-
Verwendung von Steroidtrienonen und -trienonderivaten
-
als Tracer zur Bestimmung von Steroiden mit Hilfe der Fluoreszenzphotometrie
Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Steroidtrienonen und -trienonderivaten als
Tracer zur Bestimmung von Steroiden mit Hilfe der Fluoreszenzphotometrie.
-
Im Steroidmolekül können weitere Doppelbindungen und/oder solche Substituenten,
wie sie in biologisch wirksamen Steroiden und ihren Metaboliten vorkommen und die
Fluoreszenzeigenschaften nicht beeinflussen, enthalten sein.
-
Es besteht ein Bedarf an Methoden, geringe Mengen einer Substanz zum
Beispiel in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe spezifisch zu bestimmen. Zahlreichen,
in der Literatur beschriebenen Verfahren liegt die Spezifität von Bindungsproteinen
zu den entsprechenden Liganden zugrunde. Als Bindungsproteine können zum Beispiel
natürlich vorkommende Proteine wie SHBG (Sexhormonbindingglobulin) oder Transcortin,
geeignete Rezeptorpräparationen ebenso wie künstlich stimulierte Antikörper verwendet
werden. Dabei nutzt man die Konkurrenz (Kompetition) der zu bestimmenden Verbindung
(Analyt) zu einer Bezugssubstanz (Tracer) bei der Bindung an das Bindungsprotein
aus (kompetitiver Proteinbindungstest). Die Menge des gebundenen Tracer ist ein
Maß für die Menge des zu bestimmenden Analyten. Voraussetzung für dieses Verfahren
ist, daß man freien von Protein-gebundenem Tracer unterscheiden kann.
-
Man unterscheidet inhomogene und homogene Meßverfahren, je nachdem,
ob vor der Bestimmung des Protein-gebundenen Anteils eine Trennung von gebundenem
und freiem Tracer erforderlich ist oder nicht. Das bekannteste inhomogene Verfahren
ist der Radioimmunoassay (RIA). Hierbei ist der Tracer eine radioaktiv markierte
Form des Analyten. Der Vorteil'des RIA ist seine hohe Empfindlichkeit. Die wesentlichen
Nachteile sind neben der erforderlichen Trennung von freiem und Proteingebundenem
Tracer vor der Messung die sicherheitstechnischen Voraussetzungen und die Notwendigkeit
der wiederholten Tracersynthese, da eine hohe Empfindlichkeit nur mit kurzlebigen
Isotopen (wie zum Beispiel 25J, T1/2 = 60 Tage) zu erreichen ist.
-
Ein weiteres wichtiges inhomogenes Verfahren ist der enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA). Hierbei wird als Tracer ein Ligand-Enzym-Konjugat eingesetzt.
Dieses konkurriert in der Probe mit dem Analyten um die Bindung an den Antikörper.
Nach einer Trennung von gebundenem und freiem Konjugat wird die Aktivität des Enzyms
gemessen. Der Vorteil dieser Methode ist darin zu sehen, daß sie ohne radioaktiv
markierte Verbindungen durchgeführt werden kann. Es ist jedoch nur bedingt möglich,
definierte Enzym-Ligand-Komplexe zu synthetisieren, die bei guter Bindung am Protein
und hoher und spezifischer Kompetition mit dem Analyten noch eine für die gewünschte
Empfindlichkeit des Testes ausreichend große enzymatische Aktivität zeigen.
-
Beispielhaft für die homogenen Verfahren seien der homogeneous enzyme
immunoassay (EMIT(R)) und der Fluoreszenzimmunoassay (FIA).
-
Für die Durchführung eines EMIT(R) ist die Synthese eines Ligand-Enzym-Konjugates
erforderlich, bei dem die Aktivität des Enzyms durch Bindung an das Protein beeinflußt
wird.
-
Der Umfang der Anderung der enzymatischen Aktivität ist ein Maß für
die Menge des Analyten in der Probe. Im Vergleich zum ELISA ist es bei diesem Verfahren
noch schwieriger, ein geeignetes Ligand-Enzym-Konjugat herzustellen.
-
Ein Konjugat zwischen dem Liganden und einem fluoreszierenden Molekül
dient als Tracer beim Fluoreszenzimmunoassay. Für den homogenen Fluoreszenzimmunotest
ist es erforderlich, daß durch Bindung dieses Konjugates an das Protein die Fluoreszenz
beeinflußt wird. Im allgemeinen tritt dabei eine Verstärkung der Fluoreszenz auf.
Die Fluoreszenzänderung ist damit ein Maß für die Konzentration des Analyten. Diese
Fluoreszenzänderung und damit auch die Empfindlichkeit des Testes sind jedoch nur
gering. Weiterhin ist auch die Genauigkeit dieses Testes speziell bei der Bestimmung
kleiner Substanzmengen unbefriedigend, da die Meßgröße, wie zum Beispiel auch beim
RIA, umgekehrt proportional zu der Konzentration
des Analyten ist.
Sehr kleine Mengen an zu bestimmender Substanz stellen sich im Test als relativ
große Meßwerte dar und an sich signifikante Unterschiede in der Konzentration des
Analyten bedeuten häufig nur unsicher zu ermittelnde Unterschiede in der Meßgröße.
-
Es wurde nun gefunden, daß Steroide mit einer Trienonstruktur der
allgemeinen Formel I als Tracer für einen neuartigen homogenen Fluoreszenzimmunotest
geeignet sind, der die Nachteile des üblichen Fluoreszenzimmunotests nicht hat.
