NO315443B1 - Vannlöselige, polymerbaserte reagenser og konjugater, anvendelse derav samtfremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår vannløselige, polymerbaserte reagenser og konjugater, anvendelse derav samt fremgangsmåte for fremstilling derav. De vannløselige reagenser og konjugater er spesielt godt egnet for anvendelse ved f.eks. biologisk aktuelle påvisnings-, kvantifiserings- og målrettingsmetoder, f.eks. på områdene immunhistokjemi, påvisning av immunreaktive materialer, antistoffimmobilisering, -separasjon eller -rensing, DNA-hybridiseringsforsøk og strømningscytometri, så vel som ved andre anvendelser som vil bli åpenbare på basis av fremsettingen av den foreliggende beskrivelse.

Reagensene og konjugatene ifølge oppfinnelsen er basert på vannløselige, polymere bærermolekyler med fra moderat til høy molekylvekt, og til hvilke det er kovalent koblet reaktive divinylsulfon-avledede deler [dvs. deler med en fri ("ding-lende"), terminal, reaktiv vinylgruppe] eller brodannende divinylsulfon-avledede deler.

De polymere bærermolekyler for spesielt foretrukkede reagenser eller konjugater ifølge oppfinnelsen er i begynnelsen ikke-tverrbundne og har en ladning som i det alt vesentlige er null ved pH-verdier som er aktuelle innenfor anvendelsesområdene for oppfinnelsen. Tverrbinding skjer imidlertid vanligvis under reaksjonen mellom polymerene og divinylsulfon ved en fremstillingsfremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Når det gjelder de polymere bærermolekyler som for tiden er mest foretrukket, dvs. dekstraner, har oppfinnerne funnet at det er mulig å variere graden av tverrbinding på en reproduserbar måte og innenfor ganske vide grenser, f.eks. ved regulering av reaksjonstiden, dekstran-konsentrasjonen eller pH i mediet (eller en kombinasjon av disse) i løpet av fremstillings-prosessen.

Fremstillingen av reagensene og konjugatene ifølge oppfinnelsen finner sted under generelt milde betingelser og under anvendelse av generelt ukompliserte fremgangsmåter

som, som angitt ovenfor, utgjør aspekter ved den foreliggende oppfinnelse. Under hensiktsmessige lagringsbetingelser viser mange av reagensene og konjugatene ifølge oppfinnelsen, og spesielt de kjemisk reaktive reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen (dvs. reagenser og konjugater som lett reagerer med visse typer funksjonelle grupper som finnes i molekyl-forbindelser, under dannelse av kovalente bindinger som knytter de aktuelle molekyl-forbindelser til de polymere bærerreagenser) betydelig og uventet stabilitet ("lagrings-stabilitet") ved langvarig lagring i løsning, hvilket gjør at kommersiell utnyttelse av for-fremstilte reagenser og konjugater av disse typer blir fullt ut gjennomførbart.

I de siste to tiår har det vært store fremskritt på områdene immunkjemi og molekylærbiologi, og dette gjenspeiles tydelig ved omfanget av aktuell vitenskapelig og patentlitteratur som er fremkommet i løpet av dette tidrom. Blant de områder for hvilke den foreliggende oppfinnelse er aktuell, har f.eks. et område med spesielt stor vekst vært området som gjelder kvalitative og/eller kvantitative analyser som innbefatter anvendelse av immunreaktive substanser, dvs. antigener, haptener eller antistoffer.

Ett slikt område er området for immunhistokjemiske/cytokjemiske påvisningsmetoder, hvis formål normalt er lokalisering av antigene determinater som finnes i vev eller i/på celler, via immunkjemisk reaksjon mellom disse antigene determinanter og spesiefikke såkalte primære antistoffer som bare reagerer med de antigene måldeterminanter. De primære antistoffer er enten merket med hensiktsmessige merkematerialer (f.eks. enzymer, fluorescerende grupper eller tunge atomer), eller de påvises videre i seg selv via en immunkjemisk reaksjon med spesifikke såkalte sekundære antistoffer som reagerer med de primære antistoffer; i sistnevnte tilfelle er det de sekundære antistoffer som er merket med hensiktsmessige merkematerialer (f.eks. enzymer, fluorescerende grupper eller tunge atomer). Alternativt påvises den immunkjemiske reaksjon mellom antigene måldeterminanter og primære antistoffer, via en immunkjemisk reaksjon med et spesifikt såkalt bindingsantistoff som har den egenskap at det reagerer samtidig med (i) de primære antistoffer og (ii) et antistoff til hvilket enzymer er blitt festet via en immunkjemisk reaksjon eller via kovalent kobling.

Som et ytterligere alternativ påvises den immunkjemiske reaksjon mellom antigene måldeterminanter og primære antistoffer, eller mellom primære antistoffer og sekundære antistoffer, ved at man drar nytte av bindingen som skjer mellom bestemte par av komplementære molekyler som ikke er antigener og antistoffer; et eksempel på et slikt komplementært par er biotin og streptavidin. Ved denne fremgangsmåte festes ett element i det komplementære par til de primære eller sekundære antistoffer, og det annet molekyl bindes til egnede merkematerialer (f.eks. enzymer, fluorescerende grupper eller tunge atomer).

Ved fremgangsmåter av denne type festes et prøveeksemplar i form av en prøve av tynt skåret vev eller en prøve av celler (typisk fra et kroppsfluid) til et objektglass. Det påførte prøveeksemplar behandles så normalt med forskjellige kjemikalier for å gjøre de etterfølgende immunkjemiske reaksjoner lettere. Prøveeksemplaret underkastes deretter behandling med et merket eller ikke-merket primært antistoff, ettersom det er hensiktsmessig, hvoretter antistoffet blir immunkjemisk bundet til det aktuelle antigen i/på prøven. Etter fjerning av overskudd av antistoff ved hensiktsmessig vasking av prøven, påvises antistoffet som er bundet til den antigene determinant, ved behandling med hensiktsmessige reagenser, avhengig av valget av visualiseringssystemet (som beskrevet tidligere ovenfor), sammen med egnede vaskemetoder. Etter fjerning (ved vasking) av overskudd av merket reagens fra det valgte visualiseringssytem, underkastes prøven behandling som følger, avhengig av det aktuelle merketmateriale: (i) når det gjelder enzym-merkematerialer, behandles prøven med et substrat (fargeutviklende reagens). Enzymet reagerer med substratet, hvilket fører til dannelse av en farget uløselig avsetning på og rundt stedet for enzymet; (ii) når det gjelder et tungmetall-merkemateriale så som gull, kan prøven behandles med et såkalt forsterkningsreagens inneholdende sølv. Sølvmetall utfelles så som en svart avsetning på og rundt stedet hvor gullet befinner seg; (iii) når det gjelder fluorescerende merkematerialer, er det normalt ikke nødvendig med noe fremkallingsreagens.

Etter et vasketrinn, kan så noen av bestanddelene i prøven farges med et kjemisk fargestoff som gir en passende kontrast til fargen som fås med det aktuelle merkematerialet. Etter et endelig vasketrinn, belegges prøven med et transparent reagens for å sikre en varig registrering ved undersøkelsen.

Visualiseringen av merkematerialene (som indirekte uttrykker lokaliseringen og mengden av antigene måldeterminanter) utføres som følger: (i) lysmikroskoperingsundersøkelse (når det gjelder enzym-merkematerialer); (ii) lys- eller elektronmikroskopisk undersøkelse (når det gjelder tungmetall-merkematerialer); (iii) fluorescensmikroskopi-undersøkelse under anvendelse av bestråling med lys med en egnet bølgelengde (når det gjelder fluroescerende merkematerieler).

I det aktuelle tidsrom er det f.eks. også fremkommet og utviklet analyser av den såkalte ELISA-type (enzym-tilknyttet immunsorpsjonsanalyse), ved hvilke et antigen, hapten eller antistoff påvises ved hjelp av et enzym som er kovalent koblet (også betegnet sammenknyttet eller konjugert) enten (når et antigen eller hapten skal bestemmes) til et antistoff som er spesifikt for det aktuelle antigen eller hapten, eller (når et antistoff skal bestemmes) til et antistoff som er spesifikt for det aktuelle antistoff. Ved "tradisjonell" ELISA, er antigenet, haptenet (sistnevnte vanligvis i form av et konjugat med f.eks. et protein) eller antistoffet som skal påvises/bestemmes, normalt bundet eller gjort ubevegelig ved at det har fått mulighet til å bindes immunkjemiskt til (i) et såkalt (oppfangende) antistoff når det gjelder antigen- eller haptenbestemmelse, eller (ii) et antigen når det gjelder antistoffbestemmelse, som hvert er bundet (vanligvis ved ikke-kovalent adsorpsjon) til overflaten av et hensiktsmessig materiale, såsom polystyren i form av perler eller mikrotiterbrønner, og det hensiktsmessige enzym tilknyttede spesifikke antistoff far så bindes til den ubevegeliggjorte substans som skal påvises/bestemmes; mengden av bundet spesifikt antistoff, og således mengden av ubeveliggjorte substanser, bestemmes deretter ved tilsetning av et materiale som er substrat for det tilknyttede enzym og som, ved enzymatisk spalting, resulterer i utvikling av en karakteristisk farge hvis intensitet (målt f.eks. ved spektrofotometri eller enkel kolorimetri/komparimetri) således står i forhold (normalt proporsjonalt) til mengden av den aktuelle substans som skal bestemmes. Eksempler på foretrukkede enzymer for anvendelse ved analyser av denne type (så vel som ved immunhistokjemiske metoder) er peroksydaser, f.eks. pepperrot-peroksydase, alkalisk fosfatase, glukose-oksydaser, galaktosidaser og ureaser.

Immunkjemiske analyser av en type som er analog til ELISA, men hvor det anvendes andre påvisningsmåter, f.eks. anvendelse av spesifikke antistoffer til hvilke fluorescerende eller luminescerende markørmolekyler er kovalent bundet, har også gjennomgått betydelig utvikling i det samme tidsrom, og fremkomsten av såkalt "tids-oppløst fluorescens" er et godt eksempel: Ved denne teknikk er vanligvis markøren eller merkematerialet Eu eller en europium-chelatdanner (skjønt visse andre lantanid-forbindelser eller lantanid-chelatdannere også har vært anvendt), og et fluorescerende europium-chelat kan så dannes ved tilsetting av henholdsvis en organisk chelatdanner eller Eu<3+>. I motsetning til de fleste av de mer tradisjonelle fluorescerende markørmaterialer, f.eks. fluorescein, som vanligvis har fluorescerings-levetider på ca. 100 nanosekunder (nsek) eller mindre, er fluorescens-levetiden for lantanid-chelater vanligvis i området 100-1000 mikrosekunder (fisek); ved at man gjør bruk av en pulsert lyskilde og et tidsstyrt fluorometer, kan fluorescensen av disse forbindelser måles i et tidsvindu på ca. 200-600 psek etter hver eksitering. En hovedfordel med denne teknikk er reduksjonen av bakgrunnssignaler som kan fremkomme ved kortvarig fluorescens av andre tilstedeværende substanser, f.eks. i analyse-prøven, i eller på materialet i mikrotiterbrønner, i kyvetter eller lignende, eller ellers i målesystemet.

En ytterligere gruppe av fremgangsmåter hvor det anvendes immunkjemiske påvisningsteknikker, og som bør nevnes i forbindelse med oppfinnelsen, er "immunblotting"-metoder, og eksempler på disse er de såkalte "dot blot"- og "western blot"-metoder: Ved western blot-metoden, som anvendes for analysering og identifisering av antigene polypeptider eller proteiner, separeres proteinene/polypeptidene i en blanding av disse, ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese og overføres deretter elektroforetisk ("blottes") til et ark av nitrocellulose- eller kjemisk behandlet papir til hvilket proteinene/ polypeptidene bindes i et mønster som er identisk med mønsteret i gelen. Det hensiktsmessige spesifikke anti-stoff tilsettes deretter, fulgt av et merket andre antistoff mot det første antistoff eller merket protein-A (merket f.eks. med en radioisotop, et fluorescerende fargestoff, et enzym eller kolloidalt gull). Stedet for merkematerialet (og således tilstedeværelse av det spesielle antigen) påvises så på hensiktsmessig måte som tidligere skissert.

Når det gjelder utviklinger på det generelle molekyl-biologifelt, har ett ikke-immunkjemisk område av betydning vært området for hybridiseringsteknikker i forbindelse med genstrukturanalyse: Ved "tradisjonelle" hybridiseringsteknikker merkes en spesiell nukleotidsekvens (også kjent som en "probe" eller "gen-probe") med en hensiktsmessig markør eller merkemateriale, f.eks. en radioaktiv isotop, og tilsettes deretter til en prøve av en aktuell nukleinsyre, f.eks. en prøve i form av en del av intakte celler eller i form av isolerte DNA- eller RNA-fragmenter. Prøven kan enten være fri i løsning eller ubevegelig-gjort på et fastfase substrat. Hvis proben og nukleinsyreprøven hybridiserer ved dannelse av en sterk, ikke-kovalent binding mellom dem, kan det med rimelig sikkerhet antas at en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med sekvensen av proben, er tilstede i nukleinsyren. Markøren eller merkematerialet på proben tilveiebringer således et middel til påvisning av om hvorvidt hybridisering har skjedd, og for bestemmelse av mengden av tilstedeværende DNA/RNA-prøve.

Den såkalte "Southern blot"-metode for påvisning av sjeldne DNA-fragmenter i en kompleks blanding av DNA er et eksempel på en fremgangsmåte hvor hybridiserings-teknikken anvendes: Gelelektroforese anvendes til separering av de forskjellige fragmenter, som deretter denatureres og overføres ved blotting til nitrocelluloseark. Fragmentene hybridiseres deretter til en hensiktsmessig radioaktivt merket probe, og posisjonen for dem påvises ved autoradiografi. Analoge metoder er blitt utformet for RNA og, som allerede nevnt ("western blot", se ovenfor), for protein- eller peptidantigener.

Hybridiseringsteknikker har hatt stor betydning ved biokjemisk genetikk for forståelse for forholdet mellom nukleotidsekvenser og deres funksjon, og de representerer et viktig diagnostisk verktøy for påvisning av f.eks. genetiske defekter eller av infeksiøse midler så som virus eller bakterier.

Hovedsakelig på grunn av de helserisikoer som anvendelse av radioisotomer ved hybridiseirngsmetoder av ovennenvte typer medfører, har det vært gjort forsøk på å erstatte dem med mer ufarlige (og generelt lettere tilgjengelige) markører eller merkematerialer. Forsøk som er gjort inntil nå, f.eks. med anvendelse av biotinylerte prober for påvisning ved hjelp av f.eks. enzymmerkede reagenser, har imidlertid resultert i ledsagende tap av sensitivitet i forhold til det som kan oppnås ved anvendelse av radioaktivt merkede prober.

Det ovennevnte problem med dårlig følsomhet når det gjelder påvisning ved anvendelse spesielt ikke-radioaktive merkematerialer, gjelder ikke bare hybridiseringsteknikker, men også immunkjemiske påvisnings- eller analysemetoder, eller når immunkjemisk påvisning anvendes for forsterkning av en hybridiseringsreaksjon. Med andre ord kan den lavere påvisningsgrense vise seg å være utilstrekkelig for utvetydig påvisning eller nøyaktig kvantitativ bestemmelse av lave nivåer av f.eks. antigener eller antistoffer eller nuklein-syrer. Dette kan f.eks. skyldes at intensiteten av fargen eller fluorescensen ved en immunkjemisk eller hybridiseirngsmetode av én av de ovennevnte typer er for lav, hovedsakelig som en følge av det faktum at bare ett, eller i beste fall, meget få (vanligvis mindre enn fem) molekyler av enzym- eller markørsubstanser, normalt kan bindes f.eks. til hvert spesifikt antistoffmolekyl eller til hvert molekyl i nukleotidsekvensen av proben. Videre er det, for hvert markørmateriale som er festet (konjugert) til f.eks. et antistoffmolekyl, og spesielt hvis markørmaterialet gir antistoff/markørkonjugatet en positiv eller negativ nettoladning, en økende risiko for skadelig påvirkning på den naturlige evne hos f.eks. antistoffet til å delta i den riktige aktuelle immunkjemisk bindingsreaksjon; videre øker tilstedeværelsen av en positiv eller negativ netto ladning på et slikt konjugat risikoen for uønsket ikke-spesifikk binding av konjugatet til andre materialer eller substanser i systemet.

Spesielt på det immunkjemiske området har det vært gjort betydelige anstrengelser for å finne frem til måter til forøking av følsomheten ved immunkjemiske analysemetoder, og én metode som har vært ganske vellykket, innbefatter tilhefting av en immunkjemisk reaktiv substans, f.eks. et antistoff, og en stor mengde enzymmolekyler, fluorescerende markørmolekyler eller lignende, til ett og samme skjelett eller bærer, f.eks. en polymer bærer. Det er tallrike patentdokumenter som angår denne metodetype, og som gjør bruk av enten løselige eller uløselige bærere. Ved anvendelser av den type som er skissert ovenfor, er anvendelse av løselige bærere foretrukket generelt sett, siden tilstedeværelse av bæreren (med de tilkoblede immunkjemiske reaktive substanser og enzymer/markørmolekyler eller lignende) i homogen løsning istedenfor som en heterogen fase, sammen med den forholdsvis store strukturelle fleksibilitet hos slike substanser i løsningsfasen, i stor grad forøker hastigheten og generelt omfanget av immunkjemisk reaktivitet med det immunkjemiske substansmotstykket som skal påvises eller bestemmes; ved immunhistokjemiske anvendelser er bruken av løselige bærere praktisk talt helt vesentlig, siden god vevskontakt eller -inntrenging er nødvendig for å sikre optimal adkomst til de immunkjemisk rekative deler eller epitoper som finnes på, eller i, vevet. Videre er det generelt mye lettere å fjerne (f.eks. ved vasking eller gjennomstrømming) immunkjemisk reaktive substanser på en bærer, f.eks. antistoffer på en bærer, som ikke er blitt bundet (f.eks. på grunn av "metning" av tilgjengelige bindingssteder) til immunkjemiske motstykker, f.eks. til antigener som f.eks. er festet til overflaten av en mikrotiterbrønn, immunplate eller lignende, når de aktuelle substanser på bærere er løselige, enn når de er uløselige eller kolloide.

Den foreliggende oppfinnelse representerer et betydelig fremskritt blant annet med hensyn til forbedringen av fleksibilitet, følsomhet og pålitelighet når det gjelder alle de forskjellige typer påvisnings- og analysemetoder som er beskrevet ved eksempel ovenfor. Oppfinnelsen kan også utnyttes f.eks. til reduksjon - uten tap av følsomhet - av antallet av suksessive "sjikt" av immunreaktive komponenter (antigen, antistoff, anti-antistoff osv.) som ellers ville være nødvendig ved utføresle av f.eks. en tradisjonell ELISA- eller histokjemisk metode. Andre fordeler som er knyttet til oppfinnelsen, vil bli åpenbare utfra den foreliggende beskrivelse og de utførelseseksempler som er gitt i det foreliggende.

