JPH06181762A - 標識抗体組成物 - Google Patents
標識抗体組成物Info
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- JPH06181762A JPH06181762A JP33747792A JP33747792A JPH06181762A JP H06181762 A JPH06181762 A JP H06181762A JP 33747792 A JP33747792 A JP 33747792A JP 33747792 A JP33747792 A JP 33747792A JP H06181762 A JPH06181762 A JP H06181762A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 標識抗体と未標識抗体の重合体とを含有する
標識抗体組成物。 【効果】 この標識抗体組成物は、アミノアンチピリ
ン、ハロゲン化アルキルフェノール等の毒性を有する化
学物質を含有せずに、従来では廃棄されていた標識抗体
調製時に得られる未標識抗体を重合体としたものを利用
するため、経済的にも有利であると共に、反応系に影響
を与えず、あらゆる抗原抗体反応、特に抗原抗体反応を
利用した免疫学的測定法に利用できるものである。
標識抗体組成物。 【効果】 この標識抗体組成物は、アミノアンチピリ
ン、ハロゲン化アルキルフェノール等の毒性を有する化
学物質を含有せずに、従来では廃棄されていた標識抗体
調製時に得られる未標識抗体を重合体としたものを利用
するため、経済的にも有利であると共に、反応系に影響
を与えず、あらゆる抗原抗体反応、特に抗原抗体反応を
利用した免疫学的測定法に利用できるものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は経時的に安定な標識抗体
組成物に関する。
組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、生体液中の様々な物質を測定する
には、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法が多く用い
られている。中でも、エンザイムイムノアッセイのよう
に抗原又は抗体を標識し、これによって微量成分を測定
する方法が開発され、盛んに利用されている。また、特
開昭58-122459号公報には、酵素で標識した抗原あるい
は抗体を用いて抗原抗体反応を行わせ、会合の結果生じ
る酵素活性の変化を光学的に測定し、目的とする抗原又
は抗体を定量する方法が記載されている。
には、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法が多く用い
られている。中でも、エンザイムイムノアッセイのよう
に抗原又は抗体を標識し、これによって微量成分を測定
する方法が開発され、盛んに利用されている。また、特
開昭58-122459号公報には、酵素で標識した抗原あるい
は抗体を用いて抗原抗体反応を行わせ、会合の結果生じ
る酵素活性の変化を光学的に測定し、目的とする抗原又
は抗体を定量する方法が記載されている。
【０００３】しかしながら、標識された抗体は、経時的
な安定性に問題があり、長期保存状態においても抗原抗
体反応活性の低下しない標識抗体の開発が望まれてい
た。このため、一般に標識抗体に様々な物質、例えばア
ミノアンチピリン、ハロゲン化アルキルフェノール等を
添加して、その安定化をはかることが行われている。し
かし、これらの化合物は毒性を有し、反応系に影響を与
えるという欠点があった。そこで、特開昭60-149972号
公報には、二種類以上の非還元糖又は糖アルコールを添
加することによる標識抗体の安定化方法が記載されてい
る。
な安定性に問題があり、長期保存状態においても抗原抗
体反応活性の低下しない標識抗体の開発が望まれてい
た。このため、一般に標識抗体に様々な物質、例えばア
ミノアンチピリン、ハロゲン化アルキルフェノール等を
添加して、その安定化をはかることが行われている。し
かし、これらの化合物は毒性を有し、反応系に影響を与
えるという欠点があった。そこで、特開昭60-149972号
公報には、二種類以上の非還元糖又は糖アルコールを添
加することによる標識抗体の安定化方法が記載されてい
る。
【０００４】しかしながら、この方法も安定化効果が充
分ではなく、また糖類をわざわざ添加しなくてはならな
いという問題があった。
分ではなく、また糖類をわざわざ添加しなくてはならな
いという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、反応系に影響
を与えず、標識抗体を長期にわたって安定に維持するこ
とのできる方法の開発が望まれていた。
を与えず、標識抗体を長期にわたって安定に維持するこ
とのできる方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、鋭意研究を行った結果、未標識抗体の重合
体を添加すれば、反応系に何の影響も与えずに標識抗体
を長期安定化できることを見出し、本発明を完成した。
