DE69430573T2

DE69430573T2 - Test und reagentien zur identifizierung von antiproliferierenden stoffen

Info

Publication number: DE69430573T2
Application number: DE69430573T
Authority: DE
Inventors: Guillaume Cottarel; Veronique Damagnez; Giulio Draetta
Original assignee: MITOTIX Inc
Current assignee: Gpc Biotech Inc (ndgesd Staates Delaware) Ca
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-06-06
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2014-06-07
Also published as: AU7055194A; WO1994028914A1; US5443962A; ATE217190T1; CA2163524C; EP0708653B1; US6251585B1; CA2163524A1; EP0708653A4; DE69430573D1; EP0708653A1; AU702174B2; JPH08510650A

Description

Hintergrund der Erfindung

Der Eintritt von Zellen in die Mitose ist typischerweise mit koordinierten und gleichzeitigen Ereignissen verbunden, die zum Beispiel Umordnung des Cytoskeletts, Auflösung der Kernhülle und der Nucleoli und Kondensation des Chromatins zu Chromosomen einschliessen. Es wird angenommen, dass die Zellzyklusereignisse von einer Reihe unabhängiger biochemischer Schritte reguliert werden, wobei die Initiation der späten Ereignisse die erfolgreiche Vollendung der vorhergehenden Ereignisse voraussetzt. In eukaryotischen Zellen findet normalerweise keine Mitose statt, bis die G1, S und G2 Phasen des Zellzyklus vollendet sind. Zum Beispiel werden mindestens zwei Stufen im Zellzyklus als Antwort auf DNS-Schädigung reguliert, die G1/S und die G2/M Übergänge. Diese Übergänge dienen als Kontrollpunkte, an denen Zellen ein Fortschreiten des Zellzyklus verzögern, um Reparatur von Schädigung zu erlauben, vor Eintritt in entweder die S Phase, wenn Schädigungen fortbestehen gelassen würden, oder in die M Phase, wenn Brüche einen Verlust von genomischem Material zur Folge hätte. Sowohl der G1/S als auch der G2/M Kontrollpunkt sind bekannterweise unter genetischer Kontrolle, da es Mutanten gibt, die ein Stoppen oder Verzögerungen verhindern, welche gewöhnlich in Wildtyp-Zellen als Antwort auf DNS-Schädigung stattfinden.
Das Fortschreiten einer proliferierenden eukaryotischen Zelle durch die Zellzyklus-Kontrollpunkte wird durch eine Reihe regulatorischer Proteine kontrolliert, die sicherstellen, dass Mitose zur geeigneten Zeit stattfindet. Diese regulatorischen Proteine können hervorragende empfindliche durch Rückkopplungsmechanismen kontrollierte Kreisläufe bereitstellen, die zum Beispiel die Zelle davon abhalten können, die S-Phase zu verlassen, wenn ein Bruchteil eines Prozentes der genomischen DNS nichtrepliziert verbleibt (Dasso et al. (1990) Cell 61: 811-823) und können ein Voranschreiten in die Anaphase der Mitose hemmen, bis alle Chromosomen in einer Linie auf der Metaphasenplatte ausgerichtet sind (Rieder et al. (1990) J. Cell Biol. 110: 81-95). Insbesondere wird angenommen, dass der Austritt aus den verschiedenen Zellzyklusstufen im allgemeinen unter der Kontrolle einer grossen Anzahl wechselseitig antagonistischer Kinasen und Phosphatasen steht. Zum Beispiel werden genetische, biochemische und morphologische Hinweise mit der cdc2 Kinase als das verantwortliche Enzym für ein Auslösen von Mitose in eukaryotischen Zellen in Zusammenhäng gebracht (zur Übersicht siehe Hunt (1989) Curr Opin. Cell Biol. 1: 268-274; Lewin (1990) Cell 61: 743-752; und Nurse (1990) Nature 344-503-508). Die Ähnlichkeiten zwischen den Kontrollpunkten in Säugerzellen und Hefe lassen artübergreifend ähnliche Rollen für die cdc Proteinkinase vermuten. Zur Unterstützung dieser Hypothese wurde ein humanes cdc2 Gen gefunden, das die Fähigkeit hat, die Aktivität eines S. pombe cdc2 Gens in seiner Rolle in sowohl G1/S als auch G2/M zu ersetzen (Lee et al. (1987) Nature 327: 31). Auf ähnliche Weise unterstreicht die Tatsache, dass das cdc2 Homolog von S. Cerevisiae (cdc28) durch das humane cdc2 ersetzt werden kann, ebenfalls das Ausmass, in welchem die grundlegende Maschinerie des Zellzyklus in der Evolution konserviert worden ist.
Während des Fortschreitens der Mitose scheint die cdc2 Kinase eine Kaskade von stromabwärts gelegenen mitotischen Phänomenen, wie zum Beispiel Ausrichten der Chromosomen in der Metaphase, Segregation der Schwesterchromosomen in der Anaphase und die Bildung der Teilungsfurche auszulösen. Viele an dem mitotischen Eintritt der proliferierenden Zelle beteiligten Zielproteine werden direkt durch die cdc2 Kinase phosphoryliert. Zum Beispiel wirkt die cdc2 Proteinkinase durch Phosphorylierung einer grossen Anzahl an mitotischen Substraten, wie zum Beispiel mucleäre Lamine, Histone und Mikrotubuli-assoziierte Proteine (Moreno et al. (1990) Cell 61: 549-551; und Nigg (1991) Semin. Cell Biol. 2: 261-270). Das Cytoskelett kultivierter Zellen, die in die Mitose eintreten, wird drastisch umgeordnet. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Caldesmon, ein Aktin-assoziiertes Protein, ebenfalls ein cdc2 Kinase Substrat ist (Yamashiro et al. (1991) Nature 349: 169-172), und seine Phosphorylierung könnte bei der Induktion der M-Phasen spezifischen Auflösung der Aktinbänder beteiligt sein. Das Mikrotubuli-Netzwerk in der Interphase löst sich auf und wird von einem Mitose-spezifischen, von den Centrosomen ausgehenden Bereich der Spindel ersetzt. Diese Umordnung steht in Wechselbeziehung mit dem Vorhandensein von Mitose-spezifischer cdc2 Kinaseaktivität in Zellextrakten (Verde et al. (1990) Nature 343: 233-238). Veränderungen in der Kernstruktur während des Eintritts in die Mitose stehen ebenfalls in Wechselbeziehung mit der cdc2 Kinaseaktivität. Eine Kondensation des Chromatins zu Chromosomen wird von cdc2 Kinase-induzierter Phosphorylierung von Histon H1 begleitet (Langan et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 3860-3868), Auflösung der Kernhülle wird von der cdc2-spezifischen Phosphorylierung von Lamm B begleitet (Peter et al. (1990) Cell 61: 591-602), Verschwinden der Nucleoli wird durch die cdc2-abhängige Phosphorylierung von Nucleolin und NO38 koordiniert.
Die Aktivierung der cdc2 Kinaseaktivität findet während der M Phase statt und ist ein kompliziert regulierter Vorgang, der das aufeinander abgestimmte Binden einer essentiellen regulatorischen Untereinheit (d. h. ein Cyclin) und Phosphorylierung an multiplen, hochkonservierten Positionen einbezieht (zur Übersicht siehe Fleig und Gould (1991) Semin. Cell Biol. 2: 195-204). Die Komplexität dieses Aktivierungsvorganges stammt höchstwahrscheinlich von der Tatsache ab, dass, wie oben dargelegt, die Initiation der Mitose in einer Anzahl von Signaltransduktionsvorgängen verankert ist, deren Funktion es ist, gegen das nichtgeeignete Fortschreiten des Zellzyklus zu schützen. Insbesondere verwendet die Zelle solche Signalmechanismen, um zu garantieren, dass Mitose und Cytokinese nicht stattfinden, ohne dass Zellwachstum und Genomverdoppelung auf eine genaue und zeitlich abgestimmt Weise stattgefunden haben.
Die cdc2 Kinase ist Gegenstand multipler Kontrollstufen. Ein gut charakterisierter, die cdc2 Aktivität regulierender Mechanismus bezieht die Phosphorylierung von Tyrosin-, Threonin- und Serinresten ein; ihr Phosphorylierungsgehalt variiert während dem Zellzyklus (Draetta et al. (1988) Nature 336: 738-744; Dunphy et al. (1989) Cell 58: 181-191; Morla et al. (1989) Cell 58: 193-203; Gould et al (1989) Nature 342: 39-45; und Solomon et al. (1990) Cell 63: 1013-1024). Die Phosphorylierung von cdc2 an Tyr-15 und Thr-14, zwei Resten, die in der mutmasslichen ATP-Bindungsstelle der Kinase liegen, reguliert negativ die Kinaseaktivität. Diese inhibitorische Phosphorylierung von cdc2 wird zumindest teilweise durch die wee1 und mik1 Tyrosinkinasen vermittelt (Russel et al. (1987) Cell 49: 559-567; Lundgren et al. (1991) Cell 64: 1111-1122; Featherstone et al. (1991) Nature 349: 808-811; und Parker et al. (1992) PNAS 89: 2917-2921). Diese Kinasen wirken als mitotische Inhibitoren, ihre Überexpression bewirkt, dass Zellen in der G2 Phase des Zellzyklus verbleiben. Im Gegensatz dazu verursacht ein Funktionsverlust von wee1 ein massvolles Fortschreiten der Mitose, während ein Verlust von sowohl wee1 und mik1 Funktionen eine vorzeitige Mitose bewirkt, entkoppelt von allen Kontrollpunkten, die normalerweise Zellteilung eingrenzen (Lundgren et al. (1991) Cell 64: 1111-1122).
Erreicht die Zelle in etwa das Ende von G2, findet Dephosphorylierung der cdc2-inaktivierenden Thr-14 und Thr-15 Reste statt, wodurch eine Aktivierung des cdc2 Komplexes als eine Kinase folgt. Eine als cdc25 bekannte stimulatorische Phosphokinase ist für die Tyr-15 und Thr-14 Dephosphorylierung verantwortlich und dient als ein geschwindigkeitslimitierender mitotischer Aktivator. (Dunphy et al. (1991) Cell 67: 189-196; Lee et al. (1992) Mol Biol Cell 3: 73-84; Millar et al. (1991) EMBO J 10: 4301-4309; und Russell et al. (1986) Cell 45: 145-153). Neuere Untersuchungen sind ein Hinweis, dass sowohl die cdc25 Phosphatase als auch die cdc2-spezifischen Tyrosinkinasen während der Interphase nachweisbar aktiv sind, was vermuten lässt, dass es einen ständigen Wettbewerb zwischen diesen zwei Aktivitäten vor Mitose gibt (Kumangai et al. (1992) Cell 70: 139-151; Smythe et al. (1992) Cell 68: 787-797; und Solomon et al. (1990) Cell 63: 1013-1024). Diese Situation impliziert, dass die anfängliche Entscheidung in die Mitose einzutreten, eine Beeinflussung des Gleichgewichtes des Phosphorylierungsstadiums von cdc2 einbezieht, welches wahrscheinlich durch Variation der Geschwindigkeit der Tyrosin-Dephosphorylierung von cdc2 und/oder durch Geschwindigkeitsabnahme seiner Tyrosin-Phosphorylierung kontrolliert wird. Eine Vielzahl an genetischen und biochemischen Datenscheinen eine Abnahme der cdc2- spezifischen Tyrosinkinase-Aktivität nahe der Initiation der Mitose zu favorisieren, welche als ein Auslöseschritt dienen kann, um das Gleichgewicht zu Gunsten der cdc2 Dephosphorylierung umzukehren (Symthe et al. (1992) Cell 68: 787-797; Matsumoto et al. (1991) Cell 66: 347-360; Kumagai et al. (1992) Cell 70: 139-151; Rowley et al. (1992) Nature 356: 353-355; und Enoch et al. (1992) Genes Dev. 6: 2035-2046). Ausserdem lassen neuere Daten vermuten, dass die aktivierte cdc2 Kinase für Phosphorylierung und Aktivierung von cdc25 verantwortlich ist. Dieses Ereignis würde eine selbstamplifizierende Schleife bereitstellen und einen schnellen Anstieg der Aktivität des cdc25 Protein auslösen, wobei sichergestellt wird, dass die Tyrosin-Dephosphorylierung von cdc2 schnell bis zur Vollendung fortschreitet (Hoffmann et al. (1993) EMBO J. 12: 53).