Siden den foreliggende oppfinnelse, som allerede angitt, angår vannløselige reagenser og konjugater, samt fremstilling og anvendelse av dem, er den følgende angivelse av en rekke relevante patentdokumenter begrenset til beskrivelser hvor det anvendes løselige bærere:

Europeisk patent 0 077 671 angår blant annet en vann-løselig, ikke-tverrbundet og ikke-prim.-aminholdig polymer til hvilken en markørsubstans er konjugert. Polymer/ markørsubstanskonjugatet har en negativ ladning eller ingen ladning, og til polymerdelen av hvert molekyl i denne, er det festet "bare én immunologisk homolog" (antigen eller anti-stoff). Den opprinnelige europeiske patentsøkand (EP 0 077 671 Al) begrenser seg ikke til "bare ett" immunologisk homologt molekyl, og heller ikke er det nevnt noe spesifikt om mer enn én immunologisk homolog. De foretrukkede vannløselige polymerer i sistnevnte patent/patensøknad er polyakrylsyre, polymetakrylsyre, polyakrylamid, polyvinylalkohol, polyallylalkohol, polymerkombinasjoner av de forannevnte, hydroksyetylcellose, hydroksypropyl-cellulose, naturlige vannløselige polymerer og syntetiske vannløselige polymerer. Molekylene i markørsubstansen kan innarbeides fra begynnelsen i polymeren ved ko-polymerisering av en forholdsvis liten prosentandel av en egnet monomer under inn-arbeidelse av markørsubstansen (f.eks. når det gjelder en fluorescerende markørsubstans, en monomer dannet ved reaksjon mellom fluoresceinamin og akryloylklorid i ekvimolare mengder) med monomerene som danner grunnlaget for polymerskjelettet (f.eks. akrylsyre og akryl-amid). Andre nevnte metoder for tilhefting av markørsubstanser til polymeren innbefatter at man gjør bruk av en aktivert gruppe på markørsubstansen og anvender et "eksternt aktiveringsmiddel". Når det gjelder tilhefting av den immunologiske homolog til polymerskjelettet, er følgende eksempler gitt: (i) en akrylsyre/akrylamidkopolymer innbefattende ca. 1% av en kopolymerisert monomer dannet ved reaksjon mellom fluoresceinamin og akryloylklorid, aktiveres ved reaksjon med karbonyldiimidazol og N-hydroksysuksinimid, og det resulterende aktiverte polymer/markørsubstans-konjugat får så reagere med et monoklonalt antistoff; (ii) et monoklonalt antistoff som er blitt biotinylert ved reaksjon med biotinyl-N-hydroksysuksinimid, tilsettes til et konjugat dannet ved reaksjon mellom avidin og det aktiverte polymer/markørsubstans-konjugat fremstilt som angitt under (i) ovenfor; tilhefting av det monoklonale antistoff til polymerskjelettet skjer i dette tilfelle via den sterke, men ikke-kovalente, bindings-vekselvirkning mellom biotingruppene som er kovalent bundet til antistoffet, og avidindeler som er kovalent konjugert til polymer/markørsubstansen.

Det ser ut til at det i dette patent ikke er noen beskrivelse som angår anvendelse av dekstraner som polymerbærer, eller av divinylsulfon, eller en del som stammer derfra, som aktiveringsreagens eller koblings/brodanningsdel via hvilke en markørsubstans eller en immunologisk homolog kan festes til polymeren.

US-patent 4.152.411 angår et merket "ryggradverktøy" for bestemmelse av en komponent ved antigen/antistoff-reaksjonen, idet man fortrinnsvis gjør bruk av polymerer med amidbindinger mellom de individuelle enheter i polymeren, f.eks. polylysin, andre homopoly(animosyrer) eller polypeptider; gjennomsnittlig festet bare ett molekyl (hapten, antigen eller antistoff) som skal "merkes", til polymer-"ryggradverktøyet". Beskrivelsen nevner tolylen-2,4-diisocyanat, glutaraldehyd og karbodiimid som kandidater til aktiveringsreagenser ved hjelp av hvilke molekylet som skal "merkes", kan kobles til polymerbæreren, og to spesifikke eksempler illustrerer anvendelse av l-etyI-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid for kobling av et hapten, dvs. tyroksin. Skjønt en rekke mulige merke- eller markørmaterialer er nevnt, innbefattende tallrike fluorescerende substanser (såsom fluorescein) og enzymer (så som peroksydaser), er detaljer når det gjelder måten ved hvilken disse skal festes til polymerbæreren, bare gitt med hensyn til ett spesifikt enzym, nemlig pepperrotperoksydase (HRP), som i det aktuelle eksempel kobles til polylysin/tyroksinkonjugat via begynnelsesoksydasjonen for dioldelen av HRP under anvendelse av natriumperjodat; den resulterende diketondel av den oksyderte HRP får så reagere med sistnevnte konjugat (via en aminofunksjon på polylysindelen) under dannselse av et Schiff-basemellomprodukt, som i sin tur så reduseres, f.eks. under anvendelse av natriumborhydrid, under dannelse av det HRP-merkede polylysin/tyroskinkonjugat. Denne spesielle type merket konjugat ("diagnostisk markør-ryggradverktøy") er angitt å være "...forbausende stabil ved lagring i lengre tidsrom. Det anses som mulig å lagre et slikt verktøy i opp til tre eller seks måneder eller mer i inert atmosfære, f.eks. under nitrogen, og i fravær av fuktighet".

Muligheten for anvendelse av polysakkarider, innbefattende dekstran, som basis for "ryggradverktøyet" er kort nevnt i beskrivelsen, men det er ingen angivelse av den detaljerte måte på hvilken tilhefting av de aktuelle molekyler til dekstran skulle finne sted. Heller ikke er det noen angivelse av eventuelle fordeler som er forbundet med anvendelse av dekstran for dette formål.

EP 0 010 405 Al angår blant annet et immunkjemisk analysereagens omfattende en karboksyl-holdig, vannløselig, monoolefinisk polymer forbindelse kombinert (dvs. koblet) med et hapten eller et kjemisk modifisert produkt derav, samt en fremgangsmåte for immunkjemisk bestemmelse av et hapten under anvendelse av et slikt reagens. Det ser ut til at anvendelse av polymerer beslektet med dekstran ikke er nevnt i forbindelse med denne patentsøknad.

Kjemiske metoder som er nevnt i forbindelse med kobling av et hapten til den polymere forbindelse, er: anvendelse av karbodiimider (f.eks. dicykloheksylkarbodiimid), karbonyldiimidazol eller difenylfosforylazid (DPPA); og den midlertidige dannelse av blandede syreanhydrider (f.eks. dannet under anvendelse av en klormaursyreester såsom isobutylklorformiat), aktive estere (f.eks. dannet under anvendelse av N-hydroksysuksinimid), azider (dannet under anvendelse av hydrazin, fulgt av salpetersyrling) eller syreklorider (f.eks. dannet under anvendelse av tionylklorid eller fosforoksyklorid).

De aktuelle reagenser for immunkjemisk analyse viser "meget høy stabilitet i form av vandig løsning og kan godt tåle lagring ved romtemperatur.

Det ser ut til at det ikke er nevnt noe om muligheten for kobling av annen immunologisk aktiv substans (antigen, antistoff) enn et hapten til det aktuelle polymere materialet.

US-patent 4.166.105 og 4.169.137 angår henholdsvis antigenpåvisningsreagenser og reagenser som er merket med farge, omfattende et prim.-aminholdig polyfunksjonelt polymerskjelett, f.eks. et polyetyleniminskjelett, og tilheftede markørmolekyler (så som mange forskjellige fluorescerende fargemolekyler); reagensene ifølge førstnevnte patent omfatter videre et antistoff som er spesifikt for antigenet som skal påvises, mens reagensene ifølge sistnevnte patent videre omfatter en "første reaktant", spesielt et antistoff. Utførelseseksempler gitt i begge patenter viser et gjennomsnitt av høyst ett antistoffmolekyl festet til polymerskjelettet. Anvendelse av et dialdehyd, spesielt glutaraldehyd, som koblingsreagens for kobling av markørmolekyler og antistoff/første reaktant til polymerskjelettet, er foretrukket, idet det ikke nevnes noe om muligheten til anvendelse av devinylsulfonbasert kobling.

EP 0 135 071 A2 angår blant annet kjemiluminescensmerkede haptenkonjugater omfattende en kjemiluminescerende gruppe (f.eks. en gruppe som stammer fra luminol eller et derivat derav), en kjede-polymer "tilheftingsgruppe" (på tysk: Verknupfungs-gruppe) og et hapten; tilheftingsgruppen har repeterende funksjonelle grupper, og for hvert mol av tilheftingsgruppen er det flere mol av luminescerende gruppe og flere mol hepten, fortrinnsvis minst 10 mol av hver pr. mol tilheftingsgruppe.

Eksempler på kjedepolymerer som er kort nevnt i beskrivelsen, innbefatter peptider, proteiner, glykoproteiner, glykolipider og karbohydrater, innbefattende polysakkarider såsom dekstraner, og divinylsulfon er kort nevnt blant eksempler på koblingsreagenser for kobling av kjemiluminescerende grupper eller haptener til repeterende, funksjonelle, reaktive grupper (såsom amino-, karboksy-, karbonyl-, "tionyl"- eller hydroksygrupper) på polymeren. De eneste utførelseseksempler som finnes, angår imidlertid fremstilling og anvendelse, ved en kjemiluminescensanalyse, av luminol/hapten/proteinkonjugater basert på proteinene (polymerene) transferrin og grisetyreoglobulin, og anvendelse av henholdsvis et karbodiimid og ravsyreanhydrid, som koblingsreagenser for kobling av haptenene til proteinene.

Det er ingen videre beskrivelse eller noe utførelseseksempel i dette dokument som angår anvendelse av, eller noen fordeler knyttet til anvendelsen av, koblingskjemien som er foretrukket når det gjelder den foreliggende oppfinnelse, dvs. kobling basert på deler som stammer fra divinylsulfon; heller ikke ser det ut til å være noen klar angivelse av stabiliteten eller lagringsbestandigheten av de beskrevne konjugater, hverken i fast tilstand eller i løsning.

I forbindelse med konjugatene beskrevet i dokumentene som er omtalt ovenfor, utmerker reagensene/konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse seg f.eks. som beskrevet i det følgende: For det første er vannløselige reagenser og konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse blitt funnet å ha uventet og usedvanlig høy stabilitet/lagirngsbestandighet i vandig løsning ved moderate (ikke-ekstreme) pH-verdier, ikke bare ved lave temperaturer, men også ved temperaturer som er litt over normale romtemperaturer; dette er godt dokumentert ved utførelseseksemplene gitt i det foreliggende (se nedenfor). Det er spesielt bemerkelsesverdig at dette gjelder: (i) vannløselige reagenser ifølge oppfinnelsen som ikke har noen molekylforbindelser [som definert i det foreliggende; (se nedenfor)] tilkoblet, dvs. reagenser ifølge oppfinnelsen som omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet én eller flere grupper eller deler som stammer fra divinylsulfon, idet én ende av hver av disse er bundet til bærermolekylet via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper i divinylsulfon og en reaktiv funksjonalitet som finnes på bærermolekylet, og den annen ende beholder en fri, "dinglende" vinylgruppe som kan inngå i en etterfølgende reaksjon med en hensiktsmessig

molekylforbindelse med en egnet reaktiv funksjonell gruppe; og

(ii) vannløselige konjugater ifølge oppfinnelsen som omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det, via sammenbindende grupper som stammer fra divinylsulfon, er kovalent bundet én eller flere molekylforbindelser, idet det polymere bærermolekyl videre har kovalent tilknyttet én eller flere divinyl-sulfon-avledede deler med en fri, reaktiv vinylgruppe.

Som dokumentert i utførelseseksemplene i det foreliggende, har de nærværende oppfinnere funnet at den iboende reaktivitet hos de frie vinylgrupper som finnes i sistnevnte typer av vannløselige reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen, nedsettes ved pH-verdier som er nær nøytral pH, mens disse grupper viser meget høy reaktivitet ved alkaliske pH-verdier, f.eks. ved en pH i området ca. 9-11.

Videre tyder også foreløpige resultater oppnådd av de nærværende oppfinnere, på at vannløselige konjugater ifølge oppfinnelsen som er hovedsakelig "mettet" når det gjelder muligheten til kovalent binding av ytterligere molekylforbindelser (dvs. konugater ifølge oppfinnelsen som har molekylforbindelser kovalent bundet til det polymere bærermolekyl via sammenbindende grupper som stammer fra divinylsulfon, men som hovedsakelig mangler divinylsulfonavledede deler med frie, reaktive vinylgrupper), også på lignende måte har høy stabilitet/lagringsbestandighet i vandig løsning ved moderate pH-verdier.

Den ovenfor beskrevne langvarige stabilitet hos reagenser og konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse gjør det således mulig, som allerede angitt (se ovenfor), å markedsføre slike reagenser eller konjugater i for-fremstilt form, f.eks. i form av et utstyrs-sett som kan innbefatte (hvor aktuelt) instruksjoner og eventuelt kjemiske tilleggs-reagenser for utføresle av de hensiktsmessige videre kjemiske metoder; kjøperen kan således (i) deretter binde ønskede molekylforbindelser til for-fremstilte, kjemisk reaktive reagenser eller konjugater ifølge oppfinneslen under tillaging av f.eks. analysereagenser eller konjugater som er tilpasset til å oppfylle spesifikke behov, eller (ii) når det gjelder for-fremstilte, "mettede" konjugater (se ovenfor) ifølge oppfinnelsen, anvende et for-fremstilt konjugat ifølge oppfinnelsen direkte ved en aktuell påvisnings- eller analysemetode.

For det annet, har reagensene og konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelse,

særlig de mest foretrukkede reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen hvor det polymere bærermolekyl er et dekstran, i forhold til størrelsen av det polymere bærermolekyl, evne til høy grad av tilknytting av molekylforbindelser, mens de på samme tid forblir vannløselige; hvilket fremgår av utførelseseksemplene gitt i det foreliggende (se nedenfor). Når man tar i betraktning det forholdsvis moderate innhold av reaktive grupper (dvs. reaktive grupper som stammer fra divinylsulfon, og via hvilke kovalent tilknytting av molekylforbindelser finner sted) på de polymere bærermolekyler i de mellomliggende reagenser som anvendes i de foreliggende aktuelle utførelseseksempler, og på grunn av det faktum at betraktelig høyere innhold av reaktive grupper er oppnåelige, hvilket er godt dokumentert i andre utførelseseksempler i det foreliggende, regner man videre med at betydelig høyere nivåer av tilknytting av molekylforbindelser kan oppnås, f.eks. slik at kovalent tilknytting av flere tusen molekylforbindelser med lav molekylvekt, eller opp til størrelsesordenen tusen molekylforbindelser med forholdsvis høy molekylvekt, pr. bærermolekyl er oppnåelig, selvfølgelig avhengig av det steriske volum og/eller molekylvekten for den aktuelle molekylforbindelse, og av størrelsen eller molekylvekten av det polymere bærermolekyl.

For det tredje er det ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke bare mulighet for at bærermolekylet kan tilknyttes f.eks. en rekke haptensubstanser (som i EP 0 135 071 A2) eller fluoresceingrupper (som i US-patent 4.166.105 og 4.169.137), men det er likeså fullt mulig å tilknytte en rekke molekyler av antigener, antistoffer, enzymer, genprober, avidin eller andre typer molekylsubstanser som vil fremgå av den foreliggende beskrivelse. Spesielt bemerkelsesverdig er muligheten ifølge oppfinnelsen til tilknytting av en rekke antistoffer til et vannløselig polymert bærermolekyl som anvendes innenfor rammen av oppfinnelsen; på basis av patent- og vitenskapelig litteratur som de nærværende oppfinnere kjenner til, og som angår vannløselige reagenser eller konjugater av en type som er aktuell i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, ser det ut til at det enten har vært teknisk fordom når det gjelder muligheten for, eller ønskeligheten av, oppnåelse av tilknytning av mer enn ett antistoffmolekyl (eller i beste fall, mer enn noen meget få antistoffmolekyler) til bærermolekylet, eller kanskje at forsøk på oppnåelse av dette generelt har vært mislykkede. Anvendelsen av et antistoffbærende konjugat (som bærer en rekke antistoffer og en rekke egnede markør- eller merkematerialer) ved en immunkjemisk analyse, såsom en immunhistokjemisk eller ELISA-analyse type, forøker reaksjonshastigheten og følsom- heten (og sannsynligvis nøyaktigheten og påliteligheten) av slike analyser. Det antas at tilknyttingen ifølge oppfinnelsen av en rekke antistoff-molekyler (f.eks. ca. 5,10,15,20 eller flere) til polymerbæreren eller -skjelettet f.eks. fører til: (a) øket statistisk sannsyn-lighet for oppnåelse av en rekke antistoffmolekyler med den riktige steriske struktur til tilfredsstillende binding til den komplementære immunologiske komponent (så som et antigen), og (b) øket styrke av bindingen til den komplementære immunologiske komponent.

Det kan også nevnes her at det antas at lignende fordeler også kan oppnås ved anvendelse av oppfinnelsen f.eks. ved hybridiseringsteknikker (se ovenfor), ved at følsom-heten og påliteligheten ved påvisningen ifølge slike metoder kan ventes å være betydelig forbedret ved anvendelse av et hensiktsmessig konjugat ifølge oppfinnelsen, som omfatter en rekke markørmaterialer og eventuelt en rekke probemolekyler.

For det fjerde og som et mer generelt aspekt, muliggjør den divinylsulfonbaserte koblingskjemi som anvendes innenfor rammen av oppfinnelsen, spesielt i kombinasjon med anvendelse av et lyotropisk salt ved tilknytting av disse molekylforbindelser på en måte ifølge oppfinnelsen, en meget stor variasjon når det gjelder antall av, og/eller forholdet mellom, de to typer molekylforbindelser som knyttes til det polymere bærermolekyl, ved fremstilling av konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse som omfatter to forskjellige typer tilknyttede molekylforbindelser: Som allerede skissert ovenfor, blir det mulig på grunn av evnen til regulering av reaktiviteten til fire vinylgrupper i reagenser eller konjugater ifølge oppfinnelsen ved variasjon av pH, å tilveiebringe et ønsket nivå av tilknytting av én av de aktuelle molekylforbindelser til den polymere bærer (i forhold til det tilgjengelige antall reaktive vinylgrupper), hvoretter den iboende reaktivitet av de gjenværende, ikke-omsatte vinylgrupper kan reduseres ved justering av pH i mediet; hvis ønskelig, kan det "mellomliggende" konjugat deretter underkastes én eller flere rense-prosesser, f.eks. kromatografi, før man fortsetter med å tilknytte den annen aktuelle type molekylforbindelser. Det er således ikke bare mulig å fremstille godt karakteriserte konjugater, men det er også mulig å utøve en høy grad av kontroll av fremstillings-prosessen på en enkel måte.

For det femte antas det at konjugater ifølge oppfinnelsen basert på visse foretrukkede typer av polymere bærermolekyler, dvs. polymere bærermolekyler som hoved sakelig er lineære, har vevsstruktur-inntregningsegenskaper til tross for en forholdsvis høy molekylvekt.