発明者らは、鋭意研究を行った結果、未標識抗体の重合
体を添加すれば、反応系に何の影響も与えずに標識抗体
を長期安定化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は標識抗体と未標識抗体
の重合体とを含有することを特徴とする標識抗体組成物
を提供するものである。
の重合体とを含有することを特徴とする標識抗体組成物
を提供するものである。
【０００８】本発明に用いられる標識抗体は特に限定さ
れるものではなく、常法に従って抗体を標識化したもの
を用いることができる。好ましいものとしては、マレイ
ミド法（エンザイムイムノアッセイ、石川栄治、東京化
学同人社発行に記載）や過ヨウ素法によりペルオキシダ
ーゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識抗
体が挙げられるが、放射性同位元素で標識した放射性同
位元素標識抗体やフルオレセインイソチオシアネート
（FITC）などの蛍光物質で標識した蛍光標識抗体なども
用いることができる。
れるものではなく、常法に従って抗体を標識化したもの
を用いることができる。好ましいものとしては、マレイ
ミド法（エンザイムイムノアッセイ、石川栄治、東京化
学同人社発行に記載）や過ヨウ素法によりペルオキシダ
ーゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した酵素標識抗
体が挙げられるが、放射性同位元素で標識した放射性同
位元素標識抗体やフルオレセインイソチオシアネート
（FITC）などの蛍光物質で標識した蛍光標識抗体なども
用いることができる。
【０００９】本発明において、標識抗体は、通常pH6.5
〜8.0から適宜選択されるpHの緩衝液と混合し、液状の
状態で用いられる（以下、この液状にした標識抗体を
「抗体製剤」と称する）。ここで用いられる緩衝液は、
特に限定されないが、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液が
好ましい。
〜8.0から適宜選択されるpHの緩衝液と混合し、液状の
状態で用いられる（以下、この液状にした標識抗体を
「抗体製剤」と称する）。ここで用いられる緩衝液は、
特に限定されないが、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液が
好ましい。
【００１０】更に、抗体製剤中には、測定系に影響を及
ぼさない範囲において防腐剤等を添加することもでき
る。
ぼさない範囲において防腐剤等を添加することもでき
る。
【００１１】本発明に用いられる未標識抗体の重合体
は、失活・変性している成分で測定系に影響を与えない
ものである。また、分子量として好ましいのは、400,000
〜670,000の範囲であり、特に好ましいのは、440,000〜
670,000の範囲である。
は、失活・変性している成分で測定系に影響を与えない
ものである。また、分子量として好ましいのは、400,000
〜670,000の範囲であり、特に好ましいのは、440,000〜
670,000の範囲である。
【００１２】かかる未標識抗体の重合体は、例えば、架
橋剤として用いられる二官能性化合物と未標識抗体とを
常法に従って反応させることにより得ることができる。
ここで用いられる二官能性架橋剤としては、ジメチルス
ベロイミデート二塩酸塩（DMS）、スベリン酸ジ-N-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（DSS）、酒石酸ジ-N-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（DST）、p-フェニレ
ンビスマレイミド（pPDM）、メチル4-メルカプトブチル
イミデート塩酸塩（MBI）、メチル4-アシドベンゾイミ
デート塩酸塩（ABI）等が挙げられる。
橋剤として用いられる二官能性化合物と未標識抗体とを
常法に従って反応させることにより得ることができる。
ここで用いられる二官能性架橋剤としては、ジメチルス
ベロイミデート二塩酸塩（DMS）、スベリン酸ジ-N-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（DSS）、酒石酸ジ-N-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（DST）、p-フェニレ
ンビスマレイミド（pPDM）、メチル4-メルカプトブチル
イミデート塩酸塩（MBI）、メチル4-アシドベンゾイミ
デート塩酸塩（ABI）等が挙げられる。
【００１３】また、マレイミド法等の二官能性基を未標
識抗体に導入し、次いで標識物質を当該二官能性基に結
合させる方法によって標識抗体を作製する場合には、未
標識抗体に結合したマレイミド基等の二官能性基に酵素
等の標識物質が結合しないと、ここに更に未標識抗体が
結合し、これを繰り返すと未標識抗体の重合体が生成す
る。従って、標識抗体作製後のアフィニティークロマト
グラフィーによる精製時に得られる、標識抗体よりも大
きな分子量の部分を分画することによっても未標識抗体
