JP2001524672A - 核ホルモン受容体薬のスクリーニング法 - Google Patents
核ホルモン受容体薬のスクリーニング法Info
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Abstract
Description
ニング法を提供する。
子の発現を改変するリガンド活性化転写因子の大きく良好に定義されたファミリ
ーを含む(Laudet等, 1992, EMBO J, Vol, 1003-1013; Lopes da Silva等, 1995
, TINS 18, 542-548; Mangelsdorf等, 1995, Cell 83, 835-839; Mangelsdorf等
, 1995, Cell 83, 841-850)。ファミリーのメンバーは、オーファン受容体と、
ステロイド、ビタミンD、チロイドホルモン、レチノイン酸等を含む様々な臨床
的意義のあるリガンドに対する受容体との両方を含む。リガンド結合は受容体に
おける立体構造的変化を引き起こし、それらが、大きな核タンパク質の多種多様
なグループであり(Glass等, 1997、Curr Opn Cell Biol 9, 222-232)、シグネ
ーチャー配列モチーフを占め得る(Heery等, 1997, Nature 733-736)転写活性 化補助因子と結合するのを促進すると考えられている。得られた複合体は、次い
で染色質の高親和性部位に結合して遺伝子転写を調節する。
リガンド置換検定法であり、放射性標識されたリガンドの候補試薬による置換が
検出される。それに換わる方法は、核ホルモン受容体活性化のレポーターの発現
についての細胞ベースの転写検定法である(例えば、Evans等, (1991) 米国特許
第5,071,773号)。より最近では、ゲルベースの活性化補助因子依存的受容体リ ガンド検定法(Krey等, 1997, Mol Endocrinol 11, 779-791)が、抗高脂血症剤
を含む種々の化合物によって活性化された核ホルモン受容体であるペルオキシソ
ーム増殖因子−活性化受容体(PPAR)のリガンドを同定するのに用いられた
。残念なことに、これら種々の検定法は、各々、周知のリガンド及び時間、労働
及び資源集約的な細胞ベース及びゲルベースの方法の必要性を含む多くの制約を
受ける。
機能のモジュレーターの有効なスクリーニングのための方法及び組成物を提供す
る。この方法は、生物活性化合物の化学的ライブラリの、自動化されたコスト効
率が良くスループットの高いスクリーニングに適用される。
ホルモン受容体、ペプチドセンサー及び候補試薬を含むが、核ホルモン受容体の
天然活性化補助因子は含まない混合物を作成し、前記センサーが、受容体に対し
て、検定条件下で直接的なインビトロの結合を提供し;(b)センサーの受容体
への試薬に偏向した結合を測定し;そして(c)当該試薬偏向結合を、センサー
の受容体への対応する非偏向結合と比較する段階を含んでなり、偏向結合と非偏
向結合との間の差が、当該試薬が受容体機能を調節することを示す。特別な実施
態様では、センサーは、核ホルモン転写活性化補助因子モチーフ配列を含む両親
媒性アルファへリックス核ホルモン相互作用ドメインを含む。特異性を確実にし
結合を最適にするために、センサーは一般にサブマイクロモルの濃度で存在せし
め、結合反応は溶液中で起こす。好ましい実施態様では、センサーは蛍光標識を
含み、測定段階は標識の蛍光分極の検出を含む。
、ペプチド及び候補試薬を含む反応混合物も提供し、前記ペプチドは、受容体へ
の直接的、インビトロリガンド依存的結合を与え、特に結合は試薬の存在によっ
て促進される。
試薬を、標的化された相互作用を測定するのに有効な量で含有する混合物を用い
る。多くの天然核ホルモン受容体は、リガンド結合ドメインを含む分散した機能
性ドメインを持つモジュラータンパク質である;上掲のLaudet等, Lopes da Sil
va等, Mangelsdorf等参照。主題の受容体は、そのような全長受容体、並びに、 対応する受容体リガンド、アゴニスト及び/又はアンタゴニストの存在及び不存
在において異なるセンサー結合性を与えるのに十分な受容体の一部を含む。その
ような一部は一般的に少なくとも受容体のリガンド結合ドメインを含んでいる。
主題の組成物の生合成、分子発現及び精製のために、広範な分子及び生化学的方
法、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook,等, Cold Sp
ring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Au
subel,等, Greene Publ. assoc., Wiley-Interscience, NY)を参照、あるいはこ
の分野で他に知られているものが利用できる。核ホルモン受容体及び対応する標
的治療用途の例を表1に列挙する。
定で有意に検出可能な結合を提供するペプチドセンサーも含有する。従って、セ
