CN101377508A - 层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种层粘连蛋白测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)层粘连蛋白校准品；2)亲和素包被载体；3)生物素化的层粘连蛋白的单克隆抗体和层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体酶标记物的混合物；5)化学发光底物；以及6)浓缩洗涤液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以层粘连蛋白纯品配制校准品；2)以亲和素包被载体；3)使层粘连蛋白的单克隆抗体生物素化；4)以酶标记层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；5)配制化学发光底物；6)配制浓缩洗涤液；7)分装上述校准品、生物素化的抗体、酶标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及8)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点，可为临床诊断和科研工作提供了一种非常有价值的检测手段。

Description

层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种层粘连蛋白(LN)生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析技术测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段，是肝脏受到慢性损伤时，细胞外基质可逆性沉积的创伤愈合过程，许多慢性肝脏疾病均可引起纤维化。目前肝纤维化主要的诊断方法包括影像学诊断、病理诊断和血清学诊断三种。影像学诊断在临床上应用广泛，但只能在肝纤维化晚期发生肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图象。而肝纤维化的诊断金指标-肝组织活检，由于所取标本量较少，以及肝脏病变的不均一性，会导致取样误差。鉴于影像学和病理诊断的局限性，人们经过试验和病例研究发现，透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、III型前胶原肽(PIIIP)和层粘连蛋白(LN)等血清学指标对肝纤维化的诊断有一定价值。并且肝纤维化是一个慢性的渐进性的过程，血清学检测更有利于对组织肝纤维化的动态观察。

正常肝脏间质层粘连蛋白含量较少，但在肝纤维化和肝硬化时，肌成纤维细胞增多，大量合成和分泌胶原、层粘连蛋白等间质成分形成完整的基底膜(肝窦毛细血管化)。层粘连蛋白与纤维化程度和门脉高压正相关，在纤维化后期升高尤为显著，因此可以反映肝纤维化的进展与严重程度。

近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有：放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。目前层粘连蛋白检测方法主要有放射免疫分析法，酶联免疫吸附层析和时间分辨荧光免疫分析方法等，以酶联免疫吸附层析方法最为普及。放射免疫分析法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等，时间分辨荧光免疫分析方法也需要稀有金属进行标记，而采用化学发光免疫分析方法的产品较少。

生物素-亲和素免疫放大技术可极大地提高检测方法的灵敏度，且特异性强，稳定性高，适用范围广，实验成本低。生物素-亲和素免疫放大技术有两种基本类型，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待测反应体系和标记生物素，后在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术；另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，称为标记亲和素-生物素法。根据待测反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法和间接法。在间接法中，亲和素-生物素系统可以与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入已标记示踪物的亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。

目前，生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析技术在层粘连蛋白免疫分析产品的应用方面比较少见。化学发光免疫分析法结合生物素-亲和素免疫放大技术是一种较先进而有效的方法。利用生物素-亲和素系统间接包被抗体能达到良好的效果，而且更有利于包被抗体与抗原的结合，从而在一定程度上起到信号放大的作用。另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒主要采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明同时解决了上述问题，即将生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光技术与层粘连蛋白的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测层粘连蛋白的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析测定层粘连蛋白的试剂盒及其制备方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)层粘连蛋白校准品；2)亲和素化的固相载体；3)生物素化的层粘连蛋白的单克隆抗体和酶标记的层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体的混合物；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管；所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。

进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)以层粘连蛋白纯品配制层粘连蛋白校准品；

2)固相载体包被亲和素；

3)使层粘连蛋白的单克隆抗体生物素化；

4)用酶标记层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；

5)配制化学发光底物；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述层粘连蛋白校准品、生物素化的单克隆抗体、酶标记的层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

根据本发明的方法，优选，所述固相载体包被亲和素的步骤2)包括以下步骤：

1)包被

用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；

2)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

3)封闭

用含1％ BSA，pH值为7.0～7.5，浓度为0.010M的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。

在上述方法中，优选，所述亲和素的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管；所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

