WO2000007021A1 - Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a physiologically active component in a biological sample by using an antibody, a binding protein, or an assay using a receptor.
  • IGF-I insulin-like growth factor 1
  • the most commonly used method is the “acid ethanol method” (WH Daughaday Journal of Clinical Endocrinology and Metabol ism, 1980, Vol. 51 p781-788).
  • the bound protein that dissociates IGF-I under acidic conditions becomes insoluble in an ethanol atmosphere, and can be easily removed from the sample by centrifugation. It is a thing using.
  • ANS has been used for a long time to dissociate thyroid hormone from binding proteins, but it has other operational problems such as being unstable to light and air oxidation and highly toxic. In addition, it was pointed out that it may affect the immune response, and there are many restrictions on its use for measuring biological samples.
  • bi evening introduced Chio Ichiru group binding protein in the analysis of the Min B 1 2, loss of binding activity against the bi evening Min B 1 2
  • a method for denaturing the binding protein using peroxy acid Japanese Patent Registration No. 239,027
  • a method for denaturing the binding protein using peroxyacid are known.
  • an excessive denaturing agent is added, it is necessary to denature the binding protein and then deactivate the surplus denaturing agent.
  • IGF-I As a method for measuring IGF-I, a method of adding an excess of IGF-II to a sample is known. Because IGF II is to block all binding sites of the binding protein, a method for measuring the IGF _ I liberated dressed expelled by Imunoadzusi (WF B lum, Acta Endocrinokogica, 1988, Vol.118 p374-380) o This The method requires that the antibody used in the assay does not cross-react with IGF-II. However, since the structures of IGF-I and IGF-11 are very similar, they are completely compatible with the excess amount of IGF-11 added in the pretreatment. It is difficult to obtain unaffected antibodies. Although a similar method has been reported for the measurement of steroid hormones (Japanese Patent Application Laid-Open No. 06-120275), there are disadvantages in that the available measurement systems are limited and the cost is high. there were.
  • a specific pretreatment agent is used within a range that does not affect the activity of the measurement object. It was found that when added to the sample, only the bound protein was inactivated, and this mixture could be used directly for measurement.
  • the bound protein separates from the object to be measured, and at the same time, causes irreversible denaturation.
  • the pretreated sample does not need to neutralize the functional group of the denaturing agent or add any special substance that prevents the binding of the target protein to the bound protein. Neutralization or dilution may be carried out. Or it can be used for measurement as it is.
  • FIG. 1 shows a calibration curve of the bound radioactivity of the standard IGF-I obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows a calibration curve of bound radioactivity of the standard IGF-I obtained in Example 3.
  • the binding protein is not particularly limited as long as it is a protein that can bind to a physiologically active component to be measured.
  • binding proteins include insulin-like growth factor binding protein, growth hormone binding protein, insulin antibody, thyroid hormone binding protein, and the like.
  • growth factors in biological samples represented by body fluids such as serum, plasma, and urine, particularly insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor 2, hormones, bimin or drugs, or amino acids
  • body fluids such as serum, plasma, and urine
  • insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor 2 hormones, bimin or drugs, or amino acids
  • a surfactant and / or a surfactant is used as a pretreatment agent.
  • the pretreatment agent is usually used as an aqueous medium, and when two or more components are used, they may be used as separate liquids or as a mixture, but the latter is preferred in practice. Good.
  • anionic surfactants cationic surfactants, nonionic (nonionic) surfactants, and amphoteric surfactants are used.
  • an anionic surfactant is used.
  • anionic surfactants include alkyl benzene sulfonate and sodium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS).
  • cationic surfactants include dodecyl trimethylammonium chloride, didodecyl dimethyla
  • Nonionic surfactants such as ammonium chloride, alkylpolyoxyethylene ether, alkylpolyoxyethylene phenol, and polyoxyethylene sorbitan alkyl ester (Tween); amphoteric surfactants such as alkyltrimethylammonium Pum salt is used.
  • an anionic surfactant is preferably used, and particularly preferably, SDS is used.
  • concentration of the surfactant in the pretreatment agent for example, 0.01 to 5% by weight, preferably 0.05 to 1% by weight is used. Therefore, it is preferable to determine the optimum concentration.
