FI115413B - Vesiliukoisia, polymeeripohjaisia reagensseja ja konjugaatteja, jotka sisältävät divinyylisulfonista johdettuja ryhmiä - Google Patents

Description

115413

Vesiliukoisia, polymeeripohjaisia reagensseja ja konju-gaatteja, jotka sisältävät divinyylisulfonista johdettuja ryhmiä 5 Tämä keksintö koskee veteenliukenevia reagensseja ja konjugaatteja, jotka soveltuvat erityisen hyvin käytettäväksi esimerkiksi biologisesti relevantissa detektiossa, kvantifikaatiossa ja kohdistusmenetelmissä, esim. immuno-histokemian alalla, immunoreaktiivisten hiukkasten detek-10 tiossa, vasta-aineen immobilisaatiossa, erotuksessa tai puhdistuksessa, DNA-hybridisaatiokokeissa ja virtaussyto-metriassa, samoin kuin muissa sovelluksissa, jotka tulevat ilmeisiksi tässä selityksessä olevan esityksen perusteella. Keksintö koskee myös menetelmiä reagenssien ja 15 konjugaattien valmistamiseksi ja niiden käyttöä.

Keksinnön reagenssit ja konjugaatit perustuvat ve-teenliukeneviin, polymeerisiin kantajamolekyyleihin, joilla on keskinkertainen - suuri moolimassa ja johon reaktiiviset divinyylisulfoni-johdetut ryhmät [so. ryhmät, joissa 20 on vapaa ("riippuva") pääte, reaktiivinen vinyyliryhmä] , tai silta-divinyylisulfoni-johdetut ryhmät ovat kovalent- • · ’ ·* tisesti liittyneet.

Keksinnön mukaisten erityisen edullisten reagens-sien tai konjugaattien polymeeriset kantajamolekyylit ovat ·, ,·* 25 aluksi ei-verkkorakenteisia ja niillä on oleellisesti nol- :· lavaraus pH-arvoissa, joilla on merkitystä keksinnön so- ’ ; vellusten alalla. Verkkoutuminen tapahtuu kuitenkin yleen sä polymeerien reaktion divinyylisulfonin kanssa kuluessa keksinnön mukaisessa valmistusmenetelmässä. Tällä hetkellä 30 edullisimpien polymeeristen kantajamolekyylien tapaukses- sa, nimittäin dekstraanien, nämä keksijät ovat havainneet, että on mahdollista muunnella verkkoutumisastetta lisään-

k I

: J tyvällä tavalla ja melko laajoissa rajoissa, esim. sääte- ;·, lemällä reaktioaikaa, dekstraanipitoisuutta tai väliaineen > I k . 35 pH:ta (tai näiden yhdistelmää) valmistusprosessin aikana.

* * I

» I

115413 2

Keksinnön reagenssien ja konjugaattien valmistus tapahtuu yleensä lievissä olosuhteissa ja käyttäen yleensä suoria menetelmiä, jotka, kuten edellä on mainittu, muodostavat tämän keksinnön näkökohdat. Sopivissa varastoin-5 tiolosuhteissa monet keksinnön mukaiset reagenssit ja kon-jugaatit, ja varsinkin keksinnön mukaiset kemiallisesti reaktiiviset reagenssit ja konjugaatit (so. reagenssit ja konjugaatit, jotka reagoivat helposti tietyntyyppisten funktionaalisten ryhmien kanssa, jotka ovat läsnä molekyy-10 lihiukkasissa niin, että muodostuu kovalenttisia sidoksia, jotka ankkuroivat kyseiset molekyylihiukkaset polymeerisiin kantajareagensseihin) osoittavat merkittävää ja odottamatonta stabiilisuutta ("käyttöaika") pitkittyneen varastoinnin liuoksessa aikana, tehden tämäntyyppisten esi-15 valmistettujen reagenssien ja konjugaattien kaupallistaminen täysin mahdolliseksi.

Keksinnön tausta

Viimeisinä kahtena vuosikymmenenä on immunokemian ja molekyylibiologian alalla edetty valtavasti, ja tämä on 20 selvästi vaikuttanut tänä aikana julkaistuun relevantin tieteellisen ja patenttikirjallisuuden volyymiin. Alueil-la, joille tällä keksinnöllä on merkitystä, erityisen kas- # : vun alue on ollut esimerkiksi kvalitatiiviset ja/tai kvan titatiiviset analyysit, jotka koskevat immunoreaktiivisten 25 lajien käyttöä, so. antigeenien, hapteenien tai vasta-aineiden .

Yksi tällainen alue on immunohistokemiallisten/sy-tokemiallisten detektiomenetelmien alue, joiden menetelmien tarkoitus on tavallisesti antigeenisten determinant-: : 30 tien, jotka ovat läsnä kudoksissa tai soluissa/soluilla, ,,,* paikallistaminen näiden antigeenisten determinanttien im- munokemiallisella reaktiolla spesifisten niin kutsuttujen ,···, primaaristen vasta-aineiden kanssa, jotka reagoivat vain kohdeantigeenisten determinanttien kanssa. Primaariset ; *’ 35 vasta-aineet ovat joko merkityt sopivilla leimoilla (esim.

3 115413 entsyymeillä, fluoresoivilla ryhmillä tai raskasatomeil-la), tai ne osoitetaan itsekseen lisäksi immunokemialli-sella reaktiolla spesifisten niin kutsuttujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa, jotka reagoivat primaaristen 5 vasta-aineiden kanssa; jälkimmäisessä tapauksessa sekundaariset vasta-aineet merkitään sopivilla leimoilla (entsyymeillä, fluoresoivilla ryhmillä tai raskasatomeilla). Vaihtoehtoisesti immunokemiallinen reaktio kohdeantigee-nisten determinanttien ja primaaristen vasta-aineiden vä-10 Iillä osoitetaan immunokemiallisella reaktiolla spesifisen niin kutsutun sidosvasta-aineen kanssa, jolla on ominaisuus saattaa samanaikaisesti reagoimaan (i) primaaristen vasta-aineiden ja (ii) vasta-aineen kanssa, johon entsyymit ovat liittyneet immunokemiallisella reaktiolla tai 15 kovalenttisella liittämisellä.

Lisävaihtoehtona immunokemiallinen reaktio kohdean-tigeenisten determinanttien ja primaaristen vasta-aineiden välillä, tai primaaristen vasta-aineiden ja sekundaaristen vasta-aineiden välillä, osoitetaan hyödyntämällä sitoutu-20 mistä, joka tapahtuu tiettyjen komplementaaristen molekyy-liparien, jotka ovat muita kuin antigeenejä, ja vasta-ai-: : neiden välillä; esimerkki tällaisesta komplementaarisesta * parista on biotiini ja streptavidiini. Tässä lähestymises-sä yksi komplementaarisen parin jäsen liitetään primaari- 25 siin tai sekundaarisiin vasta-aineisiin ja toinen molekyyli yhdistetään sopivien leimojen kanssa (esim. entsyymien, fluoresoivien ryhmien tai raskasatomien).

Tämäntyyppisissä menetelmissä näyte ohueksi leikatun kudosnäytteen tai solunäytteen (tyypillisesti kehones- ' 30 teestä) muodossa kiinnitetään lasilevyyn. Käytettyä näy- * tettä käsitellään sitten normaalisti erilaisilla kemikaa- j leiliä, jolloin helpotetaan peräkkäisiä immunokemiallisia reaktioita. Näyte altistetaan sitten käsittelylle merkityllä tai ei-merkityllä primaarisella vasta-aineella tar-“ 35 peen mukaan, minkä jälkeen vasta-aine sitoutuu immunoke- * t » 115413 4 miallisesti kyseiseen antigeeniin näyteessä/näytteellä. Kun ylimääräinen vasta-aine oli poistettu pesemällä näyte sopivasti, antigeeniseen determinanttiin sitoutunut vasta-aine osoitetaan käsittelemällä sopivilla reagensseilla 5 riippuen visualisointisysteemin valinnasta (kuten aikai semmin on kuvattu yllä) yhdessä sopivien pesumenetelmien kanssa. Ylimääräisen merkityn reagenssin poistamisen (pesemällä) jälkeen valitusta visualisointisysteemistä, näyte altistetaan käsittelylle seuraavasti riippuen kyseisestä 10 leimasta: (i) entsyymileimojen tapauksessa näytettä käsitellään substraatilla (väriä kehittävä reagenssi). Entsyymi reagoi substraatin kanssa, mikä johtaa värittyneen liukenemattoman sakan muodostumiseen entsyymin paikassa ja sen 15 ympärillä; (ii) raskasmetallinleiman, kuten kullan, tapauksessa näytettä voidaan käsitellä niin kutsutulla lisäysrea-genssilla, joka sisältää hopeaa. Hopeametalli seostetaan sitten mustana sakkana kullan paikassa ja sen ympärillä.

20 (iii) fluoresoivien leimojen tapauksessa ei yleensä tarvita kehitysreagenssia.

' : Pesuvaiheen jälkeen joitakin näytteen aineosia voi- daan sitten värjätä kemiallisella väriaineella, joka antaa * ; sopivan kontrastin värille, joka tulee kyseisestä leimas- . 25 ta. Lopullisen pesuvaiheen jälkeen näyte päällystetään .läpinäkyvällä reagenssilla, jolloin varmistetaan pysyvä merkintä tutkimusta varten.

Leimojen visualisointi (epäsuoraan ilmaisten kohde-antigeenisten determinanttien paikan ja määrän) suorite-30 taan seuraavasti: (i) valomikroskooppitutkimus (entsyymileimojen ta- • pauksessa); (ii) valo- tai elektronimikroskooppitutkimus (ras-kasmetallileimojen tapauksessa); 115413 5 (iii) fluoresenssimikroskooppitutkimus käyttäen säteilytettyä sopivan aallonpituista valoa (fluoresoivien leimojen tapauksessa).

Kyseinen ajanjakso on myös nähnyt esimerkiksi niin 5 kutsuttujen ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, entsyymiin sitoutunut immunosorbentti analyysi) -tyyppisten analyysien esiintulon ja kehittymisen, jossa analyysissä antigeeni, hapteeni tai vasta-aine osoitetaan entsyymin keinoilla, joka on kovalenttisesti liittynyt (ilmaistaan 10 myös sitoutunut tai konjugoitunut) joko (kun on määritettävä antigeeni tai hapteeni) vasta-aineeseen, joka on spesifinen kyseiselle antigeenille tai hapteenille, tai (kun on määritettävä vasta-aine) vasta-aineeseen, joka on spesifinen kyseiselle vasta-aineelle. "Perinteisessä" 15 ELISAssa osoitettava/määritettävä antigeeni, hapteeni (jälkimmäinen yleensä konjugaatin esim. proteiinin kanssa muodossa) tai vasta-aine tavallisesti sidotaan tai immobi-lisoidaan sallimalla sen sitoutua immunokemiallisesti (i) niin kutsuttuun "vastaanottavaan" vasta-aineeseen antigee-20 nin tai hapteenin määrittämisen tapauksessa tai (ii) antigeeniin vasta-aineen määrittämisen tapauksessa, joista • ·' kukin on liittynyt (yleensä ei-kovalentilla adsorptiolla) ’ · sopivan materiaalin, kuten polystyreenin helmien tai mik- ; rotiitterilevyn, pintaan ja sopivan entsyymiin liittyneen , 25 spesifisen vasta-aineen annetaan sitten sitoutua immobili- soituihin hiukkasiin, jotka on osoitettava/määritettävä; sitoutuneen spesifisen vasta-aineen määrä, ja siten immo- * bilisoitujen hiukkasten määrä, määritetään sitten lisäämällä aine, joka on substraatti liittyneelle entsyymille • 30 ja josta entsymaattisen hajoamisen aikana saadaan aikaan karakteristisen värin kehittyminen, jonka intensiteetti j (mitattuna esimerkiksi spektrofotometrialla tai yksinker taisella kolorimetrialla/komparimetrialla) on siten määritettävien kiinnostavien hiukkasten määrän kaltainen 35 (yleensä suhteellinen). Esimerkkejä edullisista entsyy- 115413 6 meistä käytettäväksi tämäntyyppisissä analyyseissä (samoin kuin immunohistokemiallisissa menetelmissä) ovat peroksi-daasit, esim. piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataa-si, glukoosioksidaasit, galaktosidaasit ja ureaasit.

5 Immunokemialliset analyysit, jotka ovat tyypiltään analogisia ELISAn kanssa, mutta käyttävät muita osoitus-keinoja, esim. spesifisten vasta-aineiden, joihin fluoresoivat tai luminisoivat leimamolekyylit ovat sitoutuneet kovalenttisesti, käyttö on myös läpikäynyt huomattavaa 10 kehitystä samana ajanjaksona, ja niin kutsutun "aikahä-viävän fluoresenssin" esiin tuleminen on hyvä esimerkki: Tässä menetelmässä merkki tai leima on yleensä joko Eu3* tai europiumkelaattori (vaikka tiettyjä muita lantanidi-hiukkasia tai lantanidikelaattoreita on myös käytetty), ja 15 fluoresoiva europiumkelaatti voidaan sitten muodostaa lisäämällä vastaavasti orgaaninen kelaattori tai Eu3+. Päinvastoin kuin useimmat perinteisemmät fluoresoivan leiman hiukkaset, esim. fluoreseiini, jolla on yleensä fluoresenssin elinikä noin 100 nanosekuntia (ns) tai vähemmän, 20 lantanidikelaattien fluoresenssin elinikä on yleensä alueella 100 - 1 000 mikrosekuntia (ps); käyttämällä hy-j * : väksi värähtelevää valolähdettä ja aikasulkufluorometria (time-gated fluorometer), näiden yhdisteiden fluoresenssi voidaan mitata aika-alueella noin 200 - 600 ps kunkin vi-.· . 25 rityksen jälkeen. Tämän menetelmän pääasiallinen etu on taustasignaalien väheneminen, joita voi syntyä muiden esi-merkiksi analyysinäytteessä, mikrotiitterikuoppien ainees- • · · sa tai aineella, kyveteissä tai niiden kaltaisissa, tai muualla mittaussysteemissä läsnä olevien aineiden lyhyt-·’·*' - 30 ikäisestä fluoresenssista.

Lisäksi ryhmä menetelmiä, jotka käyttävät immunoke- t miallisia detektiomenetelmiä ja jotka tulisi mainita kek- .·**. sinnön yhteydessä, ovat "immunovärjäys"-menetelmät, joista > · * · t esimerkkejä ovat niin kutsutut "dot blot"- ja "western > " 35 blot" -menetelmät: Western blot -menetelmässä, jota käyte- • > 115413 7 tään antigeenisten polypeptidien tai proteiinien analyysiä ja identifikaatiota varten, proteiinit/polypeptidit niiden seoksessa erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirretään sitten elektroforeettisesti ("värjätään") 5 nitroselluloosa-arkille tai kemiallisesti käsitellylle paperille, johon proteiinit/polypeptidit sitoutuvat mallilla, joka on identtinen geelissä olevan kanssa. Sitten lisätään sopiva spesifinen vasta-aine, minkä jälkeen merkitty toinen vasta-aine ensimmäistä vasta-ainetta vastaan 10 tai merkitty proteiini-A (leimattu esimerkiksi radioiso-toopilla, fluoresoivalla väriaineella, entsyymillä tai kolloidisella kullalla). Leiman paikka (ja siten tietyn antigeenin läsnäolo) osoitetaan sitten sopivalla tavalla, joka on esitetty aikaisemmin.

15 Mitä tulee kehitykseen molekyylibiologian yleisellä alueella, yksi merkittävä ei-immunokemiallinen alue on ollut hybridisaatiomenetelmät geenirakenneanalyysien yhteydessä: "Perinteisissä" hybridisointimenetelmissä tietty nukleotidisekvenssi (joka tunnetaan myös "koettimena" tai 20 "geenikoettimena") merkitään sopivalla merkillä tai leimalla, esim. radioaktiivisella isotoopilla, ja lisätään : sitten kiinnostavan nukleiinihapon näytteeseen, esim.

.· näytteeseen, joka on osittain koskemattomien solujen muo dossa, tai eristettyjen DNA- tai RNA-fragmenttien muodos-25 sa. Näyte voi olla joko vapaana liuoksessa tai immobili-soituna kiinteäfaasisubstraatilla. Jos koetin ja nukleii- ! nihapponäyte hybridisoivat muodostamalla vahvan, ei-kova- * » · ' lenttisen sidoksen niiden välille, voidaan järkevästi olettaa, että koettimen kanssa oleellisesti identtinen * * · · 30 nukleotidisekvenssi on läsnä nukleiinihapossa. Merkki tai leima koettimessa tarjoaa siten keinot sen todistamiseksi, ·;.·| onko hybridisaatio tapahtunut, ja läsnä olevan DNA/RNA- .··*. näytteen määrän määrittämiseksi.

«tl

Niin kutsuttu "southern blot" -menetelmä harvinais-: " 35 ten DNA-fragmenttien osoittamiseksi DNA:n kompleksiseok- 8 115413 sessa on esimerkki menetelmästä, joka käyttää hybridisaa-tiomenetelmää: Geelielektroforeesia käytetään erottamaan erilaisia fragmentteja, jotka sitten denaturoidaan ja siirretään värjäämällä nitroselluloosa-arkille. Fragmentit 5 hybridisoidaan sitten sopivaksi radioaktiivisesti merkityksi koettimeksi, ja niiden paikka paljastetaan autora-diografiällä. Analogisia menetelmiä on suunniteltu RNA:lle ja, kuten jo mainittiin ("western blot", katso ylempänä), proteiinille tai peptidiantigeeneille.

10 Hybridisaatiomenetelmillä on ollut suuri merkitys biokemiallisessa genetiikassa nukleotidisekvenssien ja niiden toiminnan välisten suhteiden ymmärtämiseksi, ja ne tarjoavat tärkeän diagnostisen työkalun esimerkiksi geneettisten virheiden tai tarttuvien aineiden, kuten virus-15 ten tai bakteerien, osoittamiseksi.

Johtuen ensisijaisesti terveyshaitoista, jotka johtuvat radioisotooppien käytöstä edellä mainitun tyyppisissä hybridisaatiomenetelmissä, on tehty yrityksiä korvata ne vaarattomammilla (ja yleensä helpommin saatavissa ole-20 villa) merkeillä tai leimoilla. Kuitenkin tähän mennessä tehdyistä yrityksistä, esimerkiksi käyttäen biotinyloituja ; : koettimia, jotka osoitetaan esim. entsyymillä merkittyjen • reagenssien keinoilla, on saatu tätä seuraava herkkyyden ; häviäminen verrattuna radioaktiivisesti merkittyjä koetti- 25 mia käytettäessä saatavissa olevaan herkkyyteen.

Edellä mainittu heikon detektioherkkyyden ongelma käytettäessä erityisesti ei-radioaktiivisia leimoja ei ’ koske vain hybridisointimenetelmiä vaan myös immunokemial- lista detektiota tai analyysimenetelmiä, tai kun käytetään · 30 immunokemiailista detektiota lisäämään hybridisaatioreak- tiota. Toisin sanoen alempi detektioraja voi osoittautua ί riittämättömäksi yksiselitteistä detektiota tai alempien, esim. antigeenien tai vasta-aineiden tai nukleiinihappojen, tasojen tarkkaa kvantitatiivista määrittämistä var-“ 35 ten. Tämä voi johtua esimerkiksi siitä, että värin tai i t »

» I

115413 9 fluoresenssin intensiteetti yhdessä edellä mainitun tyyppisessä immunokemiallisessa tai hybridisaatiomenetelmässä on liian alhainen pääasiassa sen tosiasian seurauksena, että normaalisti vain yksi tai, parhaassa tapauksessa, 5 vain muutama (yleensä alle viisi) entsyymimolekyyliä tai merkkihiukkasta voidaan liittää esim. kuhunkin spesifiseen vasta-aine-molekyyliin tai kuhunkin koettimen nukleotidi-sekvenssin molekyyliin. Lisäksi kullekin merkkihiukkasel-le, joka on liittynyt (konjugoitunut) esim. vasta-ainemo-10 lekyyliin ja erityisesti, jos merkkihiukkaset antavat net-topositiivisen tai -negatiivisen varauksen vasta-aine/ merkki-konjugaatille, on olemassa lisääntyvä vahingollisen vaikutuksen riski esimerkiksi vasta-aineen luonnolliselle kyvylle osallistua kiinnostuksen kohteena olevaan oikeaan 15 immunokemialliseen sitoutumisreaktioon; lisäksi nettoposi-tiivisen tai -negatiivisen varauksen läsnäolo tällaisessa konjugaatissa lisää riskiä konjugaatin ei-toivotun ei-spe-sifisen sitoutumiselle muihin aineisiin tai hiukkasiin systeemissä.

20 Immunokemiallisella alalla erityisesti huomattavaa vaivaa on omistettu suunnittelukeinoille, jotka lisäävät /· immunokemiallisten analyysimenetelmien herkkyyttä, ja yksi lähestyminen, joka on saavuttanut hyvän mittausmenestyk- ; *; sen, käsittää immunokemiallisesti reaktiivisten hiukkas- \ 25 ten, esim. vasta-aineen, ja suuren määrän entsyymimolekyy- lejä, fluoresoivia merkkimolekyylejä tai niiden kaltaisia [liittämisen yhteen ja samaan selkärankaan tai kantajaan, • « * esim. polymeerikantajaan. On olemassa lukuisia patenttido-, kumentteja, jotka ovat tällaisen lähestymisen kaltaisia, ' ’ 30 ja jotka hyödyntävät joko liukenevia tai liukenemattomia *«’ kantajia. Yleisesti ottaen edellä kuvatun tyyppisissä so- :·· velluksissa liukenevien kantajien käyttö on oleva edullis- ta, koska kantajan (liittyneiden immunokemiallisesti reak- * » « tiivisten hiukkasten ja entsyymi/merkkimolekyylien tai » » * ” 35 niiden kaltaisten kanssa) läsnäolo homogeenisessa liuok- » I · 10 115413 sessa mieluummin kuin heterogeenisena faasina, yhdessä tällaisten hiukkasten suhteellisesti suuren konformaatio-taipuisuuden kanssa liuosfaasissa, lisää suunnattomasti immunokemiallisen reaktiivisuuden nopeutta ja yleensä laa-5 juutta immunokemiallisten vastaavien hiukkasten kanssa, jotka on osoitettava tai määritettävä; immunohistokemial-lisissa sovelluksissa liukenevien kantajien käyttö on itse asiassa oleellista, koska hyvä kudoskontakti tai läpäisevyys on tarpeen, jotta varmistetaan optimipääsy immunoke-10 miallisesti reaktiivisiin ryhmiin tai epitooppeihin, jotka sijaitsevat kudoksessa tai sen päällä. Lisäksi yleensä on paljon helpompaa poistaa (esim. pesemällä tai huuhtelemal-la) kantajan kuljettamat immunokemiallisesti reaktiiviset hiukkaset, esim. kantajan kuljettamat vasta-aineet, jotka 15 eivät ole (esim. johtuen käytettävissä olevien sitomis-paikkojen tyydyttymisestä) tulleet sitoutuneiksi immunoke-miallisiin vastaaviin yhdisteisiin, esim. antigeeneihin, jotka ovat sitoutuneet esimerkiksi mikrotiitterilevyn pintaan, immunolevyyn tai niiden kaltaisiin, silloin kun ky-20 seiset kantajan kuljettamat hiukkaset ovat liukenevia kuin silloin kun ne ovat likenemattomia tai kolloidisia.

• Tämä keksintö esittää merkittävän edistysaskeleen : : muun muassa kaikkien erilaisten detektiotyyppien ja ana- lyysimenetelmien, jotka on edellä esitetty esimerkkien 25 avulla, taipuisuuden, herkkyyden ja luotettavuuden lisään-tymisen suhteen. Keksintöä voidaan myös hyödyntää esimer-kiksi alentamaan, ilman herkkyyden häviämistä, peräkkäis- * · ten immunoreaktiivisten komponenttien (antigeeni, vasta-aine, antivasta-aine jne.) "kerrosten" lukumäärää, joka 1 » : 30 muutoin tarvittaisiin esim. perinteisen ELISA- tai histo- kemiallisen menetelmän suorittamisessa. Muut keksintöön | liittyvät edut tulevat ilmeisiksi tästä selityksestä ja tässä annetuista sovellusesimerkeistä.

Koska tämä keksintö koskee, kuten on jo mainittu, * 35 veteeniiukenevia reagensseja ja konjugaatteja, ja niiden 115413 valmistusta ja käyttöä, seuraava yhteenveto lukuisista asiaan liittyvistä patenttidokumenteista rajataan selityksiin, joissa käytetään liukenevia kantajia: EP-patenttijulkaisu 0 077 671 koskee muun muassa 5 veteeniiukenevaa, ei-verkkorakenteista ja ei-primaarista amiinia sisältävää polymeeriä, johon merkkiaine on konju-goitunut. Polymeeri/merkkiainekonjugaatilla on negatiivinen tai nollavaraus, ja sen kunkin molekyylin polymeeri-osaan on liittynyt "vain yksi immunologinen homologi" (an-10 tigeeni tai vasta-aine). Alkuperäinen EP-hakemusjulkaisu (EP 0 077 671 AI) ei rajoitu "vain yhteen" immunologiseen homologimolekyyliin, mutta siinä ei myöskään ole mitään spesifistä mainintaa useammasta kuin yhdestä immunologisesta homologista. Edulliset veteeniiukenevat polymeerit 15 jälkimmäisessä patentissa/patenttihakemuksessa ovat poly- akryylihappo, polymetakryylihappo, polyakryyliamidi, poly-vinyylialkoholi, polyallyylialkoholi, edellä mainittujen polymeeriyhdistelmät, hydroksietyyliselluloosa, hydroksi-propyyli selluloosa, luonnolliset veteeni iukenevat polymee-20 rit ja synteettiset veteeniiukenevat polymeerit. Merkkiaineen molekyylit voidaan sisällyttää alusta polymeeriin » · * ,·1 sekapolymeroimalla suhteellisen pieni sopivan monomeerin : : prosenttiosuus sekoittamalla merkkiaine (esim. fluoresoi- : ; van merkkiaineen tapauksessa, monomeeri, joka valmistetaan 25 fluoreseiiniamiinin reaktiolla akryloyylikloridin kanssa ·. ekvimolaarisina määrinä) monomeerien kanssa, jotka muodos- >t tavat polymeeriselkärangan perustan (esim. akryylihappo ja akryyliamidi). Muihin mainittuihin menetelmiin merkkiaineiden liittämiseksi polymeeriin kuuluvat merkkiaineessa ;· · 30 olevan aktivoidun ryhmän hyödyntäminen, ja "ulkoisen akti- *···“ vointiaineen" käyttäminen. Mitä tulee immunologisen homo- >;··· login liittämiseen polymeeri selkärankaan, annetaan seuraa- vat esimerkit: i · » ,.· (i) akryylihappo/akryyliamidisekapolymeeri, joka ” 35 sisältää n. 1 %:n sekapolymerisoitua monomeeria, joka on • · > 115413 12 valmistettu fluoreseiiniamiinin reaktiolla akryloyyliklo-ridin kanssa, aktivoidaan reaktiolla karbonyylidi-imidat-solin ja N-hydroksisukkinimidin kanssa, ja saatu aktivoitu polymeeri/merkkiainekonjugaatti saatetaan sitten reagoi-5 maan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; (ii) monoklonaalinen vasta-aine, joka on biotiny-loitu reaktiolla biotinyyli-N-hydroksisukkinimidin kanssa, lisätään konjugaattiin, joka on muodostunut avidiinin reaktiolla aktivoidun polymeerin/merkkiainekonjugaatin 10 kanssa, joka on valmistettu, kuten kohdassa (i) edellä on esitetty; monoklonaalisen vasta-aineen liittäminen poly-meeriselkärankaan tässä tapauksessa tapahtuu vahvan, mutta ei-kovalenttisen, sitomisvuorovaikutksen kautta biotiini-ryhmien, jotka ovat kovalenttisesti sitoutuneet vasta-ai-15 neeseen, ja avidiiniryhmien välillä, jotka ovat kovalenttisesti konjugoituneet polymeeri/merkkiaineeseen.

Tässä patentissa ei näytä olevan selitystä, joka koskee dekstraanien käyttöä polymeerikantajana, tai divi-nyylisulfonin tai siitä johdetun ryhmän, käyttöä aktivoin-20 tireagenssina tai liitto/siltaryhmänä, jonka kautta merkkiaine tai immunologinen homologi voidaan liittää polymee-,* riin.

US-patenttijulkaisu 4 152 411 koskee leimattua "selkärankatyökalua" antigeeni/vasta-aineen reaktion kom-. 25 ponentin määrittämistä varten edullisesti hyödyntämällä polymeerejä, joissa on amidisidokset polymeerin, esimerkiksi polylysiinin, muiden homopoly(aminohappojen) tai polypeptidien yksittäisten yksikköjen välillä; keskimäärin vain yksi "leimattava” molekyyli (hapteeni, antigeeni tai 30 vasta-aine) liitetään polymeerin "selkärankatyökaluun".