Steroide mit dieser Trienonstruktur zeigen eine gute Bindung und eine hohe Kompetition
an Antikörpern, die in üblicher Weise für analoge Steroide, zum Beispiel mit 4-En-3-on-,
1,4-Dien-3-on- oder 3-On-Struktur, erhalten werden können. Das Prinzip der Antikörperbildung
ist zum Beispiel beschrieben von Klaus Lübke und Bob Nieuweboer in "Immunologische
Teste für niedermolekulare Wirkstoffe", Seiten 5 - 10, Georg Thieme Verlag Stuttgart
1978.
-
Als analoge Steroide kommen insbesondere solche infrage, für die ein
Interesse besteht, sie analytisch zu bestimmen, zum Beispiel die natürlich vorkommenden
Hormone, wie Testosteron, Progesteron und Cortisol oder Biosynthesezwischenprodukte,
wie zum Beispiel 17a-Hydroxyprogesteron, oder biologisch aktive Metabolite, wie
zum Beispiel 5a-Dihydrotestosteron, oder auch synthetische Analoga, wie zum Beispiel
Prednisolon.
-
Ihre Eignung als Tracer haben die Trienon-Steroide der allgemeinen
Formel I aufgrund ihrer unerwarteten Fluoreszenzeigenschaften. Diese Verbindungen
besitzen Anregungs-und Emissionsmaxima im Bereich von 360 nm bzw. 475 nm (Abb. 1)
und zeigen bei einer Proteinbindung einen Verlust ihrer Fluoreszenz. Damit wird
die Meßgröße jedoch direkt proportional der zu bestimmenden Menge an Analyt und
die Ungenauigkeiten, wie sie bei dem Vergleich von zwei nur wenig verschiedenen
relativ großen Meßwerten auftreten, sind nicht zu erwarten.
-
Dank der hohen Fluoreszenzausbeute (0,2 bis 0,3) und des hohen molaren
Extinktionskoeffizienten (zum Beispiel 26 500 l-Mol 1-cm 1 für 6,8-Bisdehydrotestosteron)
lassen sich Fluoreszenzimmunoteste mit einer Empfindlichkeit im pico- bis nanoMol-Bereich
etablieren.
-
Die erfindungsgemäßen Tracer können, wie bei jedem Immunotest, auch
zur Bestimmung von Antikörpern und darüber hinaus zur Bestimmung von weiteren Bindungsproteinen,
zum Beispiel SHBG (Sexhormon binding globulin) oder CBG (Cortisol binding globulin,
Transcortin) eingesetzt werden.
-
Beispiel 1 Allgemeine Vorschrift: Aus Plasma oder Serum (die einzusetzende
Menge ist abhängig von der zu erwartenden Konzentration) wird das zu bestimmende
Steroid in üblicher Weise1 zum Beispiel mit Diäthylether oder mit einer Mischung
aus Chloroform und Methanol, extrahiert. Die Extrakte werden eingeengt, in 0,1 ml
eines Puffers (zum Beispiel Phosphatpuffer pH 7,4, 0,1 M) aufgenommen und mit 0,1
ml einer Tracerlösung und 0,1 ml eines entsprechend dem Titer verdünnten Antiserums
versetzt.
-
Nach Inkubation (die Inkubationszeit ist jeweils abhängig von den
Eigenschaften des Antiserums) wird die Fluoreszenz in üblicher Weise bestimmt und
mit einer Eichkurve verglichen. Für die Eichkurve (s. Abb. 2 - 6) werden mehrere
Konzentrationen des zu bestimmenden Steroids in jeweils 0,1 ml Puffer gelöst und,
wie oben beschrieben, mit Tracer und Antiserum versetzt und nach Inkubation gemessen.
-
Beispiel 2 Eichkurve für Testosteron (Abb. 2) Antiserum: in üblicher
Weise mit Testosteron-3-carboxymethyloxim-Rinderserumalbumin-Konjugat erhalten /vgl.
Steroids 21 735 (1973) oder Steroids 29 699 (1974)7 Tracer: 1 7ß-Hydroxy-4,6,8(14)-androstatrien-3-on
4 . 10-6 molar Testosteron: 0,2 bis 5 nMol pro Probe
Beispiel 3
Eichkurve für 5-Dihydrotestosteron (Abb. 3) Antiserum und Tracer wie bei Beispiel
2 5α-Dihydrotestosteron: 2 bis 15 pMol pro Probe Beispiel 4 Eichkurve für
Cortisol (Abb. 4) Antiserum: in üblicher Weise mit Cortisol-21-hemisuccinyl-Rinderserumalbumin
erhalten /vgl. Clin. Chim. Acta 58 173 (1970) oder Steroids 24 861 (1975)7 Tracer:
11ß,17α,21-Trihydroxy-4,6,8(14)-pregnatrien-3,20-dion 5 10 7 molar Cortisol:
3 bis 100 pMol pro Probe Beispiel 5 Eichkurve für 17-Hydroxyprogesteron (Abb. 5)
Antiserum: in üblicher Weise mit 11-Desoxycortisol-21-hemisuccinyl-Rinderserumalbumin
erhalten /vgl. Horm. Res. 6 261 (1960)7 Tracer: 17«-Hydroxy-4,6,8(14)-Pregnatrien-3,20-dion
5 zu molar 17a-Hydroxyprogesteron: 3 bis 15 pMol pro Probe Beispiel 6 Eichkurve
für Prednisolon (Abb. 6) Antiserum und Tracer wie bei Beispiel 4 Prednisolon: 3
bis 100 pMol pro Probe.