の重合体を得ることができる。本発明においては、経済
的に有利である点からこの標識抗体作成時に得られる未
標識抗体の重合体を用いるのが好ましい。
識抗体に導入し、次いで標識物質を当該二官能性基に結
合させる方法によって標識抗体を作製する場合には、未
標識抗体に結合したマレイミド基等の二官能性基に酵素
等の標識物質が結合しないと、ここに更に未標識抗体が
結合し、これを繰り返すと未標識抗体の重合体が生成す
る。従って、標識抗体作製後のアフィニティークロマト
グラフィーによる精製時に得られる、標識抗体よりも大
きな分子量の部分を分画することによっても未標識抗体
の重合体を得ることができる。本発明においては、経済
的に有利である点からこの標識抗体作成時に得られる未
標識抗体の重合体を用いるのが好ましい。
【００１４】本発明の標識抗体組成物は、上述の標識抗
体に未標識抗体の重合体を添加することにより得ること
がでる。未標識抗体の重合体の添加量は、標識抗体に対
して、30〜100重量部、特に50〜100重量部が好ましい。
添加量が標識抗体に対して30重量部未満では充分な標識
抗体の安定化効果が得られず、また100重量部を超える
と本発明の標識抗体組成物を用いた測定系に悪影響を与
え好ましくない。
体に未標識抗体の重合体を添加することにより得ること
がでる。未標識抗体の重合体の添加量は、標識抗体に対
して、30〜100重量部、特に50〜100重量部が好ましい。
添加量が標識抗体に対して30重量部未満では充分な標識
抗体の安定化効果が得られず、また100重量部を超える
と本発明の標識抗体組成物を用いた測定系に悪影響を与
え好ましくない。
【００１５】かくして得られる本発明の標識抗体組成物
はアミノアンチピリン、ハロゲン化アルキルフェノール
等の毒性を有する化学物質を含有せずに、従来では廃棄
されていた標識抗体調製時に得られる未標識抗体を重合
体としたものを利用できるため、経済的にも有利である
と共に、反応系に影響を与えず、あらゆる抗原抗体反応
に利用できるものである。従って、本発明の標識抗体組
成物は抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法に利用す
ることのできるものである。
はアミノアンチピリン、ハロゲン化アルキルフェノール
等の毒性を有する化学物質を含有せずに、従来では廃棄
されていた標識抗体調製時に得られる未標識抗体を重合
体としたものを利用できるため、経済的にも有利である
と共に、反応系に影響を与えず、あらゆる抗原抗体反応
に利用できるものである。従って、本発明の標識抗体組
成物は抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法に利用す
ることのできるものである。
【００１６】免疫学的測定法としては、通常の競合法又
はサンドイッチ法によるラジオイムノアッセイ（RIA）
又は酵素免疫測定法（EIA）等が挙げられ、これらの方
法の操作、手順等は常法に変るところはない。より具体
的には、例えば競合法を採用する場合、測定しようとす
る検体中の被験物質と、一定量の不溶化された被験物質
とを、一定量の標識抗体を含有する本発明の標識抗体組
成物と競合反応させ、次いで不溶化被験物質と標識抗体
との結合体及び非結合標識抗体を分離し、そのいずれか
一方の標識活性を測定することにより、検体中の被験物
質を定量することができる。また、サンドイッチ法を採
用する場合は、被験物質と不溶化された抗体とを反応さ
せて、被験物質−不溶化抗体複合体を形成させ、この複
合体に、標識抗体を一定量含有する本発明の標識抗体組
成物を反応させ、次いで複合体と標識抗体との結合体及
び非結合標識抗体を分離し、そのいずれか一方の標識活
性を測定することにより、検体中の被験物質を定量する
ことができる。
はサンドイッチ法によるラジオイムノアッセイ（RIA）
又は酵素免疫測定法（EIA）等が挙げられ、これらの方
法の操作、手順等は常法に変るところはない。より具体
的には、例えば競合法を採用する場合、測定しようとす
る検体中の被験物質と、一定量の不溶化された被験物質
とを、一定量の標識抗体を含有する本発明の標識抗体組
成物と競合反応させ、次いで不溶化被験物質と標識抗体
との結合体及び非結合標識抗体を分離し、そのいずれか
一方の標識活性を測定することにより、検体中の被験物
質を定量することができる。また、サンドイッチ法を採
用する場合は、被験物質と不溶化された抗体とを反応さ
せて、被験物質−不溶化抗体複合体を形成させ、この複
合体に、標識抗体を一定量含有する本発明の標識抗体組
成物を反応させ、次いで複合体と標識抗体との結合体及
び非結合標識抗体を分離し、そのいずれか一方の標識活
性を測定することにより、検体中の被験物質を定量する
ことができる。
【００１７】また、本発明の標識抗体組成物を利用する
免疫測定法において、用いることのできる検体は特に制
限されないが、血清、血漿、胸水、尿等の体液成分が好
ましい。被験物質としては、酵素、ホルモン、胎児性蛋
白質（CEA）等が挙げられる。
免疫測定法において、用いることのできる検体は特に制
限されないが、血清、血漿、胸水、尿等の体液成分が好