Selitys mainitsee tolyleeni-2,4-di-isosyanaatin, glutaral-• dehydin ja karbonyylidi-imidin ehdokkaina aktivointirea- ·. genssia varten, jolla "leimattava" molekyyli voidaan liit- i 8 , * tää polymeerikantajaan, ja kaksi spesifistä esimerkkiä * 35 havainnollistavat l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)- 8 8 i 8 115413 13 karbodi-imidin käyttöä hapteenin, nimittäin tyroksiinin, liittämiseksi. Vaikka mahdollisten leima- tai merkkihiuk-kasten lukumäärä on mainittu, mukaan lukien lukuisat fluoresoivat aineet (kuten fluoreseiini) ja entsyymit (kuten 5 peroksidaasit), yksityiskohtia tavasta, jolla nämä liitetään polymeerikantajaan, on annettu vain yhden spesifisen entsyymin tapauksessa, nimittäin piparjuuriperoksidaasin (HRP), joka kyseisessä esimerkissä liitetään polylysiini/ tyroksiinikonjugaattiin HRP:n dioliryhmän alkuhapetuksella 10 käyttäen natriumperjodaattia; saadun hapetetun HRP:n dike-toniryhmän annetaan sitten reagoida jälkimmäisen konjugaa-tin kanssa (polylysiiniosan aminoryhmän kautta), jolloin muodostuu Schiff-emäsvälituote, joka puolestaan pelkistetään sitten esim. käyttäen natriumboorihydridiä, jolloin 15 saadaan HRP-leimattu polylysiini/tyroksiinikonjugaatti. Tämän erityisen tyyppisen leimatun konjugaatin ("diagnostinen leima selkärankatyökalu") ilmoitetaan olevan "...hämmästyttävän stabiili varastoitaessa pitkiä ajanjaksoja. Tällaista työkalua on mahdollista varastoida jopa 20 kolme tai kuusi kuukautta tai enemmän inertissä atmosfäärissä, esim. käyttäen typpeä, ja kosteuden ollessa poissa." • Mahdollisuus käyttää polysakkarideja, mukaan lukien . dekstraanin, "selkärankatyökalun" pohjana, mainitaan ly- 25 hyesti selityksessä, mutta siinä ei mainita yksityiskohtaisesti tapaa, jolla kiinnostuksen kohteena olevien molekyylien liittäminen dekstraaniin tulisi tapahtua. Myöskään I i f siinä ei ole mainintaa mistään eduista, jotka liittyvät , , dekstraanin käyttöön tätä tarkoitusta varten.

ä i I

·'; : 30 Julkaisu EP 0 010 405 Ai koskee muun muassa immuno-

• I

kemiallista analyysireagenssia, joka koostuu karboksyyliä ·;· * sisältävästä, veteeni aukenevasta, mono-olef Unisesta poly- meeriyhdisteestä yhdessä (so. liitettynä) hapteenin tai • « » sen kemiallisesti modifioidun tuotteen kanssa, ja menetel-

• I

• “ 35 mää hapteenin immunokemialliseksi määrittämiseksi käyttäen • » » 115413 14 tällaista reagenssia. Siinä ei näytä olevan mitään mainintaa dekstraanin kaltaisten polymeerien käytöstä tämän patenttihakemuksen yhteydessä.

Kemialliset strategiat, jotka mainitaan hapteenin 5 liittämisen polymeeriyhdisteeseen yhteydessä, ovat: karbo-di-imidien (esim. disykloheksyylikarbodi-imidi), karbonyy-lidi-imidatsolin tai difenyylifosforyyliatsidin (DPPA) käyttö; ja sekoitettujen happoanhydridien (jotka on muodostettu esim. käyttäen kloorimuurahaishapon esteriä, ku-10 ten isobutyyliklooriformaattia), aktiivisten esterien (muodostettu esim. käyttäen N-hydroksisukkinimidiä), atsi-dien (muodostettu käyttäen hydratsiinia, minkä jälkeen typpihappoa) tai happokloridien (muodostettu esim. käyttäen tionyylikloridia tai fosforioksikloridia) välituot-15 teen muodostaminen.

Kyseiset immunokemialliset analyysireagenssit osoittavat "erittäin suurta stabiilisuutta vesiliuosten muodossa... ja ne kestävät täysin varastoinnin huoneenlämpötilassa" .

20 Mahdollisuudesta liittää immunologisesti aktiivinen hiukkanen (antigeeni, vasta-aine), muu kuin hapteeni, ky-seiseen polymeeriseen aineeseen ei näytä olevan mitään ,f mainintaa.

US-patenttijulkaisut nro 4 166 105 ja 4 169 137 i 25 (Hirschfeld ja Hirschfeld et ai., vastaavasti) koskevat antigeenin osoittavia reagensseja ja vastaavasti väriaine- i * , · t liitettäviä reagensseja, jotka käsittävät primaarisen • > » amiinia sisältävän polyfunktionaalisen polymeeriselkäran- , , g an, esim. polyetyleeni-imiiniselkärangan, ja liittyneiden ♦ ‘ * ’ 30 leimamolekyylien (kuten suuren määrän fluoresoivia väri- • » *··* ainemolekyylejä); ensimmäisen patentin mukaiset reagenssit ·;· ; käsittävät lisäksi vasta-aineen, joka on spesifinen osoi- ; tettavalle antigeenille, kun taas jälkimmäisen patentin 1 1 i mukaiset reagenssit käsittävät lisäksi "ensimmäisen rea- ’ 35 goivan aineen", erityisesti vasta-aineen. Sovellusesimer- 15 115413 kit, joita annetaan molemmissa patenteissa, havainnollistavat keskimäärin enintään yhden vasta-ainemolekyylin, joka on liittynyt polymeeriselkärankaan. Dialdehydin, erityisesti glutaraldehydin, käyttö kytkentäreagenssina lei-5 mamolekyylien ja vasta-aine/ensimmäisen reagoivan aineen liittämiseksi polymeeriselkärankaan on edullista, divinyy-lisulfonipohjaisen liittämisen käytön mahdollisuudesta ei ole mitään mainintaa.

Julkaisu EP 0 135 071 Ά2 koskee muun muassa kemilu-10 minisoivasti merkittyjä hapteenikonjugaatteja, jotka käsittävät kemiluminisoivan ryhmän (esim. ryhmän, joka on johdettu luminolista tai sen johdannaisesta), ketjupoly-meerisen "liittoryhmän" (saksaksi: Verknupfungsgruppe) ja hapteenin; liittoryhmällä on toistuvia funktionaalisia 15 ryhmiä ja jokaista liittoryhmämoolia kohti on useita lu-minisoivan ryhmän mooleja ja useita hapteenimooleja, edullisesti vähintään 10 moolia kutakin liittoryhmän moolia kohti.

Esimerkkeihin liittopolymeereista, jotka mainitaan 20 lyhyesti selityksessä, kuuluvat peptidit, proteiinit, gly-koproteiinit, glykolipidit ja karbohydraatit, mukaan lu-" j kien polysakkaridit, kuten dekstraanit, ja divinyylisulfo- .' : ni mainitaan lyhyesti kytkentäreagenssien joukossa kemilu- minisoivien ryhmien tai hapteenien liittämiseksi toistu-25 viin funktionaalisiin, reaktiivisiin ryhmiin (kuten amino-, karboksi-, karbonyyli-, "tionyyli-" tai hydroksiryh-mät) polymeerillä. Kuitenkin ainoat sovellusesimerkit, * joita tarjotaan, koskevat valmistusta ja käyttöä luminoli/ hapteeni/proteiinikonjugaattien, jotka pohjautuvat pro- 30 telineille (polymeereille) transferriini ja sian tyreoglo- buliini, kemiluminisenssianalyysissä, ja käyttäen karbodi- ; imidiä ja vastaavasti meripihkahappoanhydridiä kytkentä- » reagensseina hapteenien liittämiseksi proteiineihin.

Ei ole olemassa lisäselitystä eikä sovellusesimerk-35 kiä tässä dokumentissa, joka koskee kytkentäkemian, joka » 115413 16 on edullinen tämän keksinnön yhteydessä, nimittäin liittäminen, joka perustuu ryhmiin, jotka ovat johdetut divinyy-lisulfonista, käyttöä tai mitä tahansa etuja, jotka liittyvät käyttöön; eikä siinä näytä olevan mitään selvää mai-5 nintaa esitettyjen konjugaattien stabiilisuudesta tai käyttöajasta, joko kiinteässä tilassa tai liuoksessa.

Konjugaattien, jotka ovat esitetyt edellä tarkastelluissa dokumenteissa, yhteydessä tämän keksinnön mukaisille reagensseille/konjugaateille on tunnusomaista se, 10 mitä patenttivaatimuksissa 1, 4 tai 8 esitetään.

Ensiksi, kuten on hyvin dokumentoitu tässä annetuilla sovellusesimerkeillä (katso alempana), tämän keksinnön veteenliukenevien reagenssien ja konjugaattien on todettu omaavan odottamattoman ja epätavallisen suuren 15 stabiilisuuden/käyttöajan vesiliuoksessa keskinkertaisilla (ei-äärimmäisillä) pH-arvoilla, ei vain alhaisissa lämpötiloissa vaan myös lämpötiloissa, jotka ovat hieman normaalin ympäristön lämpötilan yläpuolella. Erityisen huomattavaa on, että tämä on totta: 20 (i) keksinnön veteenliukenevilla reagensseilla, joilla ei ole molekyylihiukkasia [kuten tässä on määritelty; (katso alempana)] niihin liittyneinä, so. keksinnön reagensseilla, jotka käsittävät veteenliukenevan polymeerisen kantajamolekyylin, johon on liittynyt kovalenttises- ; * 25 ti useampi kuin yksi ryhmä tai osa, joka on johdettu divi- • nyylisulfonista, joista kunkin yksi pää on liittynyt kan- . tajamolekyyliin kovalenttisen sidoksen kautta, joka muo dostuu yhden divinyylisulfonin kahdesta vinyyliryhmästä ja . . reaktiivisen funktionaalisuuden välillä, joka on läsnä » I.’,' 30 kantajamolekyylillä, ja joiden toinen pää jää vapaaksi, ;·’ "riippuvaksi" vinyyliryhmäksi, joka pystyy peräkkäisiin reaktiohin sopivan molekyylihiukkasen kanssa, jossa on sopiva reaktiivinen funktionaalinen ryhmä; ja (ii) keksinnön veteenliukenevilla konjugaateilla, , 35 jotka käsittävät veteenliukenevan polymeerisen kantajamolekyy- 115413 17

Iin, johon on kovalenttisesti liittynyt sidosryhmien kautta, jotka ovat johdetut divinyylisulfonista, yksi tai useampi molekyylihiukkanen, polymeeriseen kantajamolekyy-liin on lisäksi kovalenttisesti liittynyt yksi tai useampi 5 divinyylisulfonista johdettu ryhmä, joilla on vapaa, reaktiivinen vinyyliryhmä.

Kuten näissä sovellusesimerkeissä on dokumentoitu, nämä keksijät ovat havainneet, että vapaiden vinyyliryh-mien, jotka ovat läsnä keksinnön jälkimmäisen tyyppisissä 10 veteenliukenevissa reagensseissa ja konjugaateissa, luonnollinen reaktiivisuus vähenee pH-arvoilla, jotka ovat lähellä neutraalia, kun taas nämä ryhmät osoittavat erittäin suurta reaktiivisuutta emäksisissä pH-arvoissa, esim. pH-alueella noin 9-11.

15 Lisäksi näiden keksijöiden saamat alustavat tulok set osoittavat myös, että keksinnön veteeniiukenevat kon-jugaatit, jotka ovat oleellisesti "tyydyttyneitä" lisämo-lekyylihiukkasen kovalenttisen liittymisen mahdollisuuden suhteen (so. keksinnön mukaisten konjugaattien, joissa 20 molekyylihiukkaset ovat kovalenttisesti liittyneet polymeeriseen kantajamolekyyliin sidosryhmien kautta, jotka johdetaan divinyylisulfonista, mutta joilta olleellisesti | puuttuu divinyylisulfonista johdetut ryhmät, joissa on * · vapaita reaktiivisia vinyyliryhmiä), omaavat myös saman-,··, 25 laisen suuren stabiilisuuden/käyttöajan vesiliuoksessa keskimääräisillä pH-arvoilla.

Edellä kuvattu pitkäaikainen stabiilisuus, joka osoitetaan tämän keksinnön reagensseilla ja konjugaateil-la, mahdollistaa siten, kuten on jo osoitettu (katso ylem-30 pänä), tällaisten reagenssien tai konjugaattien markki- noinnin esi-valmistetussa muodossa, esim. pakkauksen ποιοι dossa, joka saattaa sisältää (silloin kun se on relevant tia) ohjeet ja mahdollisesti täydentäviä kemiallisia rea-gensseja sopivien kemiallisten lisämenetelmien suorittami-35 seksi; ostaja voi siten (i) liittää peräkkäin halutut mo- 115413 18 lekyylihiukkaset esi-valmistettuihin, kemiallisesti reaktiivisiin keksinnön reagensseihin tai konjugaatteihin, jolloin valmistetaan esimerkiksi analyysireagensseja tai -konjugaatteja, jotka räätälöidään spesifisten vaatimusten 5 mukaisiksi, tai (ii) esi-valmistettujen, "tyydyttyneiden" keksinnön mukaisten konjugaattien (katso ylempänä) tapauksessa, käyttää keksinnön mukaista esi-valmistettua konju-gaattia suoraan relevantissa detektiossa tai analyysimenetelmässä.

10 Toiseksi, kuten on ilmeistä tässä tarjotuista so vellusesimerkeistä (katso alempana), polymeerisen kantaja-molekyylin koon yhteydessä tämän keksinnön mukaiset rea-genssit ja konjugaatit, nimenomaan edullisimmat keksinnön reagenssit ja konjugaatit, joissa polymeerinen kantajamo-15 lekyyli on dekstraani, ovat kykeneviä korkean molekyyli-hiukkasten kuormitusasteeseen pysyen samaan aikaan veteen-liukenevana. Lisäksi, ottaen huomioon suhteellisen keskinkertainen reaktiivisten ryhmien (so. reaktiivisten ryhmien, jotka on johdettu divinyylisulfonista, ja joiden 20 kautta molekyylihiukkasten kovalenttinen liittäminen tapahtuu) pitoisuuden välituote reagenssien, joita käytetään näissä kyseisissä sovellusesimerkeissä, polymeerisillä : kantajamolekyyleillä, ja kun tunnetaan tosiasia, että tun- , tuvasti suuremmat reaktiivisten ryhmien pitoisuudet ovat, 25 kuten on hyvin dokumentoitu tässä muissa sovellusesimerkeissä, saavutettavissa, on otettu huomioon, että huomat-’ tavasti suuremmat kuormitustasot molekyylihiukkasilla ovat saavutettavissa, esimerkiksi sellaiset, että useiden tuhansien alhaisen moolimassan molekyylihiukkasten tai jopa ! 30 suunnilleen tuhannen suhteellisen suuren moolimassan mole- : kyylihiukkasen kovelenttinen liittäminen kantajamolekyyliä ; kohti on saavutettavissa riippuen tietenkin kyseisen mole- kyylihiukkasen eteerisestä massasta ja/tai moolimassasta, ja polymeerisen kantajamolekyylin koosta tai moolimas-: *·· 35 sasta.

115413 19

Kolmanneksi tämän keksinnön mukaan ei vain kantaja-molekyylien kuormitus suurella määrällä esimerkiksi hap-teenihiukkasia (kuten julkaisussa EP 0 135 071 A2) tai fluoreseiiniryhmillä (kuten julkaisuissa US 4 166 105 ja 5 US 4 169 137) ole mahdollista, vaan yhtä hyvin on mahdollista liittää suuri määrä antigeenien, vasta-aineiden, entsyymien, geenikoettimien, avidiinin tai muuntyyppisten molekyyliaineiden, jotka käyvät ilmeisiksi tästä selityksestä, molekyylejä. Erityisen huomattavaa on keksinnön 10 mukainen kyky liittää suuri määrä vasta-aineita veteenliu-kenevaan polymeeriseen kantajamolekyyliin, kuten on käytetty keksinnön yhteydessä; näille keksijöille tutun patentti- ja tieteellisen kirjallisuuden perusteella ja koskien veteenliukenevia reagensseja tai konjugaatteja, jotka 15 ovat tyypiltään relevantteja tämän keksinnön yhteydessä, näyttäisi, että on ollut joko teknisiä ennakkoluuloja useamman kuin yhden vasta-ainemolekyylin (tai parhaimmillaan useamman kuin muutaman vasta-ainemolekyylin) liittymisen saavuttamisessa kantajamolekyyliin käyttökelpoisuu-20 den tai toivottavuuden suhteen, tai ehkä yritykset saavuttaa tämä ovat yleisesti epäonnistuneet. Tämän keksinnön mukaisen konjugaatin, jossa on vasta-aine (jossa on suuri : määrä vasta-aineita ja suuri määrä sopivia merkki- tai * » ·*·. leimahiukkaisia), käyttö immunokemiallisessa analyysissä, -••t 25 kuten immunohistokemiallisessa tai ELISA-tyyppisessä ana- • lyysissä, lisää tällaisten analyysien reaktion nopeutta ja t

Il herkkyyttä (ja luultavasti tarkkuutta ja luotettavuutta).

·* * Uskotaan, että tämän keksinnön mukainen suuren määrän vas ta-ainemolekyy le jä (esim. noin 5, 10, 15, 20 tai enemmän) : 30 liittäminen polymeerikantajaan tai selkärankaan johtaa esimerkiksi: (a) suurentuneeseen tilastolliseen todennä- ,.,s: köisyyteen, että saadaan suuri määrä vasta-ainemolekyyle- .···. jä, joissa on oikea eteerinen konformaatio, tyydyttävää sitoutumista komplementaariseen immunologiseen komponent-: '· 35 tiin (kuten antigeeniin) varten, ja (b) suurentuneeseen 20 115413 sitoutumisvoimakkuuteen komplementaariseen immunologiseen komponenttiin.

Tässä voidaan myös mainita, että samanlaisia etuja uskotaan saatavan myös käytettäessä keksintöä esim. hybri-5 disaatiomenetelmissä (katso ylempänä) tällaisten menetelmien detektioherkkyyden ja luotettavuuden uskotaan olevan merkittävästi lisääntynyt käyttämällä sopivaa keksinnön mukaista konjugaattia, joka käsittää suuren määrän leima-hiukkaisia ja mahdollisesti suuren määrän koetinmolekyylejä.

10 Neljänneksi, ja yleisempänä näkökohtana, valmis tettaessa tämän keksinnön mukaisia konjugaatteja, jotka käsittävät kahden erityyppisiä liittyneitä molekyylihiuk-kasia, divinyylisulfonipohjainen liittokemia, jota käytetään keksinnön yhteydessä nimenomaan yhdistelmässä lyot-15 rooppisen suolan käytön näiden molekyylihiukkasten liittämisessä kanssa keksinnön mukaisella tavalla, tekee mahdolliseksi erittäin monet muunnelmat kahdentyyppisten molekyylihiukkasten, jotka ovat liittyneet polymeeriseen kanta jamolekyyliin, lukumäärissä ja/tai niiden välisissä suh-20 teissä: Kuten on edellä jo mainittu, kyky säädellä vapaiden vinyyliryhmien reaktiivisuutta keksinnön reagensseissa • · » : ·' tai konjugaateissa muuntelemalla pH:ta tekee mahdolliseksi • · *. ! saada aikaan haluttu polymeerisen kantajan kuormitustaso » » t (suhteessa käytettävissä olevaan määrään reaktiivisia vi-> : 25 nyyliryhmiä) yhdellä kyseisellä molekyylihiukkasella, min- :* kä jälkeen jäljelle jäävien, reagoimattomien vinyyliryhmi en luonnollinen reaktiivisuus voidaan tukahduttaa väliaineen pH:n säätelyllä; jos halutaan, "välituote" konjugaat-·, ti voidaan sitten altistaa yhdelle tai useammalle puhdis- 30 tusmenetelmälle, esim. kromatografisin keinoin, ennen kuin edetään liittämään kiinnostuksen kohteena olevaa toisen-tyyppistä molekyylihiukkasta. Näin ei ole vain mahdollista valmistaa hyvin karakterisoituja konjugaatteja, vaan on • ‘ myös mahdollista käyttää valmistusmenetelmän kontrollin , . 35 suurta astetta suoraviivaisella tavalla.

21 115413

Viidenneksi uskotaan, että keksinnön mukaiset kon-jugaatit, jotka pohjautuvat tietyntyyppisille polymeerisille kantajamolekyyleille, nimittäin polymeerisille kan-tajamolekyyleille, jotka ovat oleellisesti lineaarisia, 5 omaavat kudosrakenteen läpäisyominaisuuksia huolimatta suhteellisen suuresta kokonaismoolimassasta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle reagenssin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 14 esitetään, konjugaatin valmistamiseksi se, mitä 10 vaatimuksissa 15, 16 tai 18 esitetään ja niiden käytöille se, mitä vaatimuksissa 25 tai 26 esitetään.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Ensimmäisessä näkökohdassa tämä keksintö tarjoaa veteenliukenevan reagenssin, joka käsittää veteenliukene-15 van polymeerisen kantajamolekyylin, johon on kovalentti-sesti liittynyt useampi kuin yksi ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, joista ryhmistä kukin on liittynyt sidoksen kautta, joka muodostuu yhden divinyylisulfonimo-lekyylin kahdesta vinyyliryhmästä ja reaktiivisen funktio-20 naalisuuden polymeerisellä kantajamolekyylillä välille, vähintään yksi tällainen ryhmä on liittyneessä tilassaan, : ·' jossa on jäljelle jäävä vinyyliryhmä vapaana ja kyvykkäänä • t reaktioon molekyylihiukkasen kanssa, jossa on funktionaa-

IM

:,M! linen ryhmä, joka on reaktiivinen vapaalle vinyyliryhmälle.

25 Termiä "molekyylihiukkanen" ("molecular species") · käytetään tämän keksinnön yhteydessä merkitsemään esimer- ;*j*. kiksi: molekyylejä tai ionisia hiukkasia, jotka toimivat leimoina tai merkkeinä (kuten entsyymit, tai fluoresoivat tai luminisoivat hiukkaset); tai molekyylejä, jotka toimi-1,V 30 vat kohdehiukkasina, so. molekyylejä, jotka pystyvät si- ;·’ toutumaan selektiivisesti tai spesifisesti yhteen tai use- ampaan kohdemolekyyliin, ryhmään, reseptoriin tai epitoop-peihin (esimerkit tällaisista kohdehiukkasista ovat hap-teeneja tai hapteenikonjugaatteja, antigeenejä, vasta- *. , 35 aineita, nukleotidisekvenssejä ja hormoneja).

• > 115413 22

Johtuen keksinnön yhteydessä käytetyn liittämiske-mian luonteesta kokonaisuudessaan mukaan lukien keksinnön mukaiset menetelmät keksinnön reagenssien ja konjugaattien valmistamiseksi polymeerisellä kantajamolekyylillä, so. kova-5 lenttisesti sidottujen reaktiivisten ryhmien, jotka johdetaan divinyylisulfonista, aikaansaanti ja kovalenttisten sidosten aikaansaanti, toisaalta tällaisten ryhmien ja toisaalta molekyylihiukkasten, kuten tässä on määritelty, välille, vinyyliryhmien reaktiivisuuden tunnettu kuvio hiukkasis-10 sa, kuten divinyylisulfoni, vaatii yleensä, että reaktiivinen funktionaalisuus polymeerikantajalla, so. ryhmä, jonka kanssa divinyylisulfonin vinyyliryhmä reagoi, jolloin muodostuu kovalenttinen sidos, on nukleofiilinen ryhmä. Sopivia poly-meerikantajia ovat sitten esimerkiksi polymeerikantajat, jois-15 sa on funktionaalisia ryhmiä, kuten: -0' (esim. deprotonoi-dut fenolihydroksiryhmät, kuten deprotonoidut aromaattiset hydro ksiryhmät polypeptidien tai proteiinien tyrosiinitähteissä), -S” (esim. deprotonoidut tioliryhmät aromaattisissa renkaissa tai alifaattiset ryhmät, kuten deprotonoidut tioliryhmät 20 polypeptidien tai proteiinien kysteiinitähteissä), -OH (esim. alifaattiset hydroksiryhmät sokerirenkaissa, kuten glukoosi ·' ·’ tai muut monosakkaridirenkaat oligo- tai polysakkarideissa; *.' ! tai alkoholihydroksiryhmät polyoleissa, kuten polyetyleeni-

t · I

glykoleissa; tai hydro ksiryhmät tietyissä polypeptidien tai : : 25 proteiinien aminohappotähteissä, kuten seriini- tai treonii- ·;· nitähteissä), -SH (esim. tioliryhmät polypeptidien tai pro- ;'j'. teiinien kysteiinitähteissä), primaariset aminoryhmät (esim.

polypeptidien tai proteiinien lysiini- tai ornitiinitähteis-; sä; tai aminosubstituoiduissa sokerirenkaissa tietyissä po- 30 lysakkarideissa tai niiden johdannaisissa, kuten kitosaanis- • » *;* sa) tai sekundaariset aminoryhmät (esim. polypeptidien tai J proteiinien histidiinitähteet). Samanlaisten syiden vuoksi kyseinen funktionaalinen ryhmä molekyylihiukkasella keksin-nön yhteydessä on myös normaalisti nukleofiilinen ryhmä, ku- » »· , 35 ten yksi edellä kuvatun tyyppinen nukleofiilinen ryhmä.

• » » • » »

» I

23 1 1 541 3

Veteenliukenevat polymeerit, jotka toimivat kanta-jamolekyyleinä keksinnön reagensseissa ja konjugaateissa, voidaan valita lukuisista polymeerien tyypeistä, mukaan lukien: 5 luonnolliset ja synteettiset polysakkaridit, samoin kuin niiden johdannaiset, esimerkiksi dekstraanit ja deks-traanijohdannaiset, tärkkelykset ja tärkkelysjohdannaiset, selluloosajohdannaiset, amyloosi ja pektiini, samoin kuin tietyt luonnolliset kumit ja niiden johdannaiset, kuten 10 arabikumi ja algiinihapon suolat; homopoly(aminohapot) , joissa on sopivia reaktiivisia funktionaalisia ryhmiä, kuten polylysiinit, polyhisti-diinit tai polyornitiinit; luonnolliset ja synteettiset polypeptidit ja pro-15 teiinit, kuten naudan albumiini ja muut nisäkäsalbumiinit; ja synteettiset polymeerit, joissa on nukleofiilisia funktionaalisia ryhmiä, kuten polyvinyylialkoholit, poly-allyylialkoholi, polyetyleeniglykolit ja substituoidut 20 polyakrylaatit.

Erittäin sopivia polymeerejä keksinnön tarkoituksiin • · ovat polysakkaridit ja niiden johdannaiset, esimerkiksi: • « .*: dekstraanit, karboksimetyylidekstraanit, hydroksietyyli- • · 4 ,,,! ja hydroksipropyylitärkkelykset, glykogeeni, agaroosijoh- : 25 dannaiset, ja hydroksietyyli- ja hydroksipropyylisellu- ·;· loosat. Kuten on ilmeistä tässä olevista sovellusesimer- • Ui . '1 keistä (katso alempana), nimenomaan dekstraanit ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi polymeereiksi keksinnön ; . yhteydessä, ja ne ovat tällä hetkellä edullisimpia poly- I i · 30 meereja.

Kuten on jo mainittu, on usein toivottavaa, erityi-sesti monia keksinnön reagenssien ja konjugaattien immuno-kemiallisia sovelluksia varten, että nimenomaan keksinnön konjugaatilla, mukaan lukien keksinnön konjugaatit, jotka . 35 valmistetaan (menetelmällä, joka myös muodostaa keksinnön 24 1 1 541 3 näkökohdan) keksinnön reagensseista, ei ole nettovarausta, koska nettopositiivisen tai -negatiivisen varauksen läsnäolo tällaisissa tapauksissa voi johtaa, muun muassa, ei-toivottuun ei-spesifiseen konjugaattien sitoutumiseen ai-5 neisiin ja/tai materiaaleihin, jotka ovat muita kuin kiinnostuksen kohteina olevia. Monissa tapauksissa tämä ehto, ellei varauksellisia molekyylihiukkaisia viedä, täyttyy yksinkertaisesti varmistamalla, että polymeerikantaja itsessään ei omaa nettovarausta; siten, keksinnön lisänäkö-10 kohdassa, keksinnön reagenssin tai konjugaatin polymeerinen kantajamolekyyli on, vapaassa tilassaan, oleellisesti lineaarinen ja oleellisesti varaukseton pH-arvossa alueella noin 4-10, jälkimmäisen pH-välin ollessa käytännössä relevantti väli immunokemiallisten menetelmien, hybridi-15 saatiomenetelmien ja muiden, nimenomaan keksinnön konjugaattien sovellusten suunnatonta pääosaa varten. Erilaisten polymeerien joukossa, jotka täyttävät kriteerit, ovat esimerkiksi lukuisat polysakkaridit ja polysakkaridijohdannaiset, esim. dekstraanit ja hydroksietyyli- ja hydrok-20 sipropyyliselluloosat.

Riippuen käytöstä, johon keksinnön reagenssi tai ; konjugaatti laitetaan, keksinnön reagenssit ja konjugaa- : tit voivat pohjautua veteenliukeneviin polymeerikanta- jiin, joiden moolimassat vaihtelevat melko alhaisesta eri-_ 25 ttäin suuriin ja keksinnön lisänäkökohdassa polymeerikan- tajalla voi olla piikin moolimassa alueella noin 1 000 -40 000 000. Piikin moolimassat, jotka ovat melko kiinnos-tavia ja joita havainnollistetaan tässä annetuissa sovellusesimerkeissä, ovat piikin moolimassoja alueella noin i 30 1 000 - 80 000, ja alueella noin 80 000 - 2 000 000. Eri- * tyisen kiinnostava piikin moolimassa nimenomaan tapaukses- ,,, ; sa, jossa dekstraanit ovat polymeerikantajia, on piikin .. moolimassa noin 500 000.

‘I’ Termi "piikin moolimassa" (jota merkitään myös • 35 "piikin keskimääräinen moolimassa"), kuten tässä selityk- 115413 25 sessä ja patenttivaatimuksissa polymeerikantajien yhteydessä on käytetty, merkitsee suurimman runsauden moolimassaa, so. sitä moolimassaa (moolimassojen jakautuman joukossa), joka omaa suurin lukumäärä molekyylejä annetussa 5 näytteessä tai polymeerierässä. On melko normaalia karakterisoida lukuisan tyyppisiä polymeerejä tällä tavalla johtuen erittäin kapeiden moolimassajakauman polymeeri-fraktioiden saamisen tai valmistamisen vaikeudesta (erityisesti suurimmille moolimassoille). Lukuisten kaupalli-10 sesti saatavien polymeerien, jotka ovat kiinnostavia keksinnön yhteydessä, esimerkiksi dekstraanien tapauksessa valmistaja tai toimittaja voi tarjota luotettavaa piikin moolimassatietoa (määritetty esimerkiksi geelipermeaatio-kromatografiällä), joka voi tarjota perustan tietyntyyppi-15 sen reagenssin tai konjugaatin valmistukseen sopivan poly-meerifraktion valitsemiseksi. Tässä on mainittava, että piikin moolimassa-arvot, joihin viitataan tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa, viittaavat kyseisen vapaan polymeerin piikin moolimassaan, eivätkä ne ota huomioon 20 esimerkiksi mahdollista verkkorakenteisten polymeeriyksi-köiden muodostumista, esim. kahden tai useamman polymeeri-: molekyylin verkkoutuksen tuloksena reaktiolla divinyyli- • sulfonin kanssa keksinnön mukaisen menetelmän ajan keksin nön reagenssin tai konjugaatin valmistamiseksi; tällaisil-25 la verkkouttajayksiköillä on keskimäärin suuremmat mooli-. massat kuin yksittäisillä vapailla polymeerimolekyyleillä, .! joista ne muodostuvat.