ンサーは、混合物中に受容体の天然の活性化補助因子タンパク質を含有せしめる
必要をなくす。センサーは、受容体結合配列、一般的にはL1X1X2L2L3 を含み、ここで、L1−L3は独立に疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン又は
イソロイシイン、より好ましくはロイシンから選択され;X1−X2は独立に任
意のアミノ酸、好ましくは任意の天然アミノ酸から選択される。この配列を含む
センサー領域は、一般的に両親媒性のアルファへリックスを形成する。このよう
な配列は、天然活性化補助因子タンパク質モチーフ配列でもよく、例えば段階的
突然変異分析によりそれらの活性化補助因子モチーフ配列又は共通配列から、及
び/又は、全体又は部分的に合成した配列のスクリーニング、例えば残基の無作
為化及び受容体結合についての選択から誘導されてもよい。センサーは、必要な
受容体特異的結合をもたらすのに十分な長さ及び配列であり、一般的には50以
下、好ましくは24以下、より好ましくは12残基以下の長さである。従って、
予定された又は無作為化された候補センサーのパネルは、受容体結合について容
易にスクリーニングされる。例えば、高スループットの蛍光分極検定法(下記)
では、特異的結合を示す候補センサーは、最適化した結合検定条件下で、一般的
には少なくとも約5、好ましくは少なくとも約10、より好ましくは少なくとも
約20ミリ分極単位の向上した蛍光分極により簡便に同定される。
存的結合を示し、即ちセンサーは、そのようなリガンド/アゴニスト/アンタゴ
ニストの存在及び不存在で区別をつけて、各々一般的には少なくとも10/10
%、好ましくは少なくとも100/50%、より好ましくは少なくとも1,00
0/90%の差動的結合で受容体に結合する。従って、予定された又は無作為化
された候補センサーのパネルは、図2及び3において2つの例示的な受容体/リ
ガンド対について例示したように、差動的結合について容易にスクリーニングさ
れる。同様に、標的受容体の周知のアゴニスト又はアンタゴニストを用いて差動
的結合が簡便に示される。オーファン受容体については、リガンド結合ドメイン
に選択的に結合する仮性リガンド又は代替物についての既知のリガンドを予めス
クリーニングするのが好都合であることが多い。あるいは、アゴニスト及び/又
はアンタゴニストは、予定された又は無作為化された標識候補ペプチドを、検定
で検出可能な受容体結合を示すセンサーについてスクリーニングし、次いで、同
定されたセンサーの受容体に対する結合を増加/減少させる試薬、即ち各々アゴ
ニスト/アンタゴニストについてのスクリーニングによって同定してもよい。 例示的なセンサー及び結合データを表2に示す。
き、放射活性、発光、光学又は電子密度等の直接的な検出、又はエピトープタグ
等の間接的な検出を与える標識が含まれる。標識を検出するために、標識の性質
及び他の検定構成要素、例えば光学又は電子密度、放射性放出、非放射性エネル
ギー移動等を介すること、又は抗体複合体で間接的に検出されること等に応じて
種々の方法を用いることができる。特別な実施態様では、標識は受容体結合に従
って差動的に検出可能であり、あらゆる結合対非結合の分離段階を不要にする。
より特定の実施態様では、標識は、受容体結合に依存する差動的蛍光分極を与え
る蛍光標識である。このような標識の例はローダミン及びフルオレセインを含み
、これらは直接的に又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して間接的に結
合させてもよい。(例えば、固相ペプチド合成の間の)ペプチド抱合/取り込み
のための好適な標識及び方法はこの分野で良く知られている。センサーは、一般
的に約1μM未満、好ましくは約100nM未満、より好ましくは約10nM未
満、そして最も好ましくは約1nM未満の濃度で存在する。
を包含するが、典型的には有機化合物;好ましくは小さな有機化合物であり、合
成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られる。特別な実施態
様では、検定混合物は受容体の既知のリガンドも含む。この実施態様は、受容体
のアンタゴニストのスクリーニングに特に適している。また、種々の他の試薬も
混合物中に含まれ得る。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアル
ブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤等を含み、使用され得る。
和性で結合する条件下でインキュベートする。特別な実施態様では、受容体、ペ
プチド及び試薬を含む混合物の全ての成分は溶液中にある。混合物成分は、必要
な結合を提供するために任意の順序で添加でき、インキュベーションは最適な結
合を促進する任意の温度で実施してよい。インキュベーション時間は、同様に最
適な結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを促進