ましい。被験物質としては、酵素、ホルモン、胎児性蛋
白質（CEA）等が挙げられる。
【００１８】更に、免疫測定法において用いられる不溶
化被験物質及び不溶化抗体は、被験物質又は抗体を、不
溶性担体に化学的又は物理的に結合させることにより製
造される。ここで不溶性担体としては、セルロース粉
末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾
紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デ
キストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチュ
ーブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチ
ルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重
合物、エチレン−マレイン酸共重合物等が挙げられる。
不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法
（酸アミド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カル
ボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシア
ナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロー
スカルボナート誘導法、縮合試薬を使用する方法）、ア
ルキル化法、架橋試薬による担体縮合法（架橋試薬とし
てグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート
等を用いる）、Ugi反応による担体結合法等の化学的反
応；あるいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオ
ン結合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として
用いる物理的吸着法によって行われる。
化被験物質及び不溶化抗体は、被験物質又は抗体を、不
溶性担体に化学的又は物理的に結合させることにより製
造される。ここで不溶性担体としては、セルロース粉
末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾
紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デ
キストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチュ
ーブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチ
ルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重
合物、エチレン−マレイン酸共重合物等が挙げられる。
不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法
（酸アミド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カル
ボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシア
ナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロー
スカルボナート誘導法、縮合試薬を使用する方法）、ア
ルキル化法、架橋試薬による担体縮合法（架橋試薬とし
てグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート
等を用いる）、Ugi反応による担体結合法等の化学的反
応；あるいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオ
ン結合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として
用いる物理的吸着法によって行われる。
【００１９】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらによってなんら限定される
ものではない。
説明するが、本発明はこれらによってなんら限定される
ものではない。
【００２０】
【表１】尚、本実施例において使用した試薬を以下に示
す。 AFP精製抗原 (株)日本バイオテ
スト研究所製 ウシ胎児血清 三菱化成製 マウス血清 コスモ・バイオ製 フェノール 和光純薬製 西洋ワサビペルオキシダーゼ SIGMA社製 ウシ血清アルブミン 生化学工業製 ポリスチレンビーズ イムノケミカル製 （DMF）N,N-ジメチルホルムアミド 和光純薬社製 （Sulfo-SMCC）スルホ N-スクシンイミジル-4-（N'-マ
レイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート
７ SIGMA社製