Tämän keksinnön mukaiset reagenssit voidaan selvästi räätälöidä vastaamaan erittäin laajan alueen vaatimuk-M : 30 siä polymeerin piikin moolimassan ja vapaiden, reaktiivis- ten vinyyliryhmien pitoisuuden suhteen. Keksinnön lisänä- * : kökohta koskee reagensseja, jotka pohjautuvat polymeeri- .*· . seen kantajaan, jolla on piikin moolimassa noin 500 000 • · [· tai noin 2 000 000, tai jolla on piikin moolimassa millä » » ί “ 35 tahansa seuraavilla alueilla: » · * S ! fr 115413 26 noin 1 000 - noin 20 000; noin 20 000 - noin 80 000; noin 80 000 - noin 500 000; noin 500 000 - noin 5 000 000; tai noin 5 000 000 - noin 40 000 000; ja jolla on vapaiden, reaktiivisten vinyyliryhmien 5 pitoisuus alueella noin 1 - 5 000 μπιοί vinyyliryhmiä grammaa polymeerikantajaa kohti, kuten missä tahansa seuraa-vista ala-alueista (ilmaistu pmolrina vinyyliryhmää grammaa polymeerikantaj aa kohti); noin 1 - noin 50; noin 50 - noin 300; noin 300 -10 noin 1 000; tai noin 1 000 - noin 5 000;

Kuten aikaisemmin on mainittu, molekyylihiukkaset tämän keksinnön yhteydessä, so. molekyylihiukkaset, jotka liitetään keksinnön mukaiseen reagenssiin tai konjugaat-tiin, tai jotka on jo liitetty keksinnön konjugaatin poly-15 meerikantajaan, löytyvät lukuisten erityyppisten aineiden joukosta, esimerkkeinä: proteiinit, kuten ferritiini, fykoerytriinit, fyko-syaniinit tai fykobiliinit; entsyymit, kuten piparjuuri-peroksidaasi, alkalinen fosfataasi, glukoosioksidaasit, 20 galaktosidaasit tai ureaasit; toksiinit; lääkkeet; väriaineet; fluoresoivat, luminisoivat, fosforisoivat tai muut valoa emittoivat aineet; metallia kelatoivat aineet, ku- ' j ten iminodietikkahappo, etyleenidiamiinitetraetikkahappo * · (EDTA), dietyleenitriamiinipentaetikkahappo (DTPA) tai 25 desferrioksamiini B; aineet, jotka on leimattu radioaktiivisella isotoopilla; tai aineet, jotka on leimattu raskas-atomilla.

Aikaisemman keskustelun valossa edellä on selvää, että pääosa aineiden tyypeistä näiden jälkimmäisten esi-i 30 merkkien joukossa pystyy toimimaan leimoina tai merkkeinä keksinnön mukaisissa konjugaateissa. Lisäesimerkkeinä an-: netaan fluoresoivat aineet voidaan valita esim. fluore- seiinista (sopivasti fluoreseiini-isotiosyanaatti, F1TC), fluoreseiiniamiinista, 1-naftolista, 2-naftolista, eosii-35 nista, erytrosiinista, moriinista, o-fenyleenidiamiinista, 115413 27 rhodamiinista ja 8-anilino-l-naftaleenisulfonihaposta. Relevantit radioaktiiviset isotoopit voidaan valita esimerkiksi vedyn (so. tritiumista, 3H), hiilen (kuten 14C), fosforin (kuten 32P), rikin (kuten S1), jodin (kuten 131I), 5 vismutin (kuten 212Bi), yttriumin (kuten 90Y), teknetiumin (kuten "“Te), palladiumin (kuten 109Pd) ja samariumin isotooppien joukosta (kuten 153Sm). Relevantit raskasatomit voidaan valita esimerkiksi joukosta, jonka muodostavat Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, In, Ag, Au, Hg, I, Bi, Y, La, Ce, 10 Eu ja Gd. Kulta (Au) [mahdollisesti yhdistelmässä hopean (Ag) kanssa korostusreagenssina (katso ylempänä)] on erityisen käyttökelpoinen raskasatomi monissa tapauksissa.

Keksinnön lisänäkökohdissa molekyylihiukkaset tämän keksinnön yhteydessä voivat olla myös kohdehiukkasia [ku-15 ten aikaisemmin on määritelty (katso ylempänä)], jotka pystyvät selektiiviseen sitoutumiseen tai selektiiviseen reaktioon, komplementaariseen molekyyliin tai biologista alkuperää olevan aineen komplementaariseen rakennealuee-seen. Esimerkkejä relevanteista kohdehiukkasista ovat esi-20 merkiksi: antigeenit; hapteenit; monoklonaaliset tai poly-klonaaliset vasta-aineet; geenikoettimet; luonnolliset tai synteettiset oligo- tai polynukleotidit; tietyt luonnolli- j set tai synteettiset mono-, oligo- tai polysakkaridit; 1 · lektiinit; avidiini tai streptavidiini; biotiini; kasvute-25 kijät; hormonit; reseptorimolekyylit; tai proteiini A tai proteiini G. Esimerkeille sopivista vasta-aineista tehdään viittaus tässä annettuihin sovellusesimerkkeihin. Esimer- » · ’ ‘ kit relevanteista hormoneista voidaan valita steroidi-hor moneista (esim. estrogeenista, progesteronista tai korti-: i 30 sonista), aminohappo-hormoneista (esim. tyroksiinista) ja peptidi- ja proteiinihormoneista (esim. vasopressiinistä, ,.: bombesiinista, gastriinista tai insuliinista).

•^ Kuten on jo tehty selväksi, tämä keksintö koskee myös veteeniiukenevaa konjugaattia, joka käsittää veteen- liukenevan polymeerisen kantajamolekyylin, johon on liit- 115413 28 tynyt yksi tai useampi molekyylihiukkanen, kukin sidosryhmän kautta, joka on johdettu divinyylisulionista, kunkin sidosryhmän liittäminen polymeeriseen kantajamolekyyliin ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut 5 yhden divinyylisulfonimolekyylin kahdesta vinyyliryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän kantajamolekyylillä välille, ja molekyylihiukkasen liittämisen sidosryhmään ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut toisen vinyyliryhmän, joka on alunperin divinyylisulfoni-10 molekyylistä, ja funktionaalisen ryhmän molekyylihiukka-sella välille.

Erityisesti jälkimmäisen tyyppisissä keksinnön mukaisissa kiinnostavissa konjugaateissa polymeeriseen kantajamolekyyliin on lisäksi liittynyt kovalenttisesti yksi 15 tai useampi ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, kukin näistä ryhmistä on liittynyt kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut yhden divinyylisulfonimolekyylin kahdesta vinyyliryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän polymeerisellä kantajamolekyylillä välille, vä-20 hintään yhdellä tällaisella mainitulla ryhmällä liittyneessä tilassaan on jäljelle jäävä vinyyliryhmä vapaana ja kykenevänä reaktioon lisämolekyylihiukkasen kanssa, jossa I* : on funktionaalinen ryhmä, joka on reaktiivinen vapaata • % ,· ·, vinyyliryhmää kohti.

25 Liittyneet molekyylihiukkaset yhdessä jälkimmäisen "tyyppisessä konjugaatissa tai keksinnön mukaisissa muissa tyypeissä (katso alempana) voivat sopivasti olla jaetut, » esimerkiksi molekyylihiukkaset, joiden moolimassat ovat noin 2 000 tai alle, ja molekyylihiukkaset, joiden mooli- * 30 massat ovat noin 2 000 tai yli. Edellisessä tapauksessa konjugaatin polymeerisellä kantajamolekyylillä voi olla ; 1 - noin 10 000 molekyylihiukkasta liittyneenä siihen, * esimerkiksi noin 10-1 000 molekyylihiukkasta, kuten noin 20 - 500 molekyylihiukkasta kovalenttisesti liittyneenä 35 siihen. Jälkimmäisessä tapauksessa, so. molekyylihiukka- 29 1 1 54 1 3 sille, joiden moolimassa on noin 2 000 tai yli, konjugaa-tin polymeerisellä kantajamolekyylillä voi olla 1 - noin 1 000 molekyylihiukkasta kovalenttisesti liittyneenä siihen, esimerkiksi 1 - noin 500 molekyylihiukkasta, kuten 5 1 - noin 100, 2 - noin 50, tai noin 10 - noin 50 molekyy lihiukkasta kovalenttisesti liittyneenä siihen.

Lisänäkökohdassa keksinnön mukaiset tämäntyyppiset konjugaatit voivat perustua polymeerikantajalle, jonka piikin moolimassa on noin 500 000 tai noin 2 000 000, tai 10 jonka piikin moolimassa on millä tahansa seuraavista alueista: noin 1 000 - noin 20 000; noin 20 000 - noin 80 000; noin 80 000 - noin 500 000; noin 500 00 - noin 5 000 000; tai noin 5 000 000 - noin 40 000 000; 15 ja jonka molekyylihiukkasten kokonaispitoisuuden summa ja, silloin kuin relevanttia, vapaat vinyyliryhmät alueella noin 1 - 5 000 ymol molekyylihiukkasta plus, silloin kuin relevanttia, pmol vinyyliryhmiä grammaa polymee-rikantajaa kohti, kuten missä tahansa seuraavista ala-20 alueista (ilmaistu pmol:ina molekyylihiukkasia plus, silloin kuin relevanttia, pmol vinyyliryhmää grammaa polymee-: rikantaj aa kohti): I noin 1 - noin 50; noin 50 - noin 300; noin 300 - noin 1 000; tai noin 1 000 - noin 5 000; , , 25 Lisäksi molekyylihiukkasilla, kuten on määritelty keksinnön yhteydessä, voi olla mitä tahansa ominaispiirteitä, jotka on aikaisemmin edellä mainittu molekyylihiuk-* ' kasten yhteydessä.

Vielä yksi keksinnön näkökohta koskee veteenliuke-! i 30 nevaa konjugaattia, joka käsittää veteeniiukenevan poly-: meerisen kantajamolekyylin, johon on liittynyt kovalentti sesti kaksi tai useampi molekyylihiukkanen, joista vähintään yksi on erilainen kuin muut, kukin molekyylihiukkanen on liittynyt sidosryhmän kautta, joka on johdettu divinyy-35 lisulfonista, kunkin sidosryhmän liittämisen polymeeriseen 115413 30 kantajamolekyyliin ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut yhden kahdesta divinyylisulfonimole-kyylin vinyyliryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän mainitulla kantajamolekyylillä välille, ja molekyy-5 lihiukkasen liittämisen sidosryhmään ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka muodostuu muun vinyyliryhmän, joka on alunperin divinyylisulfonimolekyylistä, ja funktionaalisen ryhmän molekyylihiukkasella välille.

Tämän jälkimmäisen tyyppiset keksinnön mukaiset 10 konjugaatit voivat perustua polymeerikantajalle, jonka piikin moolimassa on noin 500 000 tai noin 2 000 000, tai jonka piikin moolimassa on millä tahansa seuraavista alueista: noin 1 000 - noin 20 000; noin 20 000 - noin 15 80 000; noin 80 000 - noin 500 000; noin 500 00 - noin 5 000 000; tai noin 5 000 000 - noin 40 000 000; ja jolla on kovalenttisesti sitoutuneiden molekyy-lihiukkasten kokonaispitoisuus alueella noin 1-5 000 μπιοί molekyylihiukkasta grammaa polymeerikantajaa kohti, 20 kuten missä tahansa seuraavista ala-alueista (ilmaistu pmol:ina molekyylihiukkasia grammaa polymeerikantajaa kohti): noin 1 - noin 50; noin 50 - noin 300; noin 300 - . noin 1 000; tai noin 1 000 - noin 5 000; , 25 Kuten on jo mainittu, keksintö koskee myös keksin nön mukaisen reagenssin tai konjugaatin valmistusmenetelmiä: siten yhdessä tällaisessa näkökohdassa keksintö tarjoaa menetelmän keksinnön mukaisen veteeniiukenevan reagenssin valmistamiseksi, so. veteeniiukenevan reagenssin, : 30 joka käsittää veteeniiukenevan polymeerisen kantajamole- ,· kyylin, johon on kovalenttisesti liittynyt yksi tai useam pi ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, joista ryhmistä kukin on liittynyt sidoksen kautta, joka on muo- t dostunut yhden kahdesta divinyylisulfonimolekyylin vinyy-35 liryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän polymee- 115413 31 risella kantajamolekyylillä välille, vähintään yhdellä tällaisella ryhmällä sitoutuneessa tilassaan on jäljelle jäävä vinyyliryhmä vapaana ja kykenevänä reaktioon mole-kyylihiukkasten kanssa, jossa on funktionaalinen ryhmä, 5 joka on reaktiivinen vapaata vinyyliryhmää kohti.

Kyseinen keksinnön mukainen menetelmä käsittää veteeni iukenevan polymeerikantajan sallimisen reagoida divi-nyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5. Yleisimmässä muodossaan reaktio voi tapahtua lämpötilassa 10 alueella 0-60 °C, vaikka lämpötila alueella 20 - 25 °C on usein aivan sopiva, kuten on havainnollistettu, esimerkiksi polymeerikantajille, kuten dekstraaneille ja tietyille polysakkaridijohdannaisille, tässä annetuissa sovellusesimerkeissä. pH, jossa reaktio yleensä tapahtuu, on 15 yleensä alueella noin 10 - 11,5, mikä on pH-alue, jossa divinyylisulfoni on erityisen reaktiivinen reaktiivisia funktionaalisia ryhmiä kohtaan useimman tyyppisillä polymeer ikanta j il la.

Mitä tulee polymeerikantajan pitoisuuteen vesi-20 liuoksessa, se on yleensä alueella 0,1 - 20 % paino/tila-vuus, ja usein alueella 1 - 10 % paino/tilavuus. Divinyy-lisulfonin pitoisuus vesiliuoksessa on yleensä alueella I 0,1 - 15 % tilavuus/tilavuus, ja usein alueella 1 - 10 % tilavuus/tilavuus.

1 , 25 On vaikeaa antaa yleisiä ohjeita koskien ajanjak- ^ soa, jonka divinyylisulfonin reaktion polymeerikantajän '!/. kanssa vesiliuoksessa tulisi antaa jatkua, koska nämä ‘ * vaihtelevat melko huomattavasti, riippuen esim. lämpöti lasta ja pH:sta, jossa reaktio tapahtuu, polymeerikantajän : 30 ja divinyylisulfonin pitoisuudesta reaktioseoksessa, poly- meerikantajan luonteesta ja/tai moolimassasta, ja laajuudesta, johon polymeerikantajan verkkoutuminen (reaktiolla divinyylisulfonin kanssa) voi edetä ennen kuin tulee esimerkiksi geeliytymisen tai saostumisen tapahtumisen riski; '* 35 kuten tässä olevissa sovellusesimerkeissä dekstraanien * · 115413 32 tapauksessa on selvästi havainnollistettu, reaktioaika voi olla tärkeä tekijä ainakin joillekin polymeerikantajien luokille. Kyseinen reaktioaika on kuitenkin normaalisti alueella 5 - 120 minuuttia.

5 Kuten on jo mainittu, keksintö tarjoaa myös valmis tusmenetelmän keksinnön mukaiselle veteeniiukenevalle kon-jugaatille, joka pohjautuu veteeniiukenevaan polymeeriseen kantajamolekyyliin, johon on sitoutunut yksi tai useampi molekyylihiukkanen, joista kukin sidosryhmän kautta, joka 10 on johdettu divinyylisulfonista, kunkin sidosryhmän sitoutumisen polymeeriseen kantajamolekyyliin ollessa kovalent-tisen sidoksen kautta, joka on muodostunut yhden kahdesta divinyylisulfonimolekyylin vinyyliryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän polymeerisellä kantajamolekyylillä 15 välille, ja molekyylihiukkasen sitoutumisen sidosryhmään ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut toisen vinyyliryhmän, joka on alunperin divinyylisulfoni-molekyylistä, ja funktionaalisen ryhmän molekyylihiukka-sella välille; samaa menetelmää käytetään myös sellaisten 20 konjugaattien valmistukseen, jossa polymeeriseen kantaja-molekyyliin on kovalenttisesti sitoutunut lisäksi yksi tai useampi reaktiivinen ryhmä, joka on johdettu divinyylisul-,· ionista. Vähintään yhdellä tällaisella ryhmällä sitoutu- ’. neessa tilassaan on jäljelle jäävä vinyyliryhmä vapaana ja ,·. 25 kykenevänä reaktioon molekyylihiukkasten kanssa, jossa on funktionaalinen ryhmä, joka on reaktiivinen vapaata vinyy-! liryhmää kohti.

‘ Kyseinen menetelmä käsittää: veteeniiukenevan polymeerikantajan sallimisen rea-: : 30 goida divinyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5, niin että muodostuu vesiliuos, joka sisältää ve-.: teeniiukenevaa välituotereagenssia, joka käsittää veteen- ··. liukenevan polymeerikanta jän molekyylejä, joihin on kova- • lenttisesti sitoutunut yksi tai useampi reaktiivinen ryh- “ 35 mä, joka johdetaan divinyylisulfonista, > · 115413 33 mahdollisesti veteeniiukenevan välituotereagenssin altistamisen puhdistusvaiheelle, ja mahdollisesti puhdistetun veteeni iukenevan välituotereagenssin sallimisen reagoida reaktiivisten ryhmiensä 5 kautta molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5.

Mahdollinen puhdistusvaihe voi sisältää esimerkiksi menetelmän, kuten dialyysin (ei-toivottujen suolojen tai muiden alhaisen moolimassan hiukkasten poistamiseksi) tai 10 geelikromatografian. pH- ja lämpötilaolosuhteet ja poly-meerikantajan ja divinyylisulfonin pitoisuudet polymeeri-kantajan reaktion divinyylisulfonin kanssa aikana ovat yleensä, kuten on aikaisemmin kuvattu keksinnön veteenliu-kenevien reagenssien valmistuksen yhteydessä, ja kommen-15 tit, jotka tehtiin koskien reaktioaikaa, ovat relevantteja myös tässä.

Koskien veteeniiukenevan välituotereagenssin reaktiota molekyylihiukkasen kanssa menetelmän loppuvaiheessa, lämpötila reaktion aikana on yleensä alueella 0-60 °C, 20 ja usein alueella 20 - 25 °C. Molekyylihiukkasten pitoisuus vesipitoisessa reaktioväliaineessa on yleensä alueel-·*: la 0,1 - 20 % tilavuus/tilavuus, ja liuoksen pH on yleensä ,· alueella noin 8-12.

Erityisesti kiinnostavassa keksinnön jälkimmäisen . 25 menetelmän näkökohdassa vesiliuos, jossa molekyylihiukka- nen reagoi mahdollisesti puhdistetun veteenliukenevan välituotereagenssin kanssa, sisältää lyotrooppista suolaa, so. suolaa, jolla on esim. tietyntyyppisten suuren moolimassan hiukkasten, erityisesti proteiinien, saostumisen ' : 30 edistämisen ominaisuus ("suoloitus") vesiliuoksesta. Täl- laisen lyotrooppisen suolan sisällyttämisen vaikuttavuus .: (osoitettu tässä sovellusesimerkeissä) molekyylihiukkasten ·. sitoutumisen reaktiivisiin vinyyliryhmiin, jotka ovat läs- • > nä veteeniiukenevassa välituotereagenssissa, joka muodos- 115413 34 tui keksinnön menetelmän aikana, lisäämiseen on mahdollista johtaa edellä mainitusta "suoloitus"-vaikutuksesta.

Sopivat lyotrooppiset suolat voidaan valita litiumin, natriumin, kaliumin ja ammoniumin sulfaateista, fos-5 faateista, sitraateista ja tartraateista, ja lyotrooppiset suolat ovat yleensä läsnä pitoisuudessa, joka vastaa ioni-vahvuutta vähintään 0,01, esimerkiksi pitoisuus, joka vastaa ionivahvuutta vähintään 0,3. Sopiva pitoisuus on usein pitoisuus, joka vastaa ionivahvuutta alueella 0,5 - 5.

10 Kuten edellä on jo mainittu, lyotrooppisten suolo jen vaikutus keksinnön menetelmiin on erityisen huomattava molekyylihiukkasten, jotka ovat proteiineja tai polypeptide j ä, tapauksessa.

On ilmeistä, että keksinnön reagenssit vastaavat 15 koostumuksessa veteenliukenevia välituotereagensseja, jotka ovat muodostuneet jälkimmäisen menetelmän kuluessa; siten vielä yksi keksinnön näkökohta koskee menetelmää samantyyppisen veteeniiukenevan konjugaatin valmistamiseksi kuin edellisessä menetelmässä, menetelmä käsittää kek-20 sinnön mukaisen veteeniiukenevan reagenssin sallimisen reagoida molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-ar-vossa yli 5. Sisältyvien molekyylihiukkasten luonne ja j menetelmässä käytetyt olosuhteet (mukaan lukien lyotroop- pisten suolojen vaikutuksen) ovat yleensä kuten edellä on » , 25 jo kuvattu.

! Vielä yksi keksinnön lisänäkökohta koskee menetel mää keksinnön mukaisen veteenliukenevan konjugaatin val- * ’ mistamiseksi, joka konjugaatti käsittää veteenliukenevan polymeerisen kantajamolekyylin, johon on kovalenttisesti 30 sitoutunut kaksi tai useampi molekyylihiukkanen, joista ainakin yksi on erilainen kuin toinen (muut), kunkin mole-.kyylihiukkasen ollessa sitoutunut sidosryhmän kautta, joka • johdetaan divinyylisulfonista, kunkin sidosryhmän sitoutu- Γ misen polymeeriseen kantajamolekyyliin ollessa kovalentti- 35 sen sidoksen kautta, joka on muodostunut yhden kahdesta 115413 35 divinyylisulfonimolekyylin vinyyli ryhmästä ja reaktiivisen funktionaalisen ryhmän kantajamolekyylillä välille ja mo-lekyylihiukkasen sitoutumisen mainittuun sidosryhmään ollessa kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut 5 toisen vinyyliryhmän, joka on alunperin divinyylisulfoni-molekyylistä, ja funktionaalisen ryhmän mainitulla mole-kyylihiukkasella välille.

Kyseinen menetelmä käsittää: (i) veteeniiukenevan polymeerikantajan sallimisen 10 reagoida divinyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH-arvos- sa yli 5, niin että muodostuu vesiliuos, joka sisältää veteeniiukenevaa välituotereagenssia, joka käsittää veteeni iukenevan polymeerikantajan molekyylejä, joihin on kovalenttisesti sitoutunut kaksi tai useampi reaktiivinen 15 ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, (ii) mahdollisesti veteeniiukenevan välituoterea-genssin altistamisen puhdistusvaiheelle, (iii) mahdollisesti puhdistetun veteeniiukenevan välituotereagenssin sallimisen reagoida reaktiivisten ryh- 20 miensä kautta molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5, niin että muodostuu veteeniiukeneva välituotekon j ugaatti olosuhteiden ollessa sellaiset, että • kaikki reaktiiviset ryhmät eivät reagoi molekyylihiukkas- . ten kanssa, . 25 (iv) mahdollisesti veteeni iukenevan välituotekonj u- gaatin altistamisen puhdistusvaiheelle, ja (v) mahdollisesti puhdistetun veteeniiukenevan vä-lituotekonjugaatin sallimisen reagoida aikaisemmin reagoimattomien reaktiivisten ryhmien kautta uusien molekyyli-: 30 hiukkasten kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5 uusien molekyylihiukkasten ollessa erilaisia kuin ne, jotka ovat jo liittyneet välituotekonjugaattiin.

Erilaisten komponenttien pitoisuudet, samoin kuin olosuhteet, jotka vallitsevat reaktiovaiheissa, ovat 35 yleensä kuten on jo kuvattu. Uusien molekyylihiukkasten 115413 36 pitoisuus ja muut olosuhteet, jotka liittyvät niiden reaktioon, ovat yleensä kuten molekyylihiukkasille. Kuten aikaisemmin, lyotrooppisen suolan mukaan lukeminen reaktio-väliaineeseen molekyylihiukkasten ja uusien molekyylihiuk-5 kasten reaktiota varten (erityisesti silloin kun nämä ovat proteiineja tai polypeptidejä) on edullinen näkökohta.

Menetelmän lisänäkökohdassa mitkä tahansa jäljelle jäävät vapaat vinyyliryhmät, jotka ovat läsnä konjugaatis-sa, joka muodostui vaiheessa (v), deaktivoidaan, deakti-10 vointi saavutetaan lisäämällä konjugaatin vesiliuokseen ylimäärä alhaisen moolimassan deaktivointihiukkasia; sopivia deaktivointihiukkasia voivat olla esimerkiksi etanoli-amiini, merkaptoetanoli tai tietyt aminohapot, esim. kys-teiini, glysiini, alaniini tai väliini.

15 On ilmeistä, että ne keksinnön konjugaatit, joilla on molekyylihiukkasia liittyneenä ja niillä on lisäksi reaktiivisia vinyyliryhmiä, vastaavat koostumuksessa ve-teenliukenevia välituotekonjugaatteja, jotka ovat muodostuneet jälkimmäisen menetelmän kuluessa; siten vielä yksi 20 keksinnön näkökohta koskee menetelmää samantyyppisen veteeni iukenevan konjugaatin valmistamiseksi kuin aikaisem-massa menetelmässä, menetelmä käsittää keksinnön mukaisen j mainituntyyppisen veteeniiukenevan konjugaatin sallimisen reagoida uuden molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa 25 pH-arvossa yli 5 uuden molekyylihiukkasen ollessa erilai-t nen kuin jo liitetyt reagoivaan konjugaattiin.

Olosuhteet, jotka ovat ominaisia reaktiolle samoin kuin uusien molekyylihiukkasten luonne, ovat yleensä kuten on jo kuvattu edellä keksinnön aikaisemman menetelmän yh- : 30 teydessä.

,·’ Keksintö koskee myös tuotteita (reagensseja ja kon- . jugaatteja), jotka tuotetaan keksinnön erilaisilla mene- , ·*, telmillä. Keksintö koskee lisäksi tällaisten konjugaattien ja muiden keksinnön konjugaattien käyttöä menetelmissä tai ” 35 tekniikoissa, jotka käsittävät kohderyhmän tai kohdefunk-

* - I

1 » 37 11 541 3 tionaalisuuden (esim. antigeeniä sitovan paikan vasta-aineessa) vuorovaikutuksen kohdehiukkasten kanssa, kuten tässä on määritelty.

Erityisemmin keksintö koskee keksinnön erilaisilla 5 menetelmillä tuotettujen konjugaattien ja muiden keksinnön konjugaattien käyttöä seuraavantyyppisissä menetelmissä tai tekniikoissa: immunokemialliset analyysimenetelmät, mukaan lukien entsymaattiset immunoanalyysit (EIA), kuten ELISA, radioimmunoanalyysit (RIA), ja nefelometriset ja 10 turbidimetriset immunoanalyysit; immunohistokemialliset menetelmät; sytokemialliset menetelmät; virtaussytometria; in situ hybridisaatiomenetelmät; membraanihybridisaatiome-netelmät (so. menetelmät, joissa hybridisaatioreaktio tapahtuu membraanilla tai kalvolla, kuten nitroselluloosa-15 membraani tai kalvo), mukaan lukien southern- ja northern-värjäyksen; ja menetelmät, jotka perustuvat lektiini/kar-bohydraattivuorovaikutuksille. Tällaisten konjugaattien käyttö biosensoreissa tai biosensorisysteemeissä on myös tämän keksinnön piirissä.

20 Esimerkkejä tekniikoista tai menetelmistä, joissa keksinnön - tai keksinnön mukaisesti valmistetut - konju-gaatit ovat erityisen käyttökelpoisia, ovat: antigeenisten : determinanttien tai vasta-aineiden detektio kudoksissa tai > · soluissa/soluilla, käyttäen immunohistokemiallisia/sytoke- , , 25 miallisia menetelmiä; detektioherkkyyden "amplifikaatio" * · tällaisille immunokemiallisille reaktioille; antigeenisten determinanttien, hapteenien tai vasta-aineiden detektio > · • ’ näytteessä käyttäen immunoanalyysiä tai immunovärjäysme- netelmiä; detektioherkkyyden "amplifikaatio" tällaisissa : 30 immunoanalyyseissä tai immunovärjäysmenetelmissä; kohde- nukleiinihapposekvenssin detektio hybridisaatioreaktioiden kautta; ja tällaisten hybridisaatioreaktioiden detektio- ,··. herkkyyden "amplifikaatio".

» » I » i t $ 115413 38

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Keksintöä havainnollistetaan suuressa määrin seu-raavilla esimerkeillä, joissa on viittauksia liitettyihin kuviin, jotka ovat seuraavat: 5 Kuvio 1: Tulokset esimerkistä 11

Geelisuodatus UV-absorptioprofiilitnäytteille pi-parjuuriperoksidaasin (HRP) liittämisestä DVS-aktivoi-tuun dekstraaniin, jonka piikin MW on 500 000. Profiilit vapaalle ja dekstraaniin sitoutuneelle HRP:lie on esi-10 tetty näytteille, jotka ovat altistetut liittämisajoille 0, 1 ja 4 tuntia vastaavasti (geelisuodatus suoritettiin Sephacryl™ S-200:lla). Vaakasuora akseli: eluutiotilavuus ml:ssa.

