CN117451983A - 提升检测范围的标记方法和免疫层析检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提升检测范围的标记方法和免疫层析检测试剂盒,涉及检测试剂技术领域。该标记方法包括在标记物和被标记物的反应体系中添加有效成分,使有效成分和被标记物同时标记在标记物上。其中标记物包括微球;被标记物包括蛋白、多肽、小分子物质中的一种或几种;有效成分包括蛋白、多肽和氨基酸中的一种或几种。该标记方法能够提升被标记物标记后的检测范围。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂技术领域,尤其是涉及一种提升检测范围的标记方法和免疫层析检测试剂盒。
背景技术
在免疫学发展的早期人们应用细菌或其外毒素给动物注射,经一定时期后用体外实验证明在其血清中存在一种能特异中和外毒素毒性的组分称之为抗毒素,或能使细菌发生特异性凝集的组分称之为凝集素。其后将血清中这种具有特异性反应的组分称为抗体(antibody,Ab),而将能刺激机体产生抗体的物质称之为抗原(antigen,Ag)。由此建立了抗原与抗体的概念。
抗体是具有4条多肽链的对称结构,其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链);2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有κ和λ两种,重链有μ、δ、γ、ε和α五种。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中,不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈,这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面,最多由17个氨基酸残基构成,少则只有2~3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的,位于两臂末端称抗原结合片段。“Y”的柄部称结晶片段,糖结合在FC上。
当将抗体标记在微球类的载体或标记物上时,理想的标记效果为抗体的Fc端标记在微球表面,Fab端能够充分的暴露在外面,空间受阻影响较小,能够更易于抗原结合,提升结合效率,进一步提升检测的灵敏度以及线性范围。但是在实际的标记过程中,抗体的Fc端和Fab端均可以标记在微球表面,导致与抗原的结合效率降低,因此如何改进这一问题是目前有待解决的问题。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提升检测范围的标记方法,以提升被微球标记的被标记物的检测效果。
本发明的另一目的在于提供利用上述标记方法制备免疫层析检测试剂盒和制备得到的产品。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
第一方面,提供了一种提升检测范围的标记方法,包括在标记物和被标记物的反应体系中添加有效成分,使有效成分和被标记物同时标记在标记物上;
所述标记物包括微球;
所述被标记物包括蛋白、多肽、小分子物质中的一种或几种;
所述有效成分包括蛋白、多肽和氨基酸中的一种或几种。
可选的实施方式中,所述被标记物包括抗体、抗原结合片段、抗原或含有抗原表位的多肽或小分子。
可选的实施方式中,所述有效成分包括血清白蛋白和/或卵清蛋白。
可选的实施方式中,所述氨基酸包括精氨酸。
可选的实施方式中,所述微球包括时间分辨荧光微球、荧光微球或彩色微球。
可选的实施方式中,所述时间分辨荧光微球包括稀土元素螯合的微球。
可选的实施方式中,所述微球修饰了羧基、氨基和羟基的一种或几种。
可选的实施方式中,所述反应体系中,被标记物和有效成分的质量比为1:1~50,优选为1:1~20,进一步优选为1:10。
可选的实施方式中,所述反应体系中,有效成分的浓度为1~5mg/mL,优选为2.5mg/mL。
第二方面,提供了使用第一方面的标记方法制备得到的微球标记的被标记物。
第三方面,提供了一种免疫层析检测试剂盒的制备方法,包括第一方面的标记方法,或包括在免疫层析试纸上包被第二方面的微球标记的被标记物。
第四方面,提供了一种免疫层析检测试剂盒,其由第三方面的制备方法制备得到,或含有第二方面的微球标记的被标记物。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明设计的宗旨即为在标记物和被标记物结合时,添加除了被标记物外的有效成分改变被标记物的结合形态,提升被标记物的有效结合率,继而在检测目标物质时提升了标记后的被标记物的使用率,增加了信号的强度,拓宽了检测范围。利用了上述标记方法制备得到的免疫层析检测试剂盒,能够有效拓宽试剂盒的检测范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不添加有效成分时,微球和抗体的结合示意图;
图2为添加有效成分时,微球和抗体的结合示意图;
图3为实施例1测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图;
图4为对比例1测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图;
图5为实施例2测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图;
图6为对比例2测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图;
图7为实施例3测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图;
图8为对比例3测试数据与公认的国际优秀水平试剂相关性统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
第一方面,提供了提升检测范围的标记方法,该方法包括在标记物和被标记物的反应体系中添加有效成分,使有效成分和被标记物同时标记在标记物上。