す。 AFP精製抗原 (株)日本バイオテ
スト研究所製 ウシ胎児血清 三菱化成製 マウス血清 コスモ・バイオ製 フェノール 和光純薬製 西洋ワサビペルオキシダーゼ SIGMA社製 ウシ血清アルブミン 生化学工業製 ポリスチレンビーズ イムノケミカル製 （DMF）N,N-ジメチルホルムアミド 和光純薬社製 （Sulfo-SMCC）スルホ N-スクシンイミジル-4-（N'-マ
レイミドメチル）-シクロヘキサン-1-カルボキシレート
７ SIGMA社製
【００２１】参考例１ 標識抗体及び未標識抗体の
重合体の製造： (1) HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）へのマレイミ
ド基の導入：HRP（シグマ type XII）10.0mgを滅菌済み
ガラスチューブに秤量し、遮光下において1.5mlの100mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、HRP溶液と
した。そのHRP溶液を、2ml容褐色リアクションバイアル
（PIERCE社製）に移し、攪拌しながら、DMFで13mg/mlに
なるように溶解したSulfo-SMCC溶液150μlをゆっくりと
加えた。その状態で蓋をし、室温で１時間反応させた。
反応終了後、バイアル内のHRP溶液（マレイミド基が結
合したHRP）をセファデックス G-50（SephadexG-50）カ
ラムを用いて、100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）
によりゲル濾過した。
重合体の製造： (1) HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）へのマレイミ
ド基の導入：HRP（シグマ type XII）10.0mgを滅菌済み
ガラスチューブに秤量し、遮光下において1.5mlの100mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、HRP溶液と
した。そのHRP溶液を、2ml容褐色リアクションバイアル
（PIERCE社製）に移し、攪拌しながら、DMFで13mg/mlに
なるように溶解したSulfo-SMCC溶液150μlをゆっくりと
加えた。その状態で蓋をし、室温で１時間反応させた。
反応終了後、バイアル内のHRP溶液（マレイミド基が結
合したHRP）をセファデックス G-50（SephadexG-50）カ
ラムを用いて、100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）
によりゲル濾過した。
【００２２】
【表２】 ディレクター、フラクションコレクターの条件 112 ：280nm（range 1, Time 2,10mV） レコーダー（range 10mV） チャートSP：60mm/hr pump speed：9.60（0.32cc/M） フラクションコレクター：１Fr＝6min（3ml） flowrate ：0.5ml/min
【００２３】チャートより回収するフラクションを決定
し（OD280で0.01以上のフラクション）、回収したマレ
イミド-HRPを４℃で遠心濃縮した。
し（OD280で0.01以上のフラクション）、回収したマレ
イミド-HRPを４℃で遠心濃縮した。
【００２４】(2)精製抗AFP抗体（IgG）へのSH基の導
入：標識用抗AFP抗体溶液１ml（10mg/mlの濃度で、−20
℃に保存）を４℃にて溶解した。標識用抗AFP抗体溶液
を透析膜（スペクトラ社製，Mw 10,000pore）に移し、
両端をクリップ（スペクトラ社製）で止め、100Mmリン
酸ナトリウム緩衝液（NaPB，pH6.5）を外液とし、スタ
ーラーで１昼夜攪拌透析を行った。透析終了後、抗AFP
抗体溶液を２ml容褐色リアクションバイアル（PIERCE社
製）に移し、攪拌しながら、DMFで60mg/mlになるように
溶解したSAMA（Ardrich社製：S-アセチルメルカプトス
クシニック アンハイドライド:Mw 174.18）溶液20μl
をゆっくりと加えた。その状態で蓋をし、室温で30分間
反応させた。反応後、100mM EDTA（pH7.0）を40μl、10
0mMトリス-HCl（pH7.0）を200μl、１Mヒドロキシルア
ミン塩酸塩（pH7.0）を200μlずつ順次添加した。各溶
液を添加後、攪拌を止め、室温にて10分間放置した。反
応終了後、バイアル内のIgG溶液（SH基が結合したIgG）
を、セファデックス G-50（Sephadex G-50）カラムを用
いて、100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）によりゲ
ル濾過した。
入：標識用抗AFP抗体溶液１ml（10mg/mlの濃度で、−20
℃に保存）を４℃にて溶解した。標識用抗AFP抗体溶液
を透析膜（スペクトラ社製，Mw 10,000pore）に移し、
両端をクリップ（スペクトラ社製）で止め、100Mmリン
酸ナトリウム緩衝液（NaPB，pH6.5）を外液とし、スタ
ーラーで１昼夜攪拌透析を行った。透析終了後、抗AFP