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäss einem Aspekt stellt die Erfindung einen Test zur Identifizierung von antiproliferierenden oder antimitotischen Stoffen bereit, welcher umfasst:
i. Bereitstellen einer Zelle mit einem beeinträchtigten Zellzyklus- Kontrollpunkt, der mindestens teilweise durch (a) Überexpression eines rekombinanten Gens, das einen mitotischen Aktivator codiert oder (b) Behandeln der Zelle mit einem hypermitotischen Stoff verursacht ist, worin der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt Proliferation der Zelle durch Bewirken von vorzeitigem Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus hemmt;
ii. In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, durch welche der Zellzyklus-Kontrollpunkt beeinträchtigt wird;
iii. Messen eines Proliferationsgehaltes der Zelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz; und
iv. Vergleichen des Proliferationsgehaltes der Zelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz mit einem Proliferationsgehalt der Zelle bei Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz, wobei eine Steigerung des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein der Prüfsubstanz ein Hinweis auf eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität der Prüfsubstanz ist.
Gemäss einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Schizosaccharomyces-Zelle bereit, welche umfasst
i) ein exprimierbares rekombinantes Gen, das eine exogene cdc25 Phosphatase codiert; und
ii) eine bedingt zu beeinträchtigende wee1 Proteinkinase, welche eine Proliferationshemmung der Zelle durch Vereinfachen eines vorzeitigen Eintritts der Zelle in die Mitose, unter Bedingungen bewirken kann, worin die wee1 Proteinkinase beeinträchtigt ist, wobei der vorzeitige Eintritt in die Mitose mindestens teilweise durch die exogene cdc25 Phosphatase und einem verringerten Gehalt an inhibitorischer Phosphorylierung einer cdc2 Proteinkinase durch die beeinträchtigte wee1 Proteinkinase vermittelt wird.
Gemäss einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Formulierung eines Medikamentes zur Hemmung der Proliferation einer Zelle bereit, welches umfasst:
i. Bereitstellen einer Testzelle mit einem beeinträchtigten Zellzyklus- Kontrollpunkt, der mindestens teilweise durch (a) Überexpression eines rekombinanten Gens, das einen mitotischen Aktivator codiert oder (b) Behandeln der Zelle mit einem hypermitotischen Stoff verursacht ist, worin der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt Proliferation der Zelle durch Bewirken von vorzeitigem Fortschreiten der Testzelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus hemmt;
ii. In-Kontakt-Bringen der Testzelle mit einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, durch welche der Zellzyklus-Kontrollpunkt beeinträchtigt wird;
iii. Messen eines Proliferationsgehaltes der Testzelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz;
iv. Vergleichen des Proliferationsgehaltes der Testzelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz mit einem Proliferationsgehalt der Testzelle bei Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz, worin eine Steigerung des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein der Prüfsubstanz ein Hinweis auf eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität der Prüfsubstanz ist;
v. Formulieren eines Medikamentes aus einer Prüfsubstanz, welche darauf hinweist, eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität zu haben.
Die vorliegende Erfindung stellt Tests und Reagenzien zur Identifizierung von antiproliferierenden Stoffen zur Verfügung, wie zum Beispiel mitotische und meiotische Inhibitoren. Der vorliegende Test stellt einen einfachen und schnellen Suchtest bereit, der auf Bewerten von positiver zellulärer Proliferation als ein Hinweis auf antimitotische oder antimeiotische Aktivität beruht, und umfasst ein In-Kontakt-Bringen einer Prüfsubstanz mit einer Zelle, die einen beeinträchtigten Zellzyklus-Kontrollpunkt hat und Messen des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein des Stoffes. Die Beeinträchtigung des Kontrollpunktes ist so, dass sie entweder ein vorzeitiges Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus oder Hemmung des normalen Fortschreitens der Zelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus bewirkt, aber durch die Wirkung eines Stoffes aufgeglichen werden kann, der mindestens ein regulatorisches Protein des Zellzyklus auf eine Weise hemmt, die die Wirkung der Beeinträchtigung ausgleicht. In einer Ausführungsform des Tests können antimitotische Stoffe durch ihre Fähigkeit eine ansonsten hypermitotische Zelle vor einer mitotischen Katastrophe (z. B. Zelltod) durch Aktivitätshemmung von mindestens einem regulatorischen Protein des Zellzyklus, welches als ein mitotischer Aktivator wirkt, zu retten, identifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform des Tests kann ein antimitotischer Stoff durch dessen Fähigkeit, Mitose in einer ansonsten hypomitotischen Zelle durch Aktivitätshemmung von mindestens einem regulatorischen Protein des Zellzyklus, das als ein negativer Regulator der Mitose wirkt, zu induzieren, identifiziert werden. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung können antimeiotische Stoffe durch ihre Fähigkeit eine günstige Meiose einer ansonsten hypermeiotischen oder hypomeiotischen Zelle zu bewirken, identifiziert werden.
Der beeinträchtigte Kontrollpunkt kann zum Beispiel durch molekularbiologische, genetische und/oder biochemische Mittel erzeugt werden. Der zu beeinträchtigende Kontrollpunkt kann ein regulatorisches Protein oder Proteine, die ein Fortschreiten durch den Zellzyklus kontrollieren, wie zum Beispiel solche, die den G2/M Übergang oder den G1/S Übergang kontrollieren, umfassen. Zum Beispiel kann der beeinträchtigte Kontrollpunkt regulatorische Proteine umfassen, die die Phosphorylierung/Dephosphorylierung einer cdc Proteinkinase kontrollieren, wie zum Beispiel die Genprodukte von wee1, mik1 oder nim1.
Die in dem Test (Reagenzzelle) verwendete Zelle kann so erzeugt werden, dass der Nachweis antiproliferierender Stoffe begünstigt wird, die spezifisch eine besondere Zellzyklus-Aktivität hemmen. Zum Beispiel kann, wenn es erwünscht ist, einen Inhibitor einer cdc25 Phosphatase-Aktivität herzustellen, eine hypermitotische oder hypermeiotische Zelle erzeugt werden, die vor einer mitotischen oder meiotischen Katastrophe durch partielle Hemmung von cdc25 gerettet wird.
Ausserdem können die hyper- und hypoproliferierenden Zellen des vorliegenden Tests entweder zur Identifizierung von antimitotischen oder antimeiotischen Stoffen so erzeugt werden, dass sie heterologe Zellzyklusproteine (d. h. artübergreifende Expression) umfassen. Zum Beispiel kann ein cdc25 Homolog aus einer Art in den Zellen einer anderen Art exprimiert werden, in der gezeigt wurde, dass das Homolog die Fähigkeit besitzt Funktionsverlust-Mutationen in dieser Wirtszelle zu retten. Zum Beispiel kann eine hypermitotische Schizosaccharomyces-Zelle, wie zum Beispiel Schizosaccharomyces pombe so konstruiert werden, dass sie eine exogene cdc25 Phosphatase und eine bedingt zu beeinträchtigende wee1 Proteinkinase umfasst. Das exogene cdc25 kann zum Beispiel ein humanes cdc25 Homolog oder alternativ ein cdc25 Homolog eines humanen Pathogens sein.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des "5' halb ura4-adh Promotor - cdc25A-3'-halb ura4" - Nucleinsäure-Fragmentes von Beispiel 1 zum Transformieren von ura4+ S. pombe Zellen.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des "5-halb ura4-adh Promotor - cdc25B-3'halb ura4" Nucleinsäure-Fragmentes von Beispiel 2 zum Transformieren von ura4+ S. pombe Zellen.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des pART3- cdc25C Plasmid von Beispiel 3.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des "5-halb ura4-adh Promotor - cdc25C-3'halb ura4" Nucleinsäure-Fragmentes von Beispiel 3 zum Transformieren von ura4+ S. pombe Zellen.
Fig. 5A und 5B sind Photographien von Hefekolonien, die von mit pART3 Plasmid transformierten S. pombe -Zellen gebildet wurden, die bei 25ºC und beziehungsweise bei 37ºC kultiviert wurden.
Fig. 6A und 6B sind Photographien von Hefekolonien, die von mit dem pARTN-cdc25A Plasmid von Beispiel 1 transformierten S. pombe -Zellen gebildet wurden, die bei 25ºC und beziehungsweise bei 37ºC kultiviert wurden.
Fig. 7A und 7B sind Photographien von Hefekolonien, die von mit dem pARTN-cdc25B Plasmid von Beispiel 2 transformierten S. pombe -Zellen gebildet wurden, die bei 25ºC und beziehungsweise bei 37ºC kultiviert wurden.
Fig. 8A und 8B sind Photographien von Hefekolonien, die von mit dem pARTN-cdc25C Plasmid von Beispiel 3 transformierten S. pombe -Zellen gebildet wurden, die bei 25ºC und beziehungsweise bei 37ºC kultiviert wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In sich teilenden eukaryotischen Zellen überwachen Kreisläufe regulatorischer Proteine sowohl die Initiation als auch die Vollendung der Hauptübergänge von sowohl den meiotischen als auch mitotischen Zellzyklen. Dieses regulatorische Netzwerk stellt sicher, dass die aufeinanderfolgenden Ereignisse eines jeden Zellzyklus auf eine gewissenhafte und pünktliche Weise stattfinden. Zum Beispiel kann Mitose nicht beginnen, bis die Zelle ausreichend gewachsen ist und ihr Genom genau repliziert hat. Ähnlicherweise kann Zellteilung nicht erfolgen, bis die mitotische Spindel die Chromosomen gleichmässig auf beide Tochterzellen verteilt hat.