  • examples of the alkaline agent include sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, and the like, with sodium hydroxide being particularly preferred.
  • concentration of the alkaline agent in the pretreatment agent is usually 0.001-1% by weight.
  • various other compounding agents can be used as the pretreatment agent.
  • a lower aliphatic alcohol can be used in combination.
  • the alcohol typically includes methanol, ethanol, isopropanol, butanol, etc., with ethanol being the most suitable.
  • the use amount of alcohol is preferably 25 to 35% by weight based on the total amount of the pretreatment agent.
  • the temperature is usually about room temperature (for example, from 10 ° C to 40 ° C). (° C), a sufficient effect can be obtained.
  • the amount of the surfactant to be supplied to the biological sample is usually 0.01 to 5% by weight, preferably 0.05 to 1% by weight, based on the biological sample.
  • the amount of the alkali agent is usually 0.001 to 1% by weight, preferably 0.01 to 0.5% by weight, based on the biological sample.
  • Such an alkali agent is used in an appropriately adjusted amount, such as when used in combination with a surfactant, in a small amount, and when used alone, in a large amount.
  • the adverse effect of the binding protein in the biological sample is eliminated by the above pretreatment, but the physiologically active component is measured using the mixed solution continuously using a known measuring method.
  • the measuring method is not particularly limited as long as the physiologically active substance to be measured can be measured. Examples of the measuring method include a competitive method and a sandwich method.
  • the mixed solution is directly used for measurement without performing any special operation such as solid-liquid separation and extraction.
  • Antibodies, binding proteins or receptors can be used as competitive assays or sandwich methods.
  • the label include an immunoassay using a radioactive substance, an enzyme, a fluorescent reagent or a chemiluminescent substrate; and an agglutination method using a latex, a magnetic latex or a fluorescent-labeled latex.
  • the present invention also includes a measurement kit.
  • reagents constituting such a kit include at least the following components. As an example, if the measurement target is insulin-like growth factor (IGF) measurement kit,
  • a pretreatment solution was prepared so as to be 0.1M HC1, 90% ethanol.
  • the anti-IGF-I monoclonal antibody was physically adsorbed to polystyrene beads under agitation conditions and used for measurement.
  • iodine- 125 was introduced by a chloramine T method as a label into a monoclonal antibody capable of forming a sandwich with IGF-I.
  • This tracer was diluted with a phosphate buffer containing the following serum albumin and used for measurement.
  • Human IGF-I obtained from Toyobo Co., Ltd. was diluted to a concentration of 0.3 to 10 Ong / ml with a phosphate buffer containing the same serum serum albumin and the like as described above.
  • Standard IGF-I and 2 samples each of the pretreated sample were weighed into a test tube, and 3001 of the tracer solution was added thereto. After mixing, add one antibody bead to each test tube, stir at room temperature for 2 hours, wash twice with 3 ml each of purified water, and measure the radioactivity bound to the antibody bead at night. did. A calibration curve was prepared from the binding radioactivity at seven concentrations of standard IGF-I (Table 1 and Figure 1).
  • the bound radioactivity (B) of the standard solution other than NSB was indicated by a value obtained by subtracting the bound radioactivity of NSB (236 cpm).
  • the IGF-I concentration in the pretreated sample was determined from the standard curve and the amount of bound radioactivity of the pretreated sample, and the IGF-I concentration in the sample before treatment was determined by multiplying by 21. Table 2 shows the results.
  • Example 3 The IGF-I concentration in the same sample as in Example 1 was compared with the case of using a mixture of 0.1 M HC1 + 90% ethanol as a pretreatment solution and 2 0.18% SDS + lmM NaOH + 30% ethanol. was measured and compared in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 3.
  • a pretreatment solution was prepared by adding 9 volumes of ethanol to 1 volume of 1N hydrochloric acid.
  • Standard IGF-I and 25/1 each of the pretreated sample were weighed into a test tube, and 3001 of the tracer solution was added thereto. After mixing, add antibody beads to each test tube. After mixing and stirring at room temperature for 2 hours, each well was washed twice with 3 ml of purified water, and the radioactivity bound to the antibody beads was measured at night. A calibration curve was prepared from the binding radioactivity at seven concentrations of standard IGF-I (Table 4 and FIG. 2).