Ved et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et vannløselig reagens omfattende et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet mer enn én del avledet fra divinylsulfon, idet hver av delene er bundet via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper i et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på det polymere bærermolekyl, og den gjenværende vinylgruppe på mer enn én slik del i den tilknyttede tilstand, er fri og i stand til å reagere med en molekylforbindelse som er forskjellig fra polymert bærermolekyl med en funksjonell gruppe som er reaktiv overfor den frie vinylgruppe.

Betegnelsen "molekylforbindelse" i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse anvendes f.eks. for å angi: molekyler eller ioneforbindelser som tjener som merkematerialer eller markører (såsom enzymer, eller fluorescerende eller luminescerende forbindelser); eller molekyler som tjener som målrettingsforbindelser, dvs. molekyler som er i stand til å bindes selektivt eller spesifikt til ett eller flere målmolekyler, deler, reseptorer eller epitoper (eksempler på slike målrettingsforbindelser er haptener eller haptenkonjugater, antigener, antistoffer, nukleotidsekvenser og hormoner).

På grunn av beskaffenheten av den koblingskjemi som anvendes innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse som helhet, innbefattende fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen for fremstilling av reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen, dvs. tilveiebringelse av kovalent bundne reaktive deler som stammer fra divnylsulfon, på det polymere bærermolekyl, og tilveiebringelse av kovalente bindinger mellom, på den ene side, slike deler, og, på den annen side, molekylforbindelser som definert i det foreliggende, vil det kjente reaksjonsmønster for vinylgruppene i en forbindelse såsom divinylsulfon, vanligvis fordre at den reaktive funksjonalitet på den polymere bærer, dvs. gruppen med hvilken en vinylgruppe i divinylsulfon vil reagere under dannelse av en kovalent binding, er en nukleofil funksjon. Egnede polymere bærere vil da f.eks. være polymere bærere med funksjonelle grupper såsom: -O" (f.eks. deprotonerte fenoliske hydroksygrupper, såsom deprotonerte aromatiske hydroksygrupper i tyrosinrester av polypeptider eller proteiner,

-S" (f.eks. deprotonerte tiolgrupper på aromatiske ringer eller alifatiske grupper, såsom deprotonerte ditolgrupper i cysteinrester av polypeptider eller proteiner), -OH (f.eks. alifatiske hydroksygrupper på sukkerringer, såsom glukose eller andre monosakkairdringer

i oligo- eller polysakkarider; eller alkoholiske hydroksygrupper i polyoler, så som polyetylenglykoler; eller hydroksygrupper i visse aminosyrerester av polypeptider eller proteiner, såsom serin- eller treoninrester, -SH (f.eks. tiolgrupper i cysteinrester av polypeptider eller proteiner), primære aminogrupper (f.eks. i lysin- eller ornitinrester av polypeptider eller proteiner; eller i aminosubstituerte sukkerringer i visse polysakkarider

eller derivater derav, såsom chitosan) eller sekundære aminogrupper (f.eks. i histidinrester av polypeptider eller proteiner). Av lignende grupper vil den aktuelle funksjonelle gruppe på molekylforbindelser innenfor rammen av oppfinnelsen også normalt være en nukleofil funksjon, såsom en nukleofil funksjon av én av de ovenfor beskrevne typer.

De vannløselige polymerer som funksjonerer som bærermolekyler i reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen, kan velges blant mange forskjellige polymertyper, innbefattende: naturlige og syntetiske polysakkarider, såvel som derivater derav, f.eks. dekstraner og dekstranderivater, stivelser og stivelsesderivater, cellulosederivater, amylose og pektin, så vel som noen naturlige gummiarter og derivater derav, så som gummi arabicum og salter av algininsyre;

homopoly(amino/syre)r med egnede reaktive funksjonaliteten, så som polylysiner, polyhistidiner eller polyomitiner;

naturlige og syntetiske polypeptider og proteiner, såsom bovint albumin og andre pattedyr-albuminer; og

syntetiske polymerer med nukleofile funksjonelle grupper, så som polyvinylalkoholer, polyallylalkohol, polyetylen-glykoler og substituerte polyakrylater.

Meget godt egnede polymerer for den foreliggende oppfinnelses formål er polysakkarider og derivater derav, f.eks.: dekstraner, karboksymetyldekstraner, hydroksyetyl- og hydroksypropylstivelsesforbindelser, glykogen, agarosederivater og hydroksyetyl- og hydroksypropylcelluloser. Som det vil fremgå av utførelseseksemplene i det foreliggende (se nedenfor), har spesielt dekstraner vist seg å være spesielt godt egnede polymerer i forbindelse med oppfinnelsen, og de er for tiden de mest foretrukkede polymerer.

Som allerede angitt, er det ofte ønskelig, spesielt for mange av de immunkjemiske anvendelser av reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen, at spesielt konjugatene ifølge oppfinnelsen, innbefattende konjugater ifølge oppfinnelsen som fremstilles (ved en frem gangsmåte som også utgjør et aspekt ved oppfinnelsen) ut fra reagenser ifølge oppfinnelsen, ikke har noen nettoladning, siden tilstedeværelse av en positiv eller negativ netto ladning i slike tilfeller blant annet kan føre til uønsket ikke-spesifikk binding av konjugatene til andre substanser og/eller materialer enn de aktuelle. I mange tilfeller vil denne betingelse, dersom det ikke innføres ladede molekylforbindelser, oppfylles ganske enkelt ved at man sikrer at den polymere bærer i seg selv ikke har noen nettoladning; ved et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen, er således det polymere bærermolekyl for et reagens eller konjugat ifølge oppfinnelsen, i fri tilstand, hovedsakelig lineær og hovedsakelig uladet ved en pH i området fra ca. 4 til ca. 10, idet sistnevnte pH-område er det området som i praksis er aktuelt for det store flertall av immunkjemiske metoder, hybridiseirngsmetoder og andre anvendelser av, spesielt, konjugater ifølge oppfinnelsen. Blant forskjellige polymerer som oppfyller dette kriterium, er f.eks. tallrike polysakkarider og polysakkaridderivater, f.eks. dekstraner og hydroksyetyl- og hydroksypropylcelluloser.

Avhengig av hva et reagens eller konjugat ifølge oppfinnelsen skal anvendes til, kan reagenser og konjugater ifølge oppfinnelsen baseres på vannløselige polymere bærere med molekylvekt i området fra meget lav til meget høy, og ved et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen kan den polymere bærer ha en molekylvekt-topp i området fra ca. 1000 til ca. 40.000.000. Molekylvekt-topper som er av betydelig interesse, og som er eksemplifisert i utførelseseksemplene som er gitt i det foreliggende, er molekylvekt-topper i området fra ca. 1000 til ca. 80.000, og i området fra ca. 80.000 til ca. 2.000.000. En spesiell aktuell molekylvekt-topp, særlig når det gjelder dekstraner som polymere bærere, er en molekylvekt-topp på ca. 500.000.

Betegnelsen "molekylvekt-topp" (også angitt "gjennomsnittsmolekylvekt-topp") anvendt i den foreliggende beskrivelse og krav i forbindelse med polymere bærere, angir den molekylvekt det er mest av, dvs. den molekylvekt (blant en klassifisering av molekylvekter) som det største antall molekyler i en gitt prøve eller sats av polymeren, har. Det er helt normalt å karakterisere tallrike polymertyper på denne måte, på grunn av vanskelig-heten (spesielt når det gjelder de høyeste molekylvekter) når det gjelder oppnåelse eller fremstilling av polymerfraksjoner med meget snever molekylvektfordeling. For tallrike kommersielt tilgjengelige polymerer som er aktuelle i forbindelse med oppfinnelsen, f.eks. dekstraner, vil fabrikanten eller forhandleren være i stand til å tilveiebringe pålitelige data for molekylvekt-topper (f.eks. bestemt ved hjelp av gel-gjennomtregningskromatografi) som kan danne grunnlaget for utvelging av en polymerfraksjon egnet for fremstilling av en spesiell type reagens eller konjugat. Det skal her nevnes at molekylvekt-toppverdier angitt i den foreliggende beskrivelse og krav, angir molekylvekt-toppen for den aktuelle frie polymer, og det er f.eks. ikke tatt hensyn til mulig dannelse av tverrbundne polymer-enheter, f.eks. som resultat av tverrbinding av to eller flere polymermolekyler ved omsetning med divinylsulfon ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et reagens eller konjugat ifølge oppfinnelsen; slike tverrbundne enheter vil gjennomsnittlig ha høyere molekylvekt enn de individuelle frie polymermolekyler som de er dannet av.

Det er klart at reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelse kan tilpasses for å oppfylle et meget stort område når det gjelder krav med hensyn til molekylvekt-topp for polymeren og innholdet av frie, reaktive vinylgrupper. Reagensene kan være basert på en polymer bærer med en molekylvekt-topp på ca. 500.000 eller ca. 2.000.000, eller med en molekylvekt-topp i hvilket som helst av følgende områder: fra ca. 1000 til ca. 20.000; fra ca. 20.000 til ca. 80.000; fra ca. 80.000 til ca. 500.000; fra ca. 500.000 til ca. 5.000.000; eller fra ca. 40.000.000; og med et innhold av frie, reaktive vinylgrupper i området fra ca. 1 til ca. 5000/imol vinylgrupper pr. gram polymer bærer, såsom i hvilket som helst av de følgende underområder (uttrykt i/imol vinylgrupper pr. gram polymer bærer): fra ca. 1 til ca. 50; fra ca. 50 til ca. 300; fra ca. 300 til ca. 1000; eller fra ca. 1000 til ca. 5000.

Som tidligere angitt, kan molekylforbindelser innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, dvs. molekylforbindelser som skal festes til et reagens eller konjugat ifølge oppfinnelsen, eller som allerede er festet til den polymere bærer for et konjugat ifølge oppfinnelsen, finnes blant tallrike forskjellige typer av substanser, f.eks.: proteiner, så som ferritin, fykoerytriner, fykocyaniner eller fykobiliner; enzymer, så som pepperrotperoksydase, alaklisk fosfatase, glukoseoksydaser, galaktosidaser eller ureaser; toksiner; legemidler; fargestoffer; fluorescerende midler, fosforescerende eller andre lys-utsendende substanser; metallchelaterende substanser, så som iminodieddiksyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), dietylen triaminpentaeddiksyre (DTPA) eller desferrioksamin B; substanser merket med en radioaktiv isotop; eller substanser merket med et tungt atom.

I lys av den omtale som er gitt tidligere ovenfor, vil det være klart at størstedelen av typene av substanser blant disse sistnevnte eksempler vil kunne tjene som merkematerialer eller markører i konjugater ifølge oppfinnelsen. For angivelse av noen flere eksempler, kan fluorescerende substanser velges blant f.eks. fluorescein (passende som fluorescein-isotio-cyanat, FITC), fluoresceinamin, 1-naftol, 2-naftol, eosin, erytrosin, morin, o-fenylendiamin, rodamin og 8-anilino-l-naftalensulfonsyre. Aktuelle radioative isotoper kan f.eks. velges blant isotyper av hydrogen (dvs. tritium,<3>H), karbon (såsom<14>C), fosfor (såsom32P), svovel (såsom<35>S), jodin (såsom<I3I>I), vismut (såsom<212>Bi), yttrium (såsom<90>Y), teknetium (såsom<99m>Tc), palladium (såsom<l09>Pd) og samarium (såsom<153>Sm). Aktuelle tunge atomer kan f.eks. velges blant Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, In, Ag, Au, Hg, I, Bi, Y, La, Ce, Eu og Gd. Gull (Au) [eventuelt i kombinasjon med sølv (Ag) som forsterkningsreagens (se ovenfor)] er et spesielt godt egnet tungt atom i mange tilfeller.

Ved et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen, kan molekylforbindelser innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme også være målrettingsforbindelser [som definert tidligere (se ovenfor)] som kan bindes selektivt til, eller reagere selektivt med, et komplementært molekyl eller et komplementært strukturelt område i et materiale av biologisk opprinnelse. Eksempler på aktuelle målrettingsforbindelser er f.eks.: antigener; haptener; monoklonale eller polyklonale antistoffer; genprober; naturlige eller syntetiske oligo- eller polynukleotider; visse naturlige eller syntetiske mono-, oligo- eller polysakkarider; lektiner; avidin eller strept-avidin; biotin; vekstfaktorer; hormoner; reseptormolekyler; eller protein A eller protein G. Når det gjelder eksempler på hensiktsmessige antistoffer, vises det til de utførelseseksempler som er gitt i det foreliggende. Eksempler på aktuelle hormoner kan velges blant steroidhormoner (f.eks. østrogen, progesteron eller kortison), amino/syre-hormoner (f.eks. tyroksin) og peptid- og protein-hormoner (f.eks. vasopressin, bombesin, gastrin eller insulin).

Som allerede forklart, angår den foreliggende oppfinnelse også et vannløselig konjugat omfattende et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet mer enn én av en gitt molekyltype som er forskjellig fra polymert bærermolekyl, hver via en sammenbindende gruppe avledet fra divinylsulfon, idet tilknyttingen av hver sammenbindende gruppe til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og tilknyttingen av en molekyltype til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfon-molekylet, og en funksjonell gruppe på molekyltypen.

I spesielt aktuelle konjugater av sistnevnte type ifølge oppfinnelsen, har det polymere bærermolekyl videre kovalent tilknyttet én eller flere deler som stammer fra divinylsulfon, idet hver del er tilknyttet via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper i et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på det polymere bærermolekyl, og idet minst én av disse deler i sin tilknyttede tilstand har den gjenværende vinylgruppe fri og i stand til reaksjon med en ytterligere molekylforbindelse med en funksjonell gruppe som er reaktiv overfor den frie vinylgruppe.

Den tilknyttede molekylforbindelse i et konjugat av én av de sistnevnte typer, eller av andre typer (se nedenfor) ifølge oppfinnelsen, kan hensiktsmessig deles i f.eks. molekyl-forbindelser med molekylvekt på ca. 2000 eller lavere, og molekylforbindelser med molekylvekt på ca. 2000 eller høyere. I førstnevnte tilfelle kan det polymere bærermolekyl i konjugatet ha fra 1 til ca. 10.000 molekylforbindelser kovalent tilknyttet, f.eks. fra ca. 10 til ca. 1000 molekylforbindelser, såsom fra ca. 20 til ca. 500 molekylforbindelser som er kovalent tilknyttet. I sistnevnte tilfelle, dvs. for molekylforbindelser med molekylvekt ca. 2000 eller høyere, kan det polymere bærermolekyl i konjugatet ha fra 1 til ca. 1000 molekyl-forbindelser kovalent tilknyttet, f.eks. fra 1 til ca. 500 molekylforbindelser, såsom fra 1 til ca. 100, fra 2 til ca. 50, eller fra ca. 10 til ca. 50 molekylforbindelser kovalent tilknyttet.

Konjugater av denne type ifølge oppfinnelsen være basert på en polymer bærer med en molekylvekttopp på ca. 500.000 eller ca. 2.000.000, eller med en molekylvekttopp i ett av følgende områder: fra ca. 1000 til ca. 20.000; fra ca. 20.000 til ca. 80.000; fra ca. 80.000 til ca. 500.000; fra ca. 500.000 til ca. 5.000.000; eller fra ca. 5.000.000 til ca. 40.000.000; og med et totalt innhold av molekylforbindelser og, hvor aktuelt, frie vinylgrupper i området fra ca. 1 til ca. 5000 ( Lmol molekylforbindelser pluss, hvor aktuelt, junol vinylgrupper pr. gram polymer bærer, såsom i ett av følgende underområder (uttrykt i pimol molekylforbindelser pluss, hvor aktuelt, pimopl vinylgrupper pr. gram polymer bærer): fra ca. 1 til ca. 50; fra ca. 50 til ca. 300; fra ca. 300 til ca. 1000; eller fra ca. 1000 til ca. 5000.

Ytterligere molekylforbindelser definert i forbindelse med oppfinnelsen, kan ha hvilken som helst av de karakteregenskaper som er tidligere nevnt ovenfor i forbindelse med molekylforbindelser.

Enda et annet aspekt ved oppfinnelsen angår et vannløselig konjugat omfattende et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet to eller flere molekyl-yper, hvorav minst én er forskjellig fra den annen (de andre), idet hver molekyltype er tilknyttet via en sammenbindende gruppe av ledet fra divinylsulfon, og tilknyttingen av hver sammenbindende gruppe til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og tilknyttingen av en molekyltype til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfonmolekylet, og en funksjonell gruppe på molekyltypen.

Konjugater av denne sistnevnte type kan være basert på en polymer bærer med en molekylvekttopp på ca. 500.000 eller ca. 2.000.000, eller med en molekylvekttopp i ett av følgende områder: fra ca. 1000 til ca. 20.000; fra ca. 20.000 til ca. 80.000; fra ca. 80.000 til ca. 500.000; fra ca. 500.000 til ca. 5.000.000; eller fra ca. 5.000.000 til ca. 40.000.000; og med et totalt innhold av kovalent tilknyttede molekylforbindelser i området fra ca. 1 til til ca. 5000fimdl molekyl-forbindelser pr. gram polymer bærer, såsom i ett av følgende underområder (uttrykt i/«noi molekylforbindelser pr. gram polymer bærer): fra ca. 1 til ca. 50; fra ca. 50 til ca. 300; fra ca. 300 til ca. 1000; eller fra ca. 1000 til ca. 5000.

Som allerede angitt, angår oppfinnelsen også fremgangsmåter for fremstilling av et reagens eller konjugat ifølge oppfinnelsen: ved ett slikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således en fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig reagens ifølge oppfinnelsen, dvs. et vannløselig reagens omfattende et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet én eller flere deler som stammer fra divinylsulfon, idet hver del er tilknyttet via en binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfon-molekyl og en reaktiv funksjonalitet på det polymere bærermolekyl, og idet minst én slik del i sin tilknyttede tilstand har den gjenværende vinylgruppe fri og i stand til reaksjon med en molekylforbindelse med en funksjonell gruppe som er reaktiv overfor den frie vinylgruppe.

Den aktuelle fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen omfatter omsetting av den vannløselige polymere bærer med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH på over 5.

I den vanligste form kan reaksjonen finne sted ved en temperatur i området 0-60°C, skjønt en temperatur i området 20-25°C ofte vil være meget godt egnet, f.eks. som illustrert for polymere bærere så som dekstraner og visse polysakkaridderivater i utførelseseksemplene som er gitt i det foreliggende. pH-verdien ved hvilken reaksjonen finner sted, er vanligvis i området ca. 10-11,5, som er et pH-område hvor divinylsulfon er spesielt reaktivt overfor reaktive funksjonaliteter på de fleste typer polymere bærere.

Når det gjelder konsentrasjonen av den polymere bærer i den vandig løsning, vil denne vanligvis være innenfor området 0,1-20 vekt/volum-%, og ofte i området 1-10 vekt/ volum-%. Konsentrasjonen av divinylsulfon i den vandige løsning vil vanligvis være i området 0,1-15 volum-%, og ofte i området 1-10 volum-%.