抗体溶液を２ml容褐色リアクションバイアル（PIERCE社
製）に移し、攪拌しながら、DMFで60mg/mlになるように
溶解したSAMA（Ardrich社製：S-アセチルメルカプトス
クシニック アンハイドライド:Mw 174.18）溶液20μl
をゆっくりと加えた。その状態で蓋をし、室温で30分間
反応させた。反応後、100mM EDTA（pH7.0）を40μl、10
0mMトリス-HCl（pH7.0）を200μl、１Mヒドロキシルア
ミン塩酸塩（pH7.0）を200μlずつ順次添加した。各溶
液を添加後、攪拌を止め、室温にて10分間放置した。反
応終了後、バイアル内のIgG溶液（SH基が結合したIgG）
を、セファデックス G-50（Sephadex G-50）カラムを用
いて、100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）によりゲ
ル濾過した。
【００２５】
【表３】 ディレクター、フラクションコレクターの条件 112 ：280nm（range 1, Time 2,10mV） レコーダー（range 10mV） チャートSP：60mm/hr pump speed：9.60（0.32cc/M） フラクションコレクター：１Fr＝6min（3ml） flowrate ：0.5ml/min
【００２６】チャートより回収するフラクションを決定
し（OD280で0.01以上のフラクション）、回収したIgG-S
Hを４℃で遠心濃縮した。
し（OD280で0.01以上のフラクション）、回収したIgG-S
Hを４℃で遠心濃縮した。
【００２７】(3)IgG-SHとマレイミド-HRPの結合 (2)で得られたIgG-SHと(1)で得られたマレイミド-HRPを
モル比で１：３になるように２ml容褐色リアクションバ
イアル（PIERCE社製）に採取し、攪拌しながら、４℃に
て16時間反応させた。反応終了後、100mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH6.5）で調製した12.51mg/mlのN-エチル
マレイミド溶液を20μl添加し、反応を停止させた。反
応停止後、バイアル内のIgG-HRP溶液を、セファデック
ス G-50（Sephadex G-50）カラムを用いて、100mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）によりゲル濾過を行っ
た。
モル比で１：３になるように２ml容褐色リアクションバ
イアル（PIERCE社製）に採取し、攪拌しながら、４℃に
て16時間反応させた。反応終了後、100mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH6.5）で調製した12.51mg/mlのN-エチル
マレイミド溶液を20μl添加し、反応を停止させた。反
応停止後、バイアル内のIgG-HRP溶液を、セファデック
ス G-50（Sephadex G-50）カラムを用いて、100mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）によりゲル濾過を行っ
た。
【００２８】
【表４】 ディレクター、フラクションコレクターの条件 112 ：280nm（range 1, Time 2,10mV） レコーダー（range 10mV） UV-1 ：405nm（range 1） レコーダー（range 10mV） チャートSP：60mm/hr pump speed：9.60（0.32cc/M） フラクションコレクター：１Fr＝6min（3ml） flowrate ：0.5ml/min
【００２９】
【表５】ゲル濾過終了後、各フラクションの吸光度280n
mと403nmを測定し、下記式に従って抗AFP抗体の標識率
を求めた。 （蛋白濃度計算法） 濃度 HRP[mg/ml]：Ａ＝403nm／2.275 IgG[mg/ml]：Ｂ＝（280nm−403nm×0.3）／1.4 モル数 HRP[M]：Ｃ＝Ａ／40,000 IgG[M]：Ｄ＝Ｂ／160,000 標識率：Ｅ＝Ｃ／Ｄ
mと403nmを測定し、下記式に従って抗AFP抗体の標識率
を求めた。 （蛋白濃度計算法） 濃度 HRP[mg/ml]：Ａ＝403nm／2.275 IgG[mg/ml]：Ｂ＝（280nm−403nm×0.3）／1.4 モル数 HRP[M]：Ｃ＝Ａ／40,000 IgG[M]：Ｄ＝Ｂ／160,000 標識率：Ｅ＝Ｃ／Ｄ
【００３０】標識率Ｅが１〜２の範囲にあるフラクショ
ンを選別し、各フラクションのIgG濃度を約100ng/mlに
なるように調製し、標識抗AFP抗体を得た。また、この
ゲル濾過時に得られた分子量400,000〜670,000のフラク
ションをすべて混合して未標識抗AFP抗体の重合体とし
た。
ンを選別し、各フラクションのIgG濃度を約100ng/mlに
なるように調製し、標識抗AFP抗体を得た。また、この
ゲル濾過時に得られた分子量400,000〜670,000のフラク
ションをすべて混合して未標識抗AFP抗体の重合体とし
た。
【００３１】実施例１ (1)10％ウシ血清アルブミン、0.01Mリン酸緩衝液（pH7.