  • the bound radioactivity (B) of the standard solution other than NSB was indicated by a value obtained by subtracting the bound radioactivity of NSB (270 cpm).
  • the IGF-I concentration in the pretreated sample was determined from the standard curve and the bound radioactivity of the pretreated sample, and the IGF-I concentration in the sample before the treatment was determined by multiplying by 21. Table 5 shows the results.
  • Example 4 Measurement of insulin-like growth factor 1 (IGF-I) using alkaline agent and ethanol
  • Example 3 the IGF-I concentration in the sample was determined using the pretreatment solution of (5) OmM Na ⁇ H solution alone, (3) 5 mM NaOH + 30% ethanol mixture, and (1) 0.1 M as control. Measurement and comparison were made in the same manner as in Example 3 with the case of using a mixture of HC 1 + 90% ethanol. Table 6 shows the results.
  • a surfactant having a concentration that deactivates only a binding protein coexisting in a sample without impairing the activity of a measurement target is used for pretreatment, an expensive reagent or a highly toxic reagent is used. It is possible to accurately measure the concentration of a measurement target in a biological sample without using complicated operations or special equipment.

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Description

明 細 生理活性成分の測定法 技術分野
本発明は、 抗体、 結合タンパク質又はレセプ夕一を用いたアツセィにより、 生 体試料中の生理活性成分を測定する方法に関する。 背景技術
成長因子、 ホルモン、 ビタミン、 薬物などの生理活性成分の多くは、 生体内に おいて結合性のタンパク質と結合し、 その作用や代謝速度が調節されている。 抗 体、 結合タンパク質、 又はレセプ夕一を用いたアツセィにより生理活性成分を測 定する場合、 しばしばこの共存するタンパク質が測定値に影響を及ぼす。
従来、 測定しょうとする物質に対する結合タンパク質が生体試料中に共存する 場合、 該結合タンパク質の測定への影響を排除するために様々な前処理が行われ てきた。 インスリン様成長因子 1 ( I G F— I ) を例に取ると、 現在最もよく行 われている方法として 「酸エタノール法」 が挙げられる （W.H. Daughaday Journ al of Cl inical Endocrinology and Metabol ism, 1980， Vol .51 p781-788) 。 こ の方法は、 生体試料を塩酸一エタノール混液で処理すると、 酸性条件で I G F— Iを乖離した結合タンパク質はエタノール雰囲気下で不溶性となるため、 遠心操 作によって容易に試料中から除くことができることを利用したものである。
しかしながら、 酸エタノール法において、 遠心操作を省略すると、 中和した時 点で I G F— Iに対する結合タンパク質の結合活性が回復し、 測定値に影響を及 ぼす。 この欠点を補うため、 酸処理した後の中和用緩衝液に、 再結合阻害剤を添 加する方法が報告されている （特開平 8— 1 4 5 9 9 8 ) 。 この方法では、 中和 後の生体試料溶液中には、 I G F— Iが全て遊離状態で存在すると考えられるの で、 結合タンパク質の共存は測定値に影響を与えない。 再結合阻害剤としては、 8—ァニリノ一 1一ナフ夕レンスルホン酸塩 （A N S ) などが用いられている。