Kuvio 2: Tulokset esimerkistä 37B 15 HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-IgG-konjugaattien pitoisuuden ja absorbanssin 492 nm:ssä välinen suhde kol-mikerros-ELISAssa. Tulokset esitetään konjugaateille, jotka käsittävät erilaisia vuohi-anti-kani-IgG-molekyylien ja immunoglubuliinimolekyylien, jotka ovat ei-immunisoiduista 20 vuohista, dekstraanimolekyyliä kohti lukumäärän yhdistelmiä. On ilmeistä, että tietylle konjugaatin pitoisuudelle mitattu absorbanssi suurenee, kun konjugoitujen vuohi-an- • ti-kani-IgG-molekyylien määrä dekstraanimolekyyliä kohti *. kasvaa.

25 Kuvio 3: Tulokset esimerkistä 37C

^ HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-IgG-konjugaatin pi- ! toisuuden ja absorbanssin 492 nm:ssä välinen suhde kolmi- kerros-ELISAssa. Vertailutarkoituksia varten tulokset esitetään myös tavanomaiselle HRP-leimatulle (konjugoidulle) : 30 sika-anti-kani-IgG:lie. On ilmeistä, että tietylle pitoi suudelle mitattu absorbanssi on huomattavasti suurempi keksinnön mukaiselle dekstraanikonjugaatille kuin tavanomaiselle konjugaatille.

” Kuvio 4: Tulokset esimerkistä 38 35 Biotinyloidun kani-IgG:n pitoisuuden kolmikerroksi- ,' · sen ELISAn toisessa kerroksessa ja absorbanssin 492 nm:ssä 115413 39 välinen suhde käyttäen HRP-dekstraani/avidiinikonjugaatte-ja osoittamaan biotinyloitu kani-IgG. Tulokset esitetään neljälle HRP-dekstraani/avidiini-konjugaatille, jotka käsittävät eri määrät avidiinimolekyylejä dekstraanimolekyy-5 lejä kohti. On ilmeistä, että tietylle biotinyloidun kani-IgG:n pitoisuudelle mitattu absorbanssi suurenee, kun kon-jugoitujen avidiinimolekyylien määrä dekstraanimolekyyliä kohti kasvaa.

Kuvio 5: Tulokset esimerkistä 40 10 Biotinyloidun kani-IgG:n, jota on käytetty ensim mäistä kerrosta varten (so. adsorptiota kiinteäfaasialus-tan pintaan) kaksikerros-ELISAssa, pitoisuuden ja absor-banssin 492 nm:ssä välinen suhde. Tulokset esitetään keksinnön mukaiselle HRP-dekstraani/streptavidiinikonjugaa-15 tille ja, vertailutarkoituksia varten, tavanomaiselle HRP-leimatulle (konjugoidulle) streptavidiinille. On ilmeistä, että tietylle biotinyloidun kani-IgG:n pitoisuudelle mitattu absorbanssi on huomattavasti suurempi keksinnön mukaiselle dekstraanikonjugaatille kuin tavanomaiselle kon-20 jugaatille, so. detektioraja analyysissä on merkittävästi alhaisempi kun käytetään keksinnön konjugaattia kuin käy-tettäessä tavanomaista konjugaattia.

| Kuvio 6: Tulokset esimerkistä 56 » . Hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen suhteen mg: aan 25 dekstraania (kompleksissa, joka on muodostunut hiiri-an-^ ti-ihmis-kappa-kevytketjujen ja HRP-dekstraani/RAM-konju- ; gaatin välille) ja absorbanssin 492 nm:ssä kaksikerros- ELISAssa välinen suhde. Tulokset esitetään neljälle ihmisen seerumiproteiinin pitoisuudelle, joita käytettiin en-: 30 simmäiselle kerrokselle (so. adsorptiota kiinteäfaasialus- , · tan pintaa varten). Absorbanssin tasoittuminen havaitaan : suhteessa noin 4 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/mg ··, dekstraania riippumatta ihmisen seerumiproteiinien, joita käytettiin adsorptiota kiinteäfaasialustan pintaan varten, " 35 pitoisuudesta.

115413 40

Kuvio 7: Tulokset esimerkistä 57

Dekstraanin (kompleksissa, joka on muodostunut biotinyloidun kani-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen ja HRP-dekstraani/streptavidiinikonjugaattien välille) pitoisuu-5 den ja absorbanssin 492 nm:ssä kaksikerros-ELISAssa välinen suhde. Tulokset esitetään komplekseille, jotka ovat muodostuneet kolmessa eri biotinyloitujen kani-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen pitoisuuksissa. On ilmeistä, että tietyille kompleksoidun konjugaatin pitoisuuksille piikin 10 absorbanssiarvo saadaan, kun kompleksi muodostuu käyttäen pitoisuutta noin 0,309 - 0,465 mg biotinyloituja kani-an-ti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml.

Kuvio 8: Tulokset esimerkistä 58

Hiiri-anti-ihmi s-kappa-kevytketjuj en(kompleksissa, 15 joka on muodostunut biotinyloitujen kani-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen ja HRP-dekstraani/RAM-konjugaatin välille) pitoisuuden ja absorbanssin 492 nm:ssä kaksikerros-ELISAssa välinen suhde. Tulokset esitetään komplekseille, jotka ovat muodostuneet viidessä eri hiiri-anti-ihmis-kap-20 pa-kevytketjujen pitoisuudessa, pitäen suhteen hiiri-anti- ihmis-kappa-kevytketjujen ja RAM:n välillä vakiona komp-leksin muodostumisen ajan. Mitattu absorbanssi osoittaa I vain pieniä muutoksia hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketju- jen, joita käytettiin kompleksin muodostamista varten, 25 pitoisuuden funktiona.

Lyhenteet ; Seuraavia lyhenteitä käytetään alla olevissa esi- merkeissä ja muualla selityksessä: BSA: naudan seerumialbumiini : i 30 DVS: divinyylisulfoni • MW: moolimassa -: HRP: piparj uuriperoksidaasi FITC: fluoreseiini-isotiosyanaatti • · PSA: prostata-spesifinen antigeeni '· 35 GAM: vuohi-anti-kani-Ig 115413 41 RAM: kani-anti-hiiri-Ig AP: alkalinen fosfataasi SPDP: N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaatti DTT: ditiotreitoli 5 LSAB: leimattu streptavidiinibiotiini cat.: luettelo

Fab: fragmentin antigeenisitominen

Ellei toisin mainita, seuraavissa esimerkeissä käytetty vesi oli Milli Q™ -laitteesta, so. vesi, joka oli 10 altistettu suodatukselle Millipore™-suodattimen läpi ja sitä seuraavalle deionisaatiolle.

Käytettyjen detektio/analyysimenetelmien yleinen kuvaus

Yleinen yhteenveto immunohistokemiallisesta ja sy-15 tokemiallisesta detektiosta annetaan tämän selityksen esittelyosassa ja tällaisia detektiomenetelmiä voi ammattitaitoinen henkilö suorittaa käyttäen tunnettuja, helposti saatavia menetelmiä.

Kohdenukleiinihapposekvenssien detektio käyttäen 20 leimattuja koettimia kuvataan myös tämän selityksen esit telyosassa ja sen voi ammattitaitoinen henkilö samalla tavalla suorittaa käyttäen tunnettuja, helposti saatavia » | menetelmiä. Tämän keksinnön yhteydessä "amplifikaatio" (so. kasvu detektioherkkyydessä) hybridisaatioreaktion * 25 tapahtuman osoituksen yhteydessä voidaan saavuttaa käyt-! täen esimerkiksi biotiinilla leimattua koetinta hybridi saatiota varten ja keksinnön mukaista konjugaattia, joka ’· ’ käsittää esim. anti-biotiini vasta-aineita, avidiinia tai streptavidiinia reagenssina hybridisäätiön detektiota var-.* 30 ten.

'· Yleinen ELlSA-menetelmä: Kuten myös on kuvattu tä- , : män selityksen esittelyosassa, tärkeä immunoanalyysimene- telmien luokka on niin kutsutut ELISA-menetelmät. Tässä

» I

olevissa sovellusesimerkeissä (katso alempana) ELlSA-me- 1 t > * „ 115413 42 netelmät suoritetaan käyttäen kolmea "kerrosta" tai - tietyissä erikoistapauksissa - kahta kerrosta seuraavasti:

Kolme kerrosta: Kun vasta-aine oli adsorpoitunut ("vastaanottava vasta-aine") polystyreenimikrotiitterile-5 vyn kuoppiin (NUNC, Tanska) (jolloin saatiin ensimmäinen kerros), komplementaarinen antigeeni tai biotiini-konju-goitu antigeeni sidotaan toisena kerroksena. Kolmas kerros keksinnön mukaisen konjugaatin muodossa käsittäen entsyymin (piparjuuriperoksidaasi), ja joko (i) antigeenispesi-10 finen vasta-aine, tai (ii) (silloin kun komplementaarinen antigeeni toisessa kerroksessa on leimattu biotiinilla) avidiini tai streptavidiini liitetään sitten. Lopuksi sitoutunut, entsyymillä leimattu konjugaatti osoitetaan sitten lisäämällä väriä kehittävää reagenssia (orto-fenylee-15 nidiamiini/vetyperoksidi), joka on entsyymin substraatti. Sopiva pesu suoritetaan näiden eri vaiheiden välillä (katso alempana).

Kaksi kerrosta: Sopiva antigeeni tai biotiinilla leimattu antigeeni adsorboidaan suoraan mikrotiitterilevyn 20 kuoppien sisäpinnalle, so. vastaanottava vasta-aine jätetään pois.

Esimerkeissä 37B, 37C ja 38 (katso alempana) käyte-j tään kolmea kerrosta, kuten edellä on kuvattu, seuraavien yksityiskohtien kanssa: ,25 1. kerros: 100 μΐ vuohi-anti-kani-Ig-laimennosta jokaisessa kuopassa. Inkubointi yön yli +4 °C:ssa.

Jäljelle jäävien sitomispaikkojen estäminen: 200 μΐ * · ‘ 0,1 M dikaliumvetyfosfaattia, 1 % Tween™ 20, pH 7,2.

Inkubointi: 30 minuuttia huoneenlämpötilassa.

!. : 30 Pesumenetelmä: Mikrotiitterilevyn kuopat tyhjenne- tään kääntämällä levy ja "läimäyttämällä" sitä kevyesti .. : pesualtaan päällä. Jäljelle jäävä neste poistetaan taput- ,··, tamalla käännettyä mikrotiitterilevyä suodatinpaperia vas ten. Kuopat täytetään sitten 0,1 M dikaliumvetyfosfaatil-35 la, 0,5 M NaCl:lla, 0,l-%:isella Tween™:lla, pH 7,2, ja 115413 43 levyä ravistellaan kevyesti 3-5 minuuttia. Tämä menettely toistetaan kahdesti.

2. kerros: 100 μΐ kani-IgG:tä (1 ng/ml) tai (silloin kun 3. kerros käsittää streptavidiinikonjugaatin) 5 100 μΐ biotiinikonjugoitua kani-IgG:tä (0,1 ng/ml) jokai sessa kuopassa. [Kontrolli: 100 μΐ laimennospuskuria (katso kyseisissä esimerkeissä)]. Inkubointi yön yli +4 °C:n lämpötilassa. Pesu, kuten edellä on kuvattu kohdassa pesu-menetelmä .

10 3. kerros: 100 μΐ HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-

Ig-laimennosta tai 100 μΐ HRP-dekstraani/streptavidiini-konjugaattivalmistetta jokaisessa kuopassa. Levyä ravistellaan kevyesti 2 tuntia. Pesu, kuten on kuvattu kohdassa pesumenetelmä. 100 μΐ väriä kehittävää reagenssiliuosta 15 lisätään, minkä jälkeen 15 minuutin kuluttua lisätään 100 μΐ 1 M H2S04:a. Värin intensiteetti yksittäisessä kuopassa mitataan sitten käyttäen automaattista ELISA-luki-jaa.

Esimerkissä 40 (katso alempana) käytetään kahta 20 kerrosta, kuten edellä on kuvattu, seuraavien yksityiskohtien kanssa: 1. kerros: 100 μΐ biotiinikonjugoitua kani-IgG-lai- * .* mennosta jokaisessa kuopassa. Inkubointi +4 °C:ssa yön 1 yli.

25 Jäljelle jäävien sitomispaikkojen estäminen: 200 μΐ * *

J 0,1 M dikaliumvetyfosfaattia, l-%:ista Tween™ 20:tä, pH

7,2. Inkubointi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pesu, • ’ kuten edellä on kuvattu kohdassa pesumenetelmä.

2. kerros: 100 μΐ HRP-dekstraani/streptavidiinival- i 30 mistetta tai 100 μΐ tavanomaista streptavidiini-peroksi- daasi-konjugaattia jokaisessa kuopassa. 100 μΐ väriä ke-hittävää reagenssiliuosta lisätään, minkä jälkeen 15 mi-nuutin kuluttua lisätään 100 μΐ IM H2S04:a. Värin intensi- * » ! teetti yksittäisissä kuopissa mitataan sitten käyttäen ’* 35 automaattista ELISA-lukijaa.

* · 115413 44

Esimerkeissä 56, 57 ja 58 (katso alempana) käytetään kahta kerrosta, kuten edellä on kuvattu, seuraavien yksityiskohtien kanssa: 1. kerros: 100 μΐ normaalia ihmisen seerumilai- 5 mennosta jokaisessa ELISA-kuopassa. Inkubointi yön yli +4 °C:ssa.

Pesumenetelmä: Mikrotiitterilevyn kuopat tyhjen netään ja pestään (5x1 minuutti) käyttäen automaattista kuopanpesijää (Denley, well-wash-4). Pesupuskuri on: 10 0,01 M natriumfosfaatti, 0,145 M NaCl, 0,l-%:ista Tween™ 20:tä, pH 7,2.

2. kerros: Jokaisessa kuopassa joko 100 μΐ HRP- dekstraani/RAM-konjugaattia kompleksoituna hiiri-anti-ih-mis-kappa-kevytketjujen laimennoksella tai 100 μΐ HRP- 15 dekstraani/streptavidiinikonjugaattia kompleksoituna bio-tinyloidun hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen laimennoksen kanssa. Inkubointi ravistaen kevyesti 1,5 tuntia noin 20 °C:ssa. Pesu, kuten edellä on kuvattu. 100 μΐ väriä kehittävää reagenssiliuosta lisätään, minkä jälkeen 10 mi-20 nuutin (esimerkeissä 56 ja 58) tai 2 minuutin (esimerkissä 57) kuluttua lisätään 100 μΐ IM H2S04:a. Värin intensiteet-ti yksittäisissä kuopissa mitataan sitten käyttäen auto-.* maattista ELISA-lukijaa.

Yleinen menetelmä Dot Blotille (immunovärjäys): 25 Yleinen menetelmä immunovärjäykselle [kuten on käytetty t esimerkeissä 37C ja 40 tässä (katso alempana)] on seu-raava:

Antigeeni tai biotiinikonjugoitu (biotinyloitu) antigeeni immobilisoidaan nitroselluloosamembraaneille i 30 sarjalaimennustäplien muodossa. Jäljelle jäävien sitomis-: paikkojen estämisen jälkeen nitroselluloosamambraanit in- : kuboidaan sopivalla peroksidaasia sisältävällä konjugaa- tilla, jolla on sitomisspesifisyyttä (mahdollisesti bioti- » nyloidulle) antigeenille.

115413 45

Pesun jälkeen lisätään väriä kehittävä reagenssi (diaminobentsidiini/vetyperoksidi) syntyneen värin intensiteetin ollessa suhteellinen läsnä olevaan entsyymin määrään konjugaatin, joka on sitoutunut (mahdollisesti bioti-5 nyloituun) antigeeniin täplissä, muodossa.

Menetelmä: 1 μΐ (mahdollisesti biotinyloitua) kani-IgG:tä laimennoksissa 6, 3, 1,5, 0,75, 0,38, 0,19, 0,10, 0,05 ja 0,025 ng/μΐ levitetään nitroselluloosamembraanil-le; laimennusväliaine on 0,1 M NaCl, joka sisältää 50 mg 10 BSA/1 000 ml.

Jäljelle jäävien sitomispaikkojen estäminen: 0,1 M kaliumfosfaattia, l-%:ista Tween™ 20:tä, pH 7,2, 2 minuuttia.

Yleinen pesumenetelmä: nitroselluloosamembraani 15 pestään 0,1 M dikaliumvetyfosfaatilla, 0,5 M NaCl:lla, 0,l-%:isella Tween™:llä, pH 7,2, 5 minuuttia ravistaen kevyesti; käytetty pesupuskuri poistetaan sitten. Menetelmä toistetaan kahdesti.

Testattava konjugaatti laimennetaan 0,1 M kalium-

20 fosfaattiin, l-%:iseen BSA:han, 0,1-%:iseen Tween™:iin, pH

7,2. Pesu, kuten edellä on kuvattu kohdassa yleinen pesu- menetelmä. Membraani upotetaan väriä kehittävään reagens- : siin ja 15 minuutin kuluttua membraani sitten pestään ker- » ran tislatulla vedellä. Alhaisin antigeenilaimennos, joka 25 antaa positiivisen täplän, määritetään.

Esimerkki 1

Hydroksietyyliselluloosandivinyylisulfoniaktivoin-• ’ ti

Yksi gramma hydroksietyyliselluloosaa ("Natrosol : i 30 250 HR", Aqualon, Saksa) liuotettiin 50 ml:aan vettä huo- neenlämpötilassa (20 - 25 °C) ja liuokseen lisättiin 50 ml ...0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 11,5) ,«··, ja 25 mg natriumboorihydridiä. Heti natriumboorihydridin Γ liukenemisen jälkeen reaktioseos siirrettiin hyvin tuule- 35 tettuun suojukseen ja 5 ml divinyylisulfonia (Aldrich, 115413 46 cat. nro V370, 97-%risen puhdas) lisättiin. Varovainen sekoitus suoritettiin magneettisekoittimella. 10 minuutin ja vastaavasti 30 minuutin jälkeen otettiin 50 ml:n liuos-erät erilleen. Kunkin erän pH säädettiin arvoon 6 - 7 5 M 5 kloorivetyhapolla (jolloin reaktio vaimeni). Kumpikin kahdesta liuoksesta dialysoitiin sitten 4x51 vettä vastaan kahden vuorokauden aikana huoneenlämpötilassa. Dialyysin jälkeen kunkin liuoksen tilavuus oli kasvanut 76 ml:aan, joka vastaa 6,6 mg/ml DVS-aktivoidun hydroksietyylisellu-10 loosan lopullista pitoisuutta.

Vapaiden, reaktiivisten vinyyliryhmien (so. DVS-johdettujen ryhmien "riippuvan" päätteen vinyyliryhmät, jotka ovat kovalenttisesti sitoutuneet polymeerisubstraattiin sidoksen kautta, joka on muodostunut yhden DVS:n kah-15 desta vinyyliryhmästä reaktiolla, tässä tapauksessa hyd- roksiryhmän kanssa hydroksietyyliselluloosalla) pitoisuus määritettiin reaktiolla suuren ylimäärän kanssa natrium-tiosulfaattia, minkä jälkeen titrattiin saadut hydroksidi-ionit standardilla kloorivetyhapolla. Vapaiden vinyyliryh-20 mien reaktio tiosulfaatti-ionin kanssa tapahtuu seuraavan reaktiokaavion mukaisesti [Porath et ai., J. Chromatogr. [: 103 (1975) 49]: (substraatti )-0-CH2-CH2-S02-CH=CH2 + S203'' + H20 -> ·. 25 (substraatti )-0-CH2-CH2-S02-CH2-CH2-S203' + OH’ ! Titraustulokset osoittivat, että DVS-aktivoidun hydroksietyyliselluloosan näytteillä oli pitoisuudet 150 ja 818 pmol vinyyliryhmiä hydroksietyyliselluloosan gram- ‘ < * : 30 maa kohti 10 ja vastaavasti 30 minuutin aktivoinnin jäl- •,,. · keen.

Esimerkki 2

Hydroksipropyylitärkkelyksen divinyylisulfoniakti- vointi 35 Käytettiin reaktio- ja dialyysimenetelmää, jotka ; olivat täsmälleen analogisia esimerkissä 1 kuvattujen 115413 47 kanssa, käyttäen lähtöaineena 1 grammaa hydroksipropyyli-tärkkelystä ("Reppal PES 200", Reppe Glykos AB, Ruotsi). Dialyysin jälkeen liuoksen, joka oli johdettu erästä, joka otettiin erilleen 10 minuutin jälkeen, tilavuus oli kasva-5 nut 64 ml:aan, kun taas liuoksen, joka oli johdettu erästä, joka otettiin erilleen 30 minuutin jälkeen, tilavuus oli kasvanut 78 ml:aan. Tämä vastaa DVS-aktivoidun hydrok-sipropyylitärkkelyksen lopullista pitoisuutta 7,8 ja vastaavasti 6,4 mg/ml.

10 Käyttäen esimerkissä 1 kuvattua titrausmenetelmää määritettiin reaktiivisten vinyyliryhmien kahdessa DVS-aktivoidussa hydroksipropyylitärkelysnäytteessä pitoisuuden olevan 1 026 ja vastaavasti 2 568 pmol vinyyliryhmiä grammaa hydroksipropyylitärkkelystä kohti.

15 Suoritettaessa analogista aktivointimenetelmää pH- arvossa 11,5 arvon 11,0 sijaan tapahtui laaja aktivoidun tuotteen geeliytyminen ja saostuminen.

Esimerkki 3

Naudan seerumialbumiinin divinyylisulfoniaktivoitu-20 minen

Kaksi grammaa naudan seerumialbumiinia (98-%:inen puhtaus, Sigma Chemical Company) liuotettiin 200 ml:aan : 0,25 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 10,0) huoneenlämpötilassa (20 - 25 °C). 2 ml divinyylisulfonia 25 lisättiin (Suojus!). Varovainen sekoitus suoritettiin mag-neettisekoittimella. 60 minuutin jälkeen reaktioseoksen pH säädettiin arvoon 6 - 7 5 M kloorivetyhapolla. Liuos dia-lysoitiin sitten 4x5 1 0,1 M natriumkloridia vastaan kahden vuorokauden aikana huoneenlämpötilassa, i 30 Dialyysin jälkeen liuoksen tilavuus oli kasvanut 215 ml:aan, joka vastaa DVS-aktivoidun BSA:n lopullista pitoisuutta 9,3 mg/ml.

,··*, Käyttäen aikaisemmin kuvattua menetelmää määritet- Γ tiin reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuuden olevan 184 115413 48 pmol grammaa BSA:ta kohti, mikä vastaa n. 12 mol vinyyli-ryhmiä BSA:n moolia kohti.

Esimerkki 4

Dekstraanin (piikin MH 500 000) divinyylisulfoniak-5 tivointi. DVS-pitoisuuden vaikutus

Viisi erillistä liuosta (A-E), jotka sisältävät yhtäläiset dekstraanipitoisuudet piikin moolimassan ollessa 500 000 (Pharmacia, Ruotsi) ja eri DVS-pitoisuuksia, valmistettiin niin että saatiin seuraavat lopulliset pi-10 toisuudet:

Kaikki liuokset: 5 % paino/tilavuus dekstraania; 0,25 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 11,5); 0,25 mg natriumboorihydridiä ml:aa kohti, DVS-pitoisuudet: 15 liuos A: 10 % tilavuus/tilavuus liuos B: 5 % tilavuus/tilavuus liuos C: 3 % tilavuus/tilavuus liuos D: 1 % tilavuus/tilavuus liuos E: 0,5 % tilavuus/tilavuus 20 Aktivointi suoritettiin 25 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Aktivoinnin jälkeen reaktioseosten pH säädettiin arvoon 7 5 M kloorivetyhapolla. Kaikki näytteet dialysoitiin huo-: lellisesti vettä vastaan, jolloin ylimääräiset reagenssit poistuivat.

25 Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus DVS-aktivoi- dun dekstraanin erilaisille näytteille määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Tulokset (katso taulukko alla) voidaan ilmaista pmooleina vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti; ne voidaan vaihtoehtoisesti, pohjautuen keski-;: 30 määräisen moolimassan 500 000 olettamukselle (kuten teks- tissä on edelleen keskusteltu), antaa mooleina vinyyliryh-,miä dekstraanimoolia kohti: 115413 49

Liuos μπιοί vinyyliryh- mol vinyyliryh- miä/g dekstraania miä/mol deks- traania A 542 271 B 414 207 C 234 117 5 D 179 89,5 E 86 43

Esimerkki 5

Dekstraanin (piikin MH 500 000) divinyylisulfoniak-10 tivointi. DVS-pitoisuuden vaikutus suurilla deks- traanipitoisuuksilla

Neljä erillistä liuosta (A-D), jotka sisältävät yhtäläiset dekstraanin pitoisuudet (kaksi kertaa niin suuret kuin esimerkissä 4) piikin moolimassan ollessa 500 000 15 (Pharmacia, Ruotsi) ja eri DVS-pitoisuuksia, valmistettiin niin että saatiin seuraavat lopulliset pitoisuudet:

Kaikki liuokset: 10 % paino/tilavuus dekstraania; l 0,25 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 11,5); ", 0,25 mg natriumboorihydridiä ml:aa kohti, 20 DVS-pitoisuudet: liuos A: 10 % tilavuus/tilavuus liuos B: 5 % tilavuus/tilavuus liuos C: 3 % tilavuus/tilavuus liuos D: 1 % tilavuus/tilavuus • 25 Aktivointi suoritettiin 25 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Aktivoinnin jälkeen reaktioseosten pH säädettiin arvoon 7 : 5 M kloorivetyhapolla. Kaikki näytteet dialysoitiin huo lellisesti vettä vastaan, jolloin ylimääräiset reagenssit poistuivat.

i · i i 115413 50

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus DVS-aktivoi-dun dekstraanin erilaisille näytteille määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Tulokset on koottu alla: 5 Liuos μπιοί vinyyliryh- mol vinyyliryh- miä/g dekstraania miä/mol deks- traania A 944 472 B 583 292 C 335 168 D 194 97

Esimerkki 6

Dekstraanin (piikin MW 500 000) divinyylisulfoniak-tivointi. Ajan vaikutus alhaisilla dekstraanipitoi-suuksilla 15 Neljä erillistä liuosta (A - D), jotka sisältävät yhtäläiset alhaiset dekstraanin pitoisuudet, piikin mooli-, massan ollessa 500 000 (Pharmacia, Ruotsi) ja DVS:a, val- mistettiin niin että saadaan seuraavat lopulliset pitoi- • suudet: ,· 20 Kaikki liuokset: 1 % paino/tilavuus dekstraania; 0,25 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 11,5); 0,25 mg natriumboorihydridiä ml:aa kohti, DVS-pitoisuudet: liuos A: 5 % tilavuus/tilavuus 25 liuos B: 5 % tilavuus/tilavuus » liuos C: 10 % tilavuus/tilavuus liuos D: 10 % tilavuus/tilavuus • Liuoksille A ja C aktivoinnin annettiin edetä 30 / minuuttia. Liuosten B ja D tapauksessa aktivoinnin annet- 30 tiin edetä 60 minuuttia. Aktivointi suoritettiin 25 °C:n 1 » 115413 51 lämpötilassa, ja aktivoinnin jälkeen kunkin liuoksen pH säädettiin arvoon 7 5 M kloorivetyhapolla.

Tulokset: Liuoksella B tapahtui kiinteän geelin saostuminen aktivointiastiassa 50 minuutin reaktion jäl-5 keen. Liuoksella D kiinteän geelin saostuminen tapahtui 40 minuutin reaktion jälkeen. Reaktioseokset näistä kahdesta liuoksesta heitettiin siksi pois.

A:sta ja C:stä saadut liuokset dialysoitiin huolellisesti vettä vastaan, jolloin ylimääräiset reagenssit 10 poistuivat.

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus kahdelle DVS-aktivoidun dekstraanin näytteelle määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Tulokset on koottu alla: 15 Liuos pmol vinyyliryh- mol vinyyliryh- miä/g dekstraania miä/mol deks- traania E A 1 500 750 C 2 760 1 380

Esimerkki 7 20 Dekstraanien divinyylisulfoniaktivointi erilaisten piikin moolimassojen kanssa, jotka ovat välillä 100 000 ja 500 000 :1 Neljä dekstraania (Pharmacosmos, Tanska; merkitty - tässä Dl - D4), joissa oli erilaisia spesifioituja piikin 25 moolimassoja (katso alla), aktivoitiin divinyylisulfonilla käyttäen yhdenmukaisia olosuhteita.

. Dekstraani dekstraanin piikin MW

Dl 123 600 » / D2 196 300 • : 30 D3 276 500 D4 401 300 52 115413

Olosuhteet DVS-aktivointia varten: 5 % paino/tila-vuus sopivaa dekstraania; 0,25 M dikaliumvetyfosfaatti/ natriumhydroksidia (pH 11,5); 0,25 mg natriumboorihydridiä ml:aa kohti; 5 % tilavuus/tilavuus divinyylisulfonia.

5 Aktivointi suoritettiin huoneenlämpötilassa 15 mi nuutin ajan. Kunkin reaktioseoksen pH säädettiin sitten arvoon 7 5 M kloorivetyhapolla, minkä jälkeen näytteet dialysoitiin huolellisesti vettä vastaan.

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus DVS-aktivoi-10 tujen dekstraanien näytteissä määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Tulokset on koottu alla:

Dekstraani pmol vinyyliryh- mol vinyyliryh- miä/g dekstraania miä/mol dekstraania

Dl 861 106 15 D2 735 144 D3 780 216 D4 734 295 t i : Esimerkki 8 20 Dekstraanin, jonka piikin MH on 2 000 000, divinyy- lisulfoniaktivointi

Yksi gramma dekstraania, jonka piikin MW on : 2 000 000 (Pharmacia, Ruotsi), liuotettiin 50 ml:aan vettä

huoneenlämpötilassa (20 - 25 °C), ja liuokseen lisättiin 25 50 ml 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

11,5) ja 25 mg natriumboorihydridiä. 1 ml divinyylisulfo- * nia lisättiin ja seosta sekoitettiin varovasti magneetti-’ sekoittimella 30 minuuttia. Reaktioseoksen pH säädettiin ,· sitten arvoon 6 - 7 5 M kloorivetyhapolla, minkä jälkeen 30 liuos dialysoitiin 4x51 vettä vastaan kahden vuorokau- ; den aikana huoneenlämpötilassa.