Det er vanskelig å gi generelle retningslinjer når det gjelder lengden av tidsrommet i hvilket reaksjonen mellom divinylsulfon og den polymere bærer i vandig løsning skal få foregå, siden disse vil variere i betydelig grad, f.eks. avhengig av temperaturen og pH-verdien ved hvilken reaksjonen foregår. Konsentrasjonen av den polymere bærer og av divinylsulfon i reaksjonsblanding, beskaffenheten og/eller molekylvekten av den polymere bærer, og i hvilket omfang tverrbinding av den polymere bærer (ved reaksjon med divinylsulfon) kan foregå før det f.eks. er risiko for at geldannelse eller utfelling kan finne sted; som tydelig illustrert i utførelseseksemplene i det foreliggende når det gjelder dekstraner, kan reaksjonstiden være en viktig faktor for i det minste noen klasser av polymere bærere. Den aktuelle reaksjonstid vil imidlertid normalt være innenfor området 5-120 minutter.

Som også angitt tidligere, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge oppfinnelsen basert på et vann-løselig polymert bærermolekyl til hvilket én eller flere molekylforbindelser er kovalent tilknyttet, hver via en sammenbindende gruppe som stammer fra divinylsulfon, idet tilknyttingen av hver av de sammenbindende grupper til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfonmolekyl, og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og idet tilknyttingen av en molekylforbindelse til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfonmolekylet, og en funksjonell gruppe på molekylforbindelsen; den samme fremgangsmåte gjelder også fremstillingen av slike konjugater hvor de polymere bærermolekyler videre har kovalent tilknyttet én eller flere reaktive deler som stammer fra divinylsulfon.

Den aktuelle fremgangsmåte omfatter:

den vannløselige polymere bærer får reagere med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH over 5, under dannelse av en vandig løsning inneholdende et vannløselig mellomproduktreagens omfattende molekyler av den vannløselige polymere bærer til hvilke det er kovalent tilknyttet én eller flere reaktive deler som stammer fra divinylsulfon,

det vannløselige mellomproduktreagens underkastes eventuelt et rensetrinn, og

det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens får reagere, via sine reaktive deler, med en molekylforbindelse i vandig løsning ved en pH på over 5.

Det valgfrie rensetrinn kan f.eks. innbefatte en prosess såom dialyse (for fjerning av uønskede salter eller andre forbindelser med lav molekylvekt) eller gelkromatografi. pH-og temperaturbetingelsene, og konsentrasjonene av polymer bærer og divinylsulfon under reaksjonen mellom den polymere bærer og divinylsulfon, vil vanligvis være som beskrevet tidligere i forbindelse med fremstillingen av vannløselige reagenser ifølge oppfinnelsen, og de bemerkninger som er gjort angående reaksjonstiden, er også aktuelle her.

Når det gjelder reaksjonen mellom det vannløselige mellomproduktreagens og molekylforbindelsen i slutt-trinnet av fremgangsmåten, vil temperaturen under reaksjonen vanligvis være i området 0-60°C, og ofte i området 20-25°C. Konsentrasjonen av molekyl-forbindelser i det vandige reaksjonsmedium vil vanligvis være i området 0,1-20 volum-%, og pH i løsningen vil vanligvis være i området ca. 8-12.

Ved et spesielt interessant aspekt ved sistnevnte fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, inneholder den vandige løsning i hvilken molekylforbindelsen reagerer med det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens, et lyotropisk salt, dvs. et salt som har den egenskap at det f.eks. fremskynder utfellingen ("utsaltingen") av visse typer høye molekylære forbindelser, spesielt proteiner, fra vandig løsning. Effektiviteten (vist i utførelseseksemplene i det foreliggende) av innarbeidelsen av et slikt lyotropisk salt når det gjelder forøking av tilknyttingen av molekylforbindelser til de reaktive vinylgrupper som finnes i det vannløselige mellomproduktreagens dannet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, antas å stamme fra "utsaltings"-effekten nevnte ovenfor.

Egnede lyotropiske salter kan velges blant sulfater, fosfater, citrater og tartrater av litium, natrium, kalium og ammonium, og det lyotropiske salt vil normalt være tilstede i en konsentrasjon som svarer til en ionestyrke på minst 0,01, f.eks. en konsentrasjon som svarer til en ionestyrke på minst 0,3. En egnet konsentrasjon vil ofte være en konsentrasjon som svarer til en ionestyrke i området 0,5-5.

Som allerede angitt ovenfor, er innvirkningen av lyotropiske salter ved fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen spesielt betydningsfull når det gjelder molekylforbindelser som er proteiner eller polypeptider.

Det vil være klart at reagenser ifølge oppfinnelsen i sammensetning svarer til de vannløselige mellomproduktreagenser som dannes i løpet av sistnevnte prosess; således angår enda et annet aspekt ved oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av den samme type vannløselig konjugat som ved den foregående fremgangsmåte, idet fremgangsmåten omfatter at et vannløselig reagens ifølge oppfinnelsen får reagere med en molekylforbindelse i vandig løsning ved en pH på over 5. Beskaffenheten av molekylforbindelsen som inngår, og betingelsene som gjelder ved fremgangsmåten (innbefattende innvirkningen av lyotropiske salter) er generelt som allerede beskrevet ovenfor.

Enda et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge oppfinnelsen, hvilket konjugat omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet to eller flere molekylforbindelser, hvorav minst én er forskjellig fra den annen (de andre), idet hver molekylforbindelse er tilknyttet via en sammenbindende gruppe som stammer fra divinylsulfon, og idet tilknyttingen av hver sammenbindende gruppe til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og tilknyttingen av en molekylforbindelse til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfonmolekylet, og en funksjonell gruppe på molekylforbindelsen.

Den aktuelle fremgangsmåte omfatter:

(i) den vannløselige polymere bærer får reagere med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH på over 5, under dannelse av en vandig løsning inneholdende et vann-løselig mellomproduktreagens omfattende molekyler av den vann-løselige polymere bærer til hvilket det er kovalent bundet to eller flere reaktive deler som stammer fra divinylsulfon,

(ii) det vannløselige mellomproduktreagens underkastes eventuelt et rensetrinn,

(iii) det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens får reagere, via sine reaktive deler, med en molekylforbindelse i vandig løsning ved en pH på over 5, under dannelse av et vannløselig mellomproduktkonjugat, idet betingelsene er slik

at ikke alle de reaktive deler reagerer med en molekylforbindelse,

(iv) det vannløselige mellomproduktkonjugat underkastes eventuelt et rensetrinn, og (v) det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktkonjugat får reagere, via reaktive deler som ikke har reagert på forhånd, med en ytterligere molekylforbindelse i vandig løsning ved en pH på over 5, idet den ytterligere molekylforbindelse er forskjellig fra den som allerede er festet til mellomproduktkonjugatet.

Konsentrasjonene av de forskjellige komponenter, så vel som de betingelser som hersker ved reaksjonstrinnet, vil generelt være som allerede beskrevet. Konsentrasjonen av ytterligere molekylforbindelser, og de andre betingelser som er knyttet til reaksjonen av disse, vil generelt være som for molekylforbindelser. Som før, er innlemming av et lyotropisk salt i reaksjonsmediet for omsetting av molekylforbindelsene og de ytterligere molekylforbindelser (spesielt når disse er proteiner eller polypeptider) et foretrukket aspekt.

Ved et ytterligere aspekt av denne fremgangsmåte, deaktiveres eventuelle gjenværende frie vinylgrupper som finnes i konjugatet dannet i trinn (v), idet deaktiveringen oppnås ved at det til den vandig løsning av konjugatet tilsettes et overskudd av en deaktiverende forbindelse med lav molekylvekt; egnende deaktiveringsforbindelser kan f.eks. være etanolamin, merkaptoetanol eller visse aminosyrer, f.eks. cystein, glycin, alanin eller valin.

Det vil være klart at de konjugater ifølge oppfinnelsen som har en molekylforbindelse tilknyttet og som videre har reaktive vinylgrupper, når det gjelder sammensetning, svarer til de vannløselige mellomproduktkonjugater dannet ved sistnevnte fremgangsmåte; således angår enda et annet aspekt ved oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av den samme type vannløselig konjugat som ved den foregående fremgangsmåte, idet fremgangsmåten omfatter at et vannløselig konjugat av nevnte type ifølge oppfinnelsen, får reagere med en ytterligere molekylforbindelse i vandig løsning ved en pH på over 5, og idet den ytterligere molekylforbindelse er forskjellig fra den som allerede er knyttet til det reagerende konjugat.

Betingelsene som gjelder ved reaksjonen, så vel som beskaffenheten av de ytterligere molekylforbindelser, vil generelt være som allerede beskrevet ovenfor i forbindelse med den foregående fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av slike konjugater og av andre konjugater ifølge oppfinnelsen, ved fremgangsmåter eller teknikker som omfatter vekselvirking mellom en måldel eller målfunksjonalitet (f.eks. et antigenbindende sted på et antistoff) med en målrettingsforbindelse som definert i det foreliggende.

Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelse av konjugater fremstilt ved hjelp av de forskjellige fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen, og av andre konjugater ifølge oppfinnelsen, ved fremgangsmåter eller teknikker av følgende typer: immunkjemiske analyseteknikker, innbefattende enzymatiske immunanalyser (EIA) såsom ELISA, radioimmunanalyser (RIA), og nefelometriske og turbidimetriske immunanalyser; immunhistokjemiske metoder; cytokjemiske metoder; strømningscytometri; in situ-hybridiseringsteknikker; membranhybridiseringsteknikker (dvs. teknikker hvor en hybridiseringsreaksjon finner sted på en membran eller et ark, såsom en nitrocellulose-membran eller -ark), innbefattende Southern og Northern blotting; og fremgangsmåter basert på lektin/karbohydratvekselvirkninger.

Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelse av et vannløselig konjugat ifølge krav 8, ved: immunkjemiske analyseteknikker, innbefattende enzymatiske immunanalyser (EIA) såsom ELISA, radioimmunanalyser (RIA), og nefelometriske og turbidimetriske immunanalyser; immunhistokjemiske metoder; cytokjemiske metoder; strømnings-cytometri; in situ-hybridiseirngsteknikker; membranhybridiseringsteknikker, innbefattende Southern og Northern blotting; biosensorer; og fremgangsmåter basert på lektin/ karbohydratvekselvirkninger.

Eksempler på teknikker eller fremgangsmåter hvor konjugater ifølge - eller fremstilt ifølge - oppfinnelsen er spesielt egnede er for eksempel: påvisning av antigene determinanter eller antistoffer i vev eller i/på celler under anvendelse av immunhistokjemiske/ cytokjemiske metoder; "forsterkning" av følsomheten ved påvisning for slike immunkjemiske reaksjoner; påvisning av antigene determinanter, haptener eller antistoffer i en prøve under anvendelse av immunanalyser eller immunblottingsmetoder; "forsterkning" av følsomheten ved påvisning ved slike immunanalyser eller immunblottingsmetoder; påvisning av målnukleinsyresekvenser via hybridiseringsreaksjoner; og "forsterkning" av følsomheten ved påvisning av slike hybridiseringsreaksjoner.

Oppfinnelsen er illustrert mer detaljert ved hjelp av de følgende eksempler, under henvisning til de tilknyttede tegninger, som er som følger:

Fig. 1: Resultater fra eksempel 11

Gel-filtrerings-UV-absorpsjons-profiler for prøver fra kobling av pepperrot-peroksydase (HRP) til DVS-aktivert dekstran i molekylvekttopp 500.000. Profilene for fri og dekstranbundet HRP er vist for prøver underkastet kobling i henholdsvis 0,1 og 4 timer (gelfiltrering utført på Sephacrylt S-200). Horisontal akse: elueringsvolum i ml.

Fig. 2: Resultater fra eksempel 37B

Forholdet mellom konsentrasjonen av HRP-dekstran/geite-anti-kanin-IgG-konjugater og absorbansen ved 492 nm ved en tre-sjikts-ELISA. Det er vist resultater for konjugater omfattende forskjellige kombinasjoner av antall geite-anti-kanin-IgG-molekyler og molekyler av immunglobulin fra ikke-immuniserte geiter pr. molekyl dekstran. Det kan sees at for en gitt konsentrasjon av konjugat, øker den målte absorbans med økning i antallet konjugerte geite-anti-kanin-IgG-molekyler pr. molekyl dekstran.

Fig. 3: Resultater fra eksempel 37C

Forholdet mellom konsentrasjonen av et HRP-dekstran/geite-anti-kanin-IgG-konjugat og absorbansen ved 492 nm ved en tre-sjikts-ELISA. For sammenligningsformål er resultater også vist for et vanlig HRP-merket (konjugert) grise-anti-kanin-IgG. Det kan sees at for en gitt konsentrasjon, er den målte absorbans betydelig høyere for dekstran-konjugatet ifølge oppfinnelsen enn for det vanlige konjugat.

Fig. 4: Resultater fra eksempel 38

Forholdet mellom konsentrasjonen av biotinylert kanin-IgG i det annet sjikt ved en tre-sjikts-ELISA, og absorbansen ved 492 nm under anvendelse av HRP-dekstran/avidin-konjugater, ved påvisning ved det biotinylerte kanin-IgG. Resultater er vist for fire HRP-dekstran/avidin-konjugater omfattende forskjellige antall avidinmolekyler pr. molekyl dekstran. Det kan sees at for en gitt konsentrasjon av biotinylert kanin-IgG, øker den målte absorbans med økning i antallet konjugerte avidinmolekyler pr. molekyl dekstran.

Fig. 5: Resultater fra eksempel 40

Forholdet mellom konsentrasjonen av biotinylert kanin-IgG anvendt for det første sjikt (dvs. for adsorpsjon til overflaten av fastfasebæreren) ved en to-sjikts-ELISA, og absorbansen ved 492 nm. Resultater er vist for et HRP-dekstran/streptavidin-konjugat ifølge oppfinnelsen og, for sammenligningsformål, for et vanlig HRP-merket (konjugert) streptavidin. Det kan sees at for en gitt konsentrasjon av biotinylert kanin-IgG, er den målte absorbans betydelig høyere for dekstran-konjugatet ifølge oppfinnelsen enn for det vanlige konjugat, dvs. at påvisningsgrensen ved analysen er betydelig lavere når konjugatet ifølge oppfinnelsen anvendes, enn når det vanlige konjugat anvendes.

Fig. 6: Resultater fra eksempel 56

Forbindelsen mellom forholdet mellom antall mg muse-anti-humane lette kappa-kjeder og antall mg dekstran (i et kompleks dannet melom muse-anti-humane lette kappa-kjeder og HRP-dekstran/RAM-konjugat) og absorbansen ved 492 nm i et to-sjikts-ELISA. Resultatene er vist for fire konsentrasjoner av humane serumproteiner anvendt for det første sjikt (dvs. for adsorpsjon til overflaten av fastfase-bæreren). En utflating av absorbansen observeres ved et forhold på ca. 4 mg muse-anti-humane lette kappa-kjeder pr. mg dekstran, uavhengig av konsentrasjonen av humane serumproteiner anvendt for adsorpsjon til fastfase-bæreren.

Fig. 7: Resultater fra eksempel 57

Forbindelsen mellom konsentrasjonen av dekstran (i et kompleks dannet mellom biotinylerte kanin-anti-humane lette kappa-kjeder og HRP-dekstran/streptavidinkonjugat) og absorbansen ved 492 nm i en to-sjikts-ELISA. Resultaene er vist for komplekser dannet ved tre forskjellige konsentrasjoner av biotinylerte kanin-anti-humane lette kappa-kjeder. Det er tydelig at for en gitt konsentrasjon av kompleksdannet konjugat, fås en maksimal absorbansverdi når komplekset dannes under anvendelse av en konsentrasjon på ca. 0,309-0,465 mg biotinylerte kanin-anti-humane lette kappa-kjeder/ml.

Fig. 8: Resultater fra eksempel 58

Forbindelsen mellom konsentrasjonen av muse-anti-humane lette kappa-kjeder (i et kompleks dannet mellom muse-anit-humane lette kappa-kjeder og HRP-dekstran/RAM-konjugat) og absorbansen ved 492 nm i et to-sjikts-ELISA. Resultater er vist for komplekser dannet ved fem forskjellige konsentrasjoner av muse-anti-humane lette kappa-kjeder, idet forholdet mellom muse-anti-humane lette kappa-kjeder og RAM holdes konstant under kompleksdannelsen. Den målte absorbans viser bare små variasjoner som funksjon av konsentrasjonen av muse-anti-humane lette kappa-kjeder anvendt for kompleksdannelse.

FORKORTELSER

Følgende forkortelser anvendes i eksemplene gitt nedenfor og ellers i beskrivelsen:

BSA: bovint serumalbumin

DVS: divinylsulfon

MW: molekylvekt

HRP: pepperrot-peroksydase

FITC: fluoresceinisotiocyanat

PS A: prostat-spesifikt antigen GAM: geite-anti-muse-Ig

RAM: kanin-anti-muse-Ig

AP: alkalisk fosfatase

SPDP: N-suksinimidyl-3-(2-pyridyIditio)propionat

DTT: ditiotreitol

LSAB: merket streptavidin biotin

kat.: katalog

FAB: fragment-antigen-binding

Dersom ikke annet er angitt, var vannet som ble anvendt i de følgende eksempler, vann fra et Milli Q^-apparat, dvs. vann som var blitt underkastet filtrering gjennom et Millipore^-filter og etterfølgende avionisering.

GENERELL BESKRIVELSE AV ANVENDTE PÅVISNINGS/ANALYSE-METODER

En generell oversikt over immunhistokjemisk og cytokjemisk påvisning er gitt i den innledende del av den foreliggende beskrivelse, og slike påvisningsmetoder kan utføres av en fagmann under anvendelse av etablerte, lett tilgjengelige metoder.

Påvisning av mål-nukleinsyresekvenser under anvendelse av merkede prober er også omtalt i den innledende del av den foreliggende beskrivelse, og kan likeledes utføres av en fagmann under anvendelse av etablerte, lett tilgjengelige metoder. Innenfor den foreliggende oppfinnelses ramme, kan "forsterkning" (dvs. øking av påvisningsfølsomheten) i forbindelse med påvisning av forekomsten av en hybridiseringsreaksjon oppnås f.eks. under anvendelse av en biotin-merket probe for hybridiseringen, og et konjugat ifølge oppfinnelsen omfattende f.eks. anti-biotin-antistoffer, avidin eller streptavidin som reagens for påvisning av hybridiseringen.

Generell ELISA-metode: Som også omtalt i den innledende del av den foreliggende beskrivelse, er en viktig klasse immunanalyse-metoder de såkalte ELISA-metoder. I utførelses-eksemplene i det foreliggende (se nedenfor), utføres ELISA-metodene under anvendelse av tre "sjikt" eller - i visse spesielle tilfeller - to sjikt som følger: Tre sjikt: Etter adsorpsjon av antistoff ("oppfangende antistoff') til brønnene i en polystyren-mikrotiterplate (NUNC, Danmark) (som gir det første sjikt), bindes det komplementære antigen eller det biotin-konjugerte antigen som et annet sjikt. Det tredje sjikt i form av et konjugat ifølge oppfinnelsen omfattende enzym (pepperrot-peroksydase) og enten (i) et antigen-spesifikt antistoff, eller (ii) (når det komplementære antigen i det annet sjikt er merket med biotin) avidin eller streptavidin, innføres deretter. Endelig påvises så det bundne, enzym-merkede konjugat ved tilsetting av et fargeutviklingsreagens (orto-fenylendiamin/hydrogenperoskyd) som er et substrat for enzymet. Hensiktsmessig vasking utføres mellom disse forskjellige trinn (se nedenfor).