A N Sは、 甲状腺ホルモンを結合タンパク質から乖離させる目的で古くから使 用されているものであるが、 光や空気酸化に対して不安定であり、 かつ毒性が強 い等の操作上の問題の他に、 免疫反応に影響を及ぼす場合があることが指摘され、 生体試料の測定に用いるには制約が多い。
また試料中に含まれている結合タンパク質の影響を除去する方法として、 ビ夕 ミン B 1 2の分析において結合タンパク質にチォ一ル基を導入し、 ビ夕ミン B 1 2に 対する結合活性を消失させる方法 （日本国特許登録 1 9 4 0 5 9 6 ) や、 ペルォ キシ酸を用いて結合タンパク質を変性させる方法 （日本国特許登録 2 0 2 3 9 2 7 ) が知られている。 しかしこれらの方法においては、 過剰の変性剤を添加する ため、 結合タンパク質を変性させた後、 余剰の変性剤を失活させる必要があった。
I G F— Iの測定法として、 試料中に過剰の I G F— IIを添加する方法が知ら れている。 I G F— IIは結合タンパク質の結合部位を全てふさぐため、 追い出さ れる格好で遊離する I G F _ Iをィムノアヅセィで測定する方法である （W.F. B lum, Acta Endocrinokogica, 1988, Vol.118 p374-380)o この方法では測定に用 いる抗体が I G F— IIと交差反応しないことが求められるが、 I G F—Iと I G F— 11は構造が酷似しているため、 前処理で添加する過剰量の I G F— 11に全く 影響を受けない抗体を得ることは困難である。 同様な方法がステロイ ドホルモン の測定でも報告されているが （特開平 0 6— 1 0 2 2 7 5 ) 、 使用可能な測定系 が限定される上に、 コス卜が高くつくなどの欠点があった。
従来は、 上述のように生体試料中に共存する結合タンパク質の影響を除去する のに、 高価な試薬や毒性の高い試薬を、 前処理剤、 中和剤、 又は測定用緩衝液に 加えることが必要であったり、 あるいは煩維な操作や特別な機器を必要とした。 そのため、 このような既存方法の有する欠点を解決することが求められていた。 発明の開示
本発明では、 測定対象物の活性に影響を及ぼさない範囲で、 特定の前処理剤を 試料に添加すると、 結合タンパク質のみが失活し、 この混合物をそのまま測定に 供することができることを見い出した。
すなわち、 生体試料を界面活性剤及び/又はアル力リ剤に曝すことによって、 結合タンパク質が測定対象物から乖離し、 同時に不可逆的変性を起こす。 前処理 を終えた試料は、 変性剤の官能基を中和したり、 測定対象物と結合タンパク質の 再結合を阻止するような特別な物質を加える必要はなく、 pHが測定に適した条件 になるように中和もしくは希釈すればよい。 あるいはそのまま測定に供すること が可能となるのである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において得られた標準 I G F— Iの結合放射能の検量線を示 す。 図 2は、 実施例 3において得られた標準 I G F— Iの結合放射能の検量線を 示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明において結合タンパク質とは、 測定対象の生理活性成分に結合し得る夕 ンパク質であれば特に限定されない。 結合タンパク質の例としては、 インスリン 様成長因子結合タンパク質、 成長ホルモン結合タンパク質、 インスリン抗体、 甲 状腺ホルモン結合タンパク質などが挙げられる。
本発明によれば、 血清、 血漿、 尿などの体液に代表される生体試料中の成長因 子、 特にインスリン様成長因子 1及びインスリン様成長因子 2、 ホルモン、 ビ夕 ミン又は薬物、 あるいはアミノ酸、 アミノ酸代謝物、 ペプチド又はタンパク質の 測定に、 煩雑な操作や危険性の高い特別な試薬を必要とせず、 測定系の精度を損 なわないで前処理を行う測定系が提供される。
本発明では前処理剤として界面活性剤及び/又はアル力リ剤を使用するもので ある。 前処理剤は通常、 水性媒体として用いられ、 2種以上の成分を用いる場合 は、 別々の液として用いても、 混合液として用いてもよいが、 実用上、 後者が好 ましい。
界面活性剤としては、 ァニオン性界面活性剤、 カチオン性界面活性剤、 ノニォ ン性 （非イオン性） 界面活性剤、 両性界面活性剤が用いられる。 好ましくは、 ァ 二オン性界面活性剤が用いられる。
ァニオン性界面活性剤としては、 例えば、 アルキルベンゼンスルホン酸塩、 ド デシル硫酸ナトリウム （以下、 S D Sと略記） 等、 カチオン性界面活性剤として は、 例えば、 ドデシルトリメチルアンモニゥムクロリ ド、 ジドデシルジメチルァ ンモニゥムクロリ ド等、 ノニオン性界面活性剤としてはアルキルポリオキシェチ レンエーテル、 アルキルポリオキシエチレンフエノール、 ポリオキシエチレンソ ルビタンアルキルエステル （T w e e n ) 等、 両性界面活性剤としては、 アルキ ルトリメチルアンモニゥム塩等が用いられる。