Die vorliegende Erfindung stellt Tests und Reagenzien zur Identifizierung von antimitotischen und antimeiotischen Stoffen zur Verfügung. Wie hierin beschrieben, können antimitotische Stoffe in einer Ausführungsform des vorliegenden Tests durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, eine ansonsten hypermitotische Zelle vor einer mitotischen Katastrophe durch Aktivitätshemmung von mindestens einem regulatorischen Protein des Zellzyklus, das als ein mitotischer Aktivator wirkt, zu retten. Der Begriff hypermitotische Zelle kennzeichnet eine Zelle mit einem beeinträchtigten Zellzyklus-Kontrollpunkt, der ein vorzeitiges Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil des Zellzyklus bewirken kann, und dabei eine Proliferationshemmung der Zelle zur Folge hat. Der beeinträchtigte Kontrollpunkt der hypermitotischen Zelle würde ansonsten als negativer Regulator stromabwärts gelegener mitotischer Ereignisse wirken. Eine Beeinträchtigung eines solchen negativen Regulators erlaubt folglich der Zelle in die nachfolgenden mitotischen Stadien abweichend fortzuschreiten und hemmt schliesslich eine günstige Proliferation der Zelle. Bei Vorhandensein des Stoffes mit der Fähigkeit, einen mitotischen Aktivator zu hemmen, kann ein Fortschreiten der hypermitotischen Zelle durch den Zellzyklus verlangsamt werden, um die Zelle zu ermächtigen, auf eine geeignete Weise Mitose zu durchlaufen und mit genauer Übereinstimmung zu proliferieren. Im allgemeinen wird erwartet, dass zum Nachweis eines antimitotischen Stoffes in dem vorliegenden Test unter Verwendung einer hypermitotischen Zelle der Stoff einen mitotischen Aktivator hemmen muss, dessen Wirkungsweise in dem Zellzyklus mit dem beeinträchtigten Kontrollpunkt ausreichend verknüpft ist, so dass die Zelle durch den antimitotischen Stoff von Festlegung auf ansonsten katastrophale Ereignisse eines vorzeitigen Durchlaufs des Kontrollpunktes abgehalten wird. Es ist klar, dass ein zum Retten der hypermitotischen Zelle in dem vorliegenden Test wirksamer antimitotischer Stoff dieses durch direktes Wirken auf den mitotischen Aktivator tun kann, so wie es zum Beispiel von einem Phosphatase-Inhibitor zu erwarten ist, es mit einem cdc25 Homolog zu tun. Alternativ kann der antimitotische Stoff seine Wirkung durch Vorbeugen der Aktivierung des mitotischen Aktivators, wie zum Beispiel Hemmung des Phosphorylierungsschrittes, der cdc25 als eine Phosphatase aktiviert oder Hemmung der Aktivität der cdc2 Kinase bezüglich anderer potentieller Substrate, ausüben.
In einer anderen Ausführungsform des vorliegenden Tests kann ein antimitotischer Stoff durch seine Fähigkeit, Mitose in einer ansonsten hypomitotischen Zelle durch Hemmung der Aktivität von mindestens einem regulatorischen Protein des Zellzyklus, das als ein negativer Regulator der Mitose wirkt, identifiziert werden. Der Begriff hypomitotische Zelle bezieht sich auf eine Zelle, die einen beeinträchtigten Kontrollpunkt hat, der einen übermässig aktiven negativen mitotischen Regulator, der ein Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil des Zellzyklus unterdrückt, umfasst. Bei Vorhandensein eines Stoffes, der die Fähigkeit hat, die Aktivität des negativen Regulators zu hemmen, wird eine Hemmung des Zellzyklus überwunden, und die Zelle kann in einer gesteigerten Geschwindigkeit im Verhältnis zu der unbehandelten hypomitotischen Zelle proliferieren. So wie bei dem obigen hypermitotischen System wird im allgemeinen erwartet, dass ein in dem hypomitotischen System nachgewiesener antimitotischer Stoff direkt auf den oder ausreichend nahe bei dem übermässig-aktiven negativen Regulator wirkt, um dessen inhibitorische Wirkung auf den Zellzyklus zu verringern.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können antimeiotische Stoffe auf eine ähnliche Weise analog zu dem obigen antimitotischen Test identifiziert werden, worin eine akkurate Meiose einer entweder hypermeiotischen oder hypomeiotischen Zelle bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein einer Prüfsubstanz gemessen wird. Wie oben beziehen sich die Begriffe hypermeiotisch und hypomeiotisch auf beeinträchtigte meiotische Kontrollpunkte, die entweder eine verringerte Aktivität oder gesteigerte Aktivität im Verhältnis zu der normalen meiotischen Zelle aufweisen.
Der vorliegende Test stellt einen einfachen und schnellen Suchtest bereit, der auf Bewerten positiver Proliferation als Hinweis auf antimitotische Aktivität beruht. Ein Vorteil des vorliegenden Tests ist, dass während direkte Wachstumshemmung durch jegliche zu einer proliferierenden Zellkultur hinzugefügten toxischen Verbindung verursacht werden kann, wird Wachstumsstimulation in dem vorliegenden Test nur aufgrund spezifischer Hemmung eines mitotischen Aktivators, wenn der Test eine hypermitotische Zelle umfasst oder aufgrund von Hemmung eines negativen mitotischen Aktivators, wenn der Test eine hypomitotische Zelle umfasst, erzielt. Auf ähnliche Weise kann positives meiotisches Fortschreiten in dem vorliegenden Test als ein Hinweis auf antimeiotische Aktivität der Prüfsubstanz verwendet werden.
Andere Vorteile der vorliegenden Tests schliessen die Fähigkeit nach antimitotischer und antimeiotischer Aktivität in vivo zu suchen, als auch die Vorzüge des Tests bezüglich einer Analyse mit hohem Durchlauf ein. In dem vorliegenden Test identifizierte antimitotische Stoffe können wichtige medizinische Konsequenzen haben und können ausserdem bezüglich einer Verwendung zur Behandlung proliferativer Erkrankungen, die einen weitreichenden Bereich an Krebsen, Neoplasien und Hyperplasien einschliessen, als auch für allgemeine oder spezifische Immunsuppression, wie zum Beispiel durch Proliferationshemmung von Lymphozyten getestet werden. Zusätzlich kann der vorliegende Test zur Identifizierung von sowohl antimitotischen und antimeiotischen Stoffen verwendet werden, die in der Behandlung pathogener Infektionen, wie zum Beispiel Pilzinfektionen, die eine Mykose hervorrufen, verwendet werden können. In dem vorliegenden Test identifizierte antimitotische und antimeiotische Stoffe können ebenfalls zum Beispiel für Empfängnisverhütungsverfahren durch Unterbrechung der oogenen Pfade verwendet werden, um die Entwicklung von entweder dem Ei oder Spermie zu verhindern oder durch Verhindern des mitotischen Fortschreitens eines befruchteten Eis.
Bezüglich der hypermitotischen Zelle und hypomitotischen Zelle des vorliegenden Tests kann eine Beeinträchtigung des negativen regulatorischen Kontrollpunktes so erzeugt werden, dass diese entweder kontinuierlich oder bedingt ist. Eine bedingte Beeinträchtigung erlaubt dem Kontrollpunkt unter manchen Bedingungen einsatzbereit zu sein, so dass die Zelle proliferieren kann und durch Zellkulturverfahren erhalten werden kann; und unter anderen Bedingungen nichteinsatzbereit oder alternativ hypereinsatzbereit zu sein. Im Fall der hypermitotischen Zelle ist der beeinträchtigte Kontrollpunkt in einem solchen Ausmass effektiv nichteinsatzbereit, dass die Beeinträchtigung ein Stattfinden einer anormalen Mitose erlaubt, die in einer mitotischen Katastrophe endet (z. B. Zelltod). Umgekehrt kann die hypomitotische Zelte durch einen beeinträchtigten Kontrollpunkt erzeugt werden, der effektiv hypereinsatzbereit ist und eine Hemmung des Zellzyklus zur Folge hat. Eine kontinuierliche Beeinträchtigung andererseits ist eine, die immer vorhanden ist, und die Proliferation der Zelle unter Bedingungen erlaubt, bei denen es keinen Bedarf gibt, die Zelle am Kontrollpunkt anzuhalten; aber in dem Fall der hypermitotischen Zelle führt dies zur mitotischen Katastrophe unter Bedingungen, bei denen der Zellzyklus angehalten werden muss, wie zum Beispiel bei Vorhandensein von DNS-Synthese-Inhibitoren oder DNS Schadstoffen.
Der beeinträchtigte Kontrollpunkt kann zum Beispiel durch molekularbiologische, genetische und/oder biochemische Mittel erzeugt werden. Der zu beeinträchtigende Kontrollpunkt kann ein regulatorisches Protein oder Proteine, die Fortschreiten durch den Zellzyklus kontrollieren, umfassen, wie zum Beispiel solche, die den G2/M Übergang oder den G1/S Übergang kontrollieren. Ausgiebige genetische und biochemische Analysen dieser Pfade (siehe zum Beispiel Molecular Biology of the Fission Yeast, eds Nasi et al., Academic Press, San Diego, 1989) hat zu der Fähigkeit geführt, die Kontrolle der Mitose durch Funktionsverlust- und Funktionszugewinn- Mutationen und durch Plasmidüberexpression, als auch durch Aussetzen der Zellen gegen bestimmten Chemikalien zu manipulieren. Die Beeinträchtigung des Kontrollpunktes kann zum Beispiel das Ergebnis von direkter Veränderung der effektiven Aktivität eines regulatorischen Proteins an dem Kontrollpunkt sein (d. h. durch Veränderung seiner katalytischen Aktivität und/oder Konzentration), oder indirekt das Ergebnis einer Modifizierung der Wirkung eines anderen Proteins sein, das stromaufwärts zum Kontrollpunkt ist, aber welches die Wirkung der regulatorischen Proteine am Kontrollpunkt beeinflusst. Zum Beispiel sind verschiedene Mutanten isoliert worden, die die Fähigkeit haben, spezifischen Zellzykluskontrollkreisläufen zu entfliehen und in das nächste Zellzyklus-Stadium ungeeigneterweise fortzuschreiten und können zum Erzeugen der hypermitotischen Zelle verwendet werden. Auf ähnliche Weise sind Mutanten isoliert worden, die nicht die Fähigkeit haben, einen spezifischen Zellzyklus-Kontrollpunkt zu passieren und die davon abgehalten werden, in das nächste Zellzyklusstadium fortzuschreiten und die Basis für die hypomitotische Zelle des vorliegenden Tests darstellen.
Genetische Studien in eukaryotischen Systemen einschliesslich Säugern und Fungi haben mehrere Gene identifiziert, die für die Wahl des geeigneten Zeitpunktes der Mitose wichtig sind. Zum Beispiel sind in der Spalthefe S. pombe Gene, die Regulatoren der Zellteilung codieren, ausgiebig charakterisiert worden (zur Übersicht siehe MacNeil et al. (1989) Curr. Genet. 16: 1). Wie oben dargelegt, geht eine Initiation der Mitose in Spalthefen mit Aktivierung der cdc2 Proteinkinase einher. cdc2 ist eine Komponente des aus Fröschen und Seestern gereinigten M Phase-fördernden Faktors (MPF), und cdc2 Homologe sind in einer grossen Anzahl an Eukaryoten identifiziert worden, was vermuten lässt, dass cdc2 eine zentrale Rolle in der mitotischen Kontrolle in allen eukaryotischen Zellen spielt (Norbury et al. (1989) Biochem. Biophys. Acta 989: 85). Für Ziele der vorliegenden Offenlegung wird der Begriff "cdc2" oder "cdc Proteinkinase" synonym mit der kürzlich übernommenen "Cyclin-abhängige Kinase" (cdk) Nomenklatur verwendet. Ausserdem wird, wie hierin verwendet, der Begriff cdc2 so verstanden, um Mitglieder der Familie Cyclin-abhängigen Kinase (cdk) zu kennzeichnen. Repräsentative Beispiele von cdc Proteinkinasen schliessen cdc2-SP, cdc28 (S. Cerevisiae), cdk2-XL, cdc2-HS und cdk2-HS ein, wobei "HS" homosapiens kennzeichnet, SP kennzeichnet S. pombe und "XL" kennzeichnet Xenopus Laevis. Wie oben dargelegt wird angenommen, dass der Schalter, der den Übergang zwischen dem während der S-G2-Prophase vorhandenen inaktiven cdc2/CyclinB Komplex (phosphoryliert an Try-15 und Thr-14) und der während der Metaphase vorhandenen, aktiven Form der cdc2/Cyclin B Kinase (dephosphorylierte an Try-15 und Thr-14) kontrolliert, mit einer Veränderung der relativen Aktivitäten entgegengesetzten Kinasen und Phosphatase(n), die auf die Stellen wirken, übereinstimmt. Unter der Annahme, dass viele regulatorische Pfade bei den cdc Kinasen zusammen zu laufen scheinen, als auch ihre aktivierende Rolle bei sowohl G1/S und G2/M Übergängen, kann die hypermitotische Zelle des vorliegenden Tests zur Entwicklung von für besondere cdc Proteinkinasen spezifischen Inhibitoren verwendet werden.