To sjikt: Det hensiktsmessige antigen eller biotinmerkede antigen adsorberes direkte til den indre overflate av mikrotiterplate-brønner, dvs. at det oppfangende antistoff utelates.

I eksemplene 37B, 37C og 38 (se nedenfor), anvendes det tre sjikt som beskrevet ovenfor, med følgende detaljer: 1. sjikt: 100 ptl geite-anti-kanin-Ig-fortynning i hver brørnn. Inkubering over natten ved +4°C.

Blokkering av gjenværende bindingssteder: 200 fil 0,1 M dikaliumhydrogenfosfat, 1% Tween® 20, pH 7,2.

Inkubering: 30 minutter ved romtemperatur.

Vaskemetoder: Mikrotiterplate-brønnene tømmes ved at platen snus opp ned og "knipses" over en vask. Restvæske fjernes ved at den omsnutte mikrotiterplate bankes lett mot filtrerpapir. Brønnene fylles så med 0,1 M dikalumhydrogenfosfat, 0,5 M NaCl og 0,1% Tween®, pH 7,2, og platen vugges forsiktig i 3-5 minutter. Denne fremgangsmåte gjentas to ganger. 2. sjikt: 100/il kanin-IgG (1 ng/ml) eller (når det 3. sjikt skal omfatte et streptavidin-konjugat) 100 fil biotin-konjugert kanin-IgG (0,1 ng/ml) i hver brønn. [Kontroll: 100 fil for-tynningsbuffer (se de aktuelle eksempler)]. Inkubering over natten ved +4°C. Vasking som beskrevet ovenfor under "vaskemetode". 3. sjikt: 100 pil HRP-dekstran/geite-anit-kanin-Ig-fortynning eller 100 pil HRP-dekstran/streptavidin-konjugat-preparat i hver brønn. Platen vugges forsiktitg i 2 timer. Vasking som beskrevet under "vaskemetode". 100 fil fargeutviklingsreagens-løsning tilsettes, fulgt, etter 15 minutter, av tilsetting av 100 pil 1M H2SO4. Fargeintensiteten i de individuelle brønner måles under anvendelse av en atuomatisk ELISA-avlesningsanordning.

I eksempel 40 (se nedenfor) anvendes det to sjikt som beskrevet ovenfor, med følgende detaljer: 1. sjikt: 100 fil biotin-konjugert kanin-IgG-fortynning i hver brønn. Inkubering over natten ved +4°C.

Blokkering av gjenværende bindingssteder: 200 fil 0, 1 M dikalumhydrogenfosfat, 1% Tween® 20, pH 7,2. Inkubering i 30 minutter ved romtemperatur. Vasking som beskrevet ovenfor under "vaskemetode". 2. sjikt: 100 fil HRP-dekstran/streptavidinpreparat eller 100 fil vanlig streptavidin-peroskydase-konjugat i hver brønn. 100 fil fargeutviklings-reagensløsning tilsettes, fulgt av tilsetting av 100 fil 1M H2SO4etter 15 minutter. Fargeintensiteten i de individuelle brønner måles deretter under anvendelse av en automatisk ELISA-avlesningsanordning.

I eksemplene 56,57 og 58 (se nedenfor) anvendes det to sjikt som beskrevet ovenfor, med følgende detaljer: 1. sjikt: 100 fil fortynning av normalt human-serum i hver ELISA-brønn. Inkubering over natten vd +4°C.

Vaskemetode: Brønnene i mikrotiterplaten tømmes og vaskes (5 x 10 minutt) under anvendelse av en automatisk brønnvaskings-anording (Denley, well-wash-4). Vaskebufferen er: 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, 0,1% Tween® 20, pH 7,2. 2. sjikt: I hver brønn, enten 100 fil HRP-dekstran/RAM-konjugat kompleksbundet med fortynning av muse-anti-humane lette kappa-kjeder, eller 100 fil HRP-dekstran/strepativdin-konjugat kompleksbundet med fortynning av muse-anti-humane lette kappa-kjeder. Inkubering med forsiktig rysting i 1,5 timer ved ca. 20°C. Vasking som beskrevet ovenfor. 100 fil fargeutviklings-reagensløsning tilsettes, fulgt av tilsetting av 100 fil 1M H2SO4etter 10 minutter (i eksemplene 56 og 58) eller etter 2 minutter (i eksempel 57). Fargeintensiteten i de individuelle brønner måles så under anvendelse av en automatisk ELISA-avlesningsanordning.

Generell fremgangsmåte for "Dot Blot" (immunblotting): Den generelle fremgangsmåte for immunblotting [som anvendt i eksemplene 37C og 40 i det foreliggende (se nedenfor)] er som følger: Antigen eller biotin-konjugert (biotinylert) antigen immobiliseres på nitrocellulose-membraner i form av "dotter" av en seriefortynning. Etter blokkering av gjenværende bindingssteder, inkuberes nitrocellulosemembranene med det hensiktsmessige peroksydase-holdige konjugat med bindingsspesifisitet for antigenet (som eventuelt er biotinylert).

Etter vasking, tilsettes fargeutviklingsreagens (diaminobenzidin/hydrogenperoksyd), idet intensiteten av fargen som dannes, er proporsjonal med mengden enzym som finnes i form av konjugat bundet til antigenet (som eventuelt er biotinylert) i "dottene".

Fremgangsmåte: 1 /il (eventuelt biotinylert) kanin-IgG i fortynningene 6,3,1,5, 0,75,0,38, 0,19, 0,10,0,05 og 0,025 ng/jil påsettes på nitrocellulosemembranen; fortynningsmediet er 0,1 M NaCl inneholdende 50 mg BSA/1000 ml.

Blokkering av gjenværende bindingssteder: 0,1 M kaliumfosfat, 1% Tween® 20, pH 7,2, i 2 minutter.

Generell vaskemetode: Nitrocellulosemembranen vaskes i 0,1 M dikalumhydrogenfosfat, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween®, pH 7,2, i 5 minutter med forsiktig vugging; den brukte vaskebuffer fjernes deretter. Fremgangsmåten gjentas to ganger.

Konjugatet som skal undersøkes, fortynnes i 0,1 M kaliumfosfat, 1% BSA, 0,1% Tween®, pH 7,2. Vasking som beskrevet ovenfor under "generell vaskemetode". Membranen nedsenkes i fargeutviklingsreagenset, og etter 15 minutter vaskes membranen så én gang med destillert vann. Den lavese fortynning av antigen som gir en positiv "dot", bestemmes.

EKSEMPEL 1

Divinylsulfon- aktivering av hvdroksvetylcellulose.

Ett gram hydroksyetylcellulose ("Natrosol 250 HR", Aqualon, Tyskland) ble oppløst i 50 ml vann ved romtemperatur (20-25°C), og til løsningen ble det tilsatt 50 ml 0,5 M di-kaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 11,5) og 25 mg natriumborhydrid. Umiddelbart etter oppløsing av natriumbor-hydridet, ble reaksjonsblandingen overført til et godt ventilert avtrekksskap, og 5 ml divinylsulfon (Aldrich, kat. nr. V370,97% rent) ble tilsatt. Forsiktig omrøring ble utført med magnetisk rører. Etter henholdsvis 10 og 30 minutter, ble 50 ml porsjoner av løsningen uttatt. pH i hver porsjon ble justert til 6-7 med 5 M saltsyre (for brå avslutning av reaksjonen). Hver av de to løsningene ble så dialysert mot 4x5 liter vann i et tidsrom på to dager ved romtemperatur. Etter dialysering, hadde volumet av hver løsning øket til 76 ml, hvilket svarte til en sluttkonsentrasjon av DVS-aktivert hydroksyetylcellulose på 6,6 mg/ml.

Innholdet av frie, reaktive vinylgrupper (dvs. "dinglende" terminale vinylgrupper i DVS-avledede deler som er kovalent bundet til polymersubstratet via en binding dannet ved reaksjon mellom én av de to vinylgrupper i DVS med, i dette tilfelle, en hydroksygruppe på hydroksyetylcellulose) ble bestemt ved omstting med et stort overskudd av natriumtiosulfat, fulgt av titrering av de resulterende hydroksydioner med standard-saltsyre. Omsettingen av de frie vinylgrupper med tiosulfationer finner sted i henhold til det følgende reaksjonsskjema [Porath et al., J. Chromatogr. 103 (1975) 49]:

Titreringsresultatene viste at prøvene av DVS-aktivert hydroksyetylcellulose hadde et innhold på 150 og 818/«noi vinylgrupper pr. gram hydroksyetylcellulose etter henholdsvis 10 og 30 minutters aktivering.

EKSEMPEL 2

Divinvlsulfonaktivering av hvdroksvpropvl- stivelse.

En reaksjons- og dialysemetode nøyaktig analog til det som er beskrevet i eksempel 1, ble anvendt, idet man startet med 1 gram hydroksypropylstivelse ("Reppal PES 200", Reppe Glykos AB, Sverige). Etter dialysering, hadde volumet av løsningen som stammet fra porsjonen uttatt etter 10 minutter, øket til 64 ml, mens volumet at løsningen som stammet fra porsjonen uttatt etter 30 minutter, hadde øket til 78 ml. Dette svarer til en sluttkonsentrasjon av DVS-aktiver hydroksypropylstivelse på henholdsvis 7,8 og 6,4 mg/ml.

Under anvendelse av titreringsmetoden i eksempel 1, ble innholdet av reaktive vinylgrupper i de to prøver av DVS-aktivert hydroksypropylstivelse, bestemt til henholdsvis 1026 og 2568/imol vinylgrupper pr. gram hydroksypropylstivelse.

Ved utførelse av en analog aktiveringsmetode ved en pH på 11,5 istedenfor 11,0, fikk man meget stor geldannelse og utfelling av det aktiverte produkt.

EKSEMPEL 3

Divinvlsulfonaktivering av bovint serum- albumin.

2 g bovint serumalbumin (98% rent, Sigman Chemical Company) ble oppløst i 200 ml 0,25 M dikaliumhydrogenfosfat/-natriumhydroksyd (pH 10,0) ved romtemperatur (20-25°C). 2 ml divinylsulfon ble tilsatt (AVTREKKS-SKAP!). Forsiktig omrøring ble foretatt med magnetisk rører. Etter 60 minutter, ble pH i reaksjonsblandingen justert til 6-7 med 5 M saltsyre. Løsningen ble så dialysen mot 4x5 liter 0,1 M natriumklorid i et tidsrom på 2 dager ved romtemperatur.

Etter dialysering, hadde volumet av løsningen øket til 215 ml, hvilket svarte til en sluttkonsentrasjon av DVS-aktivert BSA på 9,3 mg/ml.

Under anvendelse av den tidligere beskrevne fremgangsmåte, ble innholdet av reaktive vinylgrupper bestemt til å være 184 junol pr. gram BSA, svarende til ca. 12 mol vinylgrupper pr. mol BSA.

EKSEMPEL 4

Divinylsulfonaktivering av dekstran ( molekylvekttopp 500. 000V Innvirkningen av DVS-konsentrasjonen.

Fem adskilte løsninger (A-E) inneholdende ensartede konsentrasjoner av dekstran med en molekylvekttopp på 500.000 (Pharmacia, Sverige) og forskjellige konsentrasjoner av DVS ble fremstilt, idet man fikk følgende sluttkonsentrasjoner: Alle løsninger: 5 vekt/volum-% dekstran; 0,25 M dikalium-hydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 11,5); 0,25 mg narrium-borhydrid pr. ml. DVS-konsentrasjoner:

løsning A: 10 volum-%

løsning B: 5 volum-%

løsning C: 3 volum-%

løsning D: 1 volum-%

løsning E: 0,5 volum%

Aktiveringen ble utført ved 25°C i 15 minutter. Etter aktivering, ble pH i reaksjonsblandingen justert til 7 med 5 M saltsyre. Alle prøver ble dialysert grundig mot vann for fjerning av overskudd av reagenser.

Innholdet av reaktive vinylgrupper når det gjaldt de forskjellige prøver av DVS-aktivert dekstran ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene (se tabellen nedenfor) kan uttrykkes som/imol vinylgrupper pr. gram dekstran; de kan alternativt, basert på antagelsen av en gjennomsnittlig molekylvekt på 500.000 (som ytterligere omtalt i teksten), oppgis som mol vinylgrupper pr. mol dekstran:

EKSEMPEL 5

Divinylsulfanaktivering av dekstran ( molekylvekttopp 500. 000). Innvirkningen av DVS-konsentrasjon ved høv dekstrankonsentrasjon.

Fire adskilte løsninger (A-D) inneholdende ensartede konsentrasjoner (to ganger så høye som i eksempel 4) av dekstran med en molekylvekttopp på 500.000 (Pharmacia, Sverige) og forskjellige konsentrasjoner av DVS, ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: Alle løsninger: 10 vekt/volum-% dekstran; 0,25 M dikalum-hydrogenfosfat/ natriumhydroksyd (pH 11,5); 0,25 mg natriumbor-hydrid pr. ml.

D VS-konsentrasj oner:

løsning A: 10 volum-%

løsning B: 5 volum-%

løsning C: 3 volum-%

løsning D: 1 volum%

Aktiveringen ble utført ved 25°C i 15 minutter. Etter aktivering, ble pH i reaksjonsblandingen justert til 7 med 5 M saltsyre. Alle prøver ble dialysert grundig mot vann under fjerning av overskudd av reagenser.

Innholdet av reaktive vinylgrupper for de forskjellige prøver av DVS-aktivert dekstran ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er oppsummert nedenfor:

EKSEMPEL 6

Divinvlsulfonaktivering av dekstran ( molekylvekttopp 500. 000). Innvirkningen av tiden ved lav dekstrankonsentrasjon.

Fire adskilte løsninger (A-D) inneholdende ensartede, lave konsentrasjoner av dekstran med en molekylvekttopp på 500.000 (Pharmacia, Sverige), og DVS ble fremstilt under opp-nåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: Alle løsninger: 1 vekt/volum-% dekstan; 0,25 M dikalium-hydrogenfosfat/ natriumhydroksyd (pH 11,5); 0,25 mg natriumbor-hydrid pr. ml.

DVS-konsentrasj oner:

løsning A: 5 volum-%

løsning B: 5 volum-%

løsning C: 10 volum-%

løsning D: 10 volum-%

Når det gjaldt løsningene A og C, fikk aktiveringen foregå i 30 minutter. Når det gjaldt løsningene B og D, fikk aktiveringen foregå i 60 minutter. Aktiveringen ble utført ved 25°C, og etter aktivering, ble pH i hver løsning justert til 7 med 5 M saltsyre.

Resultater: Når det gjaldt løsning B, fikk man utfelling av en fast gel i aktiveringsbeholderen etter 50 minutters reaksjon. Når det gjaldt løsning D, fikk man utfelling av en fast gel etter 40 minutters reaksjon. Reaksjonsblandingene fra disse to løsninger ble derfor kastet.

Løsningene oppnådd med A og C ble dialysert grundig mot vann under fjerning av overskudd av reagenser.

Innholdet av reaktive vinylgrupper i de to prøver av DVS-aktivert dekstran ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er oppsummert nedenfor:

EKSEMPEL 7

Divinvlsulfon- aktivering av dekstraner med forskjellige molekvlvekttopper mellom 100. 000 og 500. 000.

Fire dekstranforbindelser (Pharmacosmos, Denmark, betegnet her som D1-D4) med forskjellige spesifiserte molekvlvekttopper (se nedenfor) ble aktivert med divinylsulfon under ensartede betingelser.

Betingelser for DVS-aktivering: 5 vekt/volum-% av det hensiktsmessige dekstran; 0,25 M dikaliumhydrogenfosfat/-natriumhydroksyd (pH 11,5); 0,25 mg natriumborhydrid pr. ml; 5 volum-% divinylsulfon.

Aktivering ble utført ved romtemperatur i 15 minutter. pH i hver reaksjonsblanding ble så justert til 7 med 5 M salt-syre, hvoretter prøvene ble dialysert grundig mot vann.

Innholdet av reaktive vinylgrupper i prøvene av DVS-aktiverte dekstraner ble bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er oppsummert nedenfor:

EKSEMPEL 8

Divnvlsulfon- aktivering av dekstran med molekylvekttopp 2. 000. 000.

Ett gram dekstran med molekylvekttopp 2.000.000 (Pharmacia, Sverige) ble oppløst i 50 ml vann ved romtemperatur (20-25°C), og til løsningen ble det tilsatt 50 ml 0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 11,5) og 25 mg natriumborhydrid. 1 ml divinylsulfon ble tilsatt, og blandingen ble omrørt forsiktig med en magnetisk rører i 30 min. pH i reaksjonsblandingen ble så justert til 6-7 med 5 M salt-syre, hvoretter løsningen ble dialysert mot 4x5 liter vann i et tidsrom på to dager ved romteperatur.

Innholdet av reaktive vinylgrupper ble, under anvendelse av titreringsmetoden beskrevet i eksempel 1, bestemt til 567fimdl pr. gram dekstran, svarende til 1134 mol vinylgrupper pr. mol dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt på 2.000.000.

EKSEMPEL 9

Dinvinvlsulfon- aktivering av dekstran med molek<y>lvekttopp 20. 000.

50 g dekstran med molekylvekttopp 20.000 (Sigma Chemical Company) ble oppløst i 450 ml vann ved romtemperatur (20-25°C), og til løsningen ble det tilsatt 450 ml 0,5 M dikalium-hydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 11,5) og 250 mg natriumborhydrid. 100 ml divinylsulfon ble tilsatt, og blandingen ble omrørt forsiktig med en magnetisk rører i 15 minutter. pH i reaksjonsblandingen ble deretter justert til 6-7 med 5 M saltsyre, hvoretter løsningen ble dialysert mot vann under fjerning av overskudd av reagenser.

Innholdet av reaktive vinylgrupper ble, under anvendelse av titreringsmetoden beskrevet i eksempel 1, bestemt til 1230 /xmol pr. gram dekstran, svarende til ca. 25 mol vinylgrupper pr. mol dekstran med en gjennomsnitts-molekylvekt på 20.000.

EKSEMPEL 10

Stabilitet av DVS- aktivert dekstran.

Dekstran med en molekylvekttopp på 500.000 (Pharmacia, Sverige) ble aktivert med divinylsulfon som beskrevet for løsning B i eksempel 4 (dvs. under anvendelse av 5 vekt/volum-% dekstran og 5 volum-% DVS). Det resulterende DVS-aktiverte dekstran ble funnet å inneholde 475/zmol vinylgrupper pr. gram dekstran.