本発明においては、 ァニオン性界面活性剤が好ましく用いられ、 特に好ましく は S D Sが用いられる。
前処理剤中の界面活性剤の濃度としては、 例えば、 0 . 0 1〜5重量％、 好ま しくは 0 . 0 5〜1重量％が用いられるが、 測定対象物や使用する界面活性剤に よって至適濃度を決定するのが好ましい。
一方、 アルカリ剤としては、 例えば、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 ァ ンモニァなどが挙げられ、 特に水酸化ナトリウムが好ましい。 前処理剤中のアル カリ剤の濃度は、 通常、 0 . 0 0 1〜 1重量％である。
また、 前処理剤として、 他の種々の配合剤 （変性剤、 乖離剤等） を用いても差 し支えない。 一例として、 低級脂肪族アルコールを併用することができる。 この アルコールとしては、 通常、 メタノール、 エタノール、 イソプロパノール、 ブ夕 ノールなどが挙げられるが、 エタノールが最適である。 アルコールの使用量とし ては、 前処理剤全量に対して 2 5〜3 5重量％が望ましい。
上述のように前処理剤と生体試料とを混合処理することにより、 生体試料中の 結合タンパク質の影響が抑制されるが、 この前処理においては、 通常室温程度 (例えば 1 0 °Cから 4 0 °C) で撹拌処理することで十分な効果が得られる。 この混合処理において、 生体試料中に供給される界面活性剤の量としては、 通 常、 生体試料に対して 0. 01〜5重量％、 好ましくは 0. 05〜1重量％でぁ る。 また、 アルカリ剤の量は、 通常、 生体試料に対して 0. 001〜1重量％、 好ましくは 0. 01〜0. 5重量％である。 かかるアルカリ剤は、 界面活性剤と 併用する場合は少ない使用量で、 単独で用いる場合は多めの使用量とする等、 そ の量を適宜調整して使用される。
本発明では上記の前処理により生体試料中の結合タンパク質の悪影響がなくな るが、 この混合液を引き続き公知の測定法を利用し、 生理活性成分を測定する。 測定法は、 測定対象の生理活性物質を測定できる限り特に限定されない。 測定法 の例としては競合法やサンドイッチ法などが挙げられる。 その際、 本発明では前 記混合液を固液分離ゃ抽出などの特段の操作をすることなく、 そのまま測定に供 する。
競合的測定法又はサンドイッチ法としては、 抗体、 結合タンパク質又はレセプ 夕一を用いることができる。 この際標識として放射性物質、 酵素、 蛍光試薬又は 化学発光基質を用いた免疫測定法；あるいはラテックス、 磁性ラテックスもしく は蛍光標識ラテックスを用いた凝集反応による測定法等を例示することができる。 本発明はまた、 測定用キットを含む。 そのようなキットを構成する試薬例とし ては、 少なくとも以下の成分を挙げることができる。 一例として、 測定対象物が インスリン様成長因子 （IGF)測定用キットは、
例えば、 サンドイツチ法の場合、
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b)標識抗 I GF抗体
(c) 固相化抗 I GF抗体
競合法の場合、
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b)標識 I GF
(c) 抗 I GF抗体 ラテックス凝集法を用いた競合法の場合、
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b) I GF固定ラテックス
(c) 抗 I GF抗体
蛍光標識ラテックスを用いたサンドィツチ法の場合、
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b) 抗 I GF抗体固定蛍光 （ユーロピウム） 標識ラテックス
(c)抗 I GF抗体固定磁性ラテックス
を少なくとも含有するキッ 卜が挙げられる。
以下、 実施例により本発明を説明するが、 本発明はこれにより限定されるもの ではない。
実施例 1 (界面活性剤を用いたインスリン様成長因子 1 (IGF— I) の測定） a) 前処理液の調製
®0. 15%SDSを調製した。
②対照のための酸エタノール液として、 0. 1M HC1、 90%エタノール になるよう前処理液を調製した。
b)抗体ビーズの調製
抗 I GF— Iモノクローナル抗体を、 アル力リ条件下でポリスチレンビーズに 物理的に吸着させ、 測定に供した。
c) トレーサーの調製
上記 b) の抗体とともに、 IGF—Iに対してサンドイッチを形成しうるモノ クローナル抗体に、 標識としてクロラミン T法でヨウ素125を導入した。 このト レーサーを下記ゥシ血清アルブミンなどを含むリン酸緩衝液で希釈し、 測定に供 した。
0. 1Mリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 4)
0. 15M塩化ナトリウム
1 OmMェデト酸ニナトリゥム 0. 1%ゥシ血清アルブミン
0. 1%ツイ一ン 20 (界面活性剤）
0. 02%アジ化ナトリゥム
d)標準 I GF— Iの調製