Regulatorische Pfade, die in einer cdc Proteinkinase münden oder ihre Aktivität beeinflussen, können zum Erzeugen von entweder hypermitotischen Zellen oder hypomitotischen Zellen des vorliegenden Tests manipuliert werden. Zum Beispiel wird die inhibitorische Phosphorylierung von cdc2 durch mindestens zwei Tyrosinkinasen, die ursprünglich in Spalthefe identifiziert wurden und als wee1 und mik1 bekannt sind, vermittelt (Russell et al. (1987) Cell 49: 559; Lundgren et al. (1991) Cell 64: 111; Featherstone et al. (1991) Nature 349: 808; und Parker et al. (1991) EMBO 10: 1255). Diese Kinasen wirken als mitotische Inhibitoren, deren Überexpression bewirkt, dass die Zellen in der G2 Phase des Zellzyklus anhalten. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine wee1-Überexpression eine intensive Phosphorylierung von cdc2 bewirkt (cdc28 in der Knosphefe), was ein Anhalten des Zellzyklus zur Folge hat. Umgekehrt bewirkt ein wee1-Funktionsverlust ein Fortschreiten der Mitose und die Zellen treten in die Mitose mit etwa der Hälfte der normalen Grösse ein, während ein Verlust der wee1 und mik1 Funktion eine vorzeitige Initiation der Mitose bewirkt, die von allen Kontrollpunkten, die normalerweise eine Zellteilung zurückhalten, entkoppelt ist. Somit stellen wee1 und mik1 jeweils geeignete regulatorische Proteine dar, die beeinträchtigt werden könnten, um entweder die hypermitotische oder hypomitotische Zelle des vorliegenden Tests zu erzeugen.
Desweiteren ist es ersichtlich, dass Enzyme, die die Aktivität der wee1 oder mik1 Kinasen beeinflussen, auch Angelpunkt der Kontrolle der präzisen Wahl des Zeitpunktes der Mitose sein können. Zum Beispiel kann der Gehalt des nim1/cdr1 Proteins, einem negativen Regulator der wee1 Proteinkinase, einen ausgeprägten Einfluss auf die mitotische Initiationsgeschwindigkeit haben, und es wurde gezeigt, dass die nim1 Mutanten mangelhaft auf Nährstoffmangel antworten (Russel et al., (1987) Cell 49: 569; und Feilotter et al. (1991) Genetics 127: 309). Eine nim1-Überexpression (wie zum Beispiel die S. pombe op-nim1 Mutante) kann eine Hemmung der wee1 Kinase zur Folge haben und vorzeitiges Fortschreiten in die Mitose erlauben. Ein Verlust der nim1-Funktion verzögert andererseits Mitose, bis die Zellen bis zu einer grösseren Grösse gewachsen sind. Auf ähnliche Weise ist gezeigt worden, dass eine Mutation in dem srf1 Gen Regulation des mitotischen Fortschreitens als Antwort auf DNS Synthese-Hemmung erleichtert.
Funktionsverlust-Stämme, wie zum Beispiel wee1-50, mik1, ura oder stfl-1 (Rowley et al. (1992) Nature 356: 353) sind sehr bekannt. Zusätzlich ist jedes der wee1, mik1 und nim1 Gene kloniert worden (siehe zum Beispiel Coleman et al., (1993) Cell 72: 919; und Feillotter et al. (1991) Genetics 127: 309), so dass eine Unterbrechung der wee1 und/oder mik1 Expression oder nim1-Überexpression durchgeführt werden kann, um die hypermitotische Zelle des vorliegenden Tests zu erzeugen. Auf eine ähnlich Weise kann eine wee1 und/oder mik1 Überexpression oder Unterbrechung der nim1 Expression verwendet werden, um die hypomitotische Zelle des vorliegenden Tests zu erzeugen. Desweiteren kann jeder dieser negativen mitotischen Regulatoren ebenso ein potentielles Ziel für einen antimitotischen Stoff sein, der unter Verwendung der hypomitotischen Zelle des vorliegenden Tests bewertet wird.
Genetische und biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass das zu den wee1/mik1 Kinasen antagonistisch wirkende cdc25 Protein eine zentrale Rolle in dem Vorgang der cdc2-spezifischen Dephosphorylierung spielt und bei der Aktivierung der cdc2 Kinasenaktivität bedeutend ist. Bei Nichtvorhandensein von cdc25 akkumuliert cdc2 in einem Tyrosin phoshorylierten Zustand und kann eine Mitose-Hemmung bewirken. Die Phosphatase- Aktivität von cdc25 wirkt als ein mitotischer Aktivator und ist deshalb ein geeignetes Ziel für Hemmung durch einen antimitotischen Stoff in dem vorliegenden Test. Es wird stark angenommen, dass dieser Aspekt des mitotischen Kontrollnetzwerkes im allgemeinen innerhalb Eukaryoten konserviert ist, obwohl die besondere Regulationsweise der cdc25 Aktivität etwas von Art zu Art variieren kann. Homologe von cdc25 der Spalthefe sind in der Knosphefe S. cerevisiae (Millar et al. (1991) CSH Symp. Quant. Biol. 56: 577), Menschen (Galaktinov et al. (1990) Cell 67: 1181; und Sadhu et al. (1989) PNAS 87: 5139), Maus (Kakizuka et al. (1992) Genes Dev. 6: 578), Drosophila (Edgar et al. (1989) Cell 57: 177; und Glover (1991) Trends Genet. 7: 125) und Xenopus (Kumagai et al., (1992) Cell 70: 139; und Jessus et al. (1992) Cell 68: 323) identifiziert worden. Humanes cdc25 wird von einer Multigenfamilie codiert, die nun aus drei Mitgliedern besteht, nämlich cdc25A, cdc25B und cdc25C. Wie unten beschrieben haben alle drei Homologe die Fähigkeit temperatursensitive Mutationen von S. pombe cdc25 zu retten. Frühe Hinweise lassen vermuten, dass diese unterschiedlichen Homologe verschiedene Funktionen haben können. Zum Beispiel hält eine anti-cdc25C Antikörper-Mikroinjektion in Säugerzellen, diese davon ab, sich zu teilen. Sie scheinen in der Interphase mit einer abgeflachten Morphologie anzuhalten, was mit einer Rolle für cdc25C bei dem Eintritt in die Mitose übereinstimmt. Im Gegensatz dazu hat eine Mikroinjektion von Antikörpern gegen cdc25A einen abgerundeten Mitose-ähnlichen Zustand zur Folge, was vermuten lässt, dass die verschiedenen Homologe unterschiedliche Funktionen haben könnten und einen zusätzlichen Gehalt an Komplexität für die Kontrolle des Beginns der M-Phase durch cdc25 in höheren Eukaryoten darstellt. Ein Vergleich der humanen cdc25's miteinander und mit cdc25 Homologen aus anderen Arten ist durchgeführt worden. Ein Vergleich von cdc25A mit cdc25C zeigt eine 48%ige Identität in der 273 C-terminalen Region zwischen den zwei Proteinen; und ein Vergleich zwischen cdc25B und cdc25C offenbart eine 43%ige Identität. Das Drosophila cdc25 Homolog "string" teilt 34,5% Identität mit cdc25A in einer 362 Aminosäure langen Region und 43,9% in einer 269 Aminosäure langen Region mit cdc25B. S. pombe cdc25 ist ebenfalls mit den humanen cdc25's verwandt, aber im geringeren Ausmass. Interessanterweise übersteigt die allgemeine Ähnlichkeit zwischen verschiedenen humanen cdc25 Proteinen nicht grossartig das Ausmass zwischen humanen und evolutionär weiter entfernten Arten wie Drosophila. Biochemische Experimente haben gezeigt, dass das bakteriell hergestellte cdc25 Protein von Drosophila und Mensch die Histon H1 Kinaseaktivität von cdc2 in Xenopus- oder Seestern-Extrakten aktiviert (Kumangai et al. (1990) Cell 64: 903; und Strausfield et al. (1991) Nature 351: 242).
Ist die cdc25 Phosphatase-Aktivität das gewünschte Ziel für die Entwicklung eines antimitotischen Stoffes, kann es vorteilhaft sein, die hypermitotische Zelle des vorliegenden Tests so zu wählen, dass insbesondere antimitotische Stoffe ausgewählt werden, die direkt oder indirekt auf cdc25 wirken. Wie oben dargelegt, wird im allgemeinen erwartet, dass zum Nachweis eines antimitotischen Stoffes in einem auf einer hypermitotischen Zelle beruhenden Test der gehemmte mitotische Aktivator (z. B. cdc25) ausreichend mit dem angehörigen Kontrollpunkt verknüpft sein muss, um die Zelle zu retten, bevor sie in einer mitotischen Katastrophe endet. Ausserdem kann die hypermitotische Zelle des vorliegenden Tests durch Manipulation der Zelle, in der ein cdc25 Homolog endogen exprimiert ist, erzeugt werden, wie zum Beispiel durch Erzeugen einerweet Mutation (ein "wee" Phänotyp) oder in dem die Zelle 2-Aminopurin oder Koffein nach einem durch γ- Bestrahlung induzierten G2-Stoppen ausgesetzt wird. Alternativ kann das cdc25 Gen aus einer Spezies oder Zellart kloniert werden und nachfolgend in einer Zelle exprimiert werden, für die es nicht endogen ist, aber in der es bekannterweise die Funktionsmangel-Mutationen der endogenen cdc25 Aktivität rettet. Zum Beispiel kann das exogene cdc25, wie zum Beispiel humanes cdc25, in einer hypermitotischen Schizosaccharomyces-Zelle, wie zum Beispiel eine S. pombe Zelle, wie die temperatursensitive wee1-50 Mutante, exprimiert werden. Es ist möglich, die strukturellen und funktionellen Unterschiede zwischen den humanen cdc25 Phosphatasen auszunutzen, um antimitotische Stoffe bereitzustellen, die besonders humane Zelltypen selektiv hemmen. Auf ähnliche Weise ist es machbar, cdc25 Phosphatasen- Inhibitoren mit dem vorliegenden Test zu entwickeln, die spezifisch auf Pathogene, wie zum Beispiel in mykotischen Infektionen beteiligter Fungus, wirken, ohne im wesentlichen die humanen Homologe zu hemmen.
Die cdc2 aktivierende Kinase (CAK) stellt noch ein anderes potentielles Ziel für Hemmung durch einen antimitotischen Stoff dar, der zur Verwendung in der hypermitotischen Zelle des vorliegenden Tests ausgewählt werden kann. Neuere Erkenntnisse sind ein Hinweis, dass viele, wenn nicht alle, cdc Proteinkinasen sowohl Cyclin-Bindung als auch Phophorylierung bei Thr-161 (Thr-161 von cdc2-HS; Thr-167 von cdc-2SP; Thr-169 von cdc28; und Thr- 160 von cdk2-HS) für Aktivierung in vivo benötigen. Es wird angenommen, dass CAK Phosphorylierung von Thr-161 auf eine Cyclin-abhängige Weise lenkt und als ein mitotischer Aktivator wirkt. Eine CAK-Hemmung durch eine Prüfsubstanz kann die Wirkung einer hypermitotischen Beeinträchtigung eines Kontrollpunktes aussetzen, die sonst zu einer vorzeitigen Aktivierung einer cdc Proteinkinase (z. B. wie es eine wee1 defiziente Mutante würde) geführt hätte. Zusätzlich stellt CAK selbst eine mögliche Stelle für eine Beeinträchtigung dar, um die hypermitotische Zelle des vorliegenden Tests zu erzeugen. Eine CAK-Überexpression kann zu einer vorzeitigen Aktivierung einer cdc Proteinkinase führen und bewirkt, dass die Zelle in einer mitotischen Katastrophe endet.
Andere Kontrollpunkte, die zum Erzeugen der hypermitotischen und hypomitotischen Systeme beeinträchtigt sein können, sind durch Untersuchung von mitotischen Ereignissen in Zellen identifiziert worden, die auf eine solche Weise behandelt wurden, dass die DNS-Synthese oder DNS Reparatur unterbrochen ist. Bestrahlung-induziertes Stoppen ist ein Beispiel eines Kontrollmechanismus, der zum Identifizieren von sowohl negativen als auch positiven Regulatoren der Mitose verwendet worden ist. In diesem Fall ist eine Mitose verzögert, bis die Integrität des Genoms kontrolliert und so weit wie möglich wiederhergestellt ist. Die Kontrollpunkte wirken ebenfalls zur Verzögerung der Mitose bis zur Vollendung der DNS-Synthese. Die Beobachtung der Zellzyklus-Stoppstellen ist ein Hinweis, dass die Regulation des Fortschreitens in die Mitose als Antwort auf sowohl DNS-Schädigung als auch auf DNS-Synthese Komponenten der mitotischen Kontrolle erfordert. Zum Beispiel haben Analysen von Bestrählungs-sensitiven Mutationen in Knosphefen eine Reihe fehlerhafte regulatorische Proteine identifiziert, die das Stoppen des Zellzyklus als Antwort auf DNS-Schädigung verhindern und deshalb potentielle Kandidaten für eine Beeinträchtigung zum Erzeugen der hypermitotischen oder hypomitotischen Zelle des vorliegenden Test sind. Durch Veranschaulichung sind eine Reihe von Genen, die in dieser mitotischen Rückkopplungskontrolle beteiligt sind, identifiziert worden, und schliessen die rad9, rad17, rad24, mec1, mec2 und mec3 Gene ein (Weinert et al. (1988) Science 241: 317). Es wurde gezeigt, dass alle sechs Gene negative Regulatoren des Fortschreitens des Zellzyklus sind und als Antwort auf geschädigte DNS wirken. Zwei Gene, mec1 und mec2 sind ebenfalls beim Stoppen des Zellzyklus als Antwort auf nichtreplizierte DNS beteiligt.