本发明中,微球指的是微米级或纳米级微小球状实体,其为球形或类球形,可以物理或化学方式连接蛋白、多肽、小分子或其他活性成分。微球的材质可选择本领域可接受的常规的材质,包括但不限于天然高分子或合成的聚合物,一些实例包括但不限于淀粉微球、明胶微球、壳聚糖微球、聚乳酸微球、聚丙烯微球和聚丙乙烯微球。为了连接微球和被标记物,微球可以被本领域可接受的任选的化学键修饰,包括但不限于修饰羧基、氨基和羟基的一种或几种。
可选的实施方式中,用于标记被标记物的微球是具有示踪功能的微球,包括但不限于时间分辨荧光微球、荧光微球或彩色微球。
可选的实施方式中,所述微球选自时间分辨荧光微球。时间分辨荧光免疫分析的原理是使用三价稀土离子作为示踪物,通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗体、待测抗原相结合时,形成免疫复合物,由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子,利用时间分辨荧光分析仪,即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度,从而确定待测抗原的量。
可选的实施方式中,所述时间分辨荧光微球包括稀土元素螯合的微球。
可选的实施方式中,所述稀土元素包括铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)或镝(Dy)。
可选的实施方式中,所述时间分辨荧光微球包括金属元素铕螯合的聚苯乙烯微球。
本发明中,有效成分包括蛋白、多肽和氨基酸中的一种或几种。
可选的实施方式中,所述蛋白类有效成分包括血清白蛋白和/或卵清蛋白。
可选的实施方式中,所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)。
可选的实施方式中,所述氨基酸包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种,优选包括精氨酸。
本发明中,被标记物包括蛋白、多肽、小分子物质中的一种或几种。
蛋白类被标记物包括但不限于抗体和抗原;多肽类被标记物包括任意长度的多肽,包括但不限于一般多于10个氨基酸残基的长肽和由2~10个氨基酸残基组成的短肽。小分子类被标记物指的是分子量小于500的分子或分子量小于1000道尔顿的分子。
可选的实施方式中,所述被标记物包括抗体、抗原结合片段、抗原或含有抗原表位的多肽或小分子。
可选的实施方式中,在微球标记被标记物的方法中,被标记物可以是一种抗体。将抗体标记在微球上时,通过在反应体系中添加上述有效成分,能够促进抗体的Fc端规律的标记在微球表面,使Fab端充分的暴露在外面(如图1和图2所示),以提升抗原结合效率,提升检测的灵敏度以及线性范围。
可选的实施方式中,所述反应体系中,被标记物和有效成分的质量比为1:1~50,例如可以为但不限于1:1、1:5、1:10、1:15、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50,或上述任意两点的质量比范围,被标记物和有效成分的质量比优选为1:1~20,进一步优选为1:10。
可选的实施方式中,有效成分的浓度为1~5mg/L,例如可以为但不限于1、1.5、2、2.5、3、3.4、4、4.5或5mg/mL,优选为2.5mg/mL。
第二方面,还提供了使用第一方面提供的方法制备得到的微球标记的被标记物。
可选的实施方式中,所述微球标记的被标记物中,微球选自时间分辨荧光微球,被标记物选自抗体。
第三方面,还提供了一种免疫层析检测试剂盒的制备方法,所述制备方法包括第一方面提供的标记方法,或包括在免疫层析试纸上包被第二方面的微球标记的被标记物。所述制备方法还任选地包括本领域已知的、常规的制备步骤。
可选的实施方式中,所述制备方法包括向微球添加修饰基团的步骤,各步骤间任选地洗涤步骤,孵育步骤和纯化步骤中的一种或多种。
可选的实施方式中,所述微球为时间分辨荧光微球,所述制备方法包括时间分辨荧光微球的清洗、荧光微球的活化、被标记物与有效成分的共同标记、荧光微球空白位点封闭和保存等。
可选的实施方式中,所述制备方法包括免疫层析试纸的制备步骤,例如但不限于向载体膜上包被微球标记的被标记物,或向载体膜上包被与其他标记物偶联的抗体或抗原,或向载体膜上包被独立的抗体或抗原,以及免疫层析试纸各部分组装的步骤中的一种或多种。
第四方面,还提供了一种免疫层析检测试剂盒,所述免疫层析检测试剂盒由第三方面的制备方法制备得到,或含有第四方面的微球标记的被标记物。
可选的实施方式中,所述免疫层析检测试剂盒中还包括用于检测的其他本领域的常规试剂,包括但不限于缓冲液、洗涤液、稀释液、样本裂解液、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
可选的实施方式中,所述免疫检测产品包括糖化血红蛋白检测产品或心肌肌钙蛋白I检测产品。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例使用的主要试剂:
表1
物料 | 厂家货号信息 |
时间分辨荧光微球 | Thermo 93470720010150 |
MES | 阿拉丁-M105074 |
牛血清白蛋白 | ROCHE 10738328103 |
卵清蛋白 | 沪试69003835 |
L-精氨酸 | 沪试62004034 |
糖化血红蛋白抗体 | 旭科XK2403 |
心肌肌钙蛋白I抗体 | 旭科XK4C6B |
磷酸氢二钠(十二水) | 沪试10020318 |
磷酸二氢钠(二水) | 沪试20040718 |
海藻糖(二水) | 阿拉丁T100010 |
Proclin 300 | sigma-48912 |
Tween-20 | 阿拉丁T104863 |
实施例1
提供了一种糖化血红蛋白检测试剂(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,包括如下步骤:
(1)取20μL时间分辨荧光微球至2.0mL的离心管中,向其中加入400μL的20mMpH6.0的MES溶液。
(2)震荡混匀后离心去掉上清液。
(3)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液。
