten Proteine wurden aus dem GAL-Promotor in Hefe exprimiert und gemäß den Angaben unter c) einem Test auf ihre Spaltungsaktivität unterzogen.
g) Weitere Hefeverfahren
Eine Analyse des DNA-Gehalts wurde gemäß den Angaben von Epstein und Cross, 1992, an einem Becton Dickinson FACScan-Gerät durchgeführt, Chromosomen-Spreads wurden gemäß den Angaben von Michaelis et al., 1997, vorgenommen und Mikrophotographien wurden mit einer Photometrics CCD-Kamera, die an einem Zeiss-Axiophot-Mikroskop montiert war, aufgenommen.
Eine in vitro-Translation von Pds1p wurde in einem Reticulozytenlysat unter Verwendung des TNT-Systems (Promega) durchgeführt.
h) Humane Zellen
HeLa-Zellen wurden in DMEM, das mit 10 % FCS ergänzt war, bei 37°C und 5 % CO₂ gezüchtet.
Bei einigen Experimenten wurden HeLa-Zellen, die in stabiler Weise Mäuse-SCC1 in Fusion mit 9 myc-Epitopen am C-Terminus exprimierten, verwendet.
i) Humane Zellzyklusexperimente
Für die Zellzyklussynchronisation wurde eine doppelte Thymidinbehandlung herangezogen. HeLa-Zellen wurden zunächst 18 Stunden mit 2 mM Thymidin behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt und weitere 8 Stunden gezüchtet. Sodann wurden die Zellen erneut 18 Stunden mit 2 mM Thymidin behandelt, sodann gewaschen und in frischem Medium inkubiert. Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Die Proben wurden aufgeteilt und für die FACscan-Analyse und für das Immunoblotting verwendet. Zellextrakte wurden mit Glas-Teflon-Pottern in eiskaltem Puffer mit einem Gehalt an 50 mM Tris, pH-Wert 7,7, 100 mM NaCl, 20 mM β-Glycerophosphat, 5 mM MgCl₂, 1 mM NaF, 0,1–0,2 % Triton X-100, 10 % Glycerin, 1 mM DTT und Protease-Inhibitoren hergestellt.
Bei einigen Experimenten wurden HeLa-Zellen in der logarithmischen Phase 18 Stunden mit 330 nM Nocodazol in Lösung in 0,1 % DMSO behandelt oder Zellen, die durch doppelte Thymidinbehandlung synchronisiert worden waren, wurden für verschiedene Zeitspannen in Nocodazol enthaltendes Medium freigesetzt. Bei Kontrollexperimenten wurde 0,1 % DMSO ohne Nocodazol zugesetzt.
Für die SDS-PAGE-Analyse wurden gleiche Mengen an gesamtem Extrakt (üblicherweise 50 μg Protein pro Probe) aufgesetzt. Für das Western-Blotting wurden die folgenden Antikörper verwendet: monoklonale Maus-anti-Separase-Antikörper (ein C-terminales Fragment von humaner Separase wurde im pET28-Vektor exprimiert, His-markiertes Protein wurde gereinigt und für die Immunisierung verwendet); Kaninchen-anti-SCC1 (N-terminale oder C-terminale Peptide von humanem SCC1 wurden an KLH gekuppelt und für die Immunisierung verwendet); Kaninchen-anti-Securin (humanes Securin wurde in pTrcHis2-Vektor exprimiert, His/myc-markiertes Protein wurde gereinigt und für die Immunisierung verwendet). Sämtliche Antikörper wurden einer Affinitätsreinigung unterzogen. CDC27-, CDC20- und Proteasom-Antikörper sind in der Literatur beschrieben (Gieffers et al., 1999). Mäuse-anti-Cyclin B1 (#SC-245) stammten von der Fa. Santa Cruz Biotechnology, USA. Kaninchen-anti-Cyclin A (#06-138) und Kaninchen-anti-Phospho-Histon H3 (#06-570) stammten von der Fa. Upstate Biotechnology, USA. Kaninchen-anti-myc-Epitop-Antikörper (CM-100) stammten von der Fa. Gramsch, Deutschland.