Die Antwort auf DNS-Schädigung ist ebenfalls in der Spalthefe S. pombe untersucht worden. Es sind eine Reihe von Genen identifiziert worden, die Zellen erlauben, mit geschädigter oder nichtreplizierter DNS in die Mitose einzutreten. Zum Beispiel sind die HUS12 und HUS16 Gene mit negativen Regulatoren der Mitosen in Zusammenhang gebracht worden, die auf nichtreplizierte DNS antworten, während RAD21 ein negativer Regulator ist, der für geschädigte DNS empfindlich ist. Die HUS14, HUS17, HUS22, HUS26, RAD1, RAD3, RAD9 und RAD17 Gene von S. pombe scheinen jeweils negative Regulatoren der Mitose zu sein, die die Fähigkeit haben, entweder auf nichtreplizierte oder geschädigte DNS zu antworten. (Rowley et al. (1992) EMBO 11: 1343; und Enoch et al. (1991) CHS Symp. Quant. Biol. 56: 409)
Kürzlich sind Mutationen in den S. cerevisiae Genen BUB und MAD isoliert worden, die nicht die Fähigkeit haben, Mitose mit Mikrotubulidestabilisierenden Stoffen zu stoppen. (Hayt et al. (1991) Cell 66: 507; und Li et al. (1991) Cell 66: 519). Die S. cerevisiae Zelle kann ebenfalls durch eine Reihe von Umwelteinflüssen beeinflusst werden. Solch ein Effektor ist der α- Paarungstypfaktor, der einen G1-Stopp induziert. Mutanten in den FUS3 oder FAR1 Genen, haben nicht die Fähigkeit in G1 als Antwort auf den α-Faktor zu stoppen. Während Mutationen in jedem Gen phänotypisch ähnlich sind, beeinflussen sie unterschiedliche regulatorische Pfade. Zum Beispiel ist das FUS3 Gen kloniert worden und zeigt eine starke Sequenzähnlichkeit mit der Serin/Threonin Familie der Protein-Kinasen (Goebl et al. (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3: 242).
In dem Fungus Aspergillus nidulans wird angenommen, dass das bimE Gen einen negativen Regulator der Mitose codiert, der normalerweise die Funktion hat, Mitose durch Expressionskontrolle eines putativen mitotischen Induzierers, nimA, zu verhindern. Es wird angenommen, dass das Nichtvorhandensein der bimE Funktion Zellzykluskontrollsysteme aufhebt, die normalerweise agieren, eine während der Interphase stattfindende Chromosomenkondensation und Spindelbildung zu verhindern. Temperatursensitive Mutanten des bimE Gens, wie zum Beispiel die bimE7 Mutante erlauben Zellen mit nichtreplizierter DNS vorzeitig in die Mitose einzutreten (Osmani et al. (1988) Cell 52: 241) und können als hypermitotische Zellen des vorliegenden Tests nützliche letale Phänotypen sein.
Kontrollpunkte und Mutationen davon sind in Säugerzellen ebenfalls identifiziert worden und können zum Erzeugen der hypermitotischen und hypomitotischen Zellen des vorliegenden Tests verwendet werden. Zum Beispiel ist von einer Entkopplung der Mitose von der Vollendung von DNS Replikation in Säugerzellen als Antwort auf Behandlung mit Stoffen und Mutation berichtet worden. In Säugerzellen kann, wie in anderen eukaryotischen Zellen, durch milde Röntgenbestrahlung verursachte DNS Schädigung ein Fortschreiten durch zwei Zellzykluskontrollpunkte, dem Restriktionspunkt (G1/S) und Eintritt in Mitose (G2/M) (Little et al. (1968) Nature 218: 1064; Nagasawa et al. (1984) Radiation Res. 97: 537; und Murray (1992) Nature 359: 599) blockieren. Das/die AT Gen(e) p53 und GADD45 sind innerhalb von Genen, die identifiziert worden sind, für die negative Regulation von Mitose durch Zellzyklus-Kontrollpunkte bedeutend zu sein (Kaastan et al. (1992) Cell 71: 587; Hartwell (1992) Cell 71: 543; und Murray (1992) Nature 359: 599) und können in dem vorliegenden Test zum Erzeugen einer hypermitotischen Zelle oder einer hypomitotischen Zelle in Anhängigkeit davon, ob die Beeinträchtigung durch Expressionsunterbrechung, Aktivitätshemmung oder durch Überexpression hergestellt werden soll, verwendet werden. Zusätzlich kann eine Temperatur-sensitive Mutation im Säugetier RCC1 (Repressor der Chromosomenkondensation) Gen kultivierter Hamsterzellen bewirken, DNS Replikation zu beenden und vorzeitig in die Mitose einzutreten, wenn sie auf die nichtzulässige Temperatur während der S- Phase überführt werden. Verwandte von RCC1 sind in Hefe (d. h. pim1) und Drosophila identifiziert worden, und beide Gene können die Säugetier RCC1 Mutation komplementieren, was ausserdem vermuten lässt, dass bestimmte Kontrollpunktmechanismen, wie cdc2 Regulation des Zellzyklus, innerhalb verschiedenen Phyla konserviert sind.
Viele der regulatorischen Proteine, die in dem Fortschreiten einer Zelle durch Meiose beteiligt sind, sind ebenfalls identifiziert worden. Aufgrund der Gemeinsamkeiten bestimmter mitotischer und meiotischer Pfade dienen mehrere mitotische regulatorische Proteine oder ihre Homologe, wie zum Beispiel cdc Proteinkinasen, Cycline und cdc25 Homologe ebenfalls zur Regulation von Meiose. Zum Beispiel sind in bestimmten mitotischen Zellzyklus- Ereignissen fehlerhafte Zellteilungszyklus-Mutanten bezüglich Sporulation bei semirestriktiven Bedingungen getestet worden (Gralbert et al. (1991) Curr Genet 20: 199). Die mitotisch fehlerhaften Mutanten cdc10-129, cdc20-M10, cdc21-M6B, cdc23-M36 und cdc24-M38 bildeten viersporige Asci, aber mit geringer Wirksamkeit. Mutanten, die in den mitotischen Initiationsgenen cdc2, cdc25 und cdc13 fehlerhaft waren, wurden bei Meiose II blockiert, obwohl keine der wee1-50, d. h. nim1+ und win 1+ Allele eine Wirkung auf Sporulation hatten, was vermuten lässt, dass ihre Interaktionen mit cdc25 und cdc2 für Mitose in Hefe spezifisch sind. Andere regulatorische Gene und Genprodukte, die zum Bilden der hyper- oder hypomeiotischen Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schliessen rec102, spo13, cut1, cut2, IME1, MAT, RME1, cdc35, BCY1, TPK1, TPK2, TPK3, spd1, spd3, spd4, spo50, spo51 und spo53 ein. Wie oben können die hyper- oder hypomeiotischen Zellen genetisch oder chemisch unter Verwendung von Zellen erzeugt werden, für die das beabsichtigte Ziel des antimeiotischen Stoffes endogen ist, oder alternativ, unter Verwendung von Zellen, in denen das beabsichtigte Ziel exogen exprimiert ist.
Zusätzlich haben bestimmte meiotische regulatorische Proteine die Fähigkeit Funktionsverlust-Mutationen in dem mitotischen Zellzyklus zu retten. Zum Beispiel hat das Drosophila meiotische cdc25 Homolog "twine" die Fähigkeit, Mitose in Temperatursensitiven Mutanten der Spalthefe zu retten. Somit können antimeiotische Stoffe unter Verwendung von hyper- oder hypomeiotischen Zellen und in manchen Fällen hyper- oder hypomitotischen Zellen identifiziert werden.
Die hyper- und hypoproliferierenden Zellen des vorliegenden Tests, entweder zum Identifizieren antimitotischer oder antimeiotischer Stoffe, können so erzeugt werden, dass sie heterologe Zellzyklus-Proteine (d. h. artübergreifende Expression) umfassen. Wie oben beispielhaft in dem Fall von cdc25 dargestellt, können Zellzyklus-Proteine aus einer Art in den Zellen einer anderen Art exprimiert werden, und es ist gezeigt worden, dass sie die Fähigkeit haben Funktionsverlust-Mutationen in den Wirtszellen zu retten. Zusätzlich zu solchen Zellzyklus-Proteinen, die ideal als Ziel einer Hemmung durch die Prüfsubstanz sind, können Zellzyklus-Proteine, die mit dem beabsichtigten Ziel einer Hemmung interagieren, ebenfalls artübergreifend exprimiert werden. Zum Beispiel kann in einer hyperproliferiernden Hefezelle, in der ein humanes cdc25 (z. B. exogen exprimiert) das beabsichtigte Ziel für Entwicklung eines antimitotischen Stoffes ist, eine humane cdc Proteinkinase und humanes Cycliln ebenfalls in der Hefezelle exprimiert werden. Wird eine hypoproliferierende Hefe verwendet, die humanes wee1 exprimiert, würde ähnlicherweise eine humane cdc Proteinkinase und humanes Cyclin, mit welchen das humane cdc25 interagieren würde, verwendet werden, um die entsprechenden Hefezellzyklus-Proteine zu ersetzen. Zur Veranschaulichung kann eine dreifache cln Deletionsmutante von S. Cerevisae, die ebenfalls bedingt in cdc28 (das Knosphefe-Äquivalent zu cdc2) fehlerhaft ist, durch die Koexpression eines humanen Cyclin und humanen cdc2 Proteins gerettet werden, wodurch deutlich wird, dass die Hefezellzyklusmaschinerie zumindest teilweise durch entsprechende humane regulatorische Proteine ersetzt werden kann. Roberts et al. (1993) PCT Publication Number WO 93/06123. Auf diese Weise können die Reagenzzellen des vorliegenden Tests so erzeugt werden, um sich noch näher an die natürlichen Interaktionen anzunähern, die ein bestimmtes Zellzyklus-Protein erfahren kann.
Manipulationen dieser regulatorischen Pfade mit bestimmten Stoffen, die hier als "hypermitotische Stoffe" bezeichnet werden, können mitotische Veränderungen induzieren und haben ein Erzeugen der hypermitotischen Zelle des vorliegenden Tests zur Folge. Zum Beispiel können Koffein, die Proteinkinase-Inhibitoren 2-Aminopurin und 6-Dimethylaminopurin und der Proteinphosphatase-Inhibitor Okadainsäure Zellen, die in der S Phase durch DNS-Synthese-Inhibitoren gestoppt wurden, dazu bewirken unpassenderweise in die Mitose einzutreten (Schlegel et al. (1986) Science 232: 1264; Schlegel et al. (1987) PNAS 84: 9025; und Schlegel et al. (1990) Cell Growth Differ. 1: 171). Ausserdem wird angenommen, dass 2-Aminopurin die Fähigkeit hat, eine Reihe von Zellzyklus-Kontrollpunkten von G1, S Phase, G2 oder Mitose aufzuheben. (Andreassen et al. (1992) PNAS 89: 2272; Andreassen et al. (1991) J. Cell Sci. 100: 299, und Steinmann et al. (1991) PNAS 88: 6843). Zum Beispiel erlaubt 2-Aminopurin Zellen eine durch γ-Bestrahlung induzierte G21M Blockade zu überwinden. Zusätzlich haben kontinuierlich 2-Aminopurin allein ausgesetzten Zellen die Fähigkeit aus der S Phase ohne Vollendung der Replikation auszutreten und aus Mitose ohne Metaphase-, Anaphase oder Telophase-Ereignisse auszutreten.
Analog dazu können hypomitotische Stoffe, wie zum Beispiel ein Phosphatase-Inhibitor verwendet werden, um chemisch eine Beeinträchtigung eines oder mehrerer Pfade zu induzieren, um die hypomitotische Zelle des vorliegenden Tests herzustellen. Ähnlicherweise können hypermeiotische oder hypomeiotische Stoffe angewandt werden, um chemisch die geeignete Reagenzzelle zur Identifizierung antimeiotischer Stoffe in dem vorliegenden Test zu erzeugen.