するために最短化される。インキュベーションの後、受容体と試薬との間の試薬
偏向結合が、上記のような標識の性質に従って検出される。試薬有無での結合に
おける相違が、その試薬が受容体結合機能を調節することを示している。ここで
用いる相違とは、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも50%、より好ま
しくは少なくとも90%の違いを表す。
容体の性質、検定が溶液中で行われるか又は部分的あるいは全体的に固相で行わ
れるか、発光、放射活性又は蛍光放出が用いられるか否か、固定化された受容体
−センサー複合体のセンサー又は受容体が検出されるか否か等に応じて広範な種
々の方法が用いられる。中でも固相での実施態様では、測定段階は、受容体のセ
ンサーを介した、又はセンサーの受容体を介した固定化を含み得る。例えば、セ
ンサーは標識を含むと考えられ、タグ又はセンサー自身のアミノ酸がエピトープ
標識を提供しうる。従って、受容体はセンサーを介して固定化され、センサーは
標識を介して固定化されうる。標識は固相に従来の共有及び/又は非共有結合で
直接結合してもよく、標識に特異的な1又は複数の第2の受容体、例えばセンサ
ーエピトープ特異的抗体、アビジン(この場合標識はビオチン)等を介して間接
的に結合してもよい。センサーがこのように固定化されると、測定段階は一般に
、従来のELISA形式におけるような受容体特異的抗体等で固定化された核ホ
ルモン受容体の検出を含む。好ましいELISA形式検定法は、特に高スループ
ット使用において、簡便な読み出しのための化学発光又は時間分解蛍光基質を用
いる。
サーが核ホルモン受容体を介して固定化される。同様に、受容体は直接固定化さ
れるか、あるいは1又は複数の受容体特異的受容体を介して結合し、次いで固定
化されたセンサーが、例えばELISA型の形式において直接的又は間接的に検
出される。
行してスクリーニングする場合に特に有用である。例えば、オーファン受容体で
は、ファージディスプレー検定法において弱く結合したペプチドが同定される。
弱く結合したペプチドは、ペプチド結合を調節する化合物のライブラリのスクリ
ーニングに用いられ、次いで陽性の混合物が分離され個々のペプチドによって検
定される。このような活性ペプチドは、次いで、例えば蛍光部分で直接的に標識
され、例えば以下に記載するような蛍光分極検定法などの非常に高いスループッ
トの溶液相検定法において用いられる。また、このようなペプチドのパネルは、
既知の受容体の候補モジュレーターをスクリーニングするのにも用いられ、与え
られたモジュレーターの活性/特異性の仮想の指紋(virtual fingerprint)を構 成する一連の結合効果を与える。さらに、このようなペプチドは、直接検出可能
なセンサーペプチドを必要とする溶液相検定法のための好ましい対照物の同定に
用いてもよい。
、検出可能な標識に共有結合した配列L1X1X2L2L3を含むペプチドから
なるか、又は実質的になるセンサーを提供し、ここでL1−L3は独立に疎水性
アミノ酸から選択され、X1−X2は独立に任意のアミノ酸から選択され、前記
ペプチドは核ホルモン受容体に対して直接的なインビトロのリガンド依存的結合
を提供する。特別な実施態様では、標識はペプチドのN-末端に結合した蛍光標 識であり、ペプチドは24、好ましくは18、より好ましくは12、最も好まし
くは8残基以下の長さである。また本発明は、例えば、核ホルモン受容体、ペプ
チド及び候補試薬を含む混合物などの試薬混合物も提供し、前記ペプチドは受容
体に対して直接的なインビトロのリガンド依存的結合を提供し、好ましくは、そ
の結合は試薬の存在下で促進される。 以下の実施例は例示のために提供され、いかなる限定もされない。
e Polarization Microtiter System (Dynatech Laboratories, Inc)を用いて測 定する。
)を作成する(50mLのポリプロピレン管を使用)。室温で1時間インキュベート する。 2.主混合物95μLを96-ウェルプレート**の各ウェルに添加する。 **リアクチ-結合ストレプトアビジン被覆、白色ポリスチレンプレート (#15118B)、Pieceからのスーパーブロッキング試薬により 阻止されている。 3.各試験化合物(ストック=60μM)の5μLをプレートの各ウェルに移す。 4.プレートを室温で1時間インキュベートする。 5.インキュベートしながら、ウサギ抗-GST抗体及び抗-ウサギ-HRP抗 体混合物を作成する(上記3参照)。氷上で1時間インキュベートする。 6.プレートをH2Oで3回完全に洗浄する。 7.プレートの各ウェルに100μLの抗体混合物を添加する。 8.室温で1時間インキュベートする。 9.H2Oで3回洗浄する。 10.スーパーシグナル基質(混合したルミノール及び過酸化物)をH20中
で1:2に希釈し、100μLを各ウェルに添加する。 11.3-5分間振盪する。化学発光を読む。
は特許出願が特に及び個々に参考として取り入れられると示されているように、
ここに出典明示して取り入れるものとする。前記の発明は、理解を明瞭にする目