j) In vitro-Spaltung von SCC1-myc
Ein vollständiger Zellextrakt (mit einem Gehalt an 250 μg Protein) aus mit Nocodazol zum Stillstand gebrachten HeLa-Zellen, die ektopisch Mäuse-SCC1-myc exprimieren, wurde durch Zentrifugation in Chromatin- und Überstandfraktionen aufgetrennt. Entweder 12,5 μl der Überstandfraktion oder des Chromatinpellets (resuspendiert in 5 μl Puffer mit einem Gehalt an 0,005 % Triton X100, 20 mM Hepes, pH-Wert 7,7, 20 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂) wurden mit 25 μl entweder der Interphase oder des mitotischen Xenopus-Eiextrakts bei Raumtemperatur inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben genommen, durch SDS-PAGE getrennt und durch Immunoblotting mit anti-myc-Antikörpern analysiert. Xenopus-Extrakte wurden gemäß den Angaben von Murray, 1991, hergestellt.
k) Kartierung der N-terminalen Spaltungsstelle von humanem SCC1
Zur Erzeugung von geschnittenen Versionen der humanen SCC1-cDNA wurden Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) herangezogen. Für N-terminale Deletionen wurden verschiedene 5'-Primer mit einem Gehalt an T7- Promotorregionen, einem Startcodon und geeigneten SCC1-Sequenzen verwendet. Für C-terminale Deletionen wurden verschiedene 3'-Primer mit geeigneten SCC1-Sequenzen und einem Stoppcodon verwendet. Die erhaltenen PCR-Fragmente wurden in vitro in Gegenwart von ³⁵S-Methionin in Retikulozytenlysat transkribiert und translatiert (TNT-System, Promega). Die in vitro-translatierten Produkte wurden durch SDS-PAGE abgetrennt und einem Immunoblotting mit C- oder N-terminalen, spezifischen SCC1-Antikörpern unterworfen.
Beispiel 1
Die Chromosomenassoziation von Hefe-Scc1p in G1 ist von Esp1 abhängig.

A) Zellen (Wildtyp für ESP1 oder mit einem Gehalt an der esp1-1-Mutation) mit einer unmodifizierten; endogenen Kopie von Scc1 und einer zweiten myc-markierten Kopie unter der Kontrolle des GAL-Promotors wurden 120 Minuten mit dem passenden Pheromon-alpha-Faktor arretiert. Sämtliche Zellen waren dann in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert (Zeitpunkt 0 des Experiments). Das FACScan-Profil des DNA-Gehalts ist dargestellt und zeigt, dass sämtliche Zellen während des folgenden 120-minütigen Verlaufs des Experiments arretiert blieben. Scc1-myc wurde 60 Minuten durch Zugabe von 2 % Galactose induziert. Anschließend wurden die Zellen auf Medium mit einem Gehalt an 2 % Glucose übertragen, um die Scc1-myc-Expression zu reprimieren (1A).
B) Eine Expression von Scc1-myc durch Vollzellen-in situ-Hybridisierung war ersichtlich (offene Kreise) und eine Chromosomenbindung von Scc1-myc wurde unter Anwendung von Chromosomen-Spreads (ausgefüllte Quadrate) beobachtet. Der prozentuale Anteil von Zellen, die positiv in Bezug auf die Expression von Scc1-myc waren und der Anteil der Zellen, bei denen Scc1-myc an Chromosomen gebunden war, ist in den Diagrammen dargestellt (1B).

Beispiel 2
In vitro-Test auf Hefe-Scc1p-Spaltung und -Dissoziation aus Chromatin
Chromatin wurde aus einem Stamm mit einem Gehalt an mit HA-Epitopen markiertem Scc1p, der mit Nocodazol in der Metaphase arretiert worden war, hergestellt. Die Proteine im Chromatinpräparat wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und Scc1-HA wurde durch Western-Blotting nachgewiesen (2, Bahn 1). Dieses Chromatinpräparat wurde in den angegebenen Extrakten mit oder ohne Zugabe von in vitro-Translationsprodukten (wie angegeben) resuspendiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 25°C wurde das Chromatin erneut durch Zentrifugation vom Überstand abgetrennt. Aliquotanteile der Überstandfraktion und der Chromatinfraktion der einzelnen Reaktionen wurden analysiert.