Til den aktiverte dekstranløsning (35 mg dekstran pr. ml) ble det tilsatt 0,01 vekt/volum-% l,l,l-triklor-2-metyl-2-propanol (Sigma, kat. nr. T 5138) som konserveringsmiddel, og fire prøver av den resulterende løsning ble inkubert i mørke i forseglede beholdere ved forskjellige temperaturer som følger:

Innholdet av reaktive vinylgrupper ble bestemt etter 3 måneders inkubering, og resultatene er oppsummert nedenfor:

Det synes fremgå at innholdet av reaktive vinylgrupper ikke har øket i noe betydelig grad etter 3 måneder, og at denne bemerkelsesverdige stabilitet vedvarer selv ved temperaturer så forholdsvis høye som 30°C.

EKSEMPEL 11

Kovalent kopling av pepperrot- peroksvdase til DVS- aktivert dekstran ( molekylvekttopp 500. 000) ved høy temperatur.

Dekstran med molekylvekttopp 500.000 ble aktivert med DVS som beskrevet for "løsning B" i eksempel 4 (dvs. under anvendelse av 5 vekt/volum-% dekstran og 5 volum-% DVS). Det aktiverte dekstran hadde et innhold på 490 jrniol reaktive vinylgrupper pr. gram dekstran. Sluttkonsentrasjonen av DVS-aktivert dekstran var 26 mg/ml. Denne sats av DVS-aktivert dekstranløsning er i det følgende omtalt som "sats Dex-1".

Fremgangsmåten for kobling av pepperrot-peroksydase var som følger: 3 ml DVS-aktivert dekstranløsning ("sats Dex-1") ble blandet med en løsning av 300 mg pepperrot-peroksydase (Kem-En-Tec, København, Danmark) i 12 ml vann. Til blandingen ble det så tilsatt 15 ml 0,4 M dikaliumhydrogenfosfat/natrium-hydroksyd (pH 10,4). Den klare løsning ble inkubert ved 37°C uten omrøring.

Prøver ble uttatt etter forskjellige tidsrom, og koblingseffektiviteten, dvs. prosentandelen av den opprinnelig tilsatte pepperrot-peroksydase koblet til det aktiverte dekstran, ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl,?, S-200 (Pharmacia, Sverige). Koblingsreaksjonen ble stoppet etter 4 timers inkubering ved at pH ble senket til 7 ved tilsetting av 1M saltsyre.

Koblingsresultatene er oppsummert på fig. 1. Utfra de relative arealer for toppene, ble følgende koblingseffektiviteter bestemt som funksjon av inkuberingstid:

Disse resultater kan omregnes slik at man får det gjennomsnittlige antall pr. oksydasemolekyler som er koblet til dekstranet, idet man regner med en gjennomsnittlig molekylvekt på 500.000 for dekstranet og 40.000 for peroksy-dasen (som ytterligere omtalt i teksten).

EKSEMPEL 12

Kovalent kobling av pepperrot- peroskvdase til DVS- aktivert dekstran ( molekylvekttopp 500. 000 ved lav temperatur.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: 3 ml (inneholdende 78 mg DVS-aktivert dekstran i løsning) av "sats Dex-1" (se eksempel 11) ble blandet med en løsning av 300 mg pepperrot-peroksydase (Kem-En-Tec, København, Danmark) i 12 ml vann. Til blandingen ble det så tilsatt 15 ml 0,4 M dikalium-hydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,4). Den klare løsning ble inkubert ved 4°C uten omrøring.

Prøver ble uttatt etter forskjellige tidsrom, og koblingseffektiviteten ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-200 (Pharmacia, Sverige) på samme måte som beskrevet i eksempel 11. Koblingsreaksjonen ble stoppet etter 192 timers inkubering ved at pH ble senket til 7 ved tilsetting av 1M saltsyre. Koblingsresultatene var som følger:

EKSEMPEL 13

Kovalent kobling av pepperrot- peroksydase til DVS- aktiverte dekstraner med forksjellige grader av aktivering.

Pepperrot-peroksydase ble koblet til de syv DVS-aktiverte dekstranpreparater fremstilt som beskrevet i eksemplene 4 og 6 (dvs. A-E ifølge eksempel 4, og A og C ifølge eksempel 6). Koblingsfremgangsmåten var som følger: Alle de syv dekstranpreparater ble blandet med pepperrot-peroksydase og buffer, hvorved man fikk følgende sluttkonsentrasjoner: 2,75 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml; 10 mg pepperrot-peroskydase pr. ml; 0,2 M dikaliumhydrogenfosfat/-natriumhydroksyd (pH 10,0).

Koblingen ble utført ved 37°C i 16 timer, hvoretter reaksjonen ble stoppet ved at pH i løsningen ble justert til 6-7 ved tilsetting av 1M saltsyre. Koblingseffektiviteten ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl^S-200 (Pharmacia, Sverige) på samme måte som beskrevet i eksempel 11, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 14

Kovalent kobling av pepperrot- peroksydase til DVS- aktiverte dekstraner med molekvlvekttopper mellom 100. 000 og 2. 000. 000.

Fem dekstraner (Pharmacosmos, Danmark) med forskjellige molekvlvekttopper mellom 100.000 og 2.000.000 og aktivert med divinylsulfon ifølge eksemplene 7 og 8, ble koblet med pepper-rotperoksydase.

Fremgangsmåten for kobling av pepperrot-peroksydase var som følger:

400 mg pepperrot-peroksydase (Kem-En-Tec, København, Danmark) og 100 mg DVS-aktivert dekstran ble oppløst i buffer, hvorved man fikk følgende konsentrasjoner: 10 mg pepperrot-peroksydase pr. ml;

2,5 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,2 M dikaliumhydrogenfosfat pr. natriumhydroksyd (pH 10,6).

Inkubering ble utført ved 4°C i 48 timer, fulgt av gel-filtrering på Sephacrytø S-200 for bestemmelse av mengden peroksydase koblet til dekstranene. Resultatene er uttrykt som det gjennomsnittlige antall pepperrotperoksydase-molekyler knyttet til ett molekyl dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt svarende til molekylvekttoppen for dekstranet (mol HRP/mol dekstran):

EKSEMPEL 15

Kovalent kobling av pepperrot- peroksydase til DVS- aktivert hydroksyetylcellulose.

Renset pepperrot-peroksydase ble kovalent koblet til DVS-aktivert hydroksyetylcellulose med 818/«noi reaktive vinylsulfongrupper pr. gram hydroksyetylcellulose (fremstilt som beskrevet i eksempel 1). Koblingen ble utført ved 4°C.

Fremgangsmåten for kobling av pepperrot-peroksydase var som følger:

100 mg DVS-aktivert hydroksyetylcellulose (15,2 ml) ble blandet med en løsning av 400 mg pepperrot-peroksydase (Kem-En-Tec, København, Danmark) i 4,8 ml vann. Til blandingen ble det så tilsatt 20 ml 0,4 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,6). Den klare løsning ble inkubert ved 4°C uten omrøring i 48 timer, hvoretter

reaksjonen ble stoppet ved at pH i løsningen ble justert til 6-7 med 1M saltsyre.

Mengden av koblet pepperrot-peroksydase ble bestemt til ca. 37% av den tilsatte pepperrot-peroksydase.

EKSEMPEL 16

Kovalent kobling av pepprrot- peroskydase til DVS- aktivert hydroksypropyl- stivelse.

Renset pepperrot-peroksydase ble kovalent koblet til DVS-aktivert hydroksypropyl-stivelse med 2568/«noi reaktive vinyl-sulfongrupper pr. gram hydroksypropyl-stivelse (fremstilt som beskrevet i eksempel 2). Koblingen ble utført ved 4°C.

Fremgangsmåten for kobling av pepperrot-peroksydase var som følger:

100 mg DVS-aktivert hydroksypropyl-stivelse (15,6 ml løsning) ble blandet med en løsning av 400 mg pepperrot-peroksydase i 4,4 ml vann. Til blandingen ble det så tilsatt 20 ml 0,4 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,6).

Den klare løsning ble inkubert ved 4°C uten omrøring. Prøver ble uttatt etter 24 og 44 timers inkubering, og koblingsutbyttet ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-200.

Mengen koblet pepperrot-peroksydase ble bestemt til ca. 20% av den tilsatte pepperrot-peroksydase etter 24 timers kobling og ca. 30% etter 44 timers kobling.

EKSEMPEL 17

Kovalent kobling av et peptid til DVS- aktivert bovint serum- albumin.

Et syntetisk peptid inneholdende 13 aminosyrerester innbefattende et C-terminalt cystein ble kovalent koblet til DVS-aktivert bovint serum-albumin.

Fremgangsmåten for kobling av det syntetiske peptid var som følger:

0,5 ml løsning av DVS-aktivert bovint serumalbumin (fremstilt som beskrevet i eksempel 3) ble blandet med 1 ml peptid-løsning (7 mg/ml i 0,1 M natriumklorid) og 0,5 ml 3,0 M di-kaliumhydrogenfosfat (pH 8,5). Koblingsblandingen ble inkubert i 18 timer ved romtemperatur uten omrøring.

Koblingsutbyttet ble bestemt ved gelfiltrering på 8% agarosegel (BioGel A-0,5m, BioRad), og resultatene var som følger: I henhold til gelfiltreringsprofilen, var 18% av det tilsatte peptid koblet til det DVS-aktiverte bovine serum-albumin. Dette svarer til ca. 12 mol peptid pr. mol DVS-aktivert BSA. Dette var i god overensstemmelse med den målte aktivitet av DVS-aktivert BSA (se eksempel 3).

EKSEMPEL 18

Kovalent kobling av et peptid til DVS- aktivert dekstran med molekylvekttopp 500. 000.

Et syntetisk peptid (det samme som beskrevet i eksempel 17) inneholdende 13 aminosyrerester innbefattende et C-terminalt cystein, ble kovalent koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 490/«noi vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-1"; se eksempel 11).

Fremgangsmåten for kobling av det syntetiske peptid var som følger: 0,5 ml løsning av det DVS-aktiverte dekstran (26 mg/ml) ble blandet med 1 ml peptidløsning (3,5 mg/ml i 0,1 M natriumklorid) og 0,5 ml 3,0 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 8,5). Koblingsblandingen ble inkubert i 18 timer ved rom-temperatur uten omrøring.

Koblingsutbyttet ble bestmet ved gelfiltrering på 8% agarosegel (BioGel A-0,5m, BioRad), og resultatene var som følger: I henhold til gelfiltreringsprofilen, var ca. 98% av det tilsatte peptid koblet til det DVS-aktiverte dekstran. Dette svarer til ca. 88 mol peptid pr. mol DVS-aktivert dekstran.

EKSEMPEL 19

Kovalent kobling av alkalisk fosfatase f AP) til DVS- aktivert dekstran med molekylvekttopp 500. 000 ved høy temperatur.

Renset alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim, kvalitet I, kat. nr. 556602) ble kovalent koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000. DVS-aktiveringen ble utført som beskrevet i eksempel 6, løsning A (1 vekt/volum-% dekstran, 5 volum-% divinylsulfon), og det DVS-aktiverte dekstran inneholdt 1500 jttmol reaktive vinylgrupper pr. gram dekstran. Sluttkonsentrasjonen av DVS-aktivert dekstran var 8 mg/ml. Denne sats av DVS-aktivert dekstran er i det følgende omtalt som "sats Dex-II".

Fremgangsmåten for kobling av "alkalisk fosfatase var som følger: 0,03 ml DVS-aktivert dekstran ("sats Dex-II") ble blandet med 0,2 ml alkalisk fosfataseløsning (10 mg/ml), 0,16 ml 2,0 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 9,5) og 0,01 ml vann. Den klare løsning ble inkubert ved 37°C uten omrøring.

Prøver ble uttatt etter forskjellige inkuberingstidsrom, og prosentandelen av den tilsatte alkaliske fosfatase som var koblet til dekstranet, ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-300 HR (Pharmacia, Sverige). Resultatene var som følger:

Ut fra det relative areal av toppene, ble følgende koblingseffektiviteter som funksjon av inkuberingstiden bestemt [resultatene er vist som prosentandel av den tilsatte alkaliske fosfatase (AP) som var koblet, og beregnet som mol AP koblet pr. mol dekstran, idet man regner med en molekylvekt på 140.000 for AP og en gjennomsnittlig molekylvekt på 500.000 for dekstranet]:

EKSEMPEL 20

Kovalent kobling av alkalisk fosfatase til DVS- aktivert dekstran. Innvirkningen av saltkonsentrasjonen.

Alaklisk fosfatase ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 ("sats Dex-II"; se eksempel 19) med fire forskjellige saltkonsentrasjoner.

Fremgangsmåten for kobling av den alkaliske fosfatase var som følger: Fire forskjellige løsninger (A-D) for kobling av alkalisk fosfatase til DVS-aktivert desktran ble tillaget med følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

5 mg alkalisk fosfatase pr. ml;

0,7 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

dikaliumhydrogenfosfat pr. saltsyre (pH 9,0).

Konsentrasjonene av dikaliumhydrogenfosfat var:

løsning A: 0,10 M

løsning B: 0,25 M

løsning C: 0,50 M

løsning D: 0,80 M

Koblingen ble utført ved 24°C i 24 timer. Mengden koblet alkalisk fosfatase ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-300 HR. Resultatene var som følger:

EKSEMPEL 21

Kovalent kobling av alkalisk fosfatase til DVS- aktivert dekstran. Innvirkningen av pH.

Alkalisk fosfatase ble kovalent koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 /«noi vinylgrupper dekstran ("sats Dex-II"). Koblingen ble utført ved tre forskjellige pH-verdier.

Fremgangsmåten for kobling av alkalisk fosfatase var som følger: Tre diklaium-hydrogenfosfatbuffere (A-C) for kobling av alkalisk fosfatase til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende konsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

5 mg alkalisk fosfatase pr. ml;

0,6 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfatase.

pH i fosfatbufferne var:

løsning A: pH 8,4

løsning B: pH 9,4

løsning C: pH 10,0

De klare løsninger ble inkubert ved 37°C i 24 timer uten omrøring.

Prosentandelen av den tilsatte alkaliske fosfatase koblet til dekstranet ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl,?, S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 22

Kovalent koblin av alkalisk fosfatase til DVS- aktivert dekstran. bivirkningen av temperaturen.

Renset alkalisk fosfatase ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 pimol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II").

Fremgangsmåten for kobling av alkalisk fosfatase var som følger: Alkalisk fosfatase ble koblet til DVS-aktivert dekstran ved tre forskjellige temperaturer (løsninger A-C). Følgende konsentrasjoner og inkuberingstider ble anvendt:

Alle løsninger inneholdt:

5 mg alkalisk fosfatase pr.ml;

0,6 mg DVS-aktivert dekstran pr.ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat pr. natriumhydroksyd (pH 10,0).

Følgende temperaturer ble anvendt:

løsning A: 4°C

løsning B: 24°C

løsning C: 37°C

Løsning A ble inkubert i 24 timer, og løsningene B og C ble inkubert i 4 timer.

Mengden koblet alkalisk fosfatase ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacrytø S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 23

Kovalent kobling av alkalisk fosfatase til DVS- aktiverte dekstraner med forskjellige grader av aktivering.

Alkalisk fosfatase ble kovalent koblet til tre aktiverte dekstranpreparater tillaget som beskrevet i eksempel 4 (løsning B) og eksempel 6 (løsning A og C) (graden av DVS-aktivering var henholdsvis 414 /rniol, 1500 jrniol og 2760fimol vinylsulfongrupper pr. gram dekstran).

Fremgangsmåten for kobling av alkalisk fosfatase var som følger: De tre dekstranpreparater ble blandet med alkalisk fosfatase og buffer under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: 5 mg alkalisk fosfatase pr. ml;

0,6 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

og

A og B: 0,8 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 9,5);

C: 0,5 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 9,5).

Koblingen ble utført ved 37°C i henholdsvis 2 og 24 timer.

Mengden koblet alkalisk fosfatase ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryli, S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 24

Kovalent kobling av et antistoff til DVS- aktivert dekstran ved forskjellige pH- verdier.

Renset geite-anti-muse-Ig (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z420) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 inneholdende 1500 junol vinylsulfongrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-E").

Fremgangsmåten for kobling av lg var som følger: To

dikaliumhydrogenfosfatbuffere (A og B) for kobling av geite-anti-muse-Ig til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende konsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

6,9 mg geite-anti-muse-Ig pr. ml;

0,9 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat.

Buffernes pH var:

løsning A: pH 8,4

løsning B: pH 9,5

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 24 timer.

Prosentandelen av tilsatt geite-anti-muse-Ig som var koblet, ble bestemt ved gelfiltrering på en Sephacryl^, S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 25

Kovalent kobling av et antistoff til DVS- aktivert dekstran ved høy og lav temperatur.

Geite-anti-muse-Ig (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z420) ble kovalent koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 ("sats Dex-HT) ved to forskjellige temperaturer.

Fremgangsmåten for kobling av lg var som følger: Geite-anti-muse-antistoffet ble inkubert ved 4°C og 24°C under følgende betingelser:

Alle prøver (A-C) inneholdt:

6,9 mg geite-anti-muse-Ig pr. ml;

0,9 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 9,5).

Prøve A og C ble inkubert i 24 timer, prøve B i 48 timer.

Innholdet av koblet antistoff ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300. Ut fra det relative areal av toppene, ble følgende koblingseffektiviteter som funksjon av temperatur ble bestemt:

EKSEMPEL 26

Kovalent kobling av kanin- immunglobulin til DVS- aktivert dekstran ( molekylvekttopp 500. 000') ved høy temperatur.

Normalt kanin-immunglobulin (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. X903) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 ("sats Dex-II") ved høy temperatur.

Fremgangsmåten for kobling av kanin-immunglobulinet var som følger: 1 ml kanin-immunglobulinpreparat (20 mg/ml) ble blandet med 0,32 ml DVS-aktivert dekstran og 0,44 ml 2,0 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 9,5).

Den klare løsning ble inkubert ved 24°C uten omrøring.

Prøver ble uttatt etter forskjellige inkubasjonstidsrom, og prosentandelen av tilsatt normalt kanin-immunglobulin som var koblet til dekstranet, ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^, S-300 HR. Resultatene var som følger:

EKSEMPEL 27

Kovalent kobling av ammoniakk til DVS- aktivert dekstran.

Ammoniakk ble kovalent koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000. Aktiveringen ble utført som beskrevet i eksempel 4, løsning E (5 vekt/volum-% dekstran, 0,5 volum-% divinylsulfon), og det DVS-aktiverte dekstran inneholdt 86 pimol vinylgrupper pr. gram dekstran. Slutt-konsentrasjonen av DVS-aktivert dekstran var 22 mg/ml. Denne sats er i det følgende omtalt som "sats Dex-IC".

Fremgangsmåten for kobling av ammoniakk var som følger: I et godt ventilert avtrekksskap ble 50 ml konsentrert ammoniakk i vann tilsatt til 50 ml DVS-aktivert dekstran. Løsningen ble oppvarmet til 60°C og holdt ved denne temperatur i 2 timer. Løsningen ble så dialysert grundig mot 4x5 liter 0,5 M natriumklorid i to dager ved romtemperatur.

Etter dialysering, hadde volumet øket til 73 ml, og sluttkonsentrasjonen av dekstran var derfor 15,1 mg/ml.

Innholdet av aminogrupper koblet til det DVS-aktiverte dekstran ble bestemt ved syre-base-titrering til ca. 80fimol pr. gram dekstran. Produktet er i det følgende omtalt som "amino-dekstran".