在上述方法中，优选，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；

B液包括3.5mM过氧化脲、0.1％ Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

本发明“层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒”可以专一地检测出纤维化肝组织层粘连蛋白的含量，可以反映肝脏的早期损害和肝组织病变的活动进程，对预示肝纤维化的发生和肝硬化早期诊断有重要价值。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该层粘连蛋白测定试剂盒(化学发光法与免疫放大技术结合)的各项指标均达到酶联免疫分析法水平。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体与亲和素包被的载体上相连的生物素化抗体和被测样品的层粘连蛋白形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种模式还便于操作和生产。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而具有与酶免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶免疫分析的灵敏度大大提高，可为层粘连蛋白的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

附图说明

图1为实施例1所制备的层粘连蛋白测定试剂盒的校准品线性图。

图2显示了用本发明的测定试剂盒和层粘连蛋白酶联免疫测定试剂盒检测各种肝病患者样本的相关性结果。

其中，层粘连蛋白酶联免疫测定试剂盒的测定值为X轴，本发明中的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数r＝0.9497，y＝0.9449x+7.5005。

具体实施方式

实施例1 制备本发明的层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒

一、酶标抗体制备和生物素偶联抗体的制备

1.层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体用过碘酸氧化法与辣根过氧化物酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，—20℃以下保存备用。

2.生物素偶联层粘连蛋白单克隆抗体的制备

(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL；

(2)用0.1mol/L pH值为9.0的NaHCO₃将纯化的层粘连蛋白的单克隆抗体稀释为1～2mg/mL；

(3)按BNHS与抗体容积比为1：8或重量比1：7左右混合，室温搅拌下反应2～4h；

(4)装入透析对0.05mol/L pH值为7.2的PBS，4℃透析过夜，结合物加等体积甘油，小量分装，—20℃以下保存备用。

二、层粘连蛋白校准品的制备

用层粘连蛋白纯品配制，分装0、50、100、200、400、800ng/mL共6瓶。

三、生物素化抗体和酶标抗体浓度选定

采用方阵法选择生物素化抗体和酶标抗体的工作浓度分别为1:3000和1:6000，将生物素化抗体和酶标抗体用酶标多抗或单抗稀释液稀释。

Tris          12.120g

BSA           5g

Proclin300    1mL

双蒸水        1000mL

四、亲和素化的固相微孔板制备

(1)包被

无水碳酸钠        0.795g

碳酸氢钠          1.47g

双蒸水            500mL

溶解混匀后，调整pH至9.6，加入适量的亲和素混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃放置24h。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭液的配制

NaH₂PO₄·2H₂O        0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O         2.9g

BSA                   10g

Proclin300            1mL

双蒸水                定容至1000mL

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行封袋，贴签后置2～8℃保存。

五、化学发光底物A液

鲁米诺          10mM           1.7716g

4-羟基联苯      0.3mM          0.051g

4-碘苯硼酸      0.05mM         0.012g

硼酸                           11.4g

硼砂                           4.9g

双蒸水          定容           1000mL

pH              8.0～10.0

六、化学发光底物B液

过氧化脲          3.5mM         0.329g

Tween20           0.1％         1ml

Na₂HPO₄·12H₂O                   51.58g

NaH₂PO₄·2H₂O                    8.74g

双蒸水            定容          1000mL

pH                7.0～7.6

使用时A液与B液等比例混合。

七、20倍浓缩洗涤液

Na₂HPO₄·12H₂O                   58g

NaH₂PO₄·2H₂O                    2g

NaCl                            160g

Tween-20                        1mL

Proclin 300                     1mL

去离子水                        1000mL

调整pH至7.2～7.4

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成层粘连蛋白测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括标记抗体与生物素化抗体的活性、亲和素化载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对亲和素化载体的方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和封闭液进行试验，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，通过亲和素不同包被浓度试验找到最佳的浓度条件。对于生物素偶联抗体和对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对生物素偶联抗体和酶标记物使用的稀释液进行了长期的考察试验，配制出了能够使生物素偶联抗体和酶标记物长期保持活性而稳定的稀释液。再次通过多次方阵交叉试验确定了生物素化的抗体与酶标记物的最佳稀释比例分别为1:3000和1:6000。