Beispiel 3
Nachweis des in vivo-Hefe-Scc1p-Spaltungsprodukts in Zellen beim synchronen Übergang von der Metaphase zur Anaphase
Der verwendete Stamm exprimierte Cdc20p unter der Kontrolle des GAL-Promotors als der einzigen Cdc20p-Quelle. Scc1p wurde mit HA-Epitopen markiert und Schwesterchromatide wurden durch an tetO-Sequenzen gebundenes tetR-GFP, das am Zentromer von Chromosom V inseriert war, sichtbar gemacht. Zellen wurden in der Metaphase arretiert, indem die Zellen 120 Minuten in Medium ohne Galactose in Bezug auf Cdc20p verarmt wurden. Anschließend wurde 2 % Galactose zugegeben, um die Cdc20p-Synthese zu induzieren.

A) Das FACscan-Profil des zeitlichen Verlaufs ist in 3A dargestellt.
B) Die Sprossenbildung (3b, ausgefüllte Quadrate) wurde bewertet. Sämtliche Zellen waren nach 120 Minuten mit großen Sprossen arretiert. Eine Zytokinese erfolgte bei den meisten Zellen 30 bis 45 Minuten nach Induktion der Cdc20p-Synthese. An Chromosomen gebundenes Scc1-HA war auf Chromosomen-Spreads (3B, offene Kreise) in den meisten Zellen in der Stillstandsphase ersichtlich. Scc1-HA verschwand aus den Chromosomen innerhalb von 15 Minuten nach der Freisetzung. Der prozentuale Anteil an Zellen mit getrennten Schwesterchromatiden, die als zwei getrennte GFP-Punkte im Zellkörper sichtbar sind, ist dargestellt (3B, ausgefüllte Dreiecke).
C) Beispiele von Zellen in der Stillstandsphase nach 120 Minuten und 15 Minuten nach der Freisetzung. Die synchrone Trennung von Schwesterchromatiden ist in Form von sich trennenden GFP-Punkten sichtbar (3C).
D) Western-Blot-Analyse von Vollzellextrakten zu den angegebenen Zeitpunkten. Das Spaltungsfragment von Scc1-HA tritt nach 135 Minuten kurz nach der Freisetzung aus der Metaphasen-Blockierung beim Übergang zur Anaphase auf (3D).

Beispiel 4
Expression einer nicht-spaltbaren Variante von Hefe-Scc1p verhindert in vivo die Scc1p-Dissoziation von Chromosomen und die Trennung von Schwesterchromatiden

A) FACscan-Profil des DNA-Gehalts bei Freisetzung von sprossenfreien G1-Zellen in den Zellzyklus entweder mit oder ohne Induktion der Scc1RR-DD-Mutante (4A).
B) Sprossungsindex ohne (4B, offene Quadrate) oder mit (4B, offene Dreiecke) Induktion von Scc1RR-DD. Die Trennung von Schwesterchromatiden in den Zellen wurde durch Zählen des prozentualen Anteils von Zellen mit einem Gehalt an zwei getrennten GFP-Punkten verfolgt (4B, ausgefüllte Quadrate für die Kontrollkultur, die kein Scc1RR-DD exprimierte, und ausgefüllte Dreiecke für die Kultur, die Scc1RR-DD exprimierte).
C) Die Scc1p-Ohromosomenassoziation wurde an Chromosomen-Spreads gemessen. Das endogene Wildtyp-Scc1-myc ist für die Kontrollzellen (offene Quadrate) und für Zellen, die Scc1RR-DD exprimieren (4c, offene Dreiecke), dargestellt. Das Scc1RR-DD war HA-markiert und wurde an Chromosomen-Spreads der induzierten Kultur nachgewiesen (4C, ausgefüllte Dreiecke).