(株） 東洋紡より入手したヒト I GF— Iを、 上記と同様のゥシ血清アルブミ ンなどを含むリン酸緩衝液で 0. 3〜10 Ong/mlになるように希釈した。
e) ヒト血清試料の入手
健常人より採血し、 血清分離後速やかに凍結して、 使用時まで保管した。
f ) 試料の前処理
試料のヒト血清 25〃1を試験管にはかり取り、 これに上記①又は②の前処理 液 500 /1を加えた。 上記①の前処理液は、 試料撹拌後直ちに測定に供した。 ②の酸エタノール抽出液は、 試料撹拌後、 遠心操作を加え、 上清を測定に供した ( g) 免疫測定
標準 I G F— I及び前処理済み試料各 2 ずつを試験管にはかり取り、 こ れにトレーサー溶液 300 1を添加した。 混和後、 各試験管に抗体ビーズを 1 個入れて室温で 2時間撹拌した後、 精製水各 3 mlで 2回ずつ洗浄し、 抗体ビーズ に結合した放射能をァ力ゥン夕一で測定した。標準 I G F— Iの 7濃度の結合放 射能量から検量線を作製した （表 1及び図 1) 。
表 1
Figure imgf000010_0001
総放射能 （T) ： 182539 cpm
NSB以外の標準液の結合放射能量 （B) は、 N SBの結合放射能量 （236 c pm) を引いた値で表示した。
標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量から、 前処理済み試料中の I GF— I濃度を求め、 2 1倍することで処理前の試料中 I GF— I濃度を求めた。 結果 を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000011_0001
実施例 2 (界面活性剤とアルカリ剤を併用したインスリン様成長因子 1 (IGF 」 I ) の測定）
実施例 1と同様の試料中の IGF— I濃度を、 前処理液として① 0. 1M HC 1 + 90%エタノール混液と、 ② 0. 18%SDS+lmM NaOH + 30% エタノールを使用した場合とを実施例 1と同様に測定し比較した。 その結果を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000012_0001
① 0. 1M HC 1+ 90%エタノールに対し、 ② ImM NaOH + 0. 1 8%SDS + 30 %エタノールでは、 操作性をあげることが可能であった。 実施例 3 (アルカリ剤を用いたインスリン様成長因子 1 (IGF— I) の測 定）
a) 前処理液の調製
① 5 OmM水酸化ナトリウム水溶液を調製した。
②対照のための酸ェ夕ノ一ル液として、 1規定塩酸 1容にエタノール 9容を 加えた前処理液を調製した。
以下、 （b)抗体ビーズの調整、 （c) トレ一ザの調整、 （d)標準 IGF - Iの調整、 （ e ) ヒト血清試料の入手及び （ f )試料の前処理は、 実施例 1 と同様に行った。
g) 免疫測定
標準 I GF— I及び前処理済み試料各 25 /1ずつを試験管にはかり取り、 こ れにトレーサー溶液 300 1を添加した。 混和後、 各試験管に抗体ビーズを 1 個入れて室温で 2時間撹拌した後、 精製水各 3 mlで 2回ずつ洗浄し、 抗体ビーズ に結合した放射能をァカウン夕一で測定した。 標準 I GF— Iの 7濃度の結合放 射能量から検量線を作製した （表 4及び図 2) 。
表 4
Figure imgf000013_0001
総放射能 （T) ： 193207 c pm
NSB以外の標準液の結合放射能量 （ B ) は、 N S Bの結合放射能量 （ 27 0 c pm) を引いた値で表示した。
標準曲線と前処理済み試料の結合放射能量から、 前処理済み試料中の I GF 一 I濃度を求め、 21倍することで処理前の試料中 I GF— I濃度を求めた。 結果を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000014_0001
実施例 4 (アルカリ剤とエタノールを用いたインスリン様成長因子 1 (IGF— I ) の測定）
実施例 3と同様に試料中の I GF— I濃度を、 前処理液として② 5 OmM Na 〇H液単用と、 ③ 5mM NaOH+ 30%エタノール混液を使用した場合と、 ① 対照として 0. 1M HC 1 + 90%エタノール混液を使用した場合とを実施例 3 と同様に測定し比較した。 その結果を表 6に示す。
表 6
Figure imgf000015_0001
N a O H濃度を単独使用の 5 O mMよりも、 併用の 5 mMに落とすことによって、 前処理後の試料の保存安定性が向上し、 また試験者が濃いアル力リ液に暴露さ れる危険性を低減させることができた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 測定対象物の活性を損なうことなく、 試料中に共存する結合 タンパク質のみが失活する濃度の界面活性剤を前処理に用いているので、 高価な 試薬や毒性の高い試薬、 または煩雑な操作や特別な機器を用いずに、 生体試料中 の測定対象物濃度を正確に測定することが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