(4)震荡混匀后离心去掉上清液。
(5)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液,震荡混匀,向其中加入8μL的1mg/mL的EDC溶液(20mM pH6.0的MES溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃30min。
(6)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(7)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(8)震荡混匀后离心去掉上清液。
(9)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(10)震荡混匀后,向其中加入20μg抗体XK2403,同时加入1mg牛血清白蛋白(20mMpH7.4 PB溶液溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃120min。
(11)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(12)向离心管中加入400μL的封闭缓冲液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L pH7.4)震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃60min。
(13)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(14)向离心管中加入400μL保存液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L,海藻糖(二水)50g/L,proclin300 0.5mL/L pH7.4),震荡重选,超声后保存。以待使用。
将标记了抗体后的时间分辨荧光微球溶液喷洒在对应的结合垫上,并进行干燥、切条、再与样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、底板等进行组装,后包装成试剂条进行使用。
实施例2
本实施例提供了一种心肌肌钙蛋白I(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,包括如下步骤:
(1)取20μL时间分辨荧光微球至2.0mL的离心管中,向其中加入400μL的20mMpH6.0的MES溶液。
(2)震荡混匀后离心去掉上清液。
(3)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液。
(4)震荡混匀后离心去掉上清液。
(5)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液,震荡混匀,向其中加入8μL的1mg/mL的EDC溶液(20mM pH6.0的MES溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃30min。
(6)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(7)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(8)震荡混匀后离心去掉上清液。
(9)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(10)震荡混匀后,向其中加入20μg抗体XK4C6B,同时加入1mg卵清蛋白(20mMpH7.4 PB溶液溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃120min。
(11)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(12)向离心管中加入400μL的封闭缓冲液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L pH7.4)震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃60min。
(13)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(14)向离心管中加入400μL保存液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L,海藻糖(二水)50g/L,proclin300 0.5mL/L pH7.4),震荡重选,超声后保存。以待使用。
将标记了抗体后的时间分辨荧光微球溶液喷洒在对应的结合垫上,并进行干燥、切条、再与样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、底板等进行组装,后包装成试剂条进行使用。
实施例3
本实施例提供了一种心肌肌钙蛋白I(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,包括如下步骤:
(1)取20μL时间分辨荧光微球至2.0mL的离心管中,向其中加入400μL的20mMpH6.0的MES溶液。
(2)震荡混匀后离心去掉上清液。
(3)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液。
(4)震荡混匀后离心去掉上清液。
(5)将底部荧光微球超声重悬后,在向其中加入400μL的20mM pH6.0的MES溶液,震荡混匀,向其中加入8μL的1mg/mL的EDC溶液(20mM pH6.0的MES溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃30min。
(6)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(7)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(8)震荡混匀后离心去掉上清液。