D) Beispiele von Chromosomen-Spreads beider Kulturen nach 150 Minuten in der Metaphase und nach 180 Minuten, nachdem der Großteil der Zellen der Kontrollkultur in die Anaphase gelangt war. Die DNA wurde mit DAPI gefärbt, Scc1-myc wurde mit Kaninchen-anti-myc-Antiserum und konjugiertem sekundärem anti-Kaninchen-Cy5-Antikörper nachgewiesen, Scc1RR-DD-HA wurde mit monoklonalem Mäuse-Antikörper 16B12 und konjugiertem sekundärem anti-Maus-Cy3-Antikörper nachgewiesen. Schwesterchromatide des Zentromers V wurden durch die GFP-Punkte sichtbar gemacht (4D).

Beispiel 5
Gereinigtes Hefe-Scc1 ist ein Substrat für die Esp1-abhängige Spaltung
5A: Reinigung von Scc1 aus mit Baculovirus infizierten Insektenzellen. SDS-PAGE, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Brillantblau R250 eines Kontroll-HiFive-Vollzellextrakts (Bahn 1), eines Vollzellextrakts nach Infektion mit Scc1 exprimierendem Virus (Bahn 2), des Eluats aus der Chitin-Affinitätssäule (Bahn 3) und der gepoolten Fraktion der zweiten chromatographischen MonoQ-Stufe (Bahn 4). Auf ähnliche Weise gereinigtes Scc1, das aber eine metaphasenartige Phosphorylierung aufwies, ist in Bahn 5 dargestellt.
5B: Spaltungstest unter Verwendung von gereinigtem Scc1. Gereinigtes Scc1 sowohl in der unphosphorylierten Form als auch in der metaphasenartigen phosphorylierten Form wurde als Substrat in einem Spaltungstest verwendet. Der Esp1 enthaltende Zellextrakt entsprach dem von 2, wurde aber im Gemisch mit dem Kontrollextrakt in verschiedenen Verhältnissen verwendet, um eine Titration der Esp1-Aktivität zu erreichen. Scc1 wurde durch Western-Blotting mit dem monoklonalen anti-FLAG-Antikörper M2 (Sigma) nachgewiesen.
Beispiel 6
Eine Mutation der katalytischen Diade in Hefe-Esp1 beseitigt deren Spaltungsaktivität. Wildtyp-Esp1 und die Mutanten H1505A und C1531A wurden in Hefe überexprimiert und mit einem FLAG-Epitop zum Nachweis markiert. 6A: Western-Blot von Zellextrakten zum Nachweis, dass die beiden mutanten Esp1-Proteine als stabile Proteine in ähnlichen Konzentrationen wie das Wildtypprotein exprimiert wurden. 6B: Die assoziierte Scc1-Spaltungsaktivität wurde wie in Beispiel 2 getestet.
Beispiel 7
Eine Verhinderung der Spaltung des meiotischen Kohäsionsproteins Rec8 durch Mutationen in den Spaltungsstellen oder durch eine esp1-Mutation hemmt meiotische Kernteilungen.
7A: Diploide Hefestämme, die entweder in Bezug auf Rec8 vom Wildtyp waren, oder Rec8, bei dem beide Spaltungsstellen mutiert waren, exprimierten, wurden der Sporenbildung unterzogen. Der prozentuale Anteil an Zellen, die einen Kern, zwei Kerne oder drei oder vier Kerne enthielten, ist im gesamten zeitlichen Verlauf des Experiments dargestellt.
7B: Ein diploider Hefestamm, der in Bezug auf die esp1-2-Mutation homozygot war, wurde bei 25 oder 35°C der Sporenbildung unterzogen. Der prozentuale Anteil an Zellen, die einen Kern, zwei Kerne oder drei oder vier Kerne enthielten, ist dargestellt.