的で例示及び実施例によって幾分詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示
に照らして、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく、それ
にある種の変更及び修飾が可能であることは容易に明らかになるであろう。
を示す用量反応のグラフである。
)がRXR受容体の標識されたペプチドセンサーに対する親和性を向上させるこ
とを示す用量反応のグラフである。
(1μM)についての、TUK-1391センサーでの蛍光分極NRHアゴニス ト検定法の確証を示すグラフである。
Claims (30)
- 【請求項1】 核ホルモン受容体機能のモジュレーターのインビトロ検定方
法において、 第1の核ホルモン受容体、ペプチドセンサー及び候補試薬を含むが、第1の受
容体の天然活性化補助因子タンパク質は含まない混合物を作成し、前記センサー
が、第1の受容体に対して検定条件下で直接的に検定で検出可能な結合を提供し
、 センサーの第1の受容体に対する試薬に偏向した結合を測定し; 当該試薬偏向結合を、対応するセンサーの第1の受容体に対する非偏向結合と
比較する段階を含んでなり; 前記偏向及び非偏向結合の間の相違が、当該試薬が第1の受容体の機能を調節
することを示す方法。 - 【請求項2】 第1の受容体が、PPARγ、Cyp7PBP(LRH-1) 、NURR1、RZRβ、PORα、NOR-1、Rev-ErbAβ、Tlx、
NGFI-Bβ、HZF-2α、COUP-TFα、β、γ、Nur77、LXR α、COR、Rev-ErbAα、HNF4α、TOR、MB67α、SHP、 FXR、SF-1、LXRβ、GCNF、TR2-11α、β、TR4、ERRα
、β及びDAX-1のリガンド結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 試薬がセンサーの第1の受容体への結合における増加をもた
らす、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 センサーが約10nM未満の濃度である、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項5】 センサーが両親媒性アルファへリックスを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項6】 センサーが配列L1X1X2L2L3を含み、L1−L3が
独立に疎水性アミノ酸から選択され、X1−X2が独立に任意のアミノ酸から選
択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 センサーが、KLVQLLTTT(配列番号:1)、ILH
RLLQE(配列番号:2)、LLRYLLDK(配列番号:3)、LLRYL
LD(配列番号:4)、LRYLLD(配列番号:5)、LLRYLL(配列番
号:6)、LRYLL(配列番号:7)、LLRYLLDKD(配列番号:8)
、QLLRYLLDKD(配列番号:9)、HQLLRYLLDKD(配列番号
:10)、PQAQQKSLLQQLLT(配列番号:11)、LLQQLLT
E(配列番号:12)、VTLLQLLLG(配列番号:13)、ILRKLL
QE(配列番号:14)、ILKRLLQE(配列番号:15)、ILRRLL
QE(配列番号:16)及びILKKLLQE(配列番号:17)から選択され
るペプチド配列を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 第1の受容体、ペプチド及び試薬が溶液中にある、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項9】 ペプチドが蛍光標識を含み、測定段階が標識の蛍光分極の検
出を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 混合物が、第1の受容体のリガンドをさらに含む、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項11】 センサーが、検定条件下で、第1の受容体に対する検定で
直接的に検出可能なリガンド依存的結合を提供する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】 核ホルモン受容体、候補試薬、及び検出可能な標識に共有
結合し配列L1X1X2L2L3を含むペプチドから実質的になり、L1−L3 が独立に疎水性アミノ酸から選択され、X1−X2が独立に任意のアミノ酸から
選択され、ペプチドが受容体に対する直接的なインビトロのリガンド依存的結合
を提供する混合物。 - 【請求項13】 結合が試薬の存在によって促進される、請求項12に記載
の混合物。 - 【請求項14】 核ホルモン受容体、受容体のリガンド、候補試薬、及び検
出可能な標識に共有結合し配列L1X1X2L2L3を含むペプチドから実質的