115413 53

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuudeksi määritettiin käyttäen esimerkissä 1 kuvattua titrausmenetelmää 567 μπιοί grammaa dekstraania kohti, mikä vastaa 1 134 moolia vinyyliryhmiä dekstraanimoolia kohti, joiden keskimää-5 räinen MW on 2 000 000.

Esimerkki 9

Dekstraanin, jonka piikin MW on 20 000, divinyyli- sulfoniaktivointi

50 grammaa dekstraania, jonka piikin MW on 20 000 10 (Sigma Chemical Company), liuotettiin 450 ml:aan vettä huoneenlämpötilassa (20 - 25 °C) ja liuokseen lisättiin 450 ml 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

11,5) ja 250 mg natriumboorihydridiä. 100 ml divinyylisul-fonia lisättiin ja seosta sekoitettiin varovasti magneet-15 tisekoittimella 15 minuuttia. Reaktioseoksen pH säädettiin sitten arvoon 6 - 7 5 M kloorivetyhapolla, minkä jälkeen liuos dialysoitiin vettä vastaan, jolloin poistettiin ylimääräiset reagenssit.

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuudeksi määri-20 tettiin käyttäen esimerkissä 1 kuvattua titrausmenetelmää 1 230 μπιοί grammaa dekstraania kohti, mikä vastaa noin 25 moolia vinyyliryhmiä dekstraanimoolia kohti, joiden keski-määräinen MW on 20 000.

- ·

Esimerkki 10 25 DVS-aktivoidun dekstraanin stabiilisuus *

Dekstraani, jonka piikin MW on 500 000 (Pharmacia, Ruotsi), aktivoitiin divinyylisulfonilla, kuten on kuvattu liuokselle B esimerkissä 4 (so. käyttäen 5 % paino/tila-vuus dekstraania ja 5 % tilavuus/tilavuus DVS:a). Saadun i 30 DVS-aktivoidun dekstraanin havaittiin sisältävän 475 μπιοί vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti.

; Aktivoituun dekstraaniliuokseen (35 mg dekstraania ml:aa kohti) lisättiin 0,01 % paino/tilavuus 1,1,1-tri- » kloorl-2-metyyli-2-propanolia (Sigma, cat. nro T 5138) • 35 säilöntäaineena ja saadun liuoksen neljä näytettä inkuboi- 115413 54 tiin pimeässä suljetuissa astioissa eri lämpötiloissa seuraavasti :

Liuosnäyte Lämpötila ( °C) A -20 5 B 4 C 20 D 30

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus määritettiin 3 kuukauden inkuboinnin kuluttua, ja tulokset on koottu 10 alla:

Liuosnäyte pmol vinyyliryhmiä/g dekstraa- nia A 420 B 415 15 C 415 D 405

On ilmeistä, että reaktiivisten vinyyliryhmien pi-toisuus ei ole pienentynyt merkittävästi 3 kuukauden ku-; 20 luttua, ja että tämä merkittävä stabiilisuus pysyy jopa suhteellisen korkeissa lämpötiloissa, kuten 30 °C:ssa.

• Esimerkki 11

Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin (piikin MW 500 000) 25 korkeassa lämpötilassa

Dekstraani, jonka piikin MW oli 500 000, aktivoi-, , tiin DVS:llä, kuten on kuvattu "liuokselle B" esimerkis sä 4 (so. käyttäen 5 % paino/tilavuus dekstraania ja 5 % tilavuus/tilavuus DVS:a). Aktivoidulla dekstraanilla oli ,· 30 reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus 490 pmol grammaa dekstraania kohti. DVS-aktivoidun dekstraanin lopullinen » 115413 55 pitoisuus oli 26 mg/ml. Tähän erään DVS-aktivoitua deks-traaniliuosta viitataan tämän jälkeen "eränä Dex-I".

Menetelmä piparjuuriperoksidaasin liittämiseksi oli seuraava: 3 ml DVS-aktivoitua dekstraaniliuosta ("erä Dex-5 I") sekoitettiin liuoksen kanssa, jonka muodosti 300 mg piparjuuriperoksidaasia (Kem-En-Tec, Kööpenhamina, Tanska) 12 ml:ssa vettä. Seokseen lisättiin sitten 15 ml 0,4 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 10,4). Kirkasta liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa ilman sekoitusta.

10 Näytteet otettiin erilleen eri pituisten ajanjakso jen kuluttua ja liittämisen tehokkuus, so. alunperin lisätyn piparjuuriperoksidaasin, joka liitettiin aktivoituun dekstraaniin, prosenttiosuus määritettiin geelisuodatuk-sella Sephacryl™ S-200:lla (Pharmacia, Ruotsi). Liittämis- 15 reaktio pysäytettiin 4 tunnin inkuboinnin kuluttua alentamalla pH arvoon 7 lisäämällä 1 M kloorivetyhappoa.

Liittämisen tulokset on koottu kuvioon 1. Piikkien suhteellisista alueista määritettiin seuraavat liittämis-tehokkuudet inkubointiajan funktiona: 20

Inkubointiaika (tunteja) Liittämistehokkuus (%) I 1 12 ; 2 25 3 39 . ; 25 4 50 Nämä tulokset voidaan laskea uudelleen, jolloin saadaan dekstraaniin liittyvien peroksidaasimolekyylien keksimääräinen lukumäärä, olettaen keskimääräiseksi mooli- » : ’ 30 massaksi 500 000 dekstraanille ja 40 000 peroksidaasille (kuten tekstissä on enemmän keskusteltu): • » t s 56 115413

Inkubointiaika (tunteja) mol HRP/mol dekstraania 1 5,8 2 12 - 3 - - » - 5 4 24

Esimerkki 12

Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin (piikin MW 500 000) 10 alhaisessa lämpötilassa

Liittämismenetelmä oli seuraava: 3 ml (sisältäen 78 mg DVS-aktivoitua dekstraania liuoksessa) "erää Dex-I" (katso esimerkki 11) sekoitettiin liuoksen kanssa, jonka muodosti 300 mg piparjuuriperoksidaasia (Kem-En-Tec, Köö-15 penhamina, Tanska) 12 mlrssa vettä. Seokseen lisättiin sitten 15 ml 0,4 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksi-dia (pH 10,4). Kirkasta liuosta inkuboitiin 4 °C:ssa ilman sekoitusta.

Näytteet otettiin erilleen eripituisten ajanjakso-20 jen kuluttua ja liittämisen tehokkuus määritettiin geeli-: suodatuksella Sephacryl™ S-200:lla (Pharmacia, Ruotsi) ,* samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 11. Liittämis- reaktio pysäytettiin 192 tunnin inkuboinnin kuluttua alentamalla pH arvoon 7 lisäämällä 1 M kloorivetyhappoa. Liit-: : 25 tämisen tulokset olivat seuraavat: t · ( · * · 115413 57

Inkubointiaika Liittämistehok- mol HRP/mol (tunteja) kuus (%) dekstraania 5 14 6,7 24 24 12 5 48 34 16 192 40 19

Esimerkki 13

Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen 10 DVS-aktivoituihin dekstraaneihin, joiden aktivoin- tiaste on erilainen

Piparjuuriperoksidaasi liitettiin seitsemään DVS-aktivoituun dekstraanivalmisteeseen, jotka on valmistettu, kuten esimerkeissä 4 ja 6 on kuvattu (so. esimerkin 4 A -15 E ja esimerkin 6 A ja C). Liittämismenetelmä oli seuraava: Kaikki seitsemän dekstraanivalmistetta sekoitettiin piparjuuriperoksidaasin ja puskurin kanssa, jolloin saatiin seuraavat lopulliset pitoisuudet: 2,75 mg DVS-akti-voitua dekstraania ml:aa kohti; 10 mg piparjuuriperoksi-20 daasia ml:aa kohti; 0,2 M dikaliumvetyfosfaatti/natrium-: hydroksidia (pH 10,0).

,· Liittäminen suoritettiin 37 °C:ssa 16 tunnin ajan,

• minkä jälkeen reaktio pysäytettiin säätämällä liuoksen pH

arvoon 6-7 lisäämällä 1 M kloorivetyhappoa. Liittämis-: 25 tehokkuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-200:lla (Pharmacia, Ruotsi) samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 11, ja tulokset olivat seuraavat: t · » · » ; » » t » » · 115413 58 μιηοΐ vinyyliryh- Liittämistehok- mol HRP/mol miä/g dekstraa- kuus (%) dekstraania nla 2 760 71 32 5 1 500 62 28 542 48 22 414 40 18 234 26 12 179 19 8,6 10 86 15 6,8

Esimerkki 14

Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituihin dekstraaneihin, joiden piikin MH 15 on välillä 100 000 ja 2 000 000

Viisi dekstraania (Pharmacosmos, Tanska), joilla oli eri piikin MW välillä 100 000 ja 2 000 000 ja jotka oli aktivoitu divinyylisulfonilla esimerkkien 7 ja 8 mukaisesti, liitettiin piparjuuriperoksidaasin kanssa.

" 20 Menetelmä pipar juuriperoksidaasin liittämiseksi oli seuraava: 400 mg piparjuuriperoksidaasia (Kem-En-Tec, Kööpenhamina, Tanska) ja 100 mg DVS-aktivoitua dekstraania liuo- * tettiin puskuriin, jolloin saatiin seuraavat lopulliset 25 pitoisuudet: * 10 mg piparjuuriperoksidaasia/ml; : : 2,5 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

. 0,2 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

.* 10,6).

30 Inkubointi suoritettiin 4 °C:ssa 48 tunnin ajan, minkä jälkeen geelisuodatettiin Sephacryl™ S-200:lla, joi- » 59 115413 loin määritettiin dekstraaneihin liittyneen peroksidaasin määrä. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä piparjuuriper-oksidaasimolekyylien määränä, joka liittyy yhteen deks-traanin molekyyliin, jonka keskimääräinen MW vastaa deks-5 traanin piikin MW:a (mol HRP/mol dekstraania): dekstraanin piikin liittämisen saanto mol MW HRP/mol dekstraania A 123 600 3,7 B 196 300 6,0 10 C 276 500 8,0 D 401 300 12 E 2 000 000 32

Esimerkki 15 15 Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun hydroksietyy 1 iselluloosaan

Puhdistettu piparjuuriperoksidaasi liitettiin kova- lenttisesti DVS-aktivoituun hydroksietyyliselluloosaan, : jossa oli 818 pmol reaktiivisia vinyylisulfoniryhmiä gram- 20 maa hydroksietyyliselluloosaa kohti (valmistettu, kuten on kuvattu esimerkissä 1). Liittäminen suoritettiin 4 °C:ssa.

• *

Menetelmä pipar juuriperoksidaasin liittämiseksi oli ; seuraava: 100 mg DVS-aktivoitua hydroksietyyliselluloosaa 25 (15,2 ml) sekoitettiin liuoksen kanssa, jonka muodosti i 400 mg piparjuuriperoksidaasia (Kem-En-Tec, Kööpenhamina, • Tanska) 4,8 ml:ssa vettä. Seokseen lisättiin sitten 20 ml : 0,4 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 10,6).

Kirkasta liuosta inkuboitiin 4 °C:ssa ilman sekoitusta 48 30 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktio pysäytettiin säätämällä liuoksen pH arvoon 6 - 7 1 M kloorivetyhapolla.

* » 60 115415

Liitetyn piparjuuriperoksidaasin määrän määritettiin olevan noin 37 % lisätystä piparjuuriperoksidaasista.

Esimerkki 16

Piparjuuriperoksidaasin kovalenttinen liittäminen 5 DVS-aktivoituun hydroksipropyylitärkkelykseen

Puhdistettu piparjuuriperoksidaasi liitettiin kova-lenttisesti DVS-aktivoituun hydroksipropyylitärkkelykseen, jossa oli 2 568 pmol reaktiivisia vinyylisulfoniryhmiä grammaa hydroksipropyylitärkkelystä kohti (valmistettu, 10 kuten on kuvattu esimerkissä 2). Liittäminen suoritettiin 4 °C:ssa.

Menetelmä piparjuuriperoksidaasin liittämiseksi oli seuraava: 100 mg DVS-aktivoitua hydroksipropyylitärkkelystä 15 (15,6 ml liuosta) sekoitettiin liuoksen kanssa, jonka muo dosti 400 mg piparjuuriperoksidaasia 4,4 ml:ssa vettä. Seokseen lisättiin sitten 20 ml 0,4 M dikaliumvetyfosfaat-ti/natriumhydroksidia (pH 10,6).

Kirkasta liuosta inkuboitiin 4 °C:ssa ilman sekoi-20 tusta. Näytteet otettiin erilleen 24 ja 44 tunnin inku-boinnin kuluttua, ja liittämisen saanto määritettiin gee-lisuodatuksella Sephacryl™ S-200:lla.

: Liitetyn piparjuuriperoksidaasin määrän määritet tiin olevan noin 20 % lisätystä piparjuuriperoksidaasista 25 24 tunnin liittämisen kuluttua ja noin 30 % 44 tunnin liittämisen kuluttua.

Esimerkki 17

Peptidin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun naudan seerumialbumiiniin ; 30 Synteettinen peptidi, joka sisältää kolmetoista ,* aminohappotähdettä, mukaan lukien C-päätekysteiinin, lii tettiin kovalenttisesti DVS-aktivoituun naudan seerumial-bumiiniin.

Menetelmä synteettisen peptidin liittämiseksi oli • 35 seuraava: > » 61 115413 0,5 ml DVS-aktivoitua naudan seerumlalbumiinin liuosta (valmistettu, kuten esimerkissä 3 on kuvattu) sekoitettiin 1 ml:n kanssa peptidiliuosta (7 mg/ml 0,1 M natriumkloridissa) ja 0,5 ml 3,0 M dikaliumvetyfosfaattia 5 (pH 8,5). Liittämisseosta inkuboitiin 18 tuntia huoneenlämpötilassa ilman sekoitusta.

Liittämissaanto määritettiin geelisuodatuksella 8-%:isella agaroosigeelillä (BioGel A-0,5m, BioRad), ja tulokset olivat seuraavat: 10 Geelisuodatusprofiilin mukaisesti 18 % lisättyä peptidiä liitettiin DVS-aktivoituun naudan seerumialbumii-niin. Tämä vastaa noin 12 moolia peptidiä DVS-aktivoidun BSA:n moolia kohti. Tämä oli sopusoinnussa mitatun DVS-aktivoidun BSA:n aktiivisuuden kanssa (katso esimerkki 3).

15 Esimerkki 18

Peptidin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MH on 500 000

Synteettinen peptidi (sama kuin on kuvattu esimerkissä 17), joka sisältää kolmetoista aminohappotähdettä 20 mukaan lukien C-pääte kysteiinin, liitettiin kovalentti-sesti DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000 ja jossa oli 490 pmol vinyyliryhmiä grammaa deks-: traania kohti ("erä DeX-I"; katso esimerkki 11).

Menetelmä synteettisen peptidin liittämiseksi oli • t 25 seuraava: ! 0,5 ml DVS-aktivoitua dekstraanin liuosta (26 mg/ ' ; ml) sekoitettiin 1 ml:n kanssa peptidiliuosta (3,5 mg/ml ’·’ ‘ 0,1 M natriumkloridissa) ja 0,5 ml 3,0 M dikaliumvetyfos faattia (pH 8,5). Liittämisseosta inkuboitiin 18 tuntia : 30 huoneenlämpötilassa ilman sekoitusta.

Liittämissaanto määritettiin geelisuodatuksella , 8-%:isella agaroosigeelillä (BioGel A-0,5m, BioRad), ja tulokset olivat seuraavat:

Geelisuodatusprofiilin mukaisesti noin 98 %:iin '*· 35 lisättyä peptidiä liitettiin DVS-aktivoitua dekstraaniin.

» · I

/ 1 62 1 1 541 3 Tämä vastaa noin 88 moolia peptidiä DVS-aktivoidun deks-traanin moolia kohti.

Esimerkki 19

Alkalisen fosfataasin (AP) kovalenttinen liittämi-5 nen DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW

on 500 000, korkeassa lämpötilassa

Puhdistettu alkalinen fosfataasi (Boehringer Mannheim, aste I, cat. nro 556602) liitettiin kovalenttisesti DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000. 10 DVS-aktivointi suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 6, liuos A (1 % paino/tilavuus dekstraania, 5 % tilavuus/ tilavuus divinyylisulfonia) ja DVS-aktivoitu dekstraani sisälsi 1 500 pmol reaktiivisia vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti. DVS-aktivoidun dekstraanin lopullinen 15 pitoisuus oli 8 mg/ml. Tähän DVS-aktivoidun dekstraanin erään viitataan tämän jälkeen "eränä Dex-II".

Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli seuraava: 0,03 ml DVS-aktivoitua dekstraania ("erä Dex-II") sekoitettiin 0,2 ml:n kanssa alkalista fosfataasi-20 liuosta (10 mg/ml), 0,16 ml:n kanssa 2,0 M dikaliumvety-fosfaattia (pH 9,5) ja 0,01 ml:n kanssa vettä. Kirkasta liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa ilman sekoitusta.

: Näytteet otettiin erilleen eri inkubointijaksojen - · ·_ jälkeen ja lisätyn alkalisen fosfataasin, joka on liitetty 25 dekstraaniin, prosenttiosuus määritettiin geelisuodatuk-sella Sephacryl™ S-300 HR:llä (Pharmacia, Ruotsi). Tulok-- set olivat seuraavat:

Piikkien suhteellisesta alueesta määritettiin seuraavat liittämistehokkuudet inkubointiajan funktiona [tu-• 30 lokset annetaan lisätyn liittyneen alkalisen fosfataasin (AP) prosenttiosuutena ja laskettuna liittyneen AP:n moo-. leina dekstraanimoolia kohti olettaen MW:n olevan 140 000 AP:lie ja keskimääräisen MW:n 500 000 dekstraanille]: « i H Inkubointiaika Liittämissaanto mol AP/mol (%) dekstraania 63 115413 2 tuntia 24 7,2 4 tuntia 31 9,2 6 tuntia 39 12 5 j^^^^4^unt^^^^^^ 51

Esimerkki 20

Alkalisen fosfataasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin. Suolapitoisuuden vai-10 kutus

Alkalinen fosfataasi liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW on 500 000 ("erä Dex-II"; katso esimerkki 19), neljässä eri suolapitoisuudessa.

Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli 15 seuraava: Neljä eri liuosta (A - D) alkalisen fosfataasin liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat lopulliset pitoisuudet: . Kaikki liuokset sisälsivät: 5 mg alkalista fosfataasia/ml; • 20 0,7 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; > dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH 9,0).

* Dikaliumvetyfosfaatin pitoisuudet olivat:

liuos A: 0,10 M

: liuos B: 0,25 M

25 liuos C: 0,50 M

liuos D: 0,80 M

»

Liittäminen suoritettiin 24 °C:ssa 24 tunnin ajan. Liitetyn alkalisen fosfataasin määrä määritettiin geeli-suodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä. Tulokset olivat 30 seuraavat: t »

Liuos Liittämissaanto mol AP/mol dekstraa- (%) nia 64 115413 I A 3 0,8 B 5 1,3 C 11 2,8 5 D 24 6,1

Esimerkki 21

Alkalisen fosfataasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin. pH:n vaikutus 10 Alkalinen fosfataasi liitettiin kovalenttisesti DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW on 500 000 ja jossa on 1 500 pmol vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Liittäminen suoritettiin kolmessa eri pH-arvossa.

15 Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli seuraava: Kolme dikaliumvetyfosfaattipuskuria (A - C) alkalisen fosfataasin liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat pitoi-suudet: » • 20 Kaikki liuokset sisälsivät: 5 mg alkalista fosfataasia/ml; * 0,6 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; ’ 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia.

. : Fosfaattipuskurin pH-arvot olivat: 25 liuos A: pH 8,4 liuos B: pH 9,5 liuos C: pH 10,0

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia » ’ ilman sekoitusta.

: 30 Dekstraaniin liitetyn lisätyn alkalisen fosfataasin prosenttiosuus määritettiin geelisuodatuksena Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto mol AP/mol dekstraa- (%) nia 65 115413 A 10 3 B 45 13 C 79 24 5

Esimerkki 22

Alkalisen fosfataasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin. Lämpötilan vaikutus

Puhdistettu alkalinen fosfataasi liitettiin DVS-10 aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW on 500 000 ja jossa on 1 500 μπιοί vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II").

Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli seuraava: Alkalinen fosfataasi liitettiin DVS-aktivoituun 15 dekstraaniin kolmessa eri lämpötilassa (liuokset A - C). Käytettiin seuraavia pitoisuuksia ja inkubointiaikoja: Kaikki liuokset sisälsivät: 5 mg alkalista fosfataasia/ml;

0,6 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; j 20 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

\ 10,0).

Seuraavia lämpötiloja käytettiin: i

liuos A: 4 °C liuos B: 24 °C 25 liuos C: 37 °C

Liuosta A inkuboitiin 24 tuntia ja liuoksia B ja C ; inkuboitiin 4 tuntia.

* Liittyneen alkalisen fosfataasin määrä määritettiin | geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset 30 olivat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto mol AP/mol dekstraa- (%) nia 66 115413 A 20 6,0 B 23 6,8 C 47 14 5

Esimerkki 23

Alkalisen fosfataasin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituihin dekstraaneihin, joilla on eri akti vointias teet 10 Alkalinen fosfataasi liitettiin kovalenttisesti kolmeen aktivoituun dekstraanivalmisteeseen, jotka on valmistettu, kuten esimerkissä 4 on kuvattu (liuos B) ja esimerkissä 6 (liuos A ja C) (DVS-aktivoinnin asteet olivat 414 μπιοί, 1 500 μπιοί ja 2 760 μπιοί vinyylisulfoniryhmiä 15 grammaa dekstraania kohti vastaavasti).

Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli seuraava: Kolme dekstraanivalmistetta sekoitettiin alkalisen fosfataasin ja puskurin kanssa, jolloin saatiin seu-raavat lopulliset pitoisuudet: • 20 5 mg alkalista fosfataasia/ml; 0,6 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; ja ,·. A ja B: 0,8 M dikaliumvetyfosfaattia (pH 9,5); C: 0,5 M dikaliumvetyfosf aattia (pH 9,5).

» ! Liittäminen suoritettiin 37 °C:ssa 2 ja vastaavasti 25 24 tunnin ajan.

Liittyneen alkalisen fosfataasin määrä määritettiin - geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HRrllä, ja tulokset olivat seuraavat: s ! # • 4 I 4 • 4 115413 67

Liuos μπιοί vinyyliryh- Liittämis- miä/grammaa reaktio dekstraania (%) 24 tun- 2 tuntia tia A 414 15 33 B 1 500 24 51 C 2 760 12 -* 5 * kun liuosta C inkuboitiin 24 tuntia, geeli saostui reak-tioastiassa.

Esimerkki 24 10 Vasta-aineen kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoi- tuun dekstraaniin eri pH-arvoissa

Puhdistettu vuohi-anti-hiiri-Ig (DAKO A/S, Tanska, cat. nro Z420) liitettiin kovalenttisesti DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000, joka sisälsi 15 1 500 pmol vinyylisulfoniryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II").

Menetelmä Ig:n liittämiseksi oli seuraava: Kaksi , j dikaliumvetyfosfaattipuskuria (A ja B) vuohi-anti-hiiri-

Ig:n liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistet-20 tiin, jolloin saatiin seuraavat pitoisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: !! 6,9 mg vuohi-anti-hiiri-Ig/ml; 0,9 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia.

·· · 25 Puskureiden pH:t olivat: liuos A: pH 8,4 • liuos B: pH 9,5 . Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 24 tuntia.

» i * * » 115413 68

Liittyneen lisätyn vuohi-anti-hiiri-Ig:n prosenttiosuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto (%) 5 A 18 B -1 *saostuminen tapahtui reaktioastiassa.

10 Esimerkki 25

Vasta-aineen kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoi-tuun dekstraaniin korkeassa ja alhaisessa lämpötilassa

Vuohi-anti-hiiri-Ig (DAKO A/S, Tanska, cat. nro 15 Z420) liitettiin kovalenttisesti DVS-aktivoituun deks traaniin, jonka piikin MW oli 500 000, ("erä Dex-II") kahdessa eri lämpötilassa.

Menetelmä Ig:n liittämiseksi oli seuraava: Vuohi-anti-hiiri-vasta-ainetta inkuboitiin 4 °C:ssa ja 24 °C:ssa 20 käyttäen seuraavia olosuhteita:

Kaikki liuokset (A - C) sisälsivät: • · 6,9 mg vuohi-anti-hiiri-Ig/ml; 0,9 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; • ‘ 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia (pH 9,5).

25 Näytettä A ja C inkuboitiin 24 tuntia, näytettä B

: 48 tuntia.

Liittyneen vasta-aineen pitoisuus määritettiin gee-lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä. Piikkien suhteel-. lisesta alueesta määritettiin seuraavat liittämistehokkuu- 30 det lämpötilan funktiona: • · 1 115413 69 Näyte Lämpötila ( °C) Liittämissaanto (%) A 4 28 B 4 39 C 24 -1 5 *geelin saostuminen tapahtui näytteessä 24 °C:ssa.

Esimerkki 26

Kanin immunoglobuliinin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin (piikin MU 500 000) 10 korkeassa lämpötilassa

Normaali kanin immunoglobuliini (DAKO A/S, Tanska, cat. nro X903) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000, ("erä Dex-II") korkeassa lämpötilassa.

15 Menetelmä kanin immunoglobuliinin liittämiseksi oli seuraava: 1 ml kanin immunoglobuliinivalmistetta (20 mg/ ml) sekoitettiin 0,32 ml:n kanssa DVS-aktivoitua dekstraa-nia ja 0,44 ml:n kanssa 2,0 M dikaliumvetyfosfaattia (pH > 9,5).

• 20 Kirkasta liuosta inkuboitiin 24 °C:ssa ilman sekoi- tusta.

Näytteet otettiin erilleen eripituisten inkubointi-jaksojen jälkeen ja dekstraaniin liittyneen lisätyn nor-! maalin kanin immunoglobuliinin prosenttiosuus määritettiin 25 geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HRtllä. Tulokset oli vat seuraavat: * ‘ , Inkubointiaika Liittämissaanto (%) ·. 5 tuntia 58 ,30 20 tuntia -1 ä t • > | 1 t t saostuminen oli tapahtunut näytteessä 20 tunnin kuluttua.

115413 70

Esimerkki 27

Ammoniakin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoi- tuun dekstraaniin

Ammoniakki liitettiin kovalenttisesti DVS-aktivoi-5 tuun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000. Aktivointi suoritettiin, kuten esimerkissä 4 on kuvattu, liuos E (5 % paino/tilavuus dekstraania, 0,5 % tilavuus/tilavuus divi-nyylisulfonia), ja DVS-aktivoitu dekstraani sisälsi 86 pmol vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti. DVS-aktivoi-10 dun dekstraanin lopullinen pitoisuus oli 22 mg/ml. Tähän erään viitataan tämän jälkeen "eränä Dex-III".

Menetelmä ammoniakin liittämiseksi oli seuraava: Hyvin tuuletetussa suojuksessa 50 ml:aan DVS-aktivoitua dekstraania lisättiin 50 ml väkevää ammoniakkia vedessä. 15 Liuosta kuumennettiin 60 °C:seen ja pidettiin siinä lämpötilassa 2 tuntia. Liuos dialysoitiin sitten perusteellisesti 4x5 litraa 0,5 M natriumkloridia vastaan kahden vuorokauden aikana huoneenlämpötilassa.

Dialyysin jälkeen tilavuus oli kasvanut 73 ml:aan 20 ja dekstraanin lopullinen pitoisuus oli siksi 15,1 mg/ml.

DVS-aktivoituun dekstraaniin liittyneiden aminoryh-mien pitoisuudeksi määritettiin happo-emäs-titrauksella : noin 80 pmol grammaa dekstraania kohti. Tuotteeseen viita taan seuraavassa "aminodekstraanina".

25 Esimerkki 28

Fluoreseiini-isotiosyanaatin (F1TC) kovalenttinen liittäminen aminodekstraaniin

Fluoreseiini-isotiosyanaatti (Sigma, F-7250) liitettiin aminodekstraaniin, joka on johdettu dekstraanista, : 30 jonka piikin MW oli 500 000. Aminodekstraani (liuoksessa) valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 27.

: Menetelmä fluoreseiini-isotiosyanaatin liittämisek- . si oli seuraava: 10 ml aminodekstraaniliuosta dialysoitiin yön yli 2 litraa 0,1 M natriumkarbonaatti/bikarbonaattia ; *· 35 (pH 9,5) vastaan. Dialyysin jälkeen tilavuus oli 9,5 ml ja dekstraanin lopullinen pitoisuus oli 15,8 mg/ml.

115413 71 30 mg fluoreseiini-isotiosyanaattia liuotettiin dimetyylisulfoksidiin pitoisuudeksi 10,0 mg/ml; 2,4 ml tätä liuosta lisättiin tipoittain 9,5 ml:aan jälkimmäistä aminodekstraaniliuosta sekoittaen.

5 Reaktion annettiin edetä 1,5 tuntia huoneenlämpöti lassa suojattuna valolta.

Konjugaation (liittämisen) jälkeen reagoimaton tai hydrolysoitu väriaine poistettiin geelisuodatuksella Sep-hadex™ G 25:llä (Pharmacia, Ruotsi).

10 Saatua liuosta dialysoitiin sitten 0,1 M dikalium- vetyfosfaattia (pH 7,2) vastaan. Dialyysin jälkeen tilavuus oli 23 ml ja dekstraanin lopullinen pitoisuus oli siksi 6,6 mg/ml.