0）を用い、AFP精製抗原250ng/ml又は500ng/mlとなるよ
うなAFP調製液を調製した。 (2)10％ウシ胎児血清、１％マウス血清、0.01％フェノ
ール、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）を用い、参考例１で
得られた標識抗AFP抗体が0.1μg/mlとなるような標識抗
AFP抗体調製液を得た。これに、参考例１で得られた未
標識抗AFP抗体の重合体0.05μg/ml(標識抗AFP抗体量に
対して50重量部）を添加し、標識抗AFP抗体組成物を調
製した。 (3)試験管内で、(1)のAFP調製液20μlに(2)の標識抗AFP
抗体組成物500μlを加え、更にポリスチレンビーズ−抗
AFP抗体結合物を１個加え、37℃にて１時間インキュベ
ートした後、蒸留水にてポリスチレンビーズをよく洗浄
し、発色液［0.02％H2O2 １mg/ml、o-フェニレンジアミ
ン含有0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH5.0）］500μlを
添加して、30分間呈色反応を行った。呈色反応は、１N
H2SO4 １mlを混合して停止させ、波長492nmにおける比
色測定を行い、標識抗AFP抗体組成物の安定性を試験し
た。その結果を表６に示す。なお、本実施例で、安定性
試験は標識抗AFP抗体組成物を37℃の苛酷条件に置き、
作製直後、１週間経過後、３週間経過後、４週間経過後
及び８週間経過後のものについてそれぞれその免疫活性
を比色測定した。ここで37℃という温度は、長期間の保
存状態を短期間で想定できるために設定した温度であ
る。
0）を用い、AFP精製抗原250ng/ml又は500ng/mlとなるよ
うなAFP調製液を調製した。 (2)10％ウシ胎児血清、１％マウス血清、0.01％フェノ
ール、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）を用い、参考例１で
得られた標識抗AFP抗体が0.1μg/mlとなるような標識抗
AFP抗体調製液を得た。これに、参考例１で得られた未
標識抗AFP抗体の重合体0.05μg/ml(標識抗AFP抗体量に
対して50重量部）を添加し、標識抗AFP抗体組成物を調
製した。 (3)試験管内で、(1)のAFP調製液20μlに(2)の標識抗AFP
抗体組成物500μlを加え、更にポリスチレンビーズ−抗
AFP抗体結合物を１個加え、37℃にて１時間インキュベ
ートした後、蒸留水にてポリスチレンビーズをよく洗浄
し、発色液［0.02％H2O2 １mg/ml、o-フェニレンジアミ
ン含有0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH5.0）］500μlを
添加して、30分間呈色反応を行った。呈色反応は、１N
H2SO4 １mlを混合して停止させ、波長492nmにおける比
色測定を行い、標識抗AFP抗体組成物の安定性を試験し
た。その結果を表６に示す。なお、本実施例で、安定性
試験は標識抗AFP抗体組成物を37℃の苛酷条件に置き、
作製直後、１週間経過後、３週間経過後、４週間経過後
及び８週間経過後のものについてそれぞれその免疫活性
を比色測定した。ここで37℃という温度は、長期間の保
存状態を短期間で想定できるために設定した温度であ
る。
【００３２】実施例２ 未標識抗AFP抗体の重合体の添加量を0.1μg/ml(標識抗A
FP抗体量に対して100重量部）に代える以外は実施例１
と同様の操作を行い、標識抗AFP抗体組成物の安定性を
試験した。その結果を表６に示す。
FP抗体量に対して100重量部）に代える以外は実施例１
と同様の操作を行い、標識抗AFP抗体組成物の安定性を
試験した。その結果を表６に示す。
【００３３】比較例１ 標識抗AFP抗体組成物500μlに代えて標識抗AFP抗体調製
液500μlを用いる以外は実施例１と同様の操作を行っ
て、標識抗AFP抗体組成物の安定性を試験した。その結
果を表６に示す。
液500μlを用いる以外は実施例１と同様の操作を行っ
て、標識抗AFP抗体組成物の安定性を試験した。その結
果を表６に示す。
【００３４】
【表６】
【００３５】表６の結果から明らかなように、本発明の
標識抗体組成物は未標識抗体の重合体を添加しない標識
抗体に比べ、優れた長期保存安定性を有することがわか
る。
標識抗体組成物は未標識抗体の重合体を添加しない標識
抗体に比べ、優れた長期保存安定性を有することがわか
る。
【００３６】実施例３ (1)10％ウシ血清アルブミン、0.01Mリン酸緩衝液（pH7.