Um bei der Vereinfachung einer mitotischen Katastrophe in der hypermitotischen Zelle zu helfen, kann es wünschenswert sein, die Zelle einem Stoff auszusetzen (d. h. ein chemischer Stimulus oder Umweltstimulus), der gewöhnlich ein Stoppen des Zellzyklus an dem Kontrollpunkt induziert. Ungeeignetes Austreten aus dem chemisch oder durch Umwelteinflüsse induzierten Stadium, aufgrund der Beeinträchtigung des regativen regulatorischen Kontrollpunktes, kann für die Zelle ultimativ letal sein. Solche arretierenden Stoffe schliessen ein Aussetzen gegenüber einer DNS schädigenden Strahlung oder DNS schädigenden Stoffen; Hemmung der DNS Synthese und Reparatur unter Verwendung von DNS Polymerase Inhibitoren, wie zum Beispiel Hydroxyharnstoff oder Aphidicolin; Topoisomerase-Inhibitoren, wie zum Beispiel 4'-Dimetyhlepipodophyllotoxin (VM-26); oder Stoffe, die die Mikrotubulianordung stören, wie zum Beispiel Nocadazol und Taxol ein. Durch Beispiele ist gezeigt worden, dass bei BHK und HeLa Zellen, die 250 rad γ-Bestrahlung erhalten, ein G2-Stop erfolgt, der ohne weitere Behandlung innerhalb 4-5 Stunden umgekehrt wurde. Dennoch wurde diese mitotische Verzögerung in sowohl den Hamster als auch humanen Zellen unterdrückt und den Zellen wurde erlaubt, Mitose durchzumachen, bevor DNS-Reparatur vollendet worden war (Steinmann et al. (1991) PNAS 88: 6843). Zusätzlich kann in bestimmten Zellen der Ernähungszustand der Zelle, als auch Paarungsfaktoren, ein Stoppen der normalen Zelle während der Mitose bewirken.
Der vorliegende Test kann zum Entwickeln von Inhibitoren von Pilzinfektionen verwendet werden. Die häufigsten Pilzinfektionen sind künstlich und werden gegenwärtig mit einem von mehreren topischen Arzneimitteln oder mit den oralen Arzneimitteln Ketoconazol oder Griseofulvin behandelt. Die systemischen Mykosen bilden ein anderes therapeutisches Problem. Diese Infektionen sind oft schwer zu behandeln und eine langwierige parenterale Therapie mit potentiell toxischen Arzneimitteln kann erforderlich sein. Die systemischen Mykosen werden manchmal in zwei Gruppen gemäß dem infizierenden Organismus eingeteilt. Die "opportunistischen" Infektionen betreffen solche Mykosen - Candidiasis, Aspergillose, Kryptokokkose und Phycomykose- die gewöhnlich in schwachen und immunsuppressiven Patienten vorkommen. Diese Infektionen sind insbesondere in Patienten mit Leukemien und Lyphomen, in Menschen, die eine immunsuppressive Therapie erhalten und in Patienten mit solchen Veranlagungen wie Diabetes Mellitus oder AIDS ein besonderes Problem. Andere systemische Mykosen - zum Beispiel Blastomykose, Histoplasmose, Kokzidioidomykose und Sporotrichose - neigen dazu, ein relativ geringes Vorkommen zu haben, das gemäss der geographischen Lage beachtlich variieren kann.
Zur Entwicklung eines Tests für antimitotische oder antimeiotische Stoffe mit potentiellem therapeutischen Wert in der Behandlung bestimmter mykotischer Infektionen kann eine an der Infektion beteiligte Hefe zum Erzeugen der geeigneten Reagenzzelle des vorliegenden Tests verwendet werden. Zum Beispiel kann die hypermitotische oder hypomitotische Zelle biochemisch wie oben beschrieben erzeugt oder zum Beispiel durch Suchen nach Bestrahlung-sensitiven Mutanten mit beeinträchtigten Kontrollpunkten konstruiert werden. Zusätzlich kann ein putativer mitotischer Regulator der mykotischen Hefe, wie zum Beispiel ein cdc25 Homolog, kloniert werden und in einer heterologen Zelle exprimiert werden, die leichter manipulierbar ist oder die Proliferationsmessung vereinfacht, wie zum Beispiel ein Mitglied der Schizosaccharomyces-Gattung wie S. pombe.
Wie veranschaulicht, können die vorliegenden Tests zum Suchen nach antimitotischen und antimeiotischen Stoffen, die die Fähigkeit haben, mindestens einen in solchen Mykosen wie Candidiasis, Aspergillose, Mukormykose, Blastomykose, Geotrichose, Kryptokokkose, Chromoblastomykose, Kokzidioidomykose, Konidiosporose, Histoplasmose, Maduramykose, Rhinosporidiose, Nokardiose, Para-Aktinomykose, Penicilliose, Monoliases oder Sporotrichose beteiligten Fungus zu hemmen, verwendet werden. Zum Beispiel kann der vorliegende Test, wenn die mykotische Infektion, für die Behandlung erwünscht ist, Candidiasis ist, entweder eine hypermitotische oder hypomitotische Zelle verwenden, die direkt von oder mit klonierten Genen von Hefen erzeugt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida albicans, Candida stellafoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii und Candida rugosa. Ähnlicherweise kann der vorliegende Test zum Identifizieren antimitotischer und antimeiotischer Stoffe, die in der Behandlung von Aspergillose einen therapeutischen Wert haben durch Ausnutzen der Hefe wie zum Beispiel Aspergillus fumigamus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans oder Aspergillus terreus verwendet werden. Ist die mykotische Infektion Mucormykose, kann die Hefe aus der Gruppe bestehend aus Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, Absidia corymbifera, Absidle ramosa und Mucor pusillus ausgewählt werden. Andere Pathogene, die in dem vorliegenden Test verwendet werden können, schliessen Pneumocystis carinii und Toxoplasma gondii ein.
Bezüglich ihrer Fähigkeit als antimitotische und/oder antimeiotische Stoffe in dem vorliegenden Test zu wirken zu testende Stoffe können solche, die von Bakterien, Hefe oder anderen Organismen hergestellt werden oder chemisch hergestellte Stoffe sein. Der Test kann in jedem für das Zellwachstum geeignete Gefäss durchgeführt werden, wie zum Beispiel Mikrotiterplatten oder Petrischalen. Da potente Inhibitoren der Mitose und/oder Meiose vollständig Proliferation einer Zelle hemmen können, kann es sinnvoll sein, den Test bei verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz durchzuführen. Zum Beispiel können Verdünnungsreihen der Prüfsubstanzen zu der hypermitotischen Zelle hinzugefügt werden, so dass mindestens eine getestete Konzentration des antimitotischen Stoffes den mitotischen Aktivator in einem Ausmass hemmt, das notwendig ist, um das Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus angemessen zu verlangsamen, aber nicht in einem solchen Ausmass hemmt, dass notwendig ist, um einen Eintritt in die Mitose insgesamt zu hemmen. Enthält der Test eine hypomitotische Zelle, können auf ähnliche Weise Verdünnungsreihen einer Prüfsubstanz zu den Zellen auf eine solche Weise hinzugefügt werden, dass mindestens eine Konzentration eines antimitotischen Stoffes einen negativen mitotischen Regulator in einem solchen Ausmass hemmt, das notwendig ist, um Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus angemessen zu verstärken, aber nicht in einem Ausmass, dass eine mitotische Katastrophe bewirken würde.
Eine Quantifizierung der Proliferation der hypermitotischen Zelle bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein einer Prüfsubstanz kann mit einer Anzahl, einem Fachmann bekannten Techniken gemessen werden, einschliesslich einfacher Messungen von Populationswachstumskurven. Zum Beispiel können, wenn der Test Proliferation in einem Flüssigmedium einschliesst, turbidimetrische Techniken (d. h. Absorption/Transmission von Licht einer gegebenen Wellenlänge durch die Probe) verwendet werden. Zum Beispiel kann in dem Fall, in dem die Reagenzzelle eine Hefezelle ist, eine Absorptionsmessung von Licht bei einer Wellenlänge zwischen 540 und 600 nm eine günstige schnelle Messung von Zellwachstum bereitstellen.
Auf ähnliche Weise kann die Fähigkeit, in festem Medium (z. B. Agar) Kolonien zu bilden, verwendet werden, um Proliferation schnell nachzuweisen. Beide diese Techniken sind besonders hinsichtlich Hefezellen für Analysen mit hohem Durchlauf, die für schnelles Durchsuchen einer grossen Anzahl an Prüfsubstanzen notwendig sind, geeignet. Zusätzlich kann die Verwendung fester Medien, wie zum Beispiel Agar, weiter beim Etablieren einer Verdünnungsreihe der Prüfsubstanz helfen. Zum Beispiel kann die Prüfsubstanz auf einen auf einem festen Medium ausplattierten Reagenzzellenrasen aufgebracht werden. Die Diffusion der Prüfsubstanz durch das feste, die Aufbringstelle umgebende Medium wird eine diffusionale Wirkung schaffen. Für durch den vorliegenden Test nachgewiesene antimitotische oder antimeiotische Stoffe würde ein Zellwachstumshof in einem Bereich erwartet, der der Stoffkonzentration entspricht, die die Wirkung des beeinträchtigten Kontrollpunkts aufheben kann, die aber nicht so gross ist, um die Beeinträchtigung zu überkompensieren oder so gering ist, um die Fähigkeit zu haben, die Zelle zu retten.
Zur weiteren Veranschaulichung schliessen andere in dem vorliegenden Test nützliche proliferierende Suchtechniken Messung des mitotischen Index für unbehandelte und behandelte Zellen; Aufnahme von nachweisbaren Nucleotiden, Aminosäuren oder Farbstoffen; als auch visuelle Inspektion morphologischer Details der Zelle, wie zum Beispiel Chromatinstruktur oder andere Merkmale, die zwischen Zellen, die geeignet durch Mitose fortschreiten und Zellen, die in einer mitotischen Katastrophe enden oder bei einem bestimmten Zellzyklus-Kontrollpunkt stecken bleiben, unterscheidbar wären, ein. In dem Fall der Bewertung von Meiose kann die Sporen- oder Gametenmorphologie bewertet werden. Alternativ kann die Fähigkeit eine lebendige Spore ode Gamete zu bilden bewertet werden, zum Beispiel durch Messung der Fähigkeit einer Spore wieder negatives Wachstum zu beginnen, wenn sie mit einem geeigneten fermentierbaren Medium in Kontakt gebracht wird.
Zum Testen von Verbindungen, die spezifisch die humanen cdc25A, cdc25B oder cdc25C Genprodukte hemmen, wurden die Gene in das Genom eines S. pombe Stammes eingeführt, der konstruiert wurde, um bedingt hypermitotisch zu sein. Drei lineare DNS- Fragmente wurden konstruiert, wobei jeder eins der drei humanen cdc25A, B oder C Gene unter der Kontrolle eines S. pombe Promotors trug und von Nucleinsäure-Sequenzen flankiert wurde, die eine Integration der DNS in das S. pombe Genom erlaubten. Die cdc25-enthaltenden DNS-Fragmente wurden dann verwendet, um einen geeigneten S. pombe Stamm zu transformieren. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform die Expression des humanen cdc25 Gens durch den starken adh Promotor angetrieben, und die flankierenden Sequenzen des Fragmentes enthalten das ura4 Gen, um eine Integration des Fragmentes an dem ura4 Locus durch homologe Rekombination zu erlauben (Grimm et al. (1988) Molec. gen. Genet 81-86). Der S. pombe Stamm ist eine wee1 temperatursensitive Mutante, die bei Temperaturen oberhalb 36ºC hypermitotisch wird und ein Wildtyp ura4 Gen trägt, in das das cdc25 DNS Fragment integriert werden kann.