Aminodekstraaniin liittyneen fluoreseiini-isotio-15 syanaatin määrän määritettiin absorbanssimittauksilla 495 nm:ssä ja 280 nm:ssä olevan 68 mol FITC:tä dekstraanimoo-lia kohti. Tuotteeseen viitataan seuraavassa "fluoreseii-nidekstraanina".

Esimerkki 29 20 Fluoreseiinidekstraanin DVS-aktivointi

Fluoreseiinidekstraani, joka on johdettu deks-traanista, jonka MW on 500 000, aktivoitiin uudelleen (so.

| DVS-aktivoitiin) divinyylisulfonilla. Fluoreseiinideks traani (liuoksessa) valmistettiin, kuten on kuvattu esi-25 merkissä 28.

Uudelleenaktivointimenetelmä oli seuraava: 10 ml ; fluoreseiinidekstraaniliuosta sekoitettiin 10 ml:n kanssa 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 11,5) ja 5 mg:n kanssa natriumboorihydridiä huoneenlämpötilassa.

: 30 Heti natriumboorihydridin liukenemisen jälkeen li- .· sättiin 1 ml divinyylisulfonia (hyvin tuuletetussa suojuk- .: sessa).

Varovainen sekoitus suoritettiin magneettisekoitti-mella. 60 minuutin jälkeen seoksen pH säädettiin arvoon ·* 35 6 - 7 5 M kloorivetyhapolla reaktion pysäyttämiseksi.

115413 72

Liuosta dialysoitiin sitten 4x2 litraa 0,5 M nat-riumkloridia vastaan suojattuna valolta.

Dialyysin jälkeen tilavuus oli kasvanut 26 ml:aan ja DVS-aktivoidun fluoreseiinidekstraanin lopullinen pi-5 toisuus oli siksi 2,5 mg/ml.

Reaktiivisten vinyyliryhmien pitoisuus määritettiin reaktiolla natriumtiosulfaatin kanssa, minkä jälkeen saadut hydroksidi-ionit titrattiin standardilla kloorivetyha-polla (katso esimerkki 1).

10 Titraustulokset osoittivat, että DVS-aktivoitu fluoreseiinidekstraani sisälsi 1 080 pmol reaktiivisia vi-nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti.

Esimerkki 30

Vasta-aineen kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoi-15 tuun fluoreseiinidekstraaniin

Affiniteettipuhdistettu kani-anti-prostata-spesi-fiset antigeenivasta-aineet (kani-anti-PSA) (DAKO A/S, Tanska, cat. nro A562) liitettiin uudelleenaktivoituun fluoreseiinidekstraaniin, joka on valmistettu, kuten esi-20 merkissä 29 on kuvattu. DVS-aktivoitu fluoreseiinidekstraani sisälsi 1 080 pmol vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ja 35 mol fluoreseiinia dekstraanimoolia kohti.

* • Menetelmä kani-anti-prostata-spesifisten antigeeni- vasta-aineiden liittämiseksi oli seuraava: 1 ml uudelleen-25 aktivoidun fluoreseiinidekstraanin liuosta sekoitettiin \m 18 ml:n kanssa kani-anti-PSA-valmistetta, minkä jälkeen ! lisättiin 2,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH 10,0), jolloin saatiin lopullinen pitoisuus 0,7 M fosfaattia, pH 10,0.

30 Kirkasta liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa ilman sekoi tusta 24 tuntia.

: Liittyneen kani-anti-PSA:n pitoisuudeksi määritet tiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300:lla noin 20 % lisätystä määrästä, joka vastaa noin 4 mol vasta-ainetta 35 dekstraanimoolia kohti.

115413 73

Esimerkki 31

Avidiinin kovalenttinen liittäminen DVS-aktivoituun dekstraaniin

Avidiini kananmunan valkuaisesta (Kem-En-Tec, Tans-5 ka) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, jonka piikin MW oli 500 000 ("erä Dex-I").

Menetelmä avidiinin liittämiseksi oli seuraava: Avidiini sekoitettiin DVS-aktivoidun dekstraaniliuoksen kanssa, jolloin saadaan seuraavat loppupitoisuudet: 10 3,0 mg avidiinia/ml; 0,77 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

0,8 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

10,1).

Liittämisseosta inkuboitiin 30 °C:ssa 20 tuntia, 15 minkä jälkeen titrattiin pH-arvoon 7 1 M kloorivetyhapolla ja dialysoitiin 24 tuntia 5 litraa 0,1 M natriumkloridia vastaan.

Geelisuodatus Sepharose™ Cl 6B:llä (Pharmacia, Ruotsi) osoitti, että 45 % lisätystä avidiinista liitet-20 tiin DVS-aktivoituun dekstraaniin. Tämä vastaa noin 14 mol avidiinia dekstraanimoolia kohti, jonka MW oli 500 000.

Esimerkki 32 ,· Iminodietikkahapon kovalenttinen liittäminen DVS- aktivoituun dekstraaniin . 25 Iminodietikkahappo liitettiin DVS-aktivoituun deks traaniin, jonka piikin MW oli 20 000 ja joka valmistettiin ! esimerkin 9 mukaisesti.

Liittämismenetelmä oli seuraava: Iminodietikkahappo sekoitettiin DVS-aktivoidun dekstraaniliuoksen kanssa, : 30 jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: .· 0,5 M iminodietikkahappoa, 30 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml.

Seos titrattiin pH-arvoon 11,0 5 M natriumhydroksi-• dilla ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 24 tuntia. Inku- 35 boinnin jälkeen kirkasta liuosta (127 ml) dialysoitiin : perusteellisesti vettä vastaan.

115413 74

Dialysoidun liuoksen happo-emästitraus osoitti pitoisuuden noin 1 150 pmol iminodietikkahappoa grammaa dekstraania kohti. Tuotteeseen viitataan seuraavassa "imi-nodietikkahappodekstraanina".

5 Esimerkki 33

Iminodietikkahappodekstraanin OVS-aktivointi Iminodietikkahappodekstraani, joka valmistettiin esimerkin 32 mukaisesti, aktivoitiin uudelleen divinyy-lisulfonilla.

10 Uudelleenaktivointimenetelmä oli seuraava: 50 ml

iminodietikkahappodekstraaniliuosta (16 mg/ml) sekoitettiin 50 ml: n kanssa 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia (pH

11,5), 25 mg:n kanssa natriumboorihydridiä ja 5 ml:n kanssa divinyylisulfonia.

15 Seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa sekoittaen 30 minuuttia ja titrattiin sitten pH-arvoon 7 5 M kloori-vetyhapolla. Kirkasta liuosta dialysoitiin sitten perusteellisesti vettä vastaan.

Dialyysin jälkeen DVS-aktivoidun iminodietikkahap- 20 podekstraanin pitoisuus oli 5 mg/ml ja reaktio tiosulfaa-tin kanssa, mitä seurasi kloorivetyhappotitraus (katso : esimerkki 1), paljasti pitoisuudeksi 1 320 pmol vinyyli- • ryhmiä grammaa dekstraania kohti.

Esimerkki 34 25 Naudan gammaglobuliinien kovalenttinen liittäminen piparjuuriperoksidaasidekstraaniinsuolapitoisuuden funktiona *

Naudan gammaglobuliinit (99-%:isesti puhdas, Sigma, cat. nro G-5009) liitettiin jäljelle jääviin piparjuuri-: 30 peroksidaasidekstraanin, joka on valmistettu esimerkin 12 ,· mukaisesti, reaktiivisiin vinyylisulfoniryhmiin käyttäen : 192 tunnin inkubaatiota.

Käytetty piparjuuriperoksidaasiperoksidaasi sisälsi t keskimäärin 19 mol piparjuuriperoksidaasia dekstraanimoo-“ 35 lia kohti, jonka piikin MW oli 500 000, ja se puhdistet- 115413 75 tiin, jolloin poistettiin vapaa piparjuuriperoksidaasi geelisuodatuksella 8-%:isella agaroosigeelillä (BioGel A-0.5m, BioRad). Piparjuuriperoksidaasidekstraanin pitoisuuden laskettiin olevan 5,8 mg/ml, joka vastaa 3,5 mg 5 piparjuuriperoksidaasia/ml ja 2,3 mg dekstraania/ml. Tuote liuotettiin 0,1 M natriumkloridiin, joka sisälsi 0,01 % paino/tilavuus 1,1,l-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (Sigma, cat. nro T 5138).

Tähän piparjuuriperoksidaasidekstraaniin viitataan 10 tämän jälkeen "eränä HRP-Dex-I".

Naudan gammaglobuliinien liittäminen suoritettiin eri dikaliumvetyfosfaatin pitoisuuksilla, jolloin tutkittiin lyotrooppisen suolan vaikutusta liittämistehokkuu-teen.

15 Menetelmä naudan gammaglobuliinien liittämiseksi oli seuraava:

Naudan gammaglobuliini ja piparjuuriperoksidaasi-dekstraani sekoitettiin, jolloin saatiin seuraavat loppu-pitoisuudet: 20 7,88 mg naudan gammaglobuliinia/ml; 2,57 mg piparjuuriperoksidaasidekstraania/ml (vastaa 1,02 mg:aa dekstraania/ml); ,| ja seuraavat fosfaattipitoisuudet (dikaliumvetyfosfaatti/ natriumhydroksidina, pH 10,1):

25 näyte A: 0,10 M

!t näyte B: 0,20 M

! näyte C: 0,35 M

näyte D: 0,50 M näyte E: 0,70 M : 30 näyte F: 0,90 M

Näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 tun-tia. Inkuboinnin jälkeen pH säädettiin arvoon 7 1 M kloo-rivetyhapolla.

/ Liittämisaste (liittämistehokkuus) eri näytteissä ” 35 määritettiin sitten geelisuodatuksella Sepharose™ Cl * » 115413 76 6B:llä. Liittämistehokkuus arvioitiin muutoksesta integroidussa UV-absorbanssissa fraktioissa, jotka sisältävät vapaan ja deksträäniin liittyneen proteiinin, samoin kuin mittaamalla muutos piparjuuriperoksidaasidekstraanin ab-5 sorbanssissa 280 nm:ssä ja 403 nm:ssä ennen liittämistä ja liittämisen jälkeen. Saatiin seuraavat tulokset: Näyte Fosfaatti- % liittynyttä mol gammaglo-pitoisuus gammaglobu- buliinia/mol liinia dekstraania A 0,10 M 18 noin 4,5 10 B 0,20 M 20 noin 5,0 C 0,35 M 19 noin 5,0 D 0,50 M 24 noin 6,0 E 0,70 M 30 noin 7,5 F 0,90 M -1 15 , 1 0,9 M:ssa fosfaattia proteiinikonjugaatti saostui irre- » versiibelisti.

.: Esimerkki 35 20 Naudan gammaglobuliinin kovalenttinen liittäminen piparjuuriperoksidaasidekstraanin vinyylisulfoni-ryhmien reaktiivisuuden retention mittana

Piparjuuriperoksidaasidekstraanissa jäljelle jää-: vien vinyylisulfoniryhmien, jotka on valmistettu esimerkin ’·, 25 12 mukaisesti, pitkäaikaista stabiilisuutta tutkittiin mittaamalla pipar juuriperoksidaasidekstraanin liittämiska- : pasiteetti ennen inkubointia ja 12 viikon inkuboinnin jäl keen eri lämpötiloissa.

Liittämistehokkuus naudan gammaglobuliinien liit-. 30 tämiseksi piparjuuriperoksidaasidekstraaniin ("erä HRP- 115413 77

Dex-I") määritettiin käyttäen liittämisolosuhteita, kuten on kuvattu näytteelle D esimerkissä 34. Liittämistehokkuus määritettiin geelisuodatuksella, kuten on kuvattu esimerkissä 34, ennen inkubointia ja piparjuuriperoksidaasideks-5 traanin inkuboinnin -20, +4, +20 ja +30 °C:ssa jälkeen.

Ennen inkubointia saatu liittämissaanto määriteltiin mielivaltaisesti 100 %:ksi ja 12 viikon kuluttua saadut tulokset ilmaistaan tämän suhteen: 10 Näyte Inkubointilämpötila Suhteellinen °C liittämissaan to (%) A -20 110 B +4 95 C +20 80 D +30 70 15

Esimerkki 36A

.. Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittäminen pi- parjuuriperoksidaasidekstraaniin. pH:n vaikutus i ‘ Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinit (DAKO, Tanska, 20 cat. nro Z259) liitettiin piparjuuriperoksidaasidekstraa-,* niin kahdessa eri pH-arvossa. Piparjuuriperoksidaasideks- f traani valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 12 (48 : tuntia 4 °C:ssa), ja se sisälsi 16 mol peroksidaasia deks- traanimoolia kohti.

25 Liittämismenetelmä oli seuraava: Valmistettiin kak- ·. si eri liuosta kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittä miseksi piparjuuriperoksidaasidekstraaniin, jolloin saa- i tiin seuraavat loppupitoisuudet: ,* Kaikki liuokset sisälsivät: 30 1,9 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; : HRP-dekstraani, joka vastaa 0,25 mg:aa dekstraa- nia/ml; 115413 78 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti, joka on titrattu joko kloorivetyhapolla tai natriumhydroksidilla arvoon: liuos A: pH 8,5 liuos B: pH 10,0.

5 Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 42 °C:ssa 20 tuntia ilman sekoitusta.

Piparjuuriperoksidaasidekstraaniin liittyneiden lisättyjen kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien prosenttiosuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 10 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto mol RAM/mol (%) dekstraania A 15 3,8 B 30 7,5 15

Esimerkki 36B

Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittäminen pi-parjuuriperoksidaasidekstraaniin. Lämpötilan vaiku- • tus 20 Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinit (DAKO, Tanska, ,* cat. nro Z259) liitettiin piparjuuriperoksidaasidekstraa- ·* niin. HRP-dekstraani valmistettiin, kuten on kuvattu esi- i merkissä 12 (48 tuntia 4 °C:ssa), ja se sisälsi 16 mol ;* piparjuuriperoksidaasia dekstraanimoolia kohti.

! 25 Liittämismenetelmä oli seuraava: Valmistettiin kak si liuosta kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittämisek- : si piparjuuriperoksidaasidekstraaniin, jolloin saatiin * ; seuraavat loppupitoisuudet: , Kaikki liuokset sisälsivät: * 30 1,9 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; HRP-dekstraani, joka vastaa 0,25 mg:aa dekstraa- , nia/ml; t ! 115413 79

0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidi (pH

10,0).

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 tuntia:

Liuos A: 22 °C 5 Liuos B: 42 °C.

Liittyneiden kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien pitoisuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat: 10 Liuos Liittämissaanto mol RAM/mol (%) dekstraania A 17,5 4,3 B 30,0 7,5 BBSSBSBSBBHEBB:^BBSSS^SSBSS=BSa89SBSBSBBBSSSSaaBBSaal

Esimerkki 36C

15 Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittäminen pi- parjuuriperoksidaasidekstraaniin. Vasta-aineen ja HRP-dekstraanin pitoisuuden vaikutus

Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinit (DAKO, Tanska, cat. nro Z259) liitettiin piparjuuriperoksidaasidekstraa-20 niin viidessä eri vasta-aineen ja HRP-dekstraanin pitoi-'/ suudessa pitäen vasta-aineen moolisuhteen HRP-dekstraaniin vakiona (A - E). HRP-dekstraani valmistettiin, kuten on •-.* kuvattu esimerkissä 12 (48 tuntia 4 °C:ssa), ja se sisälsi . 16 mol piparjuuriperoksidaasia dekstraanimoolia kohti.

25 Liittämismenetelmä oli seuraava: Valmistettiin vii si eri liuosta (A - E) kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittämiseksi piparjuuriperoksidaasidekstraaniin, jolloin .saatiin seuraavat loppupitoisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: »

30 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidi (pH

: 10,0).

Liuos A: 5,7 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; .: HRP-dekstraania, joka vastaa 0,79 mg:aa dekstraa- nia/ml.

80 115413

Liuos B: 6,7 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; HRP-dekstraania, joka vastaa 0,92 mg:aa dekstraa- nia/ml.

Liuos C: 7,0 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; 5 HRP-dekstraania, joka vastaa 0,96 mg:aa dekstraa- nia/ml.

Liuos D: 7,2 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; HRP-dekstraania, joka vastaa 1,00 mg:aa dekstraa- nia/ml.

10 Liuos E: 7,6 mg kani-anti-hiiri-Ig/ml; HRP-dekstraania, joka vastaa 1,03 mg:aa dekstraa- nia/ml.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 20 tuntia. Liittyneiden kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien pi-15 toisuus määritettiin geelisuodatuksena Sephacryl™ S-300 HR:llä.

Piikkien suhteellisista alueista määritettiin seu-raavat liittämistehokkuudet vasta-ainepitoisuuden funktiona: 20

Liuos Liittämissaanto mol RAM/mol » \ (%) dekstraania *! A 29 6,7 φ [[: B 32 7,5 ► · C 36 8,5 . · ' • 25 D 40 9,3 : osittain saostu- !,* nut *

. E saostunut R

t ·

I

81 115413

Esimerkki 36D

Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien liittäminen eri DVS-aktivoituihin piparjuuriperoksidaasidekstraa- neihin 5 Kani-anti-hiiri-immunoglobuliinit (DAKO, Tanska, cat. nro Z259) liitettiin viiteen eri DVS-aktivoituun pi-parjuuriperoksidaasidekstraaniin, jotka valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 13 (1 500, 542, 234, 179 ja 86 pmol vinyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti vastaavas-10 ti).

Liittämismenetelmä oli seuraava: Kaikki viisi pipar juuriperoksidaadidekstraanivalmistetta sekoitettiin kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien ja puskurin kanssa, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: 15 HRP-dekstraania, joka vastaa 0,2 mg dekstraania/ml; 1,7 mg kani-anti-hiiri-immunoglobuliinia/ml;

0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

10,0).

Liittäminen suoritettiin 42 °C:ssa 20 tuntia ilman 20 sekoitusta.

Liittyneiden kani-anti-hiiri-immunoglobuliinien pitoisuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 j HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat: ♦ » t » I · * · t * ♦ * * » I · * > » 115413 82 I Liuos μπιοί vi- mol HRP/ % liitty- mol RAM/ nyyliryh- mol deks- nyttä mol deks-miä/g traania RAMia traania dekstraa-nia A 1 500 28 10 2,7 B 542 22 5 1,4 C 243 12 * 1 0,3 5 D 179 8,6 * 1 0,3 | E 86 6,8 * 1 0,3

Esimerkki 37Ά

Vuohi-anti-kani-Ig:n liittäminen piparjuuriperoksi-10 daasidekstraaniin

Affiniteettipuhdistettu vuohi-anti-kani-Ig liitettiin HRP-dekstraaniin ("erä HRP-Dex-I"; katso esimerkki 34).

Liittämisolosuhteet: : 15 Vasta-ainevalmiste ja HRP-dekstraaniliuos sekoitet- ,· tiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: t 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia (pH 10,1) *. 2,0 mg vuohi-anti-kani-Ig/ml 0,52 mg piparjuuriperoksidaasidekstraania/ml (vas-! 20 taa 0,21 mg:aa dekstraania/ml) Näytettä inkuboitiin 30 °C:ssa 20 tuntia. Liittämisen jälkeen glysiiniä lisättiin näytteeseen ‘ ί loppupitoisuudeksi 0,2 M glysiiniä, pH 10, ja tätä seurasi s « * '...· 2 tunnin inkubointi [jolloin saatiin jäljelle jäävien vi- 25 nyylisulfoniryhmien deaktivointi (estäminen) niiden reak- ,··*, tiolla glysiinin kanssa].

• Inkuboinnin jälkeen näytettä dialysoitiin yön yli " 4 °C:ssa 0,05 M Tris/HCl:a vastaan, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

* - » 83 115413 Näyte altistettiin sitten geelisuodatukselle Sep-harose™ CL 6B:llä vapaan vasta-aineen ja HRP-dekstraaniin sitoutuneen vasta-aineen erottamiseksi.

Tulokset: 5 Liittämissaannon vuohi-anti-kani-Ig:lie määritet tiin olevan 25 %, joka vastaa 8 mol vuohi-anti-kani-Ig:tä dekstraanimoolia kohti (olettaen dekstraanin piikin MW:n olevan 500 000 ja vasta-aineen MW:n olevan 155 000). Lopullinen tuote sisältää siten keskimäärin 8 moolia vasta-10 ainetta ja 19 moolia piparjuuriperoksidaasia dekstraanimoolia kohti.

Esimerkki 37B

Affiniteettipuhdistetun vuohi-anti-kani-Ig:n liittäminen yhdessä "normaalin" vuohen immunoglobulii-15 nin kanssa piparjuuriperoksidaasidekstraaniin. Ak tiivisuus aktiivisen vasta-aineen konjugaattipitoi-suuden funktiona

Affiniteettipuhdistettu vuohi-anti-kani-Ig yhdessä "normaalin" vuohi-IgG:n kanssa (so. immunoglobuliinit ei-20 immunisoiduista vuohista) liitettiin eri annoksina HRP-dekstraaniin. Kokeen tarkoitus oli tutkia absorbanssisig-: naalin intensiteettiä (testattu ELlSAssa), joka saadaan ,· lopullisten dekstraanikonjugaattien kanssa dekstraaniin liittyneiden antigeeni-spesifisten vasta-ainemolekyylien 25 keskimääräisen lukumäärän funktiona.

> Liittämisolosuhteet: > · I Affiniteettipuhdistettu vuohi-anti-kani-Ig, "nor- maali" vuohi-immunoglobuliini ja piparjuuriperoksidaasi- dekstraani ("erä HRP-Dex-I") sekoitettiin, jolloin saatiin • 30 seuraavat loppupitoisuudet: ? · * • » t 115413 84 RB^BSaaSBSBBS^SBSSBBtB^SSBSaBSBSSaSBlB^aBSSIEBBBSaSBSa! Näyte Affiniteettipuh- "normaali" vuo- distettu vuohi- hi-IgG (mg/ml) anti-kani-Ig (mg/ml) A 2,0 0 B 1,6 0,4 C 1,2 0,8 5 D 0,8 1,2 E 0,4 1,6 F 0 2,0

Kaikki näytteet: 10 0,5 M dikaliumvetyfosfaattia (pH 10,1) 0,55 mg HRP-dekstraania/ml (vastaa 0,22 mg:aa deks-traania/ml).

Näytettä inkuboitiin 30 °C:ssa 20 tuntia. Liittämisen jälkeen glysiiniä lisättiin näytteisiin 15 loppupitoisuudeksi 0,2 M glysiiniä, pH 10, ja tätä seurasi 2 tunnin inkubointi [jolloin saatiin jäljelle jäävien vi-nyylisulfoniryhmien deaktivointi (estäminen) niiden reak- » tiolla glysiinin kanssa], ‘ .· Inkuboinnin jälkeen näytteitä dialysoitiin yön yli ;* 20 4 °C:ssa 0,05 M Tris/HCl:a vastaan, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

i : Näytteet altistettiin sitten geelisuodatukselle

Sepharose™ CL 6B:llä vapaiden immunoglobuliinien ja HRP- : \ dekstraaniin sitoutuneiden immunoglobuliinien erottami- ♦ - * * , seksi.

• · ·’ 25 Tulokset: • * Liittämissaannon - olettaen kahdella vuohi-immu- noglobuliinivalmisteella olevan sama liittämisreaktiivi-suus - määritettiin olevan 22 %, joka vastaa keskimäärin » ,·, ; yhteensä 6,5 mol vuohi-immunoglobuliinia dekstraanimoolia • ! k » t 115413 85 kohti. Olettaen taas kahden tyyppisillä immunoglobulii-neilla olevan saman liittämisreaktiivisuuden lopullinen keskimääräinen moolimäärä kunkintyyppisiä immunoglobulii-neja dekstraaneja kohti oli seuraava: 5 - TTT, - ------------- ' ^ ----- - Näyte mol affiniteettipuhdistet- mol "normaalia" tua vuohi-anti-kani-Ig/ vuohi-IgG/mol mol dekstraania dekstraania A 6,5 0 B 5,2 1,3 C 3,9 2,6 10 D 2,6 3,9 E 1,3 5,2 F 0 6,5 ELISA-tulokset: 15 Kuusi dekstraanikonjugaattia karakterisoitiin . ELISAssa ("yleisen ELISA-menetelmän" mukaan, kolme kerros- *' ta).

ELISA-olosuhteet: » 1. kerros: 20 Vuohi-anti-kani-Ig (1 pg/ml) laimennettiin dika- liumvetyfosfaattiin (pH 7,2).

: : : 2. kerros:

Kani-IgG (1 ng/ml) laimennettiin 0,1 M dikaliumve-tyfosfaattiin, 0,5 M NaCl, l-%:inen Tween™ 20 (pH 7,2).

25 3. kerros:

Kuuden konjugaatin sarjalaimennukset 0,1 M dika- liumvetyfosfaattiin, l-%:inen Tween™ 20 (pH 7,2).

Kuten kuviosta 2 voidaan nähdä, on olemassa selvä suhde liittyneiden vuohi-anti-kani-vasta-aineiden määrän ; 30 ja ELISAssa saadun absorbanssisignaalin intensiteetin vä- 115413 86

Iillä. Vuohi-anti-kani-vasta-aineiden dekstraanilla puuttumisesta saadaan signaalin puute, kuten on oletettu.

Esimerkki 37C

HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-Ig:nkarakterisointi 5 ELISAssa ja Dot Bloteissa

Vuohi-anti-kani-Ig, joka liitettiin HRP-dekstraa-niin ja altistettiin geelisuodatukselle Sepharose™ CL 6B:llä, kuten esimerkissä 37A on kuvattu, karakterisoitiin ELISAssa ja Dot Bloteissa. Vertailun vuoksi "tavanomainen" 10 konjugaatti (HRP-leimattu sika-anti-kani-Ig; DAKO A/S, Tanska, cat. nro P217) altistettiin samoille menetelmille.

ELISA ("yleisen ELlSA-menetelmän" mukaan) 1. kerros:

Vuohi-anti-kani-Ig (1 pg/ml) 0,1 M dikaliumvetyfos-15 faatissa (pH 7,2); 2. kerros:

Kani-IgG (1 ng/ml) laimennettiin 0,1 M dikaliumve-tyfosfaattiin, l-%:inen Tween™ 20 (pH 7,2); 3. kerros: 20 HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-Ig tai HRP-leimatun sika-anti-kani-Ig (DAKO A/S, Tanska, cat. nro P217) sarja- *: laimennus 0,1 M dikaliumvetyfosfaatissa, l-%:inen Tween™ * .· 20 (pH 7,2).

'. Tulokset: 25 Kuten kuviosta 3 voidaan nähdä, dekstraanipohjaista konjugaattia voidaan laimentaa paljon enemmän kuin tavan- ,!! omaista konjugaattia ja se silti suurentaa merkittävää • » » ’ signaalia, mikä osoittaa kasvanutta herkkyyttä, joka saa daan käyttäen keksinnön konjugaattia reagenssina.

"ί ί 30 Dot Blotit ("yleisen menetelmän Dot Bloteille" mu- kaisesti): : Tulokset: ,·*, Keksinnön mukaisesta HRP-dekstraani/vuohi-anti-ka- • · ni-Ig-konjugaatista saatiin 10-kertainen kasvu herkkyydes- ” 35 sä tavanomaisen konjugaatin suhteen (so. voitiin havaita , i 10 kertaa pienempi määrä kani-IgG:tä täplissä).

115413 87

Esimerkki 38

Avidiinin liittäminen piparjuuriperoksidaasideks-traaniin

Avidiini kananmunan valkuaisesta liitettiin HRP-5 dekstraaniin ("erä HRP-Dex-I"; katso esimerkki 34) eri avidiinin pitoisuuksissa ja moolisuhteissa HRP-dekstraa-niin.

Liittämisolosuhteet:

Seuraavia komponentteja sekoitettiin: 10 (a) avidiini 25 mg/ml (b) HRP-dekstraani, joka vastaa 0,52 mg:aa deks-traania/ml (c) 2 M K2HP04/Na0H pH 10,0 (d) vesi 15 Kaikki liittämiset suoritettiin fosfaattipitoisuu- dessa 0,82 M. Avidiinin ja HRP-dekstraanin pitoisuudet esitetään seuraavassa: Näyte Avidii- HRP-dekstraa- Moolisuhde 20 nro ni ni mg/ml (avidiini:HRP-deks- • # mg/ml traani) liuoksessa • ____ 1 0,3 0,27 2 2 1,1 0,27 8 3 4,2 0,27 30 4 17,0 0,27 120 25 1-^-1-1-1

Moolisuhde annetaan mooleina avidiinia moolia HRP- > · dekstraania kohti liittämisliuoksessa.

’ , Liittämisnäytteitä inkuboitiin 30 °C:ssa 20 tuntia.

’ I »

Liittämisen jälkeen näytteitä dialysoitiin vettä » .1 30 vastaan 2 tuntia huoneenlämpötilassa.

· » » 88 115413 Näytteet altistettiin sitten geelisuodatukselle Sepharose™ CL-6B:llä vapaan ja HRP-dekstraaniin sitoutuneen avidiinin erottamiseksi.

Liittämisten tulokset: 5 Liitetyn avidiinin pitoisuuden saaduissa konjugaa- teissa todettiin kasvavan, kun avidiinin moolisuhde HRP-dekstraaniin kasvaa ja lähestyy tasaisen kohdan arvoa, moolisuhteessa yli 30 on erittäin vähän kasvua. Tulokset esitetään seuraavassa: 10 Näyte Moolisuhde mol liittynyttä nro (avidiini:HRP-deks- avidiinia/mol traani) dekstraania 12 2 2 8 6 15 3 30 11 4 120 12

Koe ELISAssa

Peroksidaasidekstraani/avidiinikonjugaateilla saa- / 20 tava detektioherkkyys konjugaatteihin liittyneiden avidii- » nimolekyylien lukumäärän funktiona testattiin ELISAssa.