0）を用い、AFP精製抗原０ng/ml、５ng/ml、25ng/ml、1
00ng/ml、250ng/ml及び500ng/mlとなるようなAFP調製液
を調製した。 (2)作製直後の実施例１の標識抗AFP抗体組成物、実施例
２の標識抗AFP抗体組成物又は比較例１の標識抗AFP抗体
調製液を用いる以外は実施例１と同様の操作を行って、
(1)の各標識抗AFP抗体組成物に含まれるAFP濃度の測定
を行った。その結果を表７に示し、この結果から作製し
た検量線を図１に示す。
0）を用い、AFP精製抗原０ng/ml、５ng/ml、25ng/ml、1
00ng/ml、250ng/ml及び500ng/mlとなるようなAFP調製液
を調製した。 (2)作製直後の実施例１の標識抗AFP抗体組成物、実施例
２の標識抗AFP抗体組成物又は比較例１の標識抗AFP抗体
調製液を用いる以外は実施例１と同様の操作を行って、
(1)の各標識抗AFP抗体組成物に含まれるAFP濃度の測定
を行った。その結果を表７に示し、この結果から作製し
た検量線を図１に示す。
【００３７】
【表７】
【００３８】表７及び図１に示した検量線から明らかな
ように、未標識抗AFP抗体を添加した本発明の標識抗AFP
抗体組成物を用いた測定系でも、AFP活性測定に影響を
及ぼさないことがわかる。
ように、未標識抗AFP抗体を添加した本発明の標識抗AFP
抗体組成物を用いた測定系でも、AFP活性測定に影響を
及ぼさないことがわかる。
【００３９】
【発明の効果】本発明の標識抗体組成物は、アミノアン
チピリン、ハロゲン化アルキルフェノール等の毒性を有
する化学物質を含有せずに、従来では廃棄されていた標
識抗体調製時に得られる未標識抗体を重合体としたもの
を利用するため、経済的にも有利であると共に、反応系
に影響を与えず、あらゆる抗原抗体反応、特に抗原抗体
反応を利用した免疫学的測定法に利用できるものであ
る。
チピリン、ハロゲン化アルキルフェノール等の毒性を有
する化学物質を含有せずに、従来では廃棄されていた標
識抗体調製時に得られる未標識抗体を重合体としたもの
を利用するため、経済的にも有利であると共に、反応系
に影響を与えず、あらゆる抗原抗体反応、特に抗原抗体
反応を利用した免疫学的測定法に利用できるものであ
る。
【図１】実施例３におけるAFP濃度の測定により得られ
た、AFP濃度と吸光度との関係を示す検量線である。
た、AFP濃度と吸光度との関係を示す検量線である。
Claims (1)
- 【請求項１】 標識抗体と未標識抗体の重合体とを含有
することを特徴とする標識抗体組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33747792A JPH06181762A (ja) | 1992-12-17 | 1992-12-17 | 標識抗体組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33747792A JPH06181762A (ja) | 1992-12-17 | 1992-12-17 | 標識抗体組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181762A true JPH06181762A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=18309018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33747792A Pending JPH06181762A (ja) | 1992-12-17 | 1992-12-17 | 標識抗体組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06181762A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2729314A1 (fr) * | 1995-01-16 | 1996-07-19 | C Richard Ets | Procede et dispositif de nettoyage pour machine de fabrication de pates alimentaires |
-
1992
- 1992-12-17 JP JP33747792A patent/JPH06181762A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2729314A1 (fr) * | 1995-01-16 | 1996-07-19 | C Richard Ets | Procede et dispositif de nettoyage pour machine de fabrication de pates alimentaires |
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