Beispiel 1

Das humane cdc25A Gen ist kürzlich kloniert worden (siehe Galaktinov et al. (1991) Cell 67: 1181). Die Sequenz des cdc25A Gens, die den offenen Leserahmen enthält, ist in Seq. ID Nr. 1 dargestellt und es wird angenommen, dass sie ein Protein von 523 Aminosäuren (Seq. ID Nr. 2) codiert. Ein 2,0 kb NcoI-KpnI Fragment, das die Aminosäuren 1-523 des humanen cdc25A codiert, wurde in ein mit NcoI-KpnI partiell verdauten pARTN Expressionsvektor subkloniert, woraus das pARTN-cdc25A Konstrukt, das die humane cdc25A cDNS in sense Orientierung zu dem konstitutiven adh Promotor trägt, folgte. Der autonom replizierende S. pombe pARTN Vektor stammt von pART3 (McLeod et al. (1987) EMBO 6: 719) durch Ligation eines NcoI Linker (New England Biolabs) in die SmaI Stelle ab.
Ein 2,3 kb DNS Fragment, das dem adh Promotor und den Aminosäuren 1-523 des humanen cdc25A Gens entsprach, wurde durch Verdau des pARTN-cdc25A Plasmids mit HindIII und Asp718 isoliert. Während HindIII zum Isolieren des Promotor/humanes cdc25A Gen-Fragments aus dem Plasmid ausreichte, verwendeten wir ebenfalls Asp718, um das nahe wandernde 2,2 kb HindIII-HindIII S. cerevisiae LEU2 Gen in zwei kleinere Fragmente zu schneiden, was die Isolierung des cdc25A Fragmentes einfacher machte.
Das HindIII/HindIII Fragment wurde dann mit Klenow-Enzym und dNTPs mit stumpfen Enden hergestellt (siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2eds. Sambrook et al., CSH Laboratory Press: 1989) und in ein zuvor mit SruI verdautes und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliertes pKS- /ura4 Plasmid ligiert. Enorme Mengen des rekombinanten Plasmids wurden präpariert und ein dem "5'halb ura4-adh Promotor-cdc25A-3'halb ura4" (siehe Fig. 1) entsprechendes 4,1 kb DNS Fragment wurde isoliert.

Beispiel 2

Das humane cdc25B Gen ist vor kurzem kloniert worden (siehe Galaktinov et al. (1991) Cell 67: 1181). Die Sequenz des cdc25B Gens, die den offenen Leserahmen enthält, ist in SEQ ID. Nr. 3 dargestellt und es wird angenommen, dass sie ein Protein von 566 Aminosäuren codiert (Seq ID Nr. 4). Ein 2,4 kb SmaI Fragment aus dem p4 · 1.2 Plasmid (Galaktinov et al., supra), das die Aminosäuren 32-566 codiert, wurde in ein SmaI-verdauten pART3 Vektor subkloniert, woraus der pARTN-cdc25B Vektor folgte, der die humane cdc25B cDNS enthielt. Während die Initiationsstelle der Translation nicht klar ist (es gibt kein exogenes ATG 5' zur SmaI Klonierungsstelle in dem offenen Leserahmen von cdc25B), vermuten wir, dass das erste ATG dem Met-59 des offenen Leserahmen des humanen cdc25B oder alternativ einem ATG an der NdeI Stelle von pART3 entspricht. Auf jeden Fall ist gezeigt worden, dass das pARTN-cdc25B Plasmid die Fähigkeit hat, eine S. pombe Zelle zu transformieren und die Fähigkeit hat, temperatursentitive Mutationen des Hefe cdc25 Gens zu retten (Galaktinov et al., supra).
Wie oben wurde ein 2,7 kb DNS Fragment, das dem adh Promoter und den Aminosäuren 32-566 des humanen cdc25B Gens entsprach, durch Verdau von pARTN-cdc25B mit HindIII und Asp718 isoliert. Das HindIII/HindIII cdc25B Fragment wurde mit Klenow-Enzym und dNTPs mit stumpfen Enden hergestellt und in einen zuvor mit StuI verdauten und mit alkalischer Phosphatase dephosphorylierten pKS-/ura4 Vektor ligiert. Ein "5'- halb ura4-adh Promotor-cdc-25B-3'-halb ura4" (siehe Fig. 2) entsprechendes 4,4 kb DNS Fragment wurde isoliert.

Beispiel 3

Das humane cdc25C Gen ist vor kurzem kloniert worden (siehe Sadhu et al. (1990) PNAS 87: 115139; und Hoffmann et al. (1993) EMBO 12: 53). Die Sequenz des cdc25C Gens, die den offenen Leserahmen enthält, ist in Seq. ID Nr. 5 dargestellt, und codiert voraussichtlich ein Protein von 473 Aminosäuren (Seq. ID Nr. 6). Ein mit dem pGEX-2T6-cdc25 Plasmid (Hoffmann et al., supra) beginnendes 1,8 kbp DNS Fragment, das den Aminosäuren 1-473 des humanen cdc25C Gen entspricht, wurde durch Verdau mit BamHl und durch partiellen Verdau mit NdeI (d. h. es gibt eine NdeI Stelle in dem cdc25C Gen) isoliert. Dieses Fragment wurde in einen pART3 Vektor ligiert, der zuvor mit NdeI und BamHI verdaut wurde, wodurch das Plasmid pART3-cdc25C folgte, das die Aminosäuren 1-473 des humanen cdc25C Gens unter der Kontrolle des starken adh Promotors enthielt (siehe Fig. 3).
Ein dem adh Promotor und den Aminosäuren 1-473 des humanen cdc25C Gens entsprechendes 2,5 kbp Fragment wurde durch Verdau von pART3-cdc25C mit HindIII und Asp718 isoliert. Das HindIII/HindIII cdc25C Fragment wurde mit Klenow-Enzym und dNTPs mit stumpfen Enden erzeugt, und in ein zuvor mit StuI verdautes und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliertes pKS-/ura4 Plasmid ligiert. Ein "5'-halb ura4-adh Promotorcdc25C-3'-halb ura4" entsprechendes 4,3 kbp DNS Fragment wurde isoliert (siehe Fig. 4).

Beispiel 4

Jedes der cdc25 Konstrukte pARTN-cdc25A, pARTN-cdc25B und pART3-cdc25C, als auch das ursprüngliche pART3 Plasmid wurden zum Transformieren des S. pombe Stammes Sp553 (h+N, cdc25-22, wee1-50, leu1-32) unter Verwendung bekannter Verfahren verwendet. Kurz zusammengefasst, wurden Zellen in YE Medium bei 25ºC angezogen, bis sie in der exponentiellen Phase waren (~10&sup7; Zellen/ml). Die Zellen wurden dann von den Medien 5 Minuten bei 3000 rpm abzentrifugiert und in LiCl/TE bei einer Konzentration von ~10&sup8; Zellen/ml (LiCl/TE = 10mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM LiCl, pH 8) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert, dann wieder 5 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert, in LiCl/TE bei einer Konzentation von ~5 · 10&sup8; Zellen/ml resuspendiert und 30 Minuten bei 25ºC geschüttelt.
Zu einem Aliquot von 150 ul Zellen wurde 500 ng Plasmid DNS und 350 ug PEG/TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50% PEG 4000 pH 8) hinzugegeben. Die Zellen/Plasmid Mischung wurde dann 30 Minuten bei 25ºC inkubiert, bei 42ºC 20 Minuten hitzeschockiert, dann 10 Sekunden bei 15 000 rpm nach Zugabe von 0,5 mL EMM zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,6 mL EMM resuspendiert und 0,2 mL Aliquots wurden ausplattiert.
Die Fig. 5A und 5B veranschaulichen die Fähigkeit der pART3 transformierten Hefe bei 25ºC und beziehungsweise 37ºC zu wachsen. Wie oben dargestellt, sind bei der nichtzulässigen Temperatur von 37ºC sowohl die endogene wee1 als auch die endogene cdc25 Aktivität beeinträchtigt, so dass sie gegenseitig ihre jeweiligen Wirkungen aufheben und die Zellen immer noch die Fähigkeit haben, zu proliferieren (pART3 fehlt jegliches cdc25 Gen).
Die Fig. 6A und 6B (cdc25A), 7A und 7B (cdc25B) und 8A und 8B (cdc25C) zeigen die Wirkung der Expression eines humanen cdc25 in einem Hefe "wee" Hintergrund. Jede der Fig. 6A, 7A und 8A zeigen, dass bei der zulässigen Temperatur von 25ºC (wee1 ist exprimiert) die Zellen die Fähigkeit haben, zu proliferieren. Dennoch hat, wie durch die Fig. 6B, 7B und 8B veranschaulicht, eine Temperaturänderung auf die nichtzulässige Temperatur von 37ºC eine mitotische Katastrophe zur Folge. Mikroskopische Analysen der auf den 37ºC Platten vorhandenen Hefezellen zeigten, dass die Expression eines humanen cdc25 in einem Hefe wee Hintergrund eine mitotische Katastrophe für die Zellen zur Folge hatte.

Beispiel 5

Zum Bereitstellen eines stabileren Transformanten und einer einheitlichen Expression des humanen cdc25 Gens, wurden je die resultierenden ura4-cdc25 Fragmente der Beispiele 1-3 zum Transformieren eines ura4+ S. pombe Stamms verwendet. Wie in Beispiel 4 trug jeder S. pombe Stamm ein thermosensitives Allel seines eigenen cdc25 Gens, wie zum Beispiel der cdc25-22 Phänotyp, so dass bei nichtzulässigen Temperaturen das exogene cdc25 prinzipiell für Aktivierung von cdc2 verantwortlich ist. In einer Ausführungsform wurde der S. pombe wee1-50 cdc25-22 ura4+ Stamm mit einem ura4-cdc25 Fragment der Beispiele 1-3 transformiert. Dieser besondere Stamm ist im allgemeinen bei 25ºC als auch bei der restriktiven Temperatur von 37ºC lebensfähig, da der Verlust der endogenen cdc25 Aktivität durch den gleichzeitigen Verlust der wee1 Funktion bei 37ºC ausgeglichen wird. Dennoch kann eine Integration und Überexpression des humanen cdc25, wie in Beispiel 4 gezeigt, einen mitotisch katastrophalen Phänotyp bei 37ºC zur Folge haben, da der wee1 Kontrollpunkt beeinträchtigt ist.