Beispiel 8
Assoziation von humanem SCC1 mit Chromatin
Chromatin- und Überstandfraktionen wurden aus HeLa-Zellen, die sich entweder in der logarithmischen Wachstumsphase (log) befanden oder in der Metaphase mit Nocodazol arretiert waren (noc), hergestellt. Proteine aus äquivalenten Aliquotanteilen dieser Fraktionen wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf die Anwesenheit von SCC1 durch Immunoblotting unter Verwendung von radioaktiv markierten Antikörpern analysiert (8, oberes Feld). Die Intensitäten der SCC1-Banden wurden quantitativ bestimmt (8, unteres Feld).
Beispiel 9
Humanes SCC1 wird bei der Mitose gespalten.
HeLa-Zellen wurden zu Beginn der S-Phase durch doppelte Thymidinbehandlung arretiert und synchron in den Zellzyklus freigegeben. Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die Zellen wurden auf ihren DNA-Gehalt durch FACscan (9A) und durch SDS-PAGE und Immunoblotting von Vollzellextrakten unter Verwendung der angegebenen Antikörper (9B) analysiert. Die von der Phosphorylierung abhängige elektrophoretische Mobilitätsverschiebung der APC-Untereinheit CDC27 wurde als Marker für den Mitoseeintritt verwendet. Das Verschwinden von Cyclin A wurde als Marker für die Metaphase verwendet und das Verschwinden von CDC20, Securin und Cyclin B als Marker für die Anaphase. Die Proteasom-Konzentrationen wurden als Beladungskontrolle bestimmt. Die Pfeile in den Feldern 3 und 4 von oben von 9B zeigen 100 kDa- und 25 kDa-Banden, die durch Antikörper erkannt werden, die spezifisch für den C- bzw. N-Terminus von SCC1 sind.
Beispiel 10
Ektopisch exprimiertes SCC1-myc wird in den Cohesinkomplex eingebaut und bei der Mitose gespalten
10A: Ein Extrakt von logarithmisch wachsenden HeLa-Zellen, die in stabiler Weise SCC1-myc exprimierten, wurde durch eine 5–20 %-Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Proteine einer jeden Gradientenfraktion wurden durch SDS-PAGE und durch Immunoblotting unter Verwendung von Antikörpern gegen SCC1, das myc-Epitop und gegen die humane Cohesin-Untereinheit SA1 analysiert. Die Position von 9S- und 14S-Cohesinkomplexen ist angegeben. Sowohl endogenes SCC1 als auch ektopisch exprimiertes SCC1-myc finden sich ausschließlich in den Fraktionen mit einem Gehalt an dem 14S-Cohesinkomplex.
10B: HeLa-Zellen, die in stabiler Weise SCC1-myc exprimierten, wurden durch doppelte Thymidinbehandlung arretiert und synchron in den Zellzyklus freigegeben. Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen und Vollzellextrakte wurden durch SDS-PAGE und Immunoblotting unter Verwendung von Antikörpern gegen das myc-Epitop und den C-Terminus von SCC1 analysiert. SCC1-Spaltungsprodukte sind durch Pfeile angegeben. Es wird gezeigt, dass zwei Behandlungen des myc-Immunoblots zu einem zweiten SCC1-myc-Spaltungsprodukt mit höherer elektrophoretischer Beweglichkeit führen, die nur bei längeren Behandlungen nachgewiesen werden kann (unteres Feld).
Beispiel 11
Humanes SCC1 wird in humanen Zellen, die durch Behandlung mit Nocodazol in der Metaphase arretiert sind, nicht gespalten.
HeLa-Zellen, die in stabiler Weise SCC1-myc exprimierten, wurden durch doppelte Thymidinbehandlung synchronisiert und in Gegenwart entweder von DMSO (Ergebnisse in 11A und C dargestellt) oder von Nocodazol in Lösung in DMSO (Ergebnisse in 11B und D dargestellt) in den Zellzyklus freigegeben. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen. Die Zellen wurden durch FACsan (11A und B) und durch Immunoblotting von Vollzellextrakten unter Verwendung der angegebenen Antikörper (11C und D) analysiert. Für den C-Terminus von SCC1 spezifische Antikörper wurden verwendet. Neben den in Beispiel 9 verwendeten Antikörpern wurde ein Antikörper, der spezifisch für mitotisch phosphoryliertes Histon H3 war (PhosphoH3) als mitotischer Marker verwendet.