I . 生体試料に界面活性剤及びアル力リ剤から選ばれた少なくとも 1種の前処 理剤を混合し、 生体試料中の結合タンパク質の影響を抑制した後、 測定に供する ことを特徴とする、 生理活性成分の測定法。
2. 界面活性剤がァニオン性界面活性剤である請求の範囲第 1項記載の測定法 c 3. 界面活性剤が、 ドデシル硫酸ナトリウム （SDS) である請求の範囲第 1 項記載の測定法。
4. アル力リ剤が、 水酸化ナトリウム、 水酸化力リウム、 又はアンモニア水溶 液である請求の範囲第 1項記載の測定法。
5. 界面活性剤の使用量が 0. 01〜5重量％である請求の範囲第 1項記載の 測定法。
6. アルカリ剤の使用量が 0. 001〜1重量％である請求の範囲第 1項記載 の測定法。
7. 前処理剤として、 界面活性剤及びアルカリ剤を併用する請求の範囲第 1項 記載の測定法。
8. 前記前処理剤とともに低級脂肪族アルコールを共存させる請求の範囲第 1 項の測定法。
9. 低級脂肪族アルコールがエタノールである請求の範囲第 8項の測定法。 10. 低級脂肪族アルコールの使用量が 25〜35重量％ある請求の範囲第 8項 の測定法。
I I. 生体試料が体液である請求の範囲第 1項記載の測定法。
12. 測定される生理活性成分が、 成長因子、 ホルモン、 ビタミン又は薬物であ る請求の範囲第 1項記載の測定法。
13. 測定される生理活性成分の成長因子が、 ィンスリン様成長因子 1又はィン スリン様成長因子 2である請求の範囲第 12項記載の測定法。
14. 測定される生理活性成分が、 アミノ酸、 アミノ酸代謝物、 ペプチド又は夕 ンパク質である請求の範囲第 1項記載の測定法。
15. 前記前処理剤を混合した生体試料混合物をそのまま測定に供する請求の範 囲第 1項記載の測定法。
16. 測定法が、 抗体、 結合タンパク質又はレセプ夕一を用いた測定法であり、 標識として放射性物質、 酵素、 蛍光物質もしくは化学発光基質を用いた測定法； 又はラテックス、 磁性ラテックスもしくは蛍光標識ラテックスを用いた測定法で ある請求の範囲第 1項記載の測定法。
17. 測定法が、 競合法又はサンドイッチ法である請求の範囲第 16項記載の測 定法。
18. 少なくとも次の試薬 （a)、 (b) 及び （c) を含み、 生体試料中のイン スリン様成長因子をサンドィツチ法により測定するためのキット。
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b)標識抗 IGF抗体
(c) 固相化抗 I GF抗体
19. 少なくとも次の試薬 （a)、 (b)及び （c) を含み、 生体試料中のイン スリン様成長因子を競合法により測定するためのキット。
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b)標識 I GF
(c) 抗 I GF抗体
20. 少なくとも次の試薬 （a)、 (b) 及び （c) を含み、 生体試料中のイン スリン様成長因子をラテックス凝集法を用 ヽた競合法により測定するためのキッ
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b) IGF固定ラテックス
(c)抗 IGF抗体
21. 少なくとも次の試薬 （a)、 (b) 及び （c) を含み、 生体試料中のィン スリン様成長因子を蛍光標識ラテックスを用いたサンドィツチ法により測定する 16 ためのキッ ト。
(a) 界面活性剤を含む前処理液
(b) 抗 I GF抗体固定蛍光標識ラテックス
(c) 抗 I GF抗体固定磁性ラテックス
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4197180B2 (ja) * 2005-06-29 2008-12-17 株式会社シバヤギ 検体中の内分泌物質測定方法
CN104020288B (zh) * 2014-06-18 2016-03-30 上海科华生物工程股份有限公司 一种人胰岛素单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的人胰岛素检测试剂盒
CN106442964A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 上海科华生物工程股份有限公司 用于蛋白质固相化的包被液制备方法
US11768209B2 (en) 2016-09-06 2023-09-26 Fujirebio Inc. Method and reagent for measuring thyroglobulin
JP6999561B2 (ja) 2016-09-13 2022-02-10 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンの測定方法及び測定試薬