EKSEMPEL 28

Kovalent kobling av fluoresceinisotiocvanat ( FITS) til amino- dekstran

Fluoresceinisotiocyanat (Sigma, F-7250) ble koblet til aminodekstran som stammet fra dekstran med molekylvekttopp 500.000. Aminodekstranet (i løsning) ble tillaget som beskrevet i eksempel 27.

Fremgangsmåten for kobling av fluoresceinisotiocyant var som følger: 10 ml aminodekstran-løsning ble dialysert over natten mot 2 liter 0,1 M natriumkarbonat/bikarbonat (pH 9,5). Etter dialysering, var volumet 9,5 ml, og sluttkonsentrasjonen av dekstranet var 15,8 mg/ml. 30 mg fluoresceinisotiocyanat ble oppløst i dimetylsulfoksyd til en konsentrasjon på 10,0 mg/ml; 2,4 ml av denne løsning ble tilsatt dråpevis til 9,5 ml av sistnevnte amino-dekstran-løsning under omrøring.

Reaksjonen fikk foregå i 1,5 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.

Etter konjugering (kobling), ble ikke-omsatt eller hydrolysen fargestoff fjernet ved gel-filtrering på Sephadex,?, G 25 (Pharmacia, Sverige).

Den resulterende løsning ble så dialysert mot 0,1 M di-kaliumhydrogenfosfat (pH 7,2). Etter dialysering, var volumet 23 ml, og sluttkonsentrasjonen av dekstran var derfor 6,6 mg/ml.

Mengden fluoresceinisotiocyanat koblet til aminodekstranet ble bestemt ved absorbansmålinger ved 495 og 280 nm til 68 mol FITS pr. mol dekstran. Produktet omtales i det følgende som "fluorescein-dekstran".

EKSEMPEL 29

DVS- aktivering av fluorescein- dekstran

Fluorescein-dekstran som stammet fra dekstran med molekylvekttopp 500.000, ble aktivert på nytt (dvs. DVS-aktivert) med divinylsulfon. Fluorescein-dekstranet (i løsning) ble tillaget som beskrevet i eksempel 28.

Gjenaktiverings-fremgangsmåten var som følger: 10 ml fluorescein-dekstran-løsning ble blandet med 10 ml 0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 11,5) og 5 mg natriumborhydrid ved romtemperatur.

Umiddelbart etter oppløsning av natriumborhydridet, ble tilsatt 1 ml divinylsulfon (i et godt ventilert avtrekksskap).

Forsiktig omrøring ble foretatt med en magnetisk rører. Etter 60 min., ble pH i blandingen justert til 6-7 med 5 M saltsyre for stopping av reaksjonen.

Løsningen ble så dialysert mot 4x2 liter 0,5 M natriumklorid, beskyttet mot lys.

Etter dialysering, hadde volumet øket til 26 ml, og sluttkonsentrasjonen av det DVS-aktiverte fluoresceindekstran var derfor 2,5 mg/ml.

Innholdet av reaktive vinylgrupper ble bestemt ved omsetting med natriumtiosulfat, fulgt av titrering av de resulterende hydroksydioner med standard-saltsyre (se eksempel 1).

Titreringsresultatene viste at det DVS-aktiverte fluoresceindekstran inneholdt 1080 pimol rekative vinylgrupper pr. gram dekstran.

EKSEMPEL 30

Kovalent kobling av et antistoff til DVS- aktivert fluorescein- dekstran

Affinitetsrensede kanin-anti-prostata-spesifikt antigen-antistoffer (kanin-anti-PSA)

(DAKO A/S, Danmark, kat. nr. A562) ble koblet til gjen-aktivert fluorescein-dekstran fremstilt som beskrevet i eksempel 29. Det DVS-aktiverte fluoresceindekstran inneholdt 1080 /«noi vinylgrupper pr. gram dekstran og 35 mol fluorescein pr. mol dekstran.

Fremgangsmåten for kobling av kanin-anti-prostata-spesifikt antigen-antistoffer var som følger: 1 ml av løsningen av gjen-aktivert fluorescein-dekstran ble blandet med 18 ml kanin-anti-PSA-preparat, hvoretter 2,5 M dikalium-hydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,0) ble tilsatt, idet man fikk en sluttkonsentrasjon på 0,7 M fosfat, pH 10,0.

Den klare løsning ble inkubert ved 37°C uten omrøring i 24 timer.

Innholdet av koblet kanin-anti-PSA ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl^S-300 til ca. 20% av den tilsatte mengde, svarende til ca. 4 mol antistoff pr. mol dekstran.

EKSEMPEL 31

Kovalent kobling av avidin til DVS- aktivert dekstran

Avidin fra hønse-eggehvite (Kem-En-Tec, Danmark) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 ("sats Dex-I").

Fremgangsmåten for kobling av avidin var som følger: Avidin ble blandet med løsningen av DVS-aktivert dekstran under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: 3,0 mg avidin pr. ml;

0,77 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,8 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,1).

Kobingsblandingen ble inkubert ved 30°C i 20 timer, fulgt av titrering til pH 7 med 1M saltsyre og dialysering i 24 timer mot 5 liter 0,1 M natriumklorid.

Gelfiltrering på Sepharose^Cl 6B (Pharmacia, Sverige) viste at 45% av det tilsatte avividin var koblet til det DVS-aktiverte dekstran. Dette svarer til ca. 14 mol avidin pr. mol dekstran med molekylvekt 500.000.

EKSEMPEL 32

Kovalent kobling av iminodieddiks<y>re til DVS- aktivert dekstran

Iminodieddiksyre ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 20.000, fremstilt ifølge eksempel 9.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Iminodieddiksyre ble blandet med løsningen av DVS-aktivert dekstran under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

0,5 M iminodieddiksyre,

30 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml.

Blandingen ble titrert til pH 11,0 med 5 M natriumhydroksyd og inkubert ved romtemperatur i 24 timer. Etter inkubering, ble den klare løsning (127 ml) dialysert grundig mot vann.

Syrebase-titrering av den dialyserte løsning viste et innhold på ca. 1150/«noi iminodieddiksyre pr. gram dekstran. Produktet omtales i det følgende som "iminidieddiksyre-dekstran".

EKSEMPEL 33

DVS- aktivering av iminodieddiksyre- dekstran

Iminodieddiksyre-dekstran fremstilt ifølge eksempel 32 ble gjen-aktivert med divinylsulfon.

Gjenaktiverings-fremgangsmåten var som følger: 50 ml iminodieddiksyredekstran-løsning (16 mg/ml) ble blandet med 50 ml 0,5 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 11,5), 25 mg natriumborhydrid og 5 ml divinylsulfon.

Blandingen ble inkubert ved romtemperatur under omrøring i 30 min., og ble deretter titrert til pH 7 med 5 M saltsyre. Den klare løsning ble så dialysert grundig mot vann.

Etter dialysering, var konsentrasjonen av DVS-aktivert iminodieddiksyre-dekstran 5 mg/ml, og omsetting med tiosulfat, fulgt av saltsyretitrering (se eksempel 1), viste et innhold på 1320/unol vinylgrupper pr. gram dekstran.

EKSEMPEL 34

Kovalent kobling av bovine gammaglobuliner til pepperrot- peroksvdase- dekstran som funksjon av saltkonsentrasjonen.

Bovine gammaglobulinger (99% renhet, Stigma, kat. nr. G-5009) ble koblet til gjenværende reaktive vinylsulfongrupper på pepperrotperoksydase-dekstran fremstilt ifølge eksempel 12, under anvendelse av 192 timers inkubering.

Det anvendte pepperrotperoksydase-dekstran inneholdt gjennomsnittlig 19 mol pepperrotperoksydase pr. mol dekstran med molekylvekttopp 500.000, og ble renset under fjerning av fri pepperrotperoksydase ved gelfiltrering på 8% agarose-gel (BioGel A-0,5m, BioRad). Konsentrasjonen av pepperrotperoksydase-dekstran ble beregnet til 5,8 mg/ml, svarende til 3,5 mg pepperrotperoksydase pr. ml og 2,3 mg dekstran/ml. Produktet ble oppløst i 0,1 M natriumklorid inneholdende 0,1 vekt/volum-% l,l,l-triklor-2-metyl-2-propanol (Sigma, kat. nr. T 5138).

Denne sats av pepperrotperoksydase-dekstran er idet følgende omtalt som "sats HRP-Dex-1".

Koblingen av bovine gammaglobuliner ble utført ved forskjellige konsentrasjoner av dikaliumhydrogenfosfat for undersøkelse av effekten av et lyotropisk salt på koblingseffektiviteteten.

Fremgangsmåten for kobling av bovine gammaglobuliner var som følger: Bovint gammaglobulin og pepperrotperoksydase-dekstran ble blandet under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: 7,88 mg bovint gammaglobulin pr. ml;

2,57 mg pepperrotperoksydase-dekstran pr. ml (svarende til

1,02 mg dekstran pr. ml;

og følgende fosfatkonsentrasjoner (som dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd, pH 10,1):

prøve A: 0,10 M

prøve B: 0,20 M

prøve C: 0,35 M

prøve D: 0,50 M

prøve E: 0,70 M

prøve F: 0,90 M

Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 20 timer. Etter inkubering, ble pH justert til 7 med 1M saltsyre.

Koblingsgraden (koblingseffektiviteten) i de forskjellige prøver ble deretter bestemt ved gelfiltrering på Sepharose£ Cl 6B. Koblingseffektiviteten ble vurdert utfra forandringen i den integrerte UV-absorbans i fraksjonene inneholdende det frie og dekstran-koblede protein, så vel som ved måling av forandringen i absorbans av pepperrotperoksydase-dekstranet ved 280 og 403 nm før og etter kobling. Følgende resultater ble oppnådd:

EKSEMPEL 35

Kovalent kobling av bovint gammaglobulin som mål for tilbake- holdelse av reaktiviteten av pepperrotperoksydase- dekstran- vinylsulfon- grupper.

Langsiktig stabilitet av de gjenværende vinylsulfongrupper på pepperrot-peroksydasedekstran fremstilt ifølge eksempel 12 ble undersøkt ved måling av koblings-evnen hos pepperrotperoksydase-dekstran før og etter inkubering i 12 uker ved forskjellige temperaturer.

Koblingseffektiviteten for kobling av bovine gammaglobuliner til pepperrot-peroksydasedekstran ("sats HRP-Dex-I") ble bestemt under anvendelse av koblingsbetingelser som beskrevet for prøve D i eksempel 34. Koblingseffektiviteten ble bestemt ved gelfiltrering som besrkevet i eksempel 34 før og etter inkubering av pepperrot-peroksydasedekstranet ved -20, +4, +20 og +30°C.

Koblingsutbyttet oppnådd før inkubering er vilkårlig definert som 100%, og resultatene oppnådd etter 12 uker, er uttrykt i forhold til dette:

EKSEMPEL 36A

Koblin<g>av kanin- anti- muse- immunglobuliner til pepperrotperoksydase- dekstran. Innvirkning av pH.

Kanin-anti-muse-immunglobuliner (DAKO, Danmark, kat. nr. Z259) ble koblet til pepperrotperoksydase-dekstran ved to forskjellige pH-verdier. Pepperrotperoksydase-dekstranet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 12 (48 timer ved 4°C) og inneholdt 16 mol peroksydase pr. mol dekstran.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: To forskjellige løsninger for kobling av kanin-anti-muse-immunglobuliner til pepperrotperoksydase-dekstran ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

1,9 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 0,25 mg dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat titrert med enten saltsyre eller

natriumhydroksyd til:

løsning A: pH 8,5

løsning B: pH 10,0

De klare løsninger ble inkubert ved 42°C i 20 timer uten omrøring.

Prosentandelen av de tilsatte kanin-anti-muse-immunglobuliner koblet til pepperrotperoksydase-dekstranet ble bestemt ved gelfiltrring på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 36B

Koblin<g>av kanin- anti- muse- immunglobuliner til pepperrotperoksydase- dekstran. Innvirkning av temperaturen.

Kanin-anti-muse-immunglobuliner (DAKO, Danmark, kat. nr. Z259) ble koblet til pepperrotperoksydase-dekstran. HRP-dekstranet ble fremstilt som beskrevet i eksemel 12 (48 timer ved 4°C) og inneholdt 16 mol pepperrotperoksydase pr. mol dekstran.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: To løsninger for kobling av kanin-anti-muse-immunglobuliner til pepperrotperoksydase-dekstran ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

1,9 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 0,25 mg dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,0).

De klare løsninger ble inkubert i 24 timer ved:

løsning A: 22°C

løsning B: 42°C

Innholdet av koblede kanin-anti-muse-immunglobuliner ble bestemt ved gelfiltrring på Sephacrytø S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 36C

Kobling av kanin- anti- muse- immunglobuliner til pepperrotperoksydase- dekstran. Innvirkning av konsentrasjonen av antistoff og HRP- dekstran.

Kanin-anti-muse-immunglobuliner (DAKO, Danmark, kat. nr. 2259) ble koblet til pepperrotperoksydase-dekstran ved fem forskjellige konsentrasjoner av antistoff og HRP-dekstran, idet det molare forhold mellom antistoff og HRP-dekstran ble holdt konstant (A-E). HRP-dekstranet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 12 (48 timer ved 4°C) og inneholdt 16 mol pepperrotperoksydase pr. mol dekstran.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Fem forskjellige løsninger (A-E) for kobling av kanin-anti-muse-immunglobuliner til pepperrotperoksydase-dekstran ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,0).

Løsning A: 5,7 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 0,79 mg dekstran pr. ml.

Løsning B: 6,7 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 0,92 mg dekstran pr. ml.

Løsning C: 7,0 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

Hrp-dekstran svarende til 0,96 mg dekstran pr. ml.

Løsning D: 7,2 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 1,00 mg dekstran pr. ml.

Løsning E: 7,6 mg kanin-anti-muse-Ig pr. ml;

HRP-dekstran svarende til 1,03 mg dekstran pr. ml.

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 20 timer.

Innholdet av koblet kanin-anti-muse-immunglobuliner ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR.

Ut fra de relative arealer av toppene ble følgende koblingseffektiviteter som funksjon av antistoffkonsentrasjonen bestemt:

EKSEMPEL 36D

Kobling av kanin- anti- muse- immunglobuliner til forskjellige DVS- aktiverte pepperrotperoksydase- dekstraner.

Kanin-anti-muse-immunglobuliner (DAKO, Danmark, kat. nr. Z259) ble koblet til fem forskjellige DVS-aktiverte pepperrot-peroksydase-dekstraner fremstilt som beskrevet i eksempel 13 (henholdsvis 1500,542,234,179 og 86fimol vinylgrupper pr. gram dekstran).

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Alle de fem pepperrotperoksydase-dekstran-preparater ble blandet med kanin-anti-muse-immunglobulinger og buffer under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: HRP-dekstran svarende til 0,2 mg dekstran pr. ml;

1,7 mg kanin-anti-muse-immunglobulinger pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,0).

Kobling ble utført ved 42°C i 20 timer uten omrøring.

Innholdet av koblede kanin-anti-muse-immunglobuliner ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 37A

Kobling av geite- anti- kanin- Ig til pepperrotpeToksydase- dekstran.

Affinitetsrenset geite-anti-kanin-Ig ble koblet til HRP-dekstran ("sats HRP-Dex-I"; se eksempel 34).

Koblingsbetingelser:

Antistoffpreprat og HRP-dekstranløsning ble blandet under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

0,5 M diklaliumhydrogenfosfat (pH 10,1)

2,0 mg geite-anti-kanin-Ig pr. ml

0,52 mg pepperrotperoksydase-dekstran pr. ml (svarende til 0,21 mg dekstran pr. ml)

Prøven ble inkubert ved 30+°C i 20 timer.

Etter kobling ble glycin tilsatt til prøven til en slutt-konsentrasjon på 0,2 M glycin, pH 10, og dette ble fulgt av inkubering i 2 timer [hvilket resulterte i deaktivering (blokkering) av gjenværende reaktive vinylsulfongrupper ved reaksjon mellom disse og glycin].

Etter inkubering, ble prøven dialysert over natten ved 4°C mot 0,05 M Tris/HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

Prøven ble deretter underkastet gelfiltrering på Sepharose^CL 6B for fraskillelse av fritt antistoff og HRP-dekstran-bundet antistoff.

Resultater:

Koblingsutbyttet for geite-anti-kanin-Ig ble bestemt til 25%, svarende til 8 mol geite-anti-kanin-Ig pr. mol dekstran (idet man antar at molekylvekttoppen for dekstranet er 500.000 og molekylvekten for antistoffet 155.000). Sluttproduktet inneholder således gjennomsnittlig 8 mol og 19 mol pepperrot-peroksydase pr. mol dekstran.

EKSEMPEL 37B

Koblin<g>av affinitets- renset geite- anti- kanin- Ig sammen med " normalt" geite-immunglobulin til pepperrotperoksydase- dekstran. Aktiviteten som funksjon av koniugatinnhold av aktivt antistoff.

Affinitetsrenset geite-anti-kanin-Ig sammen med "normalt" geite-IgG (dvs. immunglobulinger fra ikke-immuniserte geiter) ble koblet i forskjellige forhold til HRP-dekstran. Formålet med forsøket var å undersøke absorbans-signalintensiteten som var oppnåelig (undersøkt ved ELISA) med slutt-dekstrankonjugatene som funksjon av det gjennomsnittlige antall antigen-spesifikke antistoffmolekyler koblet til dekstranet.

Koblingsbetingelser:

Affinitetsrenset geite-anti-kanin-Ig, "normalt" geite-immunglobulin og pepperrotperoksydase-dekstran ("sats HRP-Dex-I") ble blandet under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle prøver:

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 10,1)

0,55 mg HRP-dekstran pr. ml (svarende til 0,22 mg dekstran pr. ml).

Prøvene ble inkubert ved 30°C i 20 timer.

Etter kobling, ble glycin tilsatt til prøvene til en sluttkonsentrasjon på 0,2 M glycin, pH 10, og dette ble fulgt av inkubering i 2 timer [hvilket resulterte i deaktivering (blokkering) av gjenværende reaktive vinylsulfongrupper ved reaksjon mellom disse og glycin].

Etter inkubering, ble prøvene dialysert over natten ved 4°C mot 0,05 M Tris/HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

Prøvene ble deretter underkastet gelfiltrering på Sepharose^CL 6B for fraskillelse av de frie immunglobuliner og HRP-dekstranbundne immunglobuliner.

Resultater:

Koblingsutbyttet - under antagelse av den samme koblings-reaktivitet hos de to geite-immunglobulin-preparater - ble bestemt til ca. 22%, svarende til gjennomsnittlig totalt 6,5 mol geite-immunglobulin pr. mol dekstran. Under antagelse av den samme koblingsreaktivitet for de to typer immunglobuliner, var det endelige gjennomsnittlige antall mol av hver type immunglobulin pr. mol dekstran som følger:

ELISA-resultater:

De seks dekstrankonjugater blekarakterisert vedELISA (i henhold til "generell ELISA-metode", tre sjikt).

ELISA-betingelser:

1. sjikt: Geite-anti-kanin-Ig (1 /xg/ml) fortynnet i kaliumhydrogenfosfat (pH 7,2).