になり、L1−L3が独立に疎水性アミノ酸から選択され、X1−X2が独立に
任意のアミノ酸から選択され、ペプチドが核ホルモン受容体に対する直接的なイ
ンビトロのリガンド依存的結合を提供する混合物。 - 【請求項15】 検出可能な標識に共有結合し配列L1X1X2L2L3を
含むペプチドから実質的になり、L1−L3が独立に疎水性アミノ酸から選択さ
れ、X1−X2が独立に任意のアミノ酸から選択され、ペプチドが核ホルモン受
容体に対する直接的なインビトロのリガンド依存的結合を提供するセンサー。 - 【請求項16】 標識が、ペプチドのN-末端に結合した蛍光標識であり、 ペプチドが12残基以下の長さである、請求項15に記載のセンサー。
- 【請求項17】 測定段階が、固定化された第1の受容体−センサー複合体
のセンサーを検出することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項18】 測定段階が、固定化された第1の受容体−センサー複合体
の受容体を検出することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 測定段階で、第1の受容体がセンサーを介して固定化され
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項20】 センサーが標識を含み、測定段階で、第1の受容体がセン
サーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して固定化される、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項21】 センサーが標識を含み、測定段階で、第1の受容体がセン
サーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して第2の受容体により固
定化される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項22】 センサーが標識を含み、測定段階で、第1の受容体がセン
サーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して第2の受容体により固
定化され、そして測定段階が固定化された第1の受容体を検出することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項23】 センサーが標識を含み、測定段階で、第1の受容体がセン
サーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して第2の受容体により固
定化され、そして測定段階が固定化された第1の受容体を第3の受容体で検出す
ることを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項24】 センサーがエピトープ標識を含み、測定段階で、第1の受
容体がセンサーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して、固定化さ
れたエピトープ標識特異的部分を含む第2の受容体により固定化される、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項25】 センサーがビオチン標識を含み、測定段階で、第1の受容
体がセンサーを介して固定化され、そしてセンサーが標識を介して、固定化され
たアビジン部分を含む第2の受容体により固定化される、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項26】 測定段階で、センサーが第1の受容体を介して固定化され
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項27】 測定段階で、センサーが第1の受容体を介して固定化され
、そして第1の受容体が第2の受容体を介して固定化される、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項28】 測定段階で、センサーが第1の受容体を介して固定化され
、そして第1の受容体が第2の受容体を介して固定化され、そして測定段階が固
定化されたセンサーを検出することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項29】 測定段階で、センサーが第1の受容体を介して固定化され
、そして第1の受容体が第2の受容体を介して固定化され、そして測定段階が固
定化されたセンサーを第3の受容体で検出することを含む、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項30】 測定段階で、センサーが第1の受容体を介して固定化され
、そして第1の受容体が受容体特異的抗体を含む第2の受容体を介して固定化さ
れる、請求項1に記載の方法。
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