本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了试验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对试验结果的影响进行了试验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响试验表明：在加入化学发光底物液后5～30分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。

实施例2～3 制备本发明的层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒

除以塑料珠、塑料管作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例4 制备本发明的层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒

除采用戊二醛法以碱性磷酸酶标记层粘连蛋白单克隆抗体、以AMPPD作为化学发光底物、以塑料珠作为载体、包被液为pH值为4.5的柠檬酸缓冲液、封闭液的pH值为7.5外，其余均以与实施例1相同的方法制备层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例5 本发明的试剂盒的使用方法

以实施例1制备的层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，插入板架上。

3)反应孔中分别加各浓度校准品每孔加0、50、100、200、400、800ng/ml各25μL，每次试验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加生物素化的抗体和酶标记物的混合物100μL，用微量震荡器充分振荡混匀，室温温育45分钟。

4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5)化学发光底物液A、B以比例1:1混合后，各孔加入100μL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

6)必须于加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

7)以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的层粘连蛋白的浓度。

实施例6 本发明的试剂盒与酶联免疫测定试剂盒的比较

1)两种试剂盒的性能指标评价

用层粘连蛋白酶联免疫测定试剂盒与本发明的试剂盒一同进行精密性、特异性、灵敏度和准确性等性能指标的评价，结果见表1：

表1 两种层粘连蛋白测定试剂盒的性能指标评价

表1的数据表明，本发明试剂盒在精密性、特异性和准确性等方面优于所选的层粘连蛋白酶联免疫测定试剂盒。

2)两种层粘连蛋白测定试剂盒对临床样本的检测结果

选取正常对照样本121例，确诊慢性肝炎样本49例，肝硬化样本60例，肝癌样本35例，采用上述两种层粘连蛋白测定试剂盒进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。

表2 两种层粘连蛋白测定试剂盒对临床样本的检测结果(单位：ng/ml)

 

	本发明试剂盒	酶联免疫测定试剂盒
			正常对照样本(n＝121)	82.40±24.66	87.29±25.66
慢性肝炎样本(n＝49)	195.55±30.68	193.88±34.63
			肝硬化样本(n＝60)	304.09±81.63	297.70±96.17
肝癌样本(n＝35)	283.74±80.22	299.54±114.01

表3 两种层粘连蛋白测定试剂盒检测结果的分析比较

酶联免疫测定试剂盒于正常对照样本中检出2份阳性，于慢性肝炎样本中检出1份阴性，而本发明中的试剂盒检测结果与临床结果完全相符，说明其灵敏度优于所选的酶联免疫测定试剂盒。本发明试剂盒与酶联免疫测定试剂盒的样本检测符合率为98.87％，相关系数为R＝0.9497(见图2)。

Claims (10)

1、一种层粘连蛋白化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)层粘连蛋白校准品；

2)亲和素化的固相载体；

3)生物素化的层粘连蛋白单克隆抗体和酶标记的层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体的混合物；

4)上述酶所作用的化学发光底物；以及

5)浓缩洗涤液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素化的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，

A液包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0～10.0；

B液包括3.5mM过氧化脲、0.1％Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0～7.6；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以层粘连蛋白纯品配制层粘连蛋白校准品；

2)固相载体包被亲和素；

3)使层粘连蛋白的单克隆抗体生物素化；

4)用酶标记层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；

5)配制化学发光底物；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述层粘连蛋白校准品、生物素化的单克隆抗体、酶标记的层粘连蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固相载体包被亲和素的步骤2)采用以下方法：

1)包被

用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；

2)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

3)封闭

用含1％BSA，pH值为7.0～7.5，浓度为0.010M的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。

8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述亲和素化的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。

9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

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