Viittauksella "yleiseen ELISA-menetelmään" , seuraa-vaa järjestelyä käytettiin: ·_ : kerros 1: vuohi-anti-kani-IgG; 0,025 mg/ml; 25 kerros 2: biotinyloidun kani-IgG:n sarjalaimennuk- set; kerros 3: HRP-dekstraani/avidiinikonjugaatit; kukin konjugaatti laimennettiin samaan proteiinipitoisuuteen, so. absorbanssiarvoon 0,00063 280 nm:ssä (A280).

• 30 ELISA-tulokset:

Kuvio 4 osoittaa absorbanssin 492 nm:ssä kerrok- : sessa 2 olevan biotinyloidun kani-IgG:n pitoisuuden funk tiona : i · 89 115413 Käyrät kuviossa 4 osoittavat, että konjugaateilla saatava detektioherkkyys kasvaa liittyneiden avidiinimole-kyylien mukana. Siis kun liittyneiden avidiinimolekyylien määrä kasvaa, pienemmät määrät biotinyloitua kani-IgG:tä 5 voidaan havaita.

Esimerkki 39

Streptavidiinin liittäminen piparjuuriperoksidaasi-dekstraaniin

Affiniteettipuhdistettu streptavidiini liitettiin 10 HRP-dekstraaniin ("erä HRP-Dex-I"; katso esimerkki 34) väliaineessa, joka sisälsi dikaliumvetyfosfaatin eri pitoisuuksia (pH 10,1).

Liittämisolosuhteet: Käytettiin seuraavia väliaineita: 15 1: 0,01 M dikaliumvetyfosfaatti (pH 10,1) 2: 0,80 M dikaliumvetyfosfaatti (pH 10,1) 3: 1,00 M dikaliumvetyfosfaatti (pH 10,1)

Kaikki näytteet: 4,0 mg streptavidiinia/ml 20 4,1 mg HRP-dekstraania/ml (vastaa 2,3 mg:aa deks- traania/ml) Näytteitä inkuboitiin 30 °C:ssa 20 tuntia.

,j Liittämisen jälkeen glysiiniä lisättiin näytteisiin loppupitoisuuteen 0,2 M glysiiniä, pH 10, ja tämän jälkeen , 25 inkuboitiin 2 tuntia [jolloin saatiin jäljelle jääneiden reaktiivisten vinyylisulfoniryhmien deaktivointi (estäminen) niiden reaktiolla glysiinin kanssa].

* ·

Inkuboinnin jälkeen näytteitä dialysoitiin yön yli 4 °C:ssa 0,05 M Tris/HCl:a vastaan, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

’ 30 Näytteet altistettiin sitten geelisuodatukselle

Sepharose™ CL 6B:llä vapaan streptavidiinin ja HRP-deks-• traaniin sitoutuneen streptavidiinin erottamiseksi.

. Tulokset: t

Liittämissaannon streptavidiinille (olettaen deks-35 traanin keskimääräisen moolimassan olevan 500 000 ja > 115413 90 streptavidiinin moolimassan olevan 60 000) määritettiin olevan: 1: 16 %, joka vastaa 5 moolia streptavidiinia/moo-lia dekstraania 5 2: 46 %, joka vastaa 14 moolia streptavidiinia/moo- li dekstraania 3: - (saostuminen tapahtui reaktioastiassa 1 tunnin kuluttua).

Lopputuotteet sisältävät siten keskimäärin: 10 1: 5 moolia streptavidiinia ja 19 moolia peroksi- daasia dekstraanimoolia kohti.

2: 14 moolia streptavidiinia ja 19 moolia peroksi-daasia dekstraanimoolia kohti.

3: - 15 Esimerkki 40 HRP-dekstraani/streptavidiinin karakterisointi ELISAssa ja Dot Blotissa

Streptavidiini liitettiin HRP-dekstraaniin esimerkin 39, näyte 2 (0,8 M K2HP04), mukaisesti.

20 Geelisuodatuksen Sepharose™ CL 6B:llä jälkeen HRP- dekstraaniin sitoutunut streptavidiini karakterisoitiin ELISAssa ja Dot Blotissa.

,j Vertailun vuoksi streptavidiinin ja piparjuuriper- oksidaasin (cat. nro: P317, DAKO, Tanska) tavanomaiset 25 konjugaatit testattiin rinnakkain.

jt ELISA ("yleisen ELISA-menetelmän", 2 kerrosta, mu- » I kaan) » ’ ELISA-olosuhteet:

Kerros 1: 1 30 Biotiini-konjugoidun kani-IgG:n sarjalaimennus 0,1 M dikaliumvetyfosfaatissa (pH 7,2).

j Kerros 2: , Yksi laimennos HRP-dekstraani/streptavidiinia (0,014 mg/ml) tai tavanomaista streptavidiiniperoksidaasia » i > 115413 91 (0,02 mg/ml) (DAKO A/S, Tanska, cat. nro P397) 0,1 M dika-liumvetyfosfaatissa, l-%:inen Tween™ 20 (pH 7,2).

Tulokset:

Kuten kuviosta 5 voidaan nähdä, keksinnön mukaises-5 ta dekstraanipohjaisesta konjugaatista saadaan huomatta vasti alhaisempi detektioraja kuin tavanomaisesta konjugaatista.

Dot Blotit:

Dot Blot -olosuhteet ("yleisen menetelmän Dot 10 Blotille" mukaisesti"):

Tulokset: Käyttäen keksinnön mukaista HRP-dekstraani/vuohi-anti-kani-Ig-konjugaattia on mahdollista havaita 10 kertaa pienempi määrä biotinyloitua kani-IgG:tä täplissä kuin 15 tavanomaisella konjugaatilla.

Esimerkki 41

Vasta-aineen kovalenttinen liittäminen alkaliseen fosfataasidekstraaniin

Puhdistettu kani-anti-hiiri-Ig (RAM) (DAKO A/S, 20 Tanska, cat. nro Z259) liitettiin kolmeen eri AP-dekstraa-nivalmisteeseen (alkalinen fosfataasi liitettiin dekstraa-: 1 : neihin, kuten on kuvattu esimerkissä 22, liuokset A ja B, ja esimerkissä 23, liuos B).

' Menetelmä vasta-aineen liittämiseksi oli seuraava: . 25 Kolme eri AP-dekstraania (A - C), jotka valmistet- tiin RAMin liittämiseksi, olivat seuraavat: ! A: 6 moolia alkalista fosfataasia/mooli dekstraa- nia; B: 7 moolia alkalista fosfataasia/moolia dekstraa- : 30 nia; .· C: 15 moolia alkalista fosfataasia/moolia dekstraa- >: nia.

Kolme liittämisnäytettä (näytteet A - C), jotka valmistettiin käyttäen näitä kolmea AP-dekstraania (A - C, 35 vastaavasti), kaikki sisälsivät: 115413 92 1,55 mg RAM/ml;

AP-dekstraania, joka vastaa 0,2 mg dekstraania/ml; 0,5 M dikallumvetyfosfaatti/natriumhydroksidia (pH

10,0).

5 Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia.

Liitetyn RAMin pitoisuus saaduissa konjugaateissa määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat: 10 Näyte Liittämissaanto mol RAM/mol dekstraania (%) A 44 11 B 42 10,5 C 24 6 15 Esimerkki 42

Alkalisen fosfataasin kovalenttinen liittäminen vasta-aine-dekstraaniin

Kolme eri vasta-aine-dekstraanivalmistetta liitet-tiin alkaliseen fosfataasiin. Vasta-aine, nimittäin vuohi-,.· 20 anti-hiiri-Ig (DAKO A/S, Tanska, cat. nro Z420), liitet- tiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, kuten on kuvattu esi-·. merkissä 24, liuos A, ja esimerkissä 25, liuokset A ja B.

Menetelmä alkalisen fosfataasin liittämiseksi oli » seuraava: Kukin kolmesta eri vasta-aine-dekstraanin vai- * · 25 misteesta sekoitettiin alkalisen fosfataasin ja puskurin kanssa, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: : Kaikki näytteet sisälsivät: > · ' ·.* 2,0 mg alkalista fosfataasia/ml; | vasta-aine-dekstraania, joka vastaa 0,29 mg deks- . 30 traania/ml; »

0,8 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

9,0).

115413 93 Näyte A: 4,5 moolia vuohi-anti-hiiri-Ig/mooli deks-traania; Näyte B: 7 moolia vuohi-anti-hiiri-Ig/moolia deks-traania; 5 Näyte C: 10 moolia vuohi-anti-hiiri-Ig/moolia deks- traania.

Liittäminen suoritettiin 24 °C:ssa 22 tuntia ravistaen varovasti.

AP-liittämisaste määritettiin geelisuodatuksella 10 Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat: Näyte Liittämissaanto mol AP/mol dekstraania (%) A <10 < 2,5 B <10 <2,5 15 C -* *geelin saostuminen tapahtui näytteessä C.

Esimerkki 43 20 Fab'-fragmenttien liittäminen alkali seen fosfataa-

sidekstraaniin. Suolapitoisuuden ja lämpötilan vai-; kutUS

Fab'-fragmentit [Fab'-fragmentti on vasta-ainefrag-·, mentti, joka käsittää yhden antigeeniä sitovan paikan ja 25 yhden vapaan SH-ryhmän; tällaisia fragmentteja valmistetaan käsittelemällä vasta-ainemolekyyliä pepsiinillä (jol-loin muodostuu niin kutsuttu F(ab' )2-fragmentti) ja sitten ’ DTT:llä], jotka valmistettiin vuohi-anti-hiiri-Ig:stä j (DAKO A/S, Tanska, cat. nro Z420) julkaisun A. Johnstone 30 ja R. Thorpe, "Immunochemistry in Practice", 2. painos, 1987, ss. 57 - 58, mukaisesti, liitettiin AP-dekstraaniin, ' kuten on kuvattu esimerkissä 20, liuos D (24 tuntia).

a 94 1 1 541 3

Liittämismenetelmä oli seuraava: Valmistettiin liuos vuohi-anti-hiiri-Fab'-fragmenttien liittämiseksi AP-dekstraaniin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: 0,63 mg vuohi-anti-hiiri-Fab'-fragmenttia/ml; 5 AP-dekstraania, joka vastaa 0,196 mg dekstraania/ ml; Näytteet A ja B; 0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/kloo-rivetyhappo (pH 8,0); Näytteet C ja D: 0,75 M dikaliumvetyfosfaatti/kloo-10 rivetyhappo (pH 8,0).

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin ravistaen varovasti 24 tuntia; A ja C; 24 °C;ssa, B ja D: 30 °C:ssa.

15 Inkuboinnin jälkeen määritettiin liitettyjen vuohi- anti-hiiri-Fab’ -fragmenttien pitoisuus geelisuodatuksella Sephacryl™:llä, ja tulokset olivat seuraavat: Näyte Liittämissaan- mol Fab'/mol to (%) dekstraania 20 A (0,5 M fosfaatti, 38 13,3 24 °C) — B (0,5 M fosfaatti, 42 14,7 30 °C) *::: C (0,75 M fosfaatti, 50 17,3 25 24 °C) : D (0,75 M fosfaatti, 49 17,2 '··.1 30 °C) > · 115413 95

Esimerkki 44

Fab'-fragmenttien liittäminen piparjuuriperoksidaa-sidekstraaniin. pH:n vaikutus

Fab'-fragmentit, jotka valmistettiin vuohi-anti-5 kani-F(ab' )2-fragmenteista (A. Johnstone ja R. Thorpe, "Immunochemistry in Practice", 2. painos, 1987, s. 57 - 58 mukaisesti), liitettiin HRP-dekstraaniin, joka valmistettiin kuten esimerkissä 12 on kuvattu (48 tuntia), viidessä eri pH-arvossa.

10 Liittämismenetelmä oli seuraava: Viisi eri liuosta (A - E) Fab’-fragmenttien liittämiseksi HRP-dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: Kaikki näytteet sisälsivät: 0,67 mg vuohi-anti-kani-Fab'-fragmenttia/ml; 15 HRP-dekstraania, joka vastaa 0,29 mg dekstraania/ ml; 0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa. Dikaliumvetyfosfaattipuskurien pH-arvot olivat: näyte A: pH 5,0 20 näyte B: pH 6,0 näyte C: pH 7,0 j : näyte D: pH 8,0 ,; näyte E: pH 9,0.

Viittä kirkasta liuosta inkuboitiin 24 °C:ssa 20 25 tuntia ravistaen varovasti.

Fab'-fragmenttien liittämisaste määritettiin geeli- » suodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat * · seuraavat: t * > · * * · 1 · 115413 96 Näyte Liittämissaanto mol Fab'/mol dekstraania (%) A 10 2,6 B 22 5,5 C 52 13 5 D 64 16 E 100 25

Esimerkki 45

Alkalisen fosfataasin tiolointi 10 Alkalinen fosfataasi (AP), MW 140 000 (Boehringer

Mannheim, cat. nro 556602, aste 1), tioloitiin N-sukkin-imidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaatilla (SPDP) (Pharmacia, Ruotsi, cat. nro 17-0458-01).

Näitä tarkoituksia varten yleistä menetelmää pro-15 teiinien tioloimiseksi, jonka kuvasivat ensin Carlsson et ai., Biochem. J. (1978) 173 723 - 737, kehitettiin edelleen seuraavasti: /· Tiolointimenetelmä: 1,0 ml:aan alkalista fosfataasivalmistetta [10 mg/

: 20 ml 3 M NaCl:ssa, 1 mM MgCl2:ssa, 0,1 mM ZnCl2:ssa, 30 mM

trietanoliamiinissa (pH 7,6)] lisättiin 28,6 μΐ SPDP:tä (10 mM 99,9-%:isessa etanolissa) (lisätyn SPDP:n määrää voidaan vaihdella ja se riippuu toivotusta substituutio- * 1 · asteesta, so. 2-pyridyylidisulfidirakenteiden moolien mää-25 rä AP:n moolia kohti). SPDP-liuos lisättiin tipoittain : ·* sekoitettuun AP-liuokseen, ja reaktioseosta inkuboitiin '>··* sitten noin 30 minuuttia 24 °C:ssa.

:·· Inkuboinnin jälkeen pieni näyte (50 - 100 μΐ) otet- tiin erilleen ja altistettiin geelisuodatukselle Sephadex™ 30 G-25:llä 0,05 M Tris/HCl-puskurin kanssa, joka sisältää ' 0,1 M NaCl:a, 1 mM MgCl2:a ja 0,1 mM ZnCl2:a (pH 7,2), yli- » » 115413 97 määräisen SPDP:n, vapautuneen N-hydroksisukkinimidin ja minkä tahansa muun alhaisen moolimassan materiaalin poistamiseksi .

Geelisuodatettua näytettä käytettiin määrittämään 5 2-pyridyylidisulfidirakenteiden pitoisuus (= tioliryhmien loppupitoisuus) modifioidussa APtssä, ja sitä käsiteltiin seuraavasti:

Absorbanssi 280 nm:ssä ja 343 nm:ssä mitattiin, minkä jälkeen ditiotreitolia (DTT) lisättiin loppupitoi-10 suuteen 10 mM. 10 minuutin inkuboinnin 23 °C:ssa jälkeen absorbanssi mitattiin uudelleen 343 nm:ssä.

Käsittely DTTrllä vaikuttaa pyridiini-2-tionin, jolla on absorptiivisyys 8,08 x 103 M^cm'1 343 nm:ssä, vapautumiseen.

15 Vapautuneen pyridiini-2-tionin määrä on ekvivalent ti 2-pyridyylidisulfidiryhmien pitoisuuden AP:ssä kanssa. Koska 2-pyridyylidisulfidiryhmä itsessään osoittaa absorption 280 nm:ssä, harhauttavan suuri proteiinipitoisuus saadaan, jos lasketaan 280 nm:ssä (A280) mitatun absorbans-20 sin pohjalta. Tämä lisäabsorbanssi voidaan korjata 2-pyri-dyylidisulf idiryhmän A280-lisäyksen vähentämisellä kokonais-·*: A2B0:stä. Edellinen lisäys lasketaan käyttäen seuraavaa lau- •, · seketta: , \ (pelkistyksessä vapautuneen pyridiini-2-tionin pi- *. 25 toisuus) x 5,1 x 103 M^cm'1 = 2-pyridyylidisulfidiryhmästä johtuva A280 (5, 1 x 103 M^cm'1 on mooliabsorptiivisyys 280 ! nm:ssä 2-pyridyylidisulfidiryhmälle).

2-pyridyylidisulfidirakenteiden pitoisuus (= tioliryhmien loppupitoisuus) modifioidussa AP:ssä määritettiin, : 30 kuten edellä on kuvattu 10 erilaiselle AP:n tioloinnille.

- · .· Kutakin näytettä käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu (so.

, 4 moolia SPDP/moolia AP inkuboinnin aikana), ja saatiin ··, pitoisuus 1,85 ± 0,25 moolia 2-pyridyylidisulfidia/moolia AP: tä.

1 » » I » * » 115413 98

Sillä aikaa 2-pyridyylidisulfidimodifioidun AP: n (ei altistetu geelisuodatukselle) seoksen loppua käsiteltiin DTT:llä proteiiniin liitettyjen 2-pyridyylidisulfidi-rakenteiden vähentämiseksi. Tämä tehtiin samalla tavalla, 5 kuten on kuvattu edellä, so. DTTrtä lisättiin loppupitoi-suuteen 10 mM ja seosta inkuboitiin 20 - 23 °C:ssa noin 5-10 minuuttia. Liitettyjen 2-pyridyylidisulfidiraken-teiden pelkistyminen tapahtuu erittäin nopeasti (< 1 - 2 minuuttia) DTT:n kanssa pH-arvossa 7,2, ja kun alkuperäi-10 set AP:n -S-S- sillat on haudattu syvään AP:n sisäiseen rakenteeseen, niitä ei pelkistetä tällä käsittelyllä.

Pelkistyksen jälkeen tioloitu AP erotettiin alhaisen moolimassan materiaalista geelisuodatuksella Sephadex™ G-25:llä (käyttäen PD-10-pylväitä) toivotun liittämispus-15 kurin kanssa ja sitä käytettiin pian sen jälkeen (tunnin kuluessa) liittämistä varten, koska tioliryhmä on erittäin reaktiivinen ja se voi läpikäydä ei-toivottuja reaktioita. Modifoitu AP täytyy siksi varastoida 2-pyridyylidisulfidi-muodossa (jos tarpeen, yön yli 4 °C:ssa edellä mainitussa 20 Tris/HCl-puskurissa) ja pelkistää juuri ennen käyttöä.

2-pyridyylidisulfidirakenteiden/moolia AP:tä pitoi-:***: suudesta 1,85 ± 0,25 ei aiheudu AP-aktiivisuuden häviötä, ;·,· ja peräkkäisestä pelkistyksestä DTT:llä aiheutuu vain noin 5 %:n häviö alkuperäisestä AP-aktiivisuudesta.

25 Esimerkki 46

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks- traaniin. pH:n vaikutus * Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi- ' 30 nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II" ). Tio- ’ loitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45 ja ·· se sisälsi keskiarvon 2,1 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalis- ; ta fosfataasia.

Liittämismenetelmä oli seuraava: Kolme eri liuosta ‘ 35 (A - C) tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun deks- * > 115413 99 traaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupi-toisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: 2,0 mg tioloitua AP:tä/ml; 5 0,286 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; 0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa; Dikaliumvetyfosfaattipuskurien pH-arvot olivat: liuos A: pH 7,0 liuos B: pH 8,0 10 liuos C: pH 8,5.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 24 tuntia varovasti ravistaen.

Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee-lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset oli-15 vat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) A 39 9,8 B 77 19,2 : 20 C 82 20,5

Esimerkki 47

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks-traaniin. Ajan ja lämpötilan vaikutus 25 Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi-nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tio- » loitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, > ja se sisälsi keskiarvon 2 moolia SH-ryhmiä/moolia alka- . 30 lista fosfataasia.

> Liittämismenetelmä oli seuraava: Liuos tioloidun “ AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistet- , i tiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: 115413 100 1,0 mg tioloitua AP:tä/ml; 0,143 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

0,5 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,0).

5 Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 4 tuntia 24 °C:ssa varovasti ravistaen ja sitten 144 tuntia 4 °C:ssa ilman ravistelua.

Näytteet otettiin inkuboinnin eri ajanjaksojen jälkeen ja liitetyn SH-alkalisen fosfataasin pitoisuus määri-10 tettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HRrllä. Tulokset olivat seuraavat: F Tuntia Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) 0 0 0 15 1 8 1,9 2 12 3,1 4 25 6,3 +144 58 14,4 : (4 °C) « · 20

Esimerkki 48

Tioloidun AP: n liittäminen DVS-aktivoituun deks-traaniin. Suolapitoisuuksien vaikutus ' Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun 25 dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi- * : nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tio- - * loitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, ja se sisälsi keskiarvon 1,6 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalista fosfataasia.

30 Liittämismenetelmä oli seuraava: Neljä eri liuosta ** (A - D) tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun deks- 115413 101 traaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupi-toisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: 2,20 mg tioloitua AP:tä/ml; 5 0,314 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml; dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH 8,0). Dikaliumvetyfosfaattien pitoisuudet puskureissa olivat:

liuos A: 0,10 M 10 liuos B: 0,25 M

liuos C: 0,50 M liuos D: 0,75 M.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 24 tuntia varovasti ravistaen.

15 Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee- lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat:

Liuos Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) ': 20 A 57 14,3 B 67 16,7 • C 77 19,3 « · V D 78 19,5 25 Esimerkki 49

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks-traaniin. Tioloidun AP-pitoisuuden vaikutus

Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun 1 * dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi-.· 30 nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tio loitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, 115413 102 ja se sisälsi keskiarvon 1,7 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalista fosfataasia.

Liittämismenetelmä oli seuraava: Kolme eri liuosta (A - C) tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun deks-5 traaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupi-toisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät:

0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,0).

10 Liuos A: 0,90 mg SH-AP/ml; 0,129 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

Liuos B: 1,8 mg SH-AP/ml; 0,258 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

Liuos C: 3,6 mg SH-AP/ml; 15 0,516 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa ravistaen varovasti. Näytteet otettiin erilleen inkuboinnin eri pituisten jaksojen jälkeen ja liitetyn AP:n pitoisuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä. Tulok-20 set olivat seuraavat:

Liuos 3 tunnin 24 tunnin I

,* inkuboin- inkuboin- I

: t:L I

Liittä- mol SH-AP/ Liittä- mol SH-AP/ 't missaanto mol deks- missaanto mol deks- (%) traania (%) traania A 28 7,0 63 15,8 ----- 25 B 45 11,3 78 19,4 : C 63 15,7 86 21,6

IssBaBBBBSBsssBSBsssBssBssaBBBaBaaBBBaBaBaBaBssBas * t t t 115413 103

Esimerkki 50

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks- traaniin. Lämpötilan vaikutus

Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun 5 dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi-nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tioloitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, ja se sisälsi keskiarvon 1,9 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalista fosfataasia.

10 Liittämismenetelmä oli seuraava: Liuos tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet: 1,9 mg SH-AP:tä/ml; 0,271 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml;

15 0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,0).

Kirkas liuos jaettiin kahteen yhtä suuren tilavuuden näytteeseen (A ja B), joita inkuboitiin 22 tuntia varovasti ravistaen seuraavissa lämpötiloissa:

20 Näyte A: 24 eC

Näyte B: 30 °C.

Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee-• lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset oli- . vat seuraavat: , 25 r ~ ~ 1 ---- Näyte Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) A 71 17,7 I B 75 18,7 104 115413

Esimerkki 51

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks-traaniin. Tioloidun AP:n ja DVS-aktivoidun deks-traanin välisen moolisuhteen vaikutus. Suuret suh-5 teet

Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi-nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tioloitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, 10 ja se sisälsi keskiarvon 1,9 moolia SH-ryhmiä/moolia alka lista fosfataasia.

Liittämismenetelmä oli seuraava: Kolme eri liuosta (A - C) tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupi-15 toisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: 1,9 mg SH-AP/ml;

0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,0).

20 Liuos A: 0,543 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml (SH-AP:dekstraani = 12:1); : Liuos B: 0,272 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml j (SH-AP:dekstraani = 25:1); . Liuos C: 0,136 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml 25 (SH-AP:dekstraani = 50:1);

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 22 tuntia ; ravistaen varovasti.

·’ * Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee- lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä. Tulokset olivat ; : 30 seuraavat: » * • » 115413 105

Liuos Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) A 89 11,1 — B 71 17,7 C 42 21,0 5

Esimerkki 52

Tioloidun AP:n liittäminen DVS-aktivoituun deks-traaniin. Tioloidun AP:n ja DVS-aktivoidun deks-traanin välisen moolisuhteen vaikutus. Pienet suh-10 teet

Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin DVS-aktivoituun dekstraaniin, piikin MW 500 000, jossa on 1 500 pmol vi-nyyliryhmiä grammaa dekstraania kohti ("erä Dex-II"). Tioloitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, 15 ja se sisälsi keskiarvon 1,6 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalista fosfataasia.

Liittämismenetelmä oli seuraava: Kolme eri liuosta (A - C) tioloidun AP:n liittämiseksi DVS-aktivoituun deks-: traaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupi- • 20 toisuudet:

Kaikki liuokset sisälsivät: 1,8 mg SH-AP/ml;

0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,o).

* * I

’ * 25 Liuos A: 1,07 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml (SH-AP:dekstraani = 6:1); : : Liuos B: 0,536 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml ,,· (SH-AP: dekstraani = 12:1); : Liuos C: 0,357 mg DVS-aktivoitua dekstraania/ml ·, 30 (SH-AP: dekstraani = 18:1).

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 22 tuntia ravistaen varovasti.

106 115413

Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee-lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä. Tulokset olivat seuraavat: | 1 T T —ri^-ΓΤ r- -,.---- - n, m , . r- „ , .

i I 5 Liuos Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) A 91 5,4 B 90 10,8 — C 75 13,5 &sacasBasBsssBBMaBSSBsssssssss:ssaBBSBMaBSssssssaBaes 10 Esimerkki 53

Tioloidun AP:n liittäminen vasta-aine-dekstraaniin. pH:n vaikutus

Tioloitu AP (SH-AP) liitettiin vasta-aine-dekstraaniin [joka on valmistettu, kuten esimerkissä 25, näyte 15 B, on kuvattu, ja joka sisältää 10 moolia vasta-ainetta (vuohi-anti-kani) dekstraanin moolia kohti]. Tioloitu AP valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 45, ja se sisälsi keskiarvon 1,4 moolia SH-ryhmiä/moolia alkalista : fosfataasia.

: 20 Liittämismenetelmä oli seuraava: Kaksi eri liuosta ; tioloidun AP:n liittämiseksi vasta-aine-dekstraaniin val- ; mistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet:

Molemmat liuokset sisälsivät: 0,94 mg tioloitua AP:tä/ml; 25 0,134 mg dekstraania/ml; , , 0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa.

* Dikaliumvetyfosfaattipuskurien pH-arvot olivat: '··*’ Liuos A: pH 7,0 * ;· : Liuos B: pH 8,0 30 Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 22 tuntia « · ravistaen varovasti.

i * 115413 107

Liitetyn tioloidun AP:n pitoisuus määritettiin gee-lisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HRjllä, ja tulokset olivat seuraavat: 5 Liuos Liittämissaanto mol SH-AP/mol dekstraania (%) A <1 0,2 B 20 5,0

Esimerkki 54 10 Tioloidun vasta-aineen liittäminen alkaliseen fos- fataasidekstraaniin

Vuohi-anti-hiiri-Ig (GAM) (DAKO A/S, Tanska, cat. nro Z420) tioloitiin N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylidi-tio)propionaatilla (SPDP) (Pharmacia, cat. nro 17-0458-01) 15 ja liitettiin sitten kahteen eri alkaliseen fosfataasi-dekstraanin (AP-dekstraani) valmisteeseen. Ensimmäinen AP-dekstraani valmistettiin, kuten esimerkissä 52 on kuvattu, liuos B, ja se sisälsi 11 moolia alkalista fosfataasia dekstraanin moolia kohti; toinen valmistettiin, kuten esi-. 20 merkissä 51 on kuvattu, liuos B, ja se sisälsi 18 moolia .' alkalista fosfataasia dekstraanin moolia kohti. Tioloitu vasta-aine valmistettiin yleisen menetelmän proteiinien tioloimiseksi mukaan, jonka ovat ensimmäiseksi kuvanneet Carlsson et ai., Biochem. J. (1978) 173 723 - 737, ja se V · 25 sisälsi keskiarvon 4 moolia SH-ryhmiä/moolia vuohi-anti- hiiri-vasta-ainetta.

' I Menetelmä tioloidun vuohi-anti-hiiri-Ig:n (SH-GAM) liittämiseksi oli seuraava: Neljä liuosta SH-GAM:n liittä-’ . mistä AP-dekstraaniin varten valmistettiin, jolloin saa- 30 tiin seuraavat loppupitoisuudet: ;·’ Kaikki liuokset sisälsivät: 2,0 mg SH-GAM/ml; 108 11S413

0,50 M dikaliumvetyfosfaatti/kloorivetyhappoa (pH

8,0).

A ja B: 10 moolia alkalista fosfataasia/ moolia dekstraania; 5 C ja D: 18 moolia alkalista fosfataasia/ moolia dekstraania; A: AP-dekstraania, joka vastaa 0,516 mg dekstraa- nia/ml; B: AP-dekstraania, joka vastaa 0,258 mg dekstraa- 10 nia/ml; C: AP-dekstraania, joka vastaa 0,516 mg dekstraa- nia/ml; D; AP-dekstraania, joka vastaa 0,258 mg dekstraa- nia/ml.

15 Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa 22 tuntia varovasti ravistaen.

SH-GAM:n liittämisaste määritettiin geelisuodatuk-sella Sephacryl™ S-300HR:llä, ja tulokset olivat seuraa-vat: 20 Γ Liuos Liittämissaanto mol SH-GAM/mol dekstraania (%) . A 78 9,8 B 49 12,2 ; C -* — 25 D -* , * geelin saostuminen tapahtui reaktioastioissa näytteille C ja D.