(9)将底部荧光微球超声重悬后,向其中加入400μL 20mM pH7.4 PB溶液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L)。
(10)震荡混匀后,向其中加入20μg抗体XK4C6B,同时加入1mg L-精氨酸(20mMpH7.4 PB溶液溶解),震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃120min。
(11)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(12)向离心管中加入400μL的封闭缓冲液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L pH7.4)震荡混匀后,放置在摇床上,30℃,转速280r/min避光摇晃60min。
(13)从摇床上取出离心管,离心去掉上清液。
(14)向离心管中加入400μL保存液(磷酸氢二钠(十二水)5.8022g/L,磷酸二氢钠(二水)0.5928g/L,牛血清白蛋白10g/L,tween-20 0.5mL/L,海藻糖(二水)50g/L,proclin300 0.5mL/L pH7.4),震荡重选,超声后保存。以待使用。
将标记了抗体后的时间分辨荧光微球溶液喷洒在对应的结合垫上,并进行干燥、切条、再与样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、底板等进行组装,后包装成试剂条进行使用。
对比例1
对比例1提供了一种糖化血红蛋白检测试剂(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,与实施例1的区别仅在于,步骤(10)不加入牛血清白蛋白。
对比例2
对比例2提供了一种心肌肌钙蛋白I检测试剂(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,与实施例2的区别仅在于,步骤(10)不加入卵清蛋白。
对比例3
对比例3提供了一种心肌肌钙蛋白I检测试剂(时间分辨荧光免疫层析法)的标记方法,与实施例3的区别仅在于,步骤(10)不加入L-精氨酸。
效果例1
分别将上述实施例1~3和对比例1~3装配成卡条形式用于检验。收集覆盖各项目线性范围宽度的30例样本,选取市场上公认的测试水平优秀的进口试剂,测试相同样本进行统计分析。
(1)实施例1和对比例1的实验结果如表2和图3和图4所示:
表2糖化血红蛋白检测试剂盒测试数据
(2)实施例2和对比例2的实验结果如表3和图5和图6所示:
表3心肌肌钙蛋白I检测试剂盒测试数据
(3)实施例3和对比例3的实验结果如表4和图7和图8所示:
表4心肌肌钙蛋白I检测试剂盒测试数据
通过上述三个实施例和对比例的测试结果可以看出,使用实施例1~3方式标记的试剂条,实施例30例样本测试值与国际优秀水平试剂测试的结果非常相近,且在线性高端处,测试结果能够很好的爬升,基本保持与国际优秀水平试剂相同的测试值上升。如表2所示,实施例1糖化血红蛋白试剂高端可以上到18%,而对比例1只能上到13%,相差明显。同样的如表2所示,心肌肌钙蛋白I检测试剂,实施例2可以上到51ng/mL的高值浓度,而对比例2只能上到41ng/mL。表3的检测结果亦然。心肌肌钙蛋白I检测项目,实施例3高端可以上到52ng/mL,而对比例3只能达到33ng/mL。因而从数据可以看出添加有效成分与目标抗体共同标记的方法可明显拓宽检测范围。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种提升检测范围的标记方法,其特征在于,包括在标记物和被标记物的反应体系中添加有效成分,使有效成分和被标记物同时标记在标记物上;
所述标记物包括微球;
所述被标记物包括蛋白、多肽、小分子物质中的一种或几种;
所述有效成分包括蛋白、多肽和氨基酸中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的标记方法,其特征在于,所述被标记物包括抗体、抗原结合片段、抗原或含有抗原表位的多肽或小分子。
3.根据权利要求1所述的标记方法,其特征在于,所述有效成分包括血清白蛋白和/或卵清蛋白;
优选地,所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白;
优选地,所述氨基酸包括精氨酸。
4.根据权利要求1所述的标记方法,其特征在于,所述微球包括时间分辨荧光微球、荧光微球或彩色微球;
优选地,所述时间分辨荧光微球包括稀土元素螯合的微球;
优选地,所述稀土元素包括铕、铽、钐或镝;
优选地,所述时间分辨荧光微球包括金属元素铕螯合的聚苯乙烯微球;
优选地,所述微球修饰了羧基、氨基和羟基的一种或几种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的标记方法,其特征在于,所述反应体系中,被标记物和有效成分的质量比为1:1~50,优选为1:1~20,进一步优选为1:10。
优选地,所述反应体系中,有效成分的浓度为1~5mg/mL,优选为2.5mg/mL。
6.根据权利要求5所述的标记方法,其特征在于,所述微球为时间分辨荧光微球,所述被标记物为抗体。
7.使用权利要求1~6任一项所述的标记方法制备得到的微球标记的被标记物。
8.免疫层析检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括权利要求1~6任一项所述的标记方法,或包括在免疫层析试纸上包被权利要求7所述的微球标记的被标记物。
9.免疫层析检测试剂盒,其特征在于,由权利要求8所述的制备方法制备得到,或含有权利要求7所述的微球标记的被标记物。
10.根据权利要求9所述的免疫层析检测试剂盒,其特征在于,所述免疫层析检测试剂盒包括糖化血红蛋白检测试剂盒或心肌肌钙蛋白I检测试剂盒。
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