2. sjikt: Kanin-IgG (1 ng/ml) fortynnet i 0,1 M dikalium-hydrogenfosfat, 0,5 M NaCl, 1% Tween® 20 (pH 7,2). 3. sjikt: Seriefortynninger av de seks konjugater i 0,1 M dikaliumhydrogenfosfat, 1% Tween® 20 (pH 7,2).

Som det vil kunne sees av fig. 2, er det en klar forbindelse mellom antallet koblede geite-anti-kanin-antistoffer og intensiteten av absorbanssignalet oppnådd ved ELISA. Fravær av geite-anti-kanin-antistoffer på dekstranet resulterer i mangel av sinal, som ventet.

EKSEMPEL 37C

Karakterisering av HRP- dekstran/ geite- anti- kanin- Ig ved ELISA og ved " Dot Blot".

Geite anti-kanin-Ig koblet til HRP-dekstran og underkastet gelfiltrering på Sepharose^CL 6B som beskrevet i eksempel 37A, blekarakterisert vedELISA og Dot Blot. Til sammenligning ble et "vanlig" konjugat (HRP-merket grise-anti-kanin-Ig; DAKO A/S, Danmark, kat. nr. P217) underkastet de samme metoder.

ELISA (ifølge "generell ELISA-metode").

1. sjikt: Geite-anti-kanin-Ig (1 /ig/ml) i 0,1 M dikalium-hydrogenfosfat (pH 7,2); 2. sjikt: Kanin-IgG (1 ng/ml) fortynnet i 0,1 M dikalium-hydrogenfosfat, 1% Tween® 20 (pH7,2); 3. sjikt: Seriefortynninger av HRP-dekstran/geite-anti-kanin-Ig eller HRP-merket grise-anti-kanin-Ig (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. P217) i 0,1 M dikaliumhydrogenfosfat, 1% Tween® 20 (pH 7,2).

Resultater:

Som det vil kunne sees av fig. 3, kan det dekstranbaserte konjugat fortynnes mye mer enn det vanlige konjugat og likevel gi opphav til et betydelig signal, hvilket tyder på den økte følsomhet som kan oppnås under anvendelse av konjugatet ifølge oppfinnelsen som reagens.

"Dot Blot" (ifølge "generell fremgangsmåte for Dot Blot"):

Resultater:

HRP-dekstran/geite-anti-kanin-Ig-konjugatet ifølge oppfinnelsen ga en 10 gangers økning i følsomheten i forhold til det vanlige konjugat (dvs. at det kunne påvise en 10 ganger mindre mengde av kanin-Igg i en "dot").

EKSEMPEL 38

Koblin<g>av avidin til pepperrotperoksydase- dekstran.

Avidin fra hønse-eggehvite ble koblet til HRP-dekstran ("sats Dex-I"; se eksempel 34) ved forskjellige konsentrasjoner og molare forhold mellom avidin og HRP-dekstran.

Koplingsbetingelser:

Følgende komponenter ble blandet:

(a) avidin 25 mg/ml

(b) HRP-dekstran svarende til 0,52 mg dekstran pr. ml

(c) 2 M K2HP04/NaOH pH 10,0

(d) vann

Alle koblinger ble utført ved en fosfatkonsentrasjon på 0,82 M. Konsentrasjonene av avidin og HRP-dekstran er vist i det følgende:

Det molare forhold er oppgitt som mol avidin pr. mol HRP-dekstran i koblingsløsningen.

Koplingsprøvene ble inkubert ved 30°C i 20 timer.

Etter kobling, ble prøvene dialysert mot vann i 2 timer ved romtemperatur.

Prøvene ble deretter underkastet gelfiltrering på Sepharose^CL 6B for fraskillelse av fritt og HRP-dekstran-bundet avidin.

Resultater av koblingene:

Innholdet av koblet avidin i de resulterende konjugater ble funnet å øke med økende molart forhold mellom avidin og HRP-dekstran, og å nærme seg en platå-verdi, idet det var meget liten økning over et molart forhold på 30. Resultatene er vist i det følgende:

Undersøkelse ved ELISA.

Påvisnings-følsomheten som var oppnåelig med peroksydase-dekstran/avidin-konjugatene som funksjon av antallet avidin-molekyler innarbeidet i konjugatene ble undersøkt ved ELISA.

Under henvisning til den "generelle ELISA-metode", ble følgende oppsetting anvendt: sjikt 1: geite-anti-kanin-IgG; 0,025 mg/ml;

sjikt 2: seriefortynning av biotinylert kanin-IgG;

sjikt 3: HRP-dekstran/avidin-konjugater; hvert konjugat fortynnet til den samme

proteinkonsentrasjon, dvs. til en absorbans-verdi på 280 nm (A280på 0,00063.

ELISA-resultater:

Fig. 4 viser absorbansen ved 492 nm som funksjon av konsentrasjonen biotinylert kanin-IgG i sjikt 2: Kurvene på fig. 4 viser at påvisningsfølsomheten som er oppnåelig med konjugatene, øker med antallet koblede avidin-molekyler. Dvs. at når antallet koblede avidinmolekyler økes, kan mindre mengder tiotinylert kanin-IgG påvises.

EKSEMPEL 39

Kobling av streptavidin til pepperrotperoksydase- dekstran.

Affinitetsrenset streptavidin ble koblet til HRP-dekstran ("sats HRP-Dex-I"; se eksempel 34) i medier inneholdende forskjellige konsentrasjoner av dikaliumhydrogenfosfat (pH 10,1).

Koplingsbetingelser:

Prøvene ble inkubert ved 30°C i 20 timer.

Etter kobling, ble glycin tilsatt til prøvene til en sluttkonsentrasjon på 0,2 M glycin, pH 10, og dette ble fulgt av inkubering i 2 timer [hvilket resulterte i dekativering (blokkering) av gjenværende reaktive vinylsulfongrupper ved reaksjon mellom disse og glycin].

Etter inkubering, ble prøvene dialysert over natten ved 4°C mot 0,05 M Tris/HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,2.

Prøvene ble så underkastet gelfiltrering på Sepharose,?, CL 6B for fraskillelse av det frie streptavidin og HRP-dekstran-bundet streptavidin.

Resultater:

Koblingsutbyttet for streptavidin (idet man antok at den gjennomsnittlige molekylvekt for dekstranet var 500.000 og molekylvekten for strepatavidinet 60.000) ble bestemt til:

1: 16%, svarende til 5 mol streptavidin pr. mol dekstran

2: 46%, svarende til 14 mol strepavidin pr. mol dekstran

3: - (utfelling fant sted i reaksjonsbeholderen etter 1 time).

Sluttproduktene inneholder således gjennomsnittlig:

1: 5 mol streptavidin og 19 mol peroksydase pr. mol dekstran.

2: 14 mol streptavidin og 19 mol peroksydase pr. mol dekstran.

3:

EKSEMPEL 40

Karakterisering av HRP- dekstran/ streptavidin ved ELISA og Dot Blot.

Streptavidin ble koblet til HRP-dekstran ifølge eksempel 39, prøve 2 (0,8 M K2HP04).

Etter gelfiltrering på Sepharose,?, CL 6B, ble det HRP-dekstran-bundne streptavidinkarakterisert vedELISA og Dot Blot.

Til sammenligning ble et vanlig konjugat av streptavidin og pepperrotperoksydase (kat. nr. P317, DAKO, Danmark) undersøkt parallelt.

ELISA (ifølge "generell ELISA-metode", to sjikt).

ELISA-betingelser:

sjikt 1: seriefortynning av biotin-konjugert kanin-IgG i 0,1 M dikaliumhydrogenfosfat (pH 7,2);

sjikt 2: én fortynning av HRP-dekstran/streptavidin (0,014 mg/ml) eller vanlig streptavidinperoksydase (0,02 mg/ml) (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. P397) i 0,1 M dikaliumhydrogenfosfat, 1% Tween® 20 (pH 7,2).

Resultater:

Som det vil kunne sees av fig. 5, gir det dekstranbaserte konjugat ifølge oppfinnelsen en betydelig lavere påvisningsgrense enn det vanlige konjugat.

"Dot Blot":

"Dot Blot"-betingelser (ifølge "generell fremgangsmåte for Dot Blot"):

Resultater:

Under anvendelse av HRP-dekstran/geite-anit-kanin-Ig-konjugatet ifølge oppfinnelsen, var det mulig å påvise en 10 ganger mindre mengde biotinylert kanin-IgG i "dof ene" enn med det vanlige konjugat.

EKSEMPEL 41

Kovalent kobling av et antistoff til alkalisk fosfatase- dekstran.

Renset kanin-anti-muse-Ig (RAM) (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z259) ble koblet til tre forskjellige AP-dekstranpreparater (alkalisk fosfatase ble koblet til dekstranene som beskrevet i eksempel 22, løsninger A og B, og eksempel 23, løsning B).

Fremgangsmåten for kobling av antistoffet var som følger:

De tre forskjellige AP-dekstraner (A-C) fremstilt for kobling av RAM var som følger: A: 6 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran;

B: 7 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran;

C: 15 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran.

De tre koblingsprøvene (prøver A-C) fremstilt under anvendelse av disse tre AP-dekstraner (henholdsvis A-C) inneholdt alle: 1,55 mg RAM pr. ml;

AP-dekstran svarende til 0,2 mg dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/natriumhydroksyd (pH 10,0).

Prøvene ble inkubert ved 37°C i 24 timer.

Innholdet av koblet RAM i de resulterende konjugater ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 42

Kovalent kobling av alkalisk fosfatase til antistoff- dekstran.

Tre forskjellige antistoff-dekstran-preparater ble koblet med alkalisk fosfatase. Antistoffet, dvs. geite-anti-muse-Ig (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z420), ble koblet til DVS-aktivert dekstran som beskrevet i eksempel 24, løsning A, og i eksempel 25, løsningene A og B.

Fremgangsmåten for kobling av alkalisk fosfatase var som følger: Hvert av de tre forskjellige preparater av antistoff-dekstraner ble blandet med alkalisk fosfatase og buffer, hvorved man fikk følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle prøver inneholdt:

2,0 mg alkalisk fosfatase pr. ml;

antistoff-dekstran svarende til 0,29 mg dekstran pr. ml;

0,8 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 9,0).

Prøve A: 4,5 mol geite-anti-muse-Ig pr. mol dekstran

Prøve B: 7 mol geite-anti-muse-Ig pr. mol dekstran

Prøve C: 10 mol geite-anti-muse lg pr. mol dekstran

Koblingen ble utført ved 24°C i 22 timer med forsiktig rysting.

Graden av AP-kobling ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^, S-300, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 43

Kobling av Fab- fragmenter til alkalisk fosfatase- dekstran. Innvirkning av saltkonsentrasjon og temperatur.

Fab-fragmenter [et Fab-fragment er et antistoff-fragment som omfatter ett

antigenbindende sted og én fri SH-gruppe; slike fragmenter fremstilles ved at et antistoffmolekyl behandles med pepsin (under dannelse av et såkalt Ffab^-fragment) og deretter med DTT] fremstilt ut fra geite-anti-muse-Ig (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z420) ifølge A. Johnstone og R. Thorpe, "Immunochemistry in Practice", 2. utgave, 1987,57-58, ble koblet til AP-dekstran som beskrevet i eksempel 20, løsning D (24 timer).

Koblings-fremgangsmåten var som følger: En løsning for kobling av geite-anti-muse-Fab'-rfagmenter til AP-dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasj oner: 0,63 mg geite-anti-muse-Fab-fragrnenterpr. ml;

AP-dekstran svarende til 0,196 mg dekstran pr. ml;

Prøver A og B:0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0);

Prøver C og D: 0,75 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

De klare løsningene ble inkubert med forsiktig omrysting i 24 timer ved: AogC: 24°C

B og D: 30°C

Etter inkubering, ble innholdet av koblede geite-anti-muse-Fab-fragmenter bestemt ved gelfiltrering på Sephacryli,, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 44

Kobling av Fab'- fragmenter til pepperrotperoksydase- dekstran. Innvirkning av pH.

Fab'-fragmenter fremstilt ut fra geite-anti-kanin-F(ab')2-fragmenter (ifølge A. Johnstone og R. Thorpe, "Immunochemistry in Practice", 2. utgave, 1987, s. 57-58) ble koblet til HRP-dekstran, fremstilt som beskrevet i eksempel 12 (48 timer), ved fem forskjellige pH-verdier.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Fem forskjellige løsninger (A-E) for kobling av Fab'-fragmenter til HRP-dekstran ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasj oner:

Alle prøver inneholdt:

0,67 mggeite-anti-kanin-Fab-fragmenterpr. ml;

HRP-dekstran svarende til 0,29 mg dekstran pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre.

pH-verdiene i dikaliumhydrogenfosfat-bufferne var:

prøve A: pH 5,0

prøve B: pH 6,0

prøve C: pH 7,0

prøve D: pH 8,0

prøve E: pH 9,0

De fem klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 20 timer med forsiktig rysting.

Graden av kobling av Fab-fragmenter ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 45

Tiolering av alkalisk fosfatase.

Alkalisk fosfatase (AP) med molekylvekt 140.000 (Boehringer Mannheim, kat. nr. 556602, kvalitet 1) ble tiolert med N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP)

(Pharmacia, Sverige, kat. nr. 17-0458-01).

For de foreliggende formål ble den generelle fremgangsmåte for tiolering av proteiner, først beskrevet av Carlsson et al., Biochem. J. (1978) 173, 723-737, utviklet videre som følger: Tiolerings-fremgangsmåte: Til 1,0 ml alkalisk fosfatase-preparat [10 mg/ml i 3 M NaCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2,30 mM trietanolamin (pH 7,6)] ble det tilsatt 28,6fi\ SPDP (10 mM i 99,9% etanol)

(mengden tilsatt SPDP kan varieres og avhenger av den ønskede substitusjonsgrad, dvs. antall mol 2-pyridyldisulfid-strukturer pr. mol AP). SPDP-løsningen ble tilsatt dråpevis til den omrørte AP-Iøsning, og reaksjonsblandingen ble deretter inkubert i ca. 30 minutter ved 24°C.

Etter inkuberingen, ble en liten prøve (50-100/ti) uttatt og underkastet gelfiltrering på Sephadex£G-25 med 0,05 M Tris/HCl-buffer inneholdende 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl2og 0,1 mM ZnCl2(pH 7,2), under fjerning av overskudd av SPDP, frigjort N-hydroksysuksinimid og eventuelt annet materiale med lav molekylvekt.

Den gelfiltrerte prøve ble anvendt til bestemmelse av innholdet av 2-pyridyldisulfid-strukturer (= slutt-innholdet av tiolgrupper) i den modifisrte AP, og ble behandlet som følger: Absorbansen ved 280 og 343 nm ble målt, hvoretter titiotreitol (DTT) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 mM. Etter inkubering i 10 minutter ved 23°C, ble absorbansen ved 343 nm målt igjen.

Behandlingen med DTT bevirker frigjøring av pyridin-2-tion, som har en absorpsjonsevne på 8,08 x 10 M" cm" ved 343 nm.

Mengden pyridin-2-tion frigjort er ekvivalent med innholdet av 2-pyridyldisulfid-grupper i AP. Siden 2-pyridyl-disulfid-gruppen i seg selv viser absorpsjon ved 280 nm vil man få en feilaktig høy proteinkonsentrasjon ved utregning av basis av den målte absorbans ved 280 nm (A2go). Denne tilleggsabsorbans kan korrigeres for ved at man trekker A28o-bidraget av 2-pyridyldisulfid-gruppen fra den totale A2go- Det førstnevnte bidrag beregnes under anvendelse av følgende uttrykk: (konsentrasjon av pyridin-2-tion frigjort ved reduksjon) x 5,1 x 10 M cm" = A2gosom skyldes 2-pyridyldisulfid-gruppen (5,1 x 103 M^cm"<1>er den molare absorpsjonsevne ved 280 nm for 2-pyridyldisulfid-gruppen).

Innholdet av 2-pyridyldisulfid-strukturer (= sluttinnholdet av tiolgrupper) i den modifiserte AP ble bestemt som beskrevet ovenfor for 10 forskjellige tioleringer av AP. Hver prøve ble behandlet som beskrevet ovenfor (dvs. 4 mol SPDP pr. mol AP under inkuberingen), og man fikk et innholdt på 1,85 + 0,25 mol 2-pyridyldisulfid pr. mol AP.

I mellomtiden ble resten av blandingen av den 2-pyridyl-disulfid-modifiserte AP

(ikke underkastet gelfiltrering) behandlet med DTT for redusering av de proteinkoblede 2-pyridyldisulfid-strukturer. Dette ble utført på samme måte som beskrevet ovenfor, dvs. at DTT ble tilsatt til en slutt-konsentrasjon på 10 mM, og blandingen ble inkubert ved 20-23°C i ca. 5-10 minutter. Redusering av de innførte 2-pyridyldisulifd-strukturer finner sted meget hurtig (< 1-2 minutter) med DTT ved pH 7,2, og siden de naturlige -S-S-broer i AP befinner seg dypt inne i den indre struktur av AP, vil de ikke bli redusert ved denne behandling.

Etter redusering, ble den tiolerte AP fraskilt fra materialet med lav molekylvekt ved gelfiltrering på Sephadex^G-25 (under anvendelse av PD-10-kolonner) med den ønskede koblingsbuffer, og ble anvendt i løpet av kort tid (innen 1 time) for kobling, siden tiol-gruppen er meget reaktiv og kan undergå uønskede reaksjoner. Den modifiserte AP må derfor oppbevares i 2-pyridyldisulfid-formen (hvis nødvendig over natten ved 4°C i ovennevnte Tris/HCl-buffer) og reduseres like før anvendelse.

Et innholdt på 1,85 + 0,25 mol 2-pyridyldisulifd-strukturer pr. mol AP resulterer i intet tap av AP-aktivitet, og den etterfølgende reduksjon med DTT resulterer i et tap på bare ca. 5% av den opprinnelige AP-aktivitet.

EKSEMPEL 46

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av pH.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500/«noi vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 2,1 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Tre forskjellige løsninger (A-C) for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende slutt-konsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

2,0 mg tiolert AP pr. ml;

0,286 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre.

pH-verdiene for dikaliumhydrogenfosfat-bufferne var:

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 24 timer med forsiktig rysting.

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 47

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirknin<g>av tid og temperatur.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 jraiol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 2 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: En løsning for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

o

1,0 mg tiolert AP pr. ml;

0,143 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,5 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Den klare løsning ble inkubert i 4 timer ved 24°C med forsiktig rysting, og deretter i 144 timer ved 4°C uten rysting.

Prøver ble uttatt etter forskjellige inkuberingstidsrom, og innholdt av koblet alkalisk SH-fosfatase ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR. Resultatene var som følger:

EKSEMPEL 48

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av saltkonsntrasjoner.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 /«noi vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,6 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: Fire forskjellige løsninger (A-D) for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasj oner:

Alle løsninger inneholdt:

2,20 mg tiolert AP pr. ml;

0,314 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Konsentrasjonene av dikaliumhydrogenfosfat i bufferne var:

De klare løsningene ble inkubert ved