Beispiel 12
SCC1 wird in der Anaphase gespalten.
HeLa-Zellen, die in stabiler Weise SCC1-myc exprimierten, wurden mit Nocodazol in der Metaphyse arretiert und synchron in die Anaphase freigegeben. Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die Zeilen wurden durch FACscan (12A) und durch Immunoblotting von Vollzellextrakten unter Verwendung der angegebenen Antikörper (12B) analysiert. Antikörper, die spezifisch für den C-Terminus von SCC1 waren, wurden verwendet.
Beispiel 13
SCC1-myc wird in vitro gespalten.
Chromatin- und Überstandfraktionen wurden durch differentielle Zentrifugation aus mit Nocodazol arretierten HeLa-Zellen, die in stabiler Weise SCC1-myc exprimierten, isoliert. Die Chromatinfraktion wurde in mitotischen und Interphasen-Xenopus-Eiextrakten inkubiert und die Überstandfraktion wurde in mitotischem Xenopus-Eiextrakt inkubiert. Proben wurden zu den in 13 angegebenen Zeitpunkten entnommen und durch SDS-PAGE und Immunoblotting unter Verwendung von Antikörpern gegen das myc-Epitop analysiert. Vollzellextrakte aus SCC1-myc exprimierenden HeLa-Zellen in der S-Phase oder in der Anaphase (erhalten durch Freigabe aus einem doppelten Thymidin-Stillstand für 6 und 11,5 Stunden) wurden nebeneinander analysiert. Spaltungsprodukte von SCC1-myc, die spezifisch in mitotischen Xenopus-Extrakten gebildet werden, sind durch Pfeile angegeben.
Beispiel 14
Kartierung der N-terminalen Spaltungsstelle von humanem SCC1
Geschnittene Versionen der humanen SCC1-cDNA wurden durch PCR erzeugt und in vitro transkribiert und translatiert. Die ³⁵5-markierten in vitro-Translationsprodukte (³⁵S-IVT) wurden durch Immunoblotting mit SCC1-Antikörpern (obere Felder) und durch Phosphorimaging (untere Felder) analysiert. N-terminale Deletionsmutanten wurden durch Immunoblotting mit für den C-Terminus von SCC1 spezifischen Antikörpern analysiert (14, linke Felder) und C-terminale Deletionsmutanten wurden mit Antikörpern, die für den N-Terminus von SCC1 spezifisch waren, analysiert (14, rechte Felder). Extrakte von SCC1-myc exprimierenden HeLa-Zellen in der Anaphase oder in der G1-Phase (erhalten durch Freigabe aus einem doppelten Thymidin-Stillstand) wurden nebeneinander analysiert. Die SCC1-Spaltungsprodukte, die in HeLa-Extrakten nachgewiesen wurden, sind durch Pfeile angegeben.
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Claims

Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Trennung von Schwesterchromatiden modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Separase in Gegenwart eines Substrats, das die Separase-Spaltstelle ExxR enthält, mit Testverbindungen inkubiert wird, und dass der modulierende Effekt der Testverbindungen auf die proteolytische Aktivität der Separase bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Separase rekombinant ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Separase human ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Substrat ein in Baculovirus in Gegenwart eines Phosphatase-Inhibitors rekombinant produziertes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Substrat humanes SCC1 oder ein Fragment oder eine Variante davon ist, welche die Separase-Spaltstelle ExxR enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Substrat ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder ein Fragment oder eine Variante davon ist, welche die Separase-Spaltstelle ExxR enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Separase eine Pflanzen-Separase ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Substrat einen Marker trägt, der ein nachweisbares Signal proportional zu der Menge des Spaltprodukts der proteolytischen Aktivität liefert, und worin das Signal in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der Marker fluoresziert.