Esimerkki 55 30 Monoklonaalisen muriinivasta-aineen liittäminen piparjuuriperoksidaasidekstraaniin : Proteiini A -puhdistetut hiiri-anti-ihmis-kappa-ke- vytketjut (DAKO A/S, Tanska, cat. nro M 827) liitettiin 115413 109 ί HRP-dekstraaniin. HRP-dekstraani valmistettiin kuten esimerkissä 12 on kuvattu (48 tunnin inkubointi, 4 °C). HRP-dekstraani sisälsi 16 moolia piparjuuriperoksidaasia deks-traanimoolia kohti.

5 Liitämismenetelmä oli seuraava: Kolme eri liuosta (A - C) hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen liittämiseksi HRP-dekstraaniin valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet:

Kaikki näytteet sisälsivät: 10 HRP-dekstraania, joka vastaa 0,30 mg dekstraania/ ml; 2,74 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; 0,7 M dikaliumvetyfosfaattia, joka on titrattu joko kloorivetyhapolla tai natriumhydroksidilla arvoon: 15 A: pH 8,4 B: pH 9,2 C: pH 10,0.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 24 °C:ssa ilman sekoitusta: 20 A: 24 tuntia, B ja C: 6 tuntia.

Liitettyjen hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen f pitoisuus määritettiin geelisuodatuksella Sephacryl™ S-300 HR:llä, ja tulokset olivat seuraavat: 25 Näyte Liittämissaanto mol hiiri-anti-ihmis-kappa- : (%) kevytketjuja/mol dekstraa- nia :: A 3,2 0,95 B 1,6 0,47 C 5,6 1,66 115413 110

Esimerkki 56

Kompleksit muriini-monoklonaalisten vasta-aineiden ja dekstraanin, joka on liittynyt peroksidaasin ja kani-anti-hiiri-Ig:n kanssa, välillä. Monoklonaali-5 sen vasta-aineen eri pitoisuuksien vaikutus

Hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjut (DAKO A/S, Tanska, cat. nro M 827) kompleksoitiin dekstraanin kanssa, joka on liitetty piparjuuriperoksidaasin ja kani-anti-hii-ri-Ig:n kanssa (HRP-dekstraani/RAM). Jälkimmäinen valmis-10 tettiin kuten on kuvattu esimerkissä 36C, liuos B. Kompleksin muodostuminen:

Seitsemän eri näytettä (A - G) kompleksin muodostamiseksi hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen ja HRP-deks-traani/RAM:n välille valmistettiin, jolloin saatiin seu-15 raavat loppupitoisuudet: Näytteet sisälsivät: HRP-dekstraani/RAM-konjugaatti, joka vastaa 0,020 mg dekstraania/ml ja 0,042 mg RAM/ml ja A: 0,003 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; 20 B: 0,006 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; C: 0,012 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; ‘ D: 0,030 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; ,· E: 0,061 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; F: 0,121 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml; 25 G: 0,242 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml.

Kompleksin muodostumisen annettiin edetä huoneen- !t lämpötilassa 2 tuntia, ja näytteet testattiin sitten * · ELISAssa.

. , ELISA: ' · ·’ 30 ELISA suoritettiin "yleisen ELISA-menetelmän" mu- .* kaisena kaksikerrosmenetelmänä.

, · Ensimmäinen kerros muodostui käyttäen: 5 pg/ml, j 1 pg/ml, 0,2 pg/ml ja 0,04 pg/ml, vastaavasti, ihmisen seerumiproteiineja 0,01 M natriumfosfaatissa, 0,145 M 35 NaCl:ssa, pH 7,2; 115413 m

Toinen kerros: kompleksien (A - G) laimennokset, jotka vastaavat 12 ng dekstraania/ml (laimennettu 0,01 M natriumfosfaattiin, 0,145 M NaCl:iin, 0,l-%:iseen Tween™ 20reen, pH 7,2.

5 Orto-fenyleenidiamiini/vetyperoksidia käytettiin väriä kehittävänä HRP-substraattina reaktioajan ollessa 10 minuuttia.

Tulokset: ELISA-analyysin tulokset esitetään kuviossa 6, joka 10 esittää 492 nmrssä saadun absorbanssin kullekin neljälle ihmisen seerumiproteiinin pitoisuudelle, joita käytetään ensimmäistä kerrosta varten ELISAssa, hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen suhteen HRP-dekstraani/RAM-konjugaat-tiin, jota käytetään kompleksin muodostumisessa, funktiona 15 (ilmaistuna mg:ina hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja mg:aa dekstraania kohti konjugaatissa).

Kuten voidaan nähdä, absorbanssi tasoittuu suhteessa noin 4 mg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/mg dekstraania.

20 Esimerkki 57

Kompleksit, jotka muodostuvat biotinyloidun kanin polyklonaalisten vasta-aineiden ja suuren moolimassan dekstraanin, joka on liittynyt piparjuuriperok-sidaasin ja streptavidiinin kanssa, välillä

*. 25 Puhdistetut kani-anti-ihmis-kappa-kevytketjut (DAKO

* · ^ A/S, Tanska, cat. nro A192) biotinyloitiin N-biotinyyli-e- ! aminokaproiinihapon N-hydroksisukkinimidiesterillä (Sigma, ' cat. nro B 2643) Kendall et ai., Journal of Immunological

Methods (1983) 56 329 - 339, mukaisesti. 0,04 M pmol bio-’· · 30 tiiniä käytettiin proteiinigrammaa kohti.

Biotinyloidut kani-anti-ihmis-kappa-kevytket jut ... j kompleksoitiin sitten suuren moolimassan dekstraanin kans- .·**. sa, joka on liitetty piparjuuriperoksidaasin ja streptavi diinin kanssa (HRP-dekstraani/streptavidiini). HRP-deks- 115413 112 traani/streptavidiini valmistettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 39.

Kompleksin muodostuminen:

Kolme eri näytettä (A - C) kompleksin muodostami-5 seksi biotinyloitujen kani-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen ja HRP-dekstraani/streptavidiinin välille, valmistettiin, jolloin saatiin seuraavat loppupitoisuudet:

Kaikki näytteet sisälsivät: HRP-dekstraani/streptaviniinikonjugaattia, joka 10 vastaa 0,2 mg dekstraania/ml ja 0,12 mg streptavidii-nia/ml.

A: 0,156 mg biotinyloituja kani-anti-ihmis-kappa-kevytketj uj a/ml; B: 0,309 mg biotinyloituja kani-anti-ihmis-kappa-15 kevytketjuja/ml; C: 0,465 mg biotinyloituja kani-anti-ihmis-kappa-kevytketj uj a/ml.

Kompleksin muodostumisen annettiin edetä huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja näytteet testattiin ELISAssa ja 20 immunohistokemiallisessa menetelmässä.

ELISA: ELISA suoritettiin kaksikerrosmenetelmänä seuraavan ,· menetelmän mukaisesti:

Ensimmäinen kerros muodostui käyttäen: 5 pg ihmisen , ·, 25 seerumiproteiineja/ml, laimennettiin 0,01 M natriumfos- * · l' faattiin, 0,145 M NaCl:iin, pH 7,2; l Toinen kerros: kuusi sarjalaimennosta kustakin ‘ kompleksinäytteestä (A - C), jotka sisälsivät 2 - 0,0625 pg dekstraania/ml (laimennettu 0,01 M natriumfosfaattiin, l 30 0,145 M NaCl:iin, 0,l-%:iseen Tween™ 20:een, pH 7,2.

Orto-fenyleenidiamiini/vetyperoksidia käytettiin : väriä kehittävänä HRP-substraattina reaktioajan ollessa 2 minuuttia.

Tulokset: 35 ELISA-analyysin tulokset esitetään kuviossa 7, joka : esittää 492 nm:ssä saadun absorbanssin kullekin kolmelle 115413 113 näytteelle (A - C) kunkin kompleksoidun konjugaatin laimennoksen funktiona.

Kuten voidaan nähdä, kompleksoidun konjugaatin annetulle pitoisuudelle saavutettiin maksimiarvon absorbans-5 si, kun kompleksi oli muodostunut käyttäen pitoisuutta noin 0,309 - 0,465 mg biotinyloituja kani-anti-ihmis-kap-pa-kevytketj uj a/ml.

Immunohistokemia:

Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin jul-10 kaisun "Handbook, Immunochemical Staining Methods", Sally J. Naish, DAKO Corporation, 1989, mukaan.

Kompleksit näytteissä A - C testattiin kitarisan kudosleikkeellä, kukin näyte laimennettiin pitoisuuksiin, jotka ovat alueella, joka vastaa 0,1 - 0,0125 mg dekstraa-15 nia/ml.

Diaminobentsidiinitetrahydrokloridi (DAB)/vetyperoksidia käytettiin väriä kehittävänä HRP-substraattina.

Kontrollimenetelmänä käytettiin kolmivaiheista LSAB-menetelmää (kuvattu julkaisussa "Handbook, Immuno-20 Chemical staining methods", DAKO Corporation, 1989).

Saatiin seuraavat tulokset: • issBaasssssssssBBSssBSBssBSsssssaassaBB^BBss^ssacai '· Näyte Pisteet ·. A ++ Γ 25 Β ++(+) : : C ++(+) ', LSAB +++

Tulokset: ‘ *« * 30 Immunohistokemiallisen analyysin tulokset osoitta vat, että käytetyllä pitoisuustasolla kolmivaiheinen LSAB-menetelmä on vain vähän parempi kuin yksivaiheinen mene-: telmä, joka perustuu näihin komplekseihin, jotka ovat muo- 115413 114 dostuneet HRP-dekstraani/streptavidiini-konjugaatin ja blotinyloitujen kanl-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen välille. On myös mahdollista, käyttäen kompleksoitua konjugaat-tia tämän keksinnön mukaisesti, yksinkertaistaa tällaista 5 immunohistokemiallista analyysia huomattavasti ja silti saavuttaa erittäin tyydyttävä värjäytyminen.

Esimerkki 58

Kompleksit, jotka muodostuvat luuriini-monoklonaa-listen vasta-aineiden ja dekstraanin, joka on liit-10 tynyt piparjuuriperoksidaasin ja kani-anti-hiiri-

IgG:n kanssa, välillä. Pitoisuuden vaikutus

Hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjut (DAKO A/S, Tanska, cat. nro M 827) kompleksoitiin dekstraanin kanssa, joka on liitetty piparjuuriperoksidaasin ja kani-anti-hii-15 ri-IgG:n (HRP-dekstraani/RAM) kanssa. HRP-dekstraani/RAM

valmistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 36C, liuos B. Kompleksin muodostuminen:

Viisi eri näytettä (A - E) valmistettiin sekoittamalla vakiomäärä HRP-dekstraani/RAMia vakiomäärän kanssa 20 hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja eri loppupitoisuuksis-sa. Valmistettiin näytteet, joilla oli seuraavat hiiri-. ": anti-ihmis-kappa-kevytketjujen loppupitoisuudet: A: 0,280 mg/ml; B: 0,140 mg/ml; ·, 25 C: 0,093 mg/ml; D: 0,070 mg/ml; ! E: 0,056 mg/ml.

Kirkkaita liuoksia inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ennen testaamista ELISAssa ja immunohistokemial-30 lisesti.

ELISA: ELISA suoritettiin kaksikerrosmenetelmänä seuraavan t menetelmän mukaisesti:

Ensimmäinen kerros muodostui käyttäen: 5 pg ihmisen 35 seerumiproteiineja/ml, laimennettiin 0,01 M natriumfos- 115413 115 faattiin, 0,145 M NaClriin, 0,l-%:iseen Tween™ 20:een, pH 7,2;

Toinen kerros: viisi sarjalaimennosta kustakin kompleksinäytteestä (A - E), jotka sisälsivät 0,01 - 5 0,00013 pg hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjuja/ml (lai mennettu 0,01 M natriumfosfaattiin, 0,145 M NaClriin, 0,l-%:iseen Tween™ 20reen, pH 7,2).

Orto-fenyleenidiamiini/vetyperoksidia käytettiin väriä kehittävänä HRP-substraattina reaktioajan ollessa 10 10 minuuttia.

Tulokset: ELISA-analyysin tulokset esitetään kuviossa 8, joka esittää 492 nmrssä saadun absorbanssin kullekin viidelle näytteelle (A - E) hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen 15 pitoisuuden kussakin kompleksoidussa konj ugaattinäytteessä funktiona.

Kuten voidaan nähdä, absorbanssiarvo kullekin näytteelle (A - E) annetussa hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytket-jujen pitoisuudessa osoitti vain suhteellisen pieniä muu-20 toksia; tämä osoittaa, että käytetyissä pitoisuuksissa tilavuudella, jossa kompleksit muodostuvat, on vain vähäi- : nen vaikutus.

* Immunohistokemia:

Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin jul- . 25 kaisun "Handbook, Immunochemical Staining Methods", Sally :, J. Nalsh, DAKO Corporation, 1989, mukaan.

! Näytteet testattiin kitarisan kudosleikkeillä, ku kin näyte laimennettiin pitoisuuksiin, jotka ovat alueella, joka vastaa 0,028 - 0,0035 mg hiiri-anti-ihmis-kappa- t : 30 kevytketjuja/ml.

Diaminobentsidiinitetrahydrokloridi (DAB)/vetyper- * oksidia käytettiin väriä kehittävänä HRP-substraattina.

Kontrollitarkoituksia varten tavanomainen konju-gaatti, so. piparjuuriperoksidaasilla leimattuja kani-an-35 ti-ihmis-kappa-kevytketjuja (DAKO A/S, Tanska, cat. nro 115413 116 P129) käytettiin, laimennettiin valmistajan suositusten mukaisesti ja käytettiin myös LSAB-menetelmää ("Handbook, Immunochemical Staining Methods", DAKO Corporation, 1989). Saatiin seuraavat tulokset: 5 I Näyte Pisteet A ++++ B ++++ C ++++ 10 I D ++++ E +++(+) tavanomainen konjugaatti ++( + ) LSAB +++(+) 15 Tulokset:

Immunohistokemiallisen analyysin tulokset osoittavat, että yksivaiheinen menetelmä, joka perustuu näihin komplekseihin, jotka ovat muodostuneet HRP-dekstraani/RAM-j konjugaatin ja hiiri-anti-ihmis-kappa-kevytketjujen välil- \ 20 le, on hieman parempi kuin kolmivaiheinen LSAB-menetelmä , ja merkittävästi parempi kuin yksivaiheinen menetelmä, joka pohjautuu tavanomaiseen konjugaattiin. Tämä taas ha-; vainnollistaa etuja, jotka liittyvät tämän keksinnön mu- ‘ ' kaisen kompleksoidun konjugaatin käyttöön analyysin jär- 25 jestelyjen ja saatavan värjäytymisintensiteetin suhteen.

» * * » »

Claims (26)

115413 117

1. Veteen liukeneva reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää veteen liukenevan polymeerisen 5 kantajamolekyylin, johon on kovalenttisesti liittynyt useampi kuin yksi ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfo-nista, joista kukin ryhmä on liittynyt kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut divinyylisulfonimole-kyylin toisen vinyyliryhmän ja reaktiivisen funktionaali-10 sen ryhmän välille polymeerisessä kantajamolekyylissä, jolloin useammassa kuin yhdessä tällaisessa mainitussa ryhmässä liittyneessä tilassaan jäljelle jäävä vinyyliryh-mä on vapaa ja kykenevä reaktioon molekyylihiukkasen kanssa, jossa on funktionaalinen ryhmä, joka on reaktiivinen 15 mainitun vapaan vinyyliryhmän suhteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että mainittu polymeerikantaja on valittu ryhmästä, joka koostuu luonnollisista ja synteettisistä polysakkarideista; homopoly(aminohapoista); luon- 20 nollisista ja synteettisistä polypeptideistä ja proteii neista; ja synteettisistä polymeereistä, joissa on nukleo-fiilisia funktionaalisia ryhmiä, mukaan lukien polyvinyy-• lialkoholit, polyallyylialkoholi, polyetyleeniglykolit ja ,ϊ substituoidut polyakrylaatit. *: 25

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reagenssi, » ;'· tunnettu siitä, että mainittu polymeerikantaja on » valittu ryhmästä, joka koostuu dekstraaneista, mukaan lukien karboksimetyylidekstraanit; tärkkelyksistä, hydroksi-etyylitärkkelyksistä ja hydroksipropyylitärkkelyksistä; » ,* 30 glykogeenistä; agaroosijohdannaisista; selluloosajohdan- '* naisista, mukaan lukien hydroksietyyli- ja hydroksipropyy- ! liselluloosat; ja luonnon kumeista.

4. Veteen liukeneva konjugaatti, tunnettu siitä, että se käsittää veteen liukenevan polymeerisen , 35 kantajamolekyylin, johon on, kukin sidosryhmän kautta, » » ne 115413 joka on johdettu divinyylisulfonista, kovalenttisesti liittynyt yhtä määrättyä molekyylihiukkasta useampi kuin yksi, jolloin kukin mainittu sidosryhmä on liittynyt mainittuun polymeeriseen kantajamolekyyliin kovalenttisen si-5 doksen kautta, joka on muodostunut divinyylisulfonimole-kyylin toisen vinyyliryhmän ja reaktiivisen funktionaalisuuden välille mainitussa kantajamolekyylissä, ja molekyy-lihiukkanen on liittynyt mainittuun sidosryhmään kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut toisen maini-10 tusta divinyylisulfonimolekyylistä peräisin olevan vinyyliryhmän ja funktionaalisen ryhmän välille mainitussa mo-lekyylihiukkasessa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että mainittuun polymeeriseen kan-15 tajamolekyyliin on lisäksi liittynyt kovalenttisesti yksi tai useampi ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, jolloin kukin ryhmistä on liittynyt kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut divinyylisulfonimolekyylin toisen vinyyliryhmän ja reaktiivisen funktionaalisuuden 20 välille polymeerisessä kantajamolekyylissä, jolloin vähintään yhdellä tällaisella ryhmällä liittyneessä tilassaan ·* on jäljelle jäänyt vinyyliryhmä vapaana ja kykenevänä ; reaktioon uuden molekyylihiukkasen kanssa, jossa on funk- v ·' tionaalinen ryhmä, joka on reaktiivinen mainitun vapaan : ; 25 vinyyliryhmän suhteen.

• 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen konjugaat- ti, tunnettu siitä, että mainitut kovalenttisesti liittyneet molekyylihiukkaset on valittu ryhmästä, joka . _ koostuu proteiineista, mukaan lukien ferritiini, fykoeryt- ‘ 30 riinit, fykosyaniinit ja fykobiliinit; entsyymeistä, mu- ’ kaan lukien piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, : glukoosioksidaasit, galaktosidaasit ja ureaasit; toksii- : neista; lääkeaineista; väriaineista; fluoresoivista, lumi- / nesoivista, fosforisoivista ja muista valoa emittoivista , 35 aineista; metallia kelatoivista aineista, mukaan lukien » 115413 119 iminodietikkahappo, etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), dietyleenitriamiinipentaetikkahappo (DTPA) ja desferrioks-amiini B; aineista, jotka ovat leimatut radioaktiivisella isotoopilla; ja aineista, jotka ovat leimatut raskasato-5 millä.

7. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen konjugaat-ti, tunnettu siitä, että mainittu kovalenttisesti liittynyt molekyylihiukkanen on kohdistava hiukkanen, joka kykenee sitoutumaan selektiivisesti, tai selektiiviseen 10 reaktioon, komplementaarisen molekyylin tai biologista alkuperää olevan materiaalin komplementaarisen rakennealueen kanssa.

8. Veteen liukeneva konjugaatti, tunnettu siitä, että se käsittää veteen liukenevan polymeerisen 15 kantajamolekyylin, johon on kovalenttisesti liittynyt kaksi tai useampia molekyylihiukkasia, joista vähintään yksi on erilainen kuin muut, kunkin molekyylihiukkasen ollessa liittynyt sidosryhmän kautta, joka on johdettu divinyyli-sulfonista, jolloin kukin mainittu sidosryhmä on liittynyt 20 mainittuun polymeeriseen kantajamolekyyliin kovalenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut divinyylisulfonimole-·' *' kyylin toisen vinyyliryhmän ja reaktiivisen funktionaali- * : suuden välille mainitussa kantajamolekyylissä, jolloin mo- : lekyylihiukkanen on liittynyt mainittuun sidosryhmään ko- ! : 25 valenttisen sidoksen kautta, joka on muodostunut toisen mainitusta divinyylisulfonimolekyylistä peräisin olevan . vinyyliryhmän ja funktionaalisen ryhmän välille mainitussa molekyylihiukkasessa.

9. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 8 mukainen konju-30 gaatti, tunnettu siitä, että mainittu polymeeri- kantaja on valittu ryhmästä, joka koostuu luonnollisista ja synteettisistä polysakkarideista; homopoly(aminohapois-: ta) ; luonnollisista ja synteettisistä polypeptideistä ja proteiineista; ja synteettisistä polymeereistä, joissa on » , 35 nukleofiilisia funktionaalisia ryhmiä, mukaan lukien poly- > » ί 120 115413 vinyylialkoholit, polyallyylialkoholi, polyetyleeniglyko- lit ja substituoidut polyakrylaatit.

10. Patenttivaatimuksen 4, 5 tai 8 mukainen konju-gaatti, tunnettu siitä, että mainittu polymeeri- 5 nen kantajamolekyyli on valittu ryhmästä, joka koostuu dekstraaneista, mukaan lukien karboksimetyylidekstraanit; tärkkelyksistä, hydroksietyylitärkkelyksistä ja hydroksi-propyylitärkkelyksistä; glykogeenistä; agaroosijohdannaisista; selluloosajohdannaisista, mukaan lukien hydroksi-10 etyyli- ja hydroksipropyyliselluloosat; ja luonnon kumeista .

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että vähintään yksi mainituista molekyylihiukkasista on valittu ryhmästä, joka koostuu 15 proteiineista, mukaan lukien ferritiini, fykoerytriinit, fykosyaniinit ja fykobiliinit; entsyymeistä, mukaan lukien piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, glukoosiok-sidaasit, galaktosidaasit ja ureaasit; toksiineista; lääkeaineista; väriaineista; fluoresoivista, luminesoivista, 20 fosforisoivista ja muista valoa emittoivista aineista; metallia kelatoivista aineista, mukaan lukien iminodietikka-happo, etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), dietylee-: nitriamiinipentaetikkahappo (DTPA) ja desferrioksamiini B; • aineista, jotka ovat leimatut radioaktiivisella isotoopil- 1 : 25 la; ja aineista, jotka on leimattu raskasatomilla.

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen konjugaatti, ·’/. tunnettu siitä, että vähintään yksi mainituista molekyylihiukkasista on kohdistava hiukkanen, joka kykenee • _-t sitoutumaan selektiivisesti, tai selektiiviseen reaktioon, 1',' 30 komplementaarisen molekyylin tai biologista alkuperää ole- » Ί' van materiaalin komplementaarisen rakennealueen kanssa.

- 13. Patenttivaatimuksen 7 tai 12 mukainen konju- : gaatti, tunnettu siitä, että mainittu kohdistava ’ hiukkanen on valittu ryhmästä, joka koostuu antigeeneistä; . . 35 hapteeneista; monoklonaalisista ja polyklonaalisista vas- t » m 115413 ta-aineista; geenikoettimista; luonnollisista ja synteettisistä oligo- ja polynukleotideista; luonnollisista ja synteettisistä mono-, oligo- ja polysakkarideista; lektii-neistä; avidiinista ja streptavidiinista; biotiinista; 5 kasvutekijöistä; hormoneista; reseptorimolekyyleistä; proteiini A:sta ja proteiini G:stä.

14. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen veteen liukenevan reagenssin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu veteen liukeneva polymeerikantaja 10 saatetaan reagoimaan divinyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5.

15. Menetelmä patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaisen veteen liukenevan konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 15 (i) mainittu veteen liukeneva polymeerikantaja saa tetaan reagoimaan divinyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH -arvossa yli 5, jolloin muodostuu vesiliuos, joka sisältää veteen liukenevan välituotereagenssin, joka käsittää mainitun veteen liukenevan polymeerikantajän molekyylejä, 20 joihin on kovalenttisesti liittynyt useampi kuin yksi reaktiivinen ryhmä, joka on johdettu divinyylisulfonista, (ii) mainittu veteen liukeneva välituotereagenssi j mahdollisesti puhdistetaan, ja '· (iii) mainittu mahdollisesti puhdistettu veteen ; : 25 liukeneva välituotereagenssi saatetaan reagoimaan mainit- :· tujen reaktiivisten ryhmien kautta molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5.

16. Menetelmä patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaisen . (1> veteen liukenevan konjugaatin valmistamiseksi, t u n - * * * 'il,' 30 n e t t u siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen ve- teen liukeneva reagenssi saatetaan reagoimaan molekyyli-hiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, ./ tunnettu siitä, että mainittu vesiliuos, jossa • « I 122 115 413 mainittu molekyylihiukkanen ja mainittu veteen liukeneva reagenssi reagoivat, sisältää lyotrooppista suolaa.

18. Menetelmä patenttivaatimuksen 8 mukaisen veteen liukenevan konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että (i) mainittu veteen liukeneva polymeerikantaja saatetaan reagoimaan divinyylisulfonin kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5, jolloin muodostuu vesiliuos, joka sisältää veteen liukenevan välituotereagenssin, joka käsittää 10 mainitun veteen liukenevan polymeerikantajan molekyylejä, joihin on kovalenttisesti liittynyt kaksi tai useampia reaktiivisia ryhmiä, jotka on johdettu divinyylisulfonis-ta, (ii) mainittu veteen liukeneva välituotereagenssi 15 mahdollisesti puhdistetaan, (iii) mainittu mahdollisesti puhdistettu veteen liukeneva välituotereagenssi saatetaan reagoimaan mainittujen reaktiivisten ryhmien kautta molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5, jolloin muodostuu 20 veteen liukeneva välituotekonjugaatti olosuhteiden ollessa sellaiset, että kaikki reaktiiviset ryhmät eivät reagoi ·' molekyylihiukkasen kanssa, (iv) mainittu veteen liukeneva välituotekonjugaatti mahdollisesti puhdistetaan, ja 25 (v) mainittu mahdollisesti puhdistettu veteen '· liukeneva välituotekonjugaatti saatetaan reagoimaan aikai- ;·. semmin reagoimattomien reaktiivisten ryhmien reaktion kautta toisen molekyylihiukkasen kanssa vesiliuoksessa pH-: arvossa yli 5, mainitun toisen molekyylihiukkasen ollessa '*!. 30 erilainen kuin se, joka on jo liittynyt mainittuun väli- ;· tuotekonjugaattiin.

19. Patenttivaatimuksen 14, 15 tai 18 mukainen me-netelmä, tunnettu siitä, että mainittu polymeeri- :») nen kantajamolekyyli on valittu ryhmästä, joka koostuu '. , 35 dekstraaneista, mukaan lukien karboksimetyylidekstraanit; 115413 123 tärkkelyksistä, hydroksietyylitärkkelyksistä ja hydroksi-propyylitärkkelyksistä; glykogeenistä; agaroosijohdannaisista; selluloosajohdannaisista, mukaan lukien hydroksi-etyyli- ja hydroksipropyyliselluloosat; ja luonnon kumeis-5 ta.

20. Patenttivaatimuksen 15 tai 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vesiliuos, jossa mainittu molekyylihiukkanen reagoi mainitun mahdollisesti puhdistetun veteen liukenevan välituotereagenssin 10 kanssa vaiheessa (iii), sisältää lyotrooppista suolaa.

21. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vesiliuos, jossa mainittu toinen molekyylihiukkanen reagoi mainitun mahdollisesti puhdistetun veteen liukenevan välituotekonjugaatin 15 kanssa vaiheessa (v), sisältää lyotrooppista suolaa.

22. Menetelmä patenttivaatimuksen 8 mukaisen veteen liukenevan konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 5 mukainen veteen liukeneva konjugaatti saatetaan reagoimaan toisen molekyylihiuk- 20 kasen kanssa vesiliuoksessa pH-arvossa yli 5 mainitun toisen molekyylihiukkasen ollessa erilainen kuin se, joka on jo liittynyt mainittuun reagoivaan konjugaattiin.

• 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, : tunnettu siitä, että mainittu vesiliuos, jossa mai- 25 nittu toinen molekyylihiukkanen ja mainittu veteen liuke-neva konjugaatti reagoivat, sisältää lyotrooppista suolaa.

24. Patenttivaatimuksen 17, 20, 21 tai 23 mukainen * menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu lyo-. . trooppinen suola on valittu ryhmästä, joka koostuu litiu- 30 min, natriumin, kaliumin ja ammoniumin sulfaateista, fos-’;*’ faateista, sitraateista ja tartraateista.

: 25. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaisen veteen :liukenevan konjugaatin käyttö immunokemiallisissa analyysimenetelmissä, mukaan lukien entsymaattiset immunoanalyy- , 35 sit (EIA), kuten ELISA, radioimmunoanalyysit (RIA) ja ne- ' * « 115413 124 felometriset ja turbidimetriset immunoanalyysit; immuno-histokemiallisissa menetelmissä; sytokemiallisissa menetelmissä; virtaussytometriassa; in situ -hybridisaatiome-netelmissä; membraanihybridisaatiomenetelmissä, mukaan 5 lukien southern- ja northern-värjäyksen; biosensoreissa; ja menetelmissä, jotka pohjautuvat lektiini/karbohydraat-tivuorovaikutuksiin.

26. Patenttivaatimuksen 8 mukaisen veteen liukenevan konjugaatin käyttö immunokemiallisissa analyysimene-10 telmissä, mukaan lukien entsymaattiset immunoanalyysit (EIA), kuten ELISA, radioimmunoanalyysit (RIA) ja nefelo-metriset ja turbidimetriset immunoanalyysit; immunohisto-kemiallisissa menetelmissä; sytokemiallisissa menetelmissä; virtaussytometriassa; in situ -hybridisaatiomenetel-15 missä; membraanihybridisaatiomenetelmissä, mukaan lukien southern- ja northern-värjäyksen; biosensoreissa; ja menetelmissä, jotka pohjautuvat lektiini/karbohydraattivuoro-vaikutuksiin. l · » « · * * * « · « ’ ' * - · » 125 115413