Beispiel 6

Zum Testen der antimitotischen Aktivität verschiedener Prüfsubstanzen werden die Zellen nach Beispiel 4 oder 5 entweder auf einem Festmedium, wie zum Beispiel EMM Platten ausplattiert oder in einem geeigneten vegetativen Flüssigkeit, wie zum Beispiel YE suspendiert.
Im Falls des Ausplattierens auf ein Festmedium werden die Prüfsubstanzen nachfolgend auf die Platte übertragen und die Platte wird bei einer nichtzulässigen Temperatur von 37ºC inkubiert. Ein Zellwachstumshof wird sich um solche Substanzen, die zumindest teilweise einen mitotischen Aktivator hemmen, der die ansonsten katastrophale Zelle retten kann, bilden.
Wird Zellwachstum in einer vegetativen Flüssigkeit durchgeführt, werden Aliquots der Zellen/Medien in Vertiefungen von Mikrotiterplatten angeordnet und Verdünnungsreihen der Prüfsubstanz werden in die Vertiefungen hinzugefügt. Die Platten werden bei 37ºC inkubiert und A&sub5;&sub4;&sub0; wird über einen Zeitraum für jede Vertiefung gemessen und mit ähnlichen Vertiefungen an Zellen/Medien, denen die Prüfsubstanz fehlt (z. B. Negativkontrollen), verglichen. Eine Steigerung der Absorption über einen Zeitraum im Verhältnis zu den Negativkontrollen ist ein Hinweis auf positive Proliferation der Zellen und lässt eine Fähigkeit einer bestimmten Prüfsubstanz einen mitotischen Aktivator zu hemmen, vermuten.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Mitotex, Inc
(B) STRASSE: One Kendall Square, Gebäude 600
(C) STADT: Cambridge
(D) BUNDESSTAAT: MA
(E) STAAT: U.S.A.
(F) PLZ: 02139
(G) Telefon: (617) 255-0001
(H) Telefax: (617) 225-0005
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Test und Reagentien zur Identifizierung von antiproliferierenden Stoffen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: ASCII (Text)
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/073,383
(B) EINREICHUNG: 04 Juli 1993
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Claims

1. Ein Test zur Identifizierung von antiproliferierenden oder antimitotischen Stoffen, welcher umfasst:

i. Bereitstellen einer Zelle mit einem beeinträchtigten Zellzyklus-Kontrollpunkt, der mindestens teilweise durch (a) Überexpression eines rekombinanten Gens, das einen mitotischen Aktivator codiert oder (b) Behandeln der Zelle mit einem hypermitotischen Stoff verursacht ist, worin der beeinträchtigte Zellzyklus- Kontrollpunkt Proliferation der Zelle durch Bewirken von vorzeitigem Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus hemmt;

ii. In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, durch welche der Zellzyklus-Kontrollpunkt beeinträchtigt wird;

iii. Messen eines Proliferationsgehaltes der Zelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz; und

iv. Vergleichen des Proliferationsgehaltes der Zelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz mit einem Proliferationsgehalt der Zelle bei Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz, wobei eine Steigerung des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein der Prüfsubstanz ein Hinweis auf eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität der Prüfsubstanz ist.

2. Der Test nach Anspruch 1, worin der Zellzyklus ein mitotischer Zellzyklus ist.

3. Der Test nach Anspruch 2, worin die Zelle eine hypermitotische Zelle ist und der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt ein vorzeitiges Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil des mitotischen Zellzyklus bewirkt, welches ausreicht, Zelltod zu bewirken.

4. Der Test nach Anspruch 1, worin der Zellzyklus ein meiotischer Zellzyklus ist.

5. Der Test nach Anspruch 4, worin (a) die Zelle eine hypermeiotische Zelle ist und der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt ein vorzeitiges Fortschreiten der Zelle durch mindestens einen Teil des meiotischen Zellzyklus bewirkt, welches ausreicht, ein Enden der Zelle in einer meiotischen Katastrophe zu bewirken.

6. Der Test nach Anspruch 4, worin die Zelle eine hypomeiotische Zelle ist und der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt eine Hemmung des Fortschreitens der Zelle durch mindestens einen Teil des meiotischen Zellzyklus bewirkt, welches ausreicht, Meiose zu hemmen.

7. Der Test nach Anspruch 1, worin der beeinträchtigte Zellzyklus-Kontrollpunkt mindestens teilweise durch eine cdc25 Phosphatase vermittelt wird, wobei eine Steigerung des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein der Prüfsubstanz ein Hinweis auf Hemmung der cdc25 Phosphatase durch die Prüfsubstanz ist.

8. Der Test nach Anspruch 7, worin die Beeinträchtigung des Zellzyklus-Kontrollpunktes den Eintritt der Zelle in die Mitose vor Vollendung der Replikation oder Reparatur vom genomischer DNS der Zelle zur Folge hat.

9. Der Test nach Anspruch 8, worin die Beeinträchtigung des Zellzyklus-Kontrollpunktes eine Verringerung von inhibitorischer Phosphorylierung einer cdk umfasst.

10. Der Test nach Anspruch 9, worin die Beeinträchtigung des Zellzyklus-Kontrollpunktes eine beeinträchtigte weel Proteinkinase-Aktivität, eine beeinträchtigte mik1 Proteinkinase-Aktivität, oder eine Überexpression eines nim1 Genproduktes umfasst.

11. Der Test nach Anspruch 7, worin die Beeinträchtigung des Zellzyklus-Kontrollpunktes durch Behandlung der Zelle mit einem hypermitotischen Stoff induziert ist.

12. Der Test nach Anspruch 11, worin der hypermitotische Stoff ausgewählt ist aus Koffein, 2- Aminopurin, 6-Dimethylaminopurin und Okadainsäure.

13. Der Test nach Anspruch 7, worin der Zellzyklus- Kontrollpunkt bedingt zu beeinträchtigen ist und der Proliferationsgehalt der Zelle bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz unter Bedingungen gemessen wird, worin der Zellzyklus-Kontrollpunkt beeinträchtigt ist.

14. Der Test nach Anspruch 7, worin die Zelle eine Hefezelle ist, zum Beispiel eine Art der Gattung Schizosaccharomyces.

15. Der Test nach Anspruch 7, worin die cdc25 Phosphatase aus einem in der Zelle exprimierten rekombinanten Genprodukt ausgewählt ist, ein humanes cdc25 oder Homolog davon, ein cdc25 oder Homolog davon eines humanen Pathogens, wie zum Beispiel Pneumocystis oder Toxoplasma ist.

16. Der Test nach Anspruch 7, worin die cdc25 Phosphatase von einem humanen Pathogen abstammt, ausgewählt aus Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Candida Quillermondii, Candida rugosa, Aspergillus funigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus orzyae, Absidia corymbifera, Absidia ramosa und Mucor pusillus.

17. Der Test nach Anspruch 7, worin die cdc Phosphatase von einem humanen Pathogen abstammt, welches an einer mykotischen Infektion beteiligt ist, wie zum Beispiel eine Mykose ausgewählt aus Candidiasis, Aspergillose, Mukormykose, Blastomykose, Geotrichose, Kryptokokkose, Chromoblastomykose, Penicilliose, Konidiosporose, Nokardiose, Kokzidioidomykose, Histoplasmose, Maduramykose, Rhinosporidiose, Monoliasis, Para-Aktinomykose und Sporotrichose.

18. Der Test nach Anspruch 1, worin der Zellzyklus- Kontrollpunkt einen G1/S Kontrollpunkt, einen G2/M Kontrollpunkt umfasst.

19. Der Test nach Anspruch 1, worin der Zellzyklus- Kontrollpunkt bedingt zu beeinträchtigen ist und der Proliferationsgehalt der Zelle bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz unter Bedingungen gemessen wird, worin der Kontrollpunkt beeinträchtigt ist.

20. Der Test nach Anspruch 1, worin (a) die Zelle eine Schizosaccharomyces-Zelle mit einer bedingt zu beeinträchtigenden weel Proteinkinase ist, welche eine Proliferationshemmung der Schizosaccharomyces-Zelle durch Vereinfachen eines vorzeitigen Eintritts der Schizosaccharomyces-Zelle in die Mitose unter Bedingungen bewirken kann, worin die weel Kinase beeinträchtigt ist, wobei der vorzeitige Eintritt in die Mitose mindestens teilweise durch die cdc25 Phosphatase und einem verringerten Gehalt an inhibitorischer Phosphorylierung einer cdc2 Proteinkinase durch die weel Proteinkinase vermittelt wird; und (b) die Zelle mit einer Prüfsubstanzverbindung unter den Bedingungen in Kontakt gebracht wird, worin die weel Kinase beeinträchtigt ist.

21. Der Test nach Anspruch 20, worin die Schizosaccharomyces-Zelle eine Schizosaccharomyces pombe Zelle ist, oder besagte Schizosaccharomyces-Zelle bedingt wee-Phänotyp ist, wie zum Beispiel eine weel-50 Mutante.

22. Der Test nach Anspruch 20, worin die Beeinträchtigung der weel Proteinkinase-Aktivität durch die Überexpression eines nim1-Aktivators in der Schizosaccharomyces-Zelle verursacht ist, wobei besagte Zelle zum Beispiel eine OP-nim1 Mutante ist.

23. Der Test nach Anspruch 20, worin die cdc25 Phosphatase-Aktivität ein in der Schizosaccharomyces- Zelle exprimiertes rekombinantes Genprodukt ist, und der Schizosaccharomyces-Zelle eine funktionelle endogene cdc25 Phosphatase-Aktivität fehlt.

24. Der Test nach Anspruch 20, worin die cdc25 Aktivität ein humanes cdc25 ist, wie zum Beispiel ausgewählt aus cdc25A, cdc25B und cdc25C oder einem Homolog davon.

25. Der Test nach Anspruch 20, worin die cdc25 Phosphatase-Aktivität ein humanes Pathogen cdc25 oder Homolog davon ist.

26. Der Test nach Anspruch 25, worin das humane Pathogen ein Fungus ist, der an einer mykotischen Infektion beteiligt ist, ausgewählt aus Candidiasis, Aspergillose, Mukormykose, Blastomykose, Geotrichose, Kryptokokkose, Chromoblastomykose, Kokzidioidomykose, Konidiosporose, Histoplasmose, Maduramykose, Rhinosporidiose, Nokardiose, Para-Aktinomykose, Penicilliose, Monoliasis und Sporotrichose.

27. Eine Schizosacchromyces-Zelle, welche umfasst

i) ein exprimierbares rekombinantes Gen, welches eine exogene cdc25 Phosphatase codiert; und

11) eine bedingt zu beeinträchtigende weel Proteinkinase, die eine Hemmung der Zellproliferation durch Vereinfachen eines vorzeitigen Eintritts der Zelle in die Mitose unter Bedingungen verursachen kann, worin die weel Proteinkinase beeinträchtigt ist, wobei der vorzeitige Eintritt in die Mitose mindestens teilweise durch die exogene cdc25 Phosphatase und einem verringerten Gehalt an inhibitorischer Phosphorylierung einer cdc2 Proteinkinase durch die beeinträchtigte weel Proteinkinase vermittelt wird.

28. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 27, worin die exogene cdc25 Phosphatase eine humane cdc25 Phosphatase umfasst; wie zum Beispiel cdc25A, cdc25B und cdc25C.

29. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 27, worin die rekombinante cdc25 Phosphatase ein humanes Pathogen cdc25 oder Homolog davon ist.

30. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 29, worin das Pathogen cdc25 eine cdc25 Phosphatase eines an einer mykotischen Infektion beteiligten Fungus ist.

31. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 27, worin die weel Proteinkinase temperatursensitiv ist und bei einer Temperatur oberhalb einer zulässigen Temperatur beeinträchtigt ist.

32. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 27, worin die Schizosaccharomyces-Zelle eine weel-50 Mutante ist.

33. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 27, die ausserdem ein überexprimiertes nim1 Genprodukt umfasst, welches die weel Proteinkinase beeinträchtigt.

34. Die Schizosaccharomyces-Zelle nach Anspruch 33, die eine OP-nim1 Mutante ist.

35. Ein Verfahren zur Formulierung eines Medikamentes zur Hemmung der Proliferation einer Zelle, welches umfasst:

i. Bereitstellen einer Testzelle mit einem beeinträchtigten Zellzyklus-Kontrollpunkt, der mindestens teilweise durch (a) Überexpression eines rekombinanten Gens, das einen mitotischen Aktivator codiert oder (b) Behandeln der Zelle mit einem hypermitotischen Stoff verursacht ist, worin der beeinträchtigte Zellzyklus- Kontrollpunkt Proliferation der Zelle durch Bewirken von vorzeitigem Fortschreiten der Testzelle durch mindestens einen Teil eines Zellzyklus hemmt;

ii. In-Kontakt-Bringen der Testzelle mit einer Prüfsubstanz unter Bedingungen, durch welche der Zellzyklus-Kontrollpunkt beeinträchtigt wird;

iii. Messen eines Proliferationsgehaltes der Testzelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz;

iv. Vergleichen des Proliferationsgehaltes der Testzelle bei Vorhandensein der Prüfsubstanz mit einem Proliferationsgehalt der Testzelle bei Nichtvorhandensein der Prüfsubstanz, worin eine 5-teigerung des Proliferationsgehaltes bei Vorhandensein der Prüfsubstanz ein Hinweis auf eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität der Prüfsubstanz ist;

v. Formulieren eines Medikamentes aus einer Prüfsubstanz, welche darauf hinweist, eine antiproliferierende oder antimitotische Aktivität zu haben.