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5393097A (en) * 1977-01-21 1978-08-15 American Monitor Corp Method and reagent for determination of creatinine
JPH04233460A (ja) * 1990-08-15 1992-08-21 Abbott Lab タンパク質沈澱試薬
JPH05252987A (ja) * 1990-12-21 1993-10-05 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体
JPH07509783A (ja) * 1992-10-30 1995-10-26 ティー　セル　ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 試料中の全分子の測定及びそれに基づく方法
JPH08145998A (ja) * 1994-11-15 1996-06-07 Daiichi Rajio Isotope Kenkyusho:Kk インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット
JPH08166382A (ja) * 1994-12-13 1996-06-25 Showa Shell Sekiyu Kk 尿中の被検出物質の検出方法およびそれに用いる検出用キット
JPH08178921A (ja) * 1994-12-21 1996-07-12 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 血清アミロイドａの免疫学的測定方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4950612A (en) 1987-12-16 1990-08-21 Microgenics Corporation Peroxy acid pretreatment in vitamin B12 assay
DE3900649A1 (de) 1989-01-11 1990-07-12 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur abloesung eines analyten von seinem bindeprotein
CA2058041A1 (en) 1990-06-27 1991-12-28 Katsuichi Sakano Anti-igf-ii monoclonal antibody
JPH06102275A (ja) 1992-09-18 1994-04-15 Tosoh Corp ステロイドホルモンの測定方法
WO1995017671A1 (en) * 1993-12-20 1995-06-29 Subburaman Mohan Method for removal of binding proteins from ligands

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5393097A (en) * 1977-01-21 1978-08-15 American Monitor Corp Method and reagent for determination of creatinine
JPH04233460A (ja) * 1990-08-15 1992-08-21 Abbott Lab タンパク質沈澱試薬
JPH05252987A (ja) * 1990-12-21 1993-10-05 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 抗ｉｇｆ−ｉｉモノクローナル抗体
JPH07509783A (ja) * 1992-10-30 1995-10-26 ティー　セル　ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 試料中の全分子の測定及びそれに基づく方法
JPH08145998A (ja) * 1994-11-15 1996-06-07 Daiichi Rajio Isotope Kenkyusho:Kk インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット
JPH08166382A (ja) * 1994-12-13 1996-06-25 Showa Shell Sekiyu Kk 尿中の被検出物質の検出方法およびそれに用いる検出用キット
JPH08178921A (ja) * 1994-12-21 1996-07-12 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 血清アミロイドａの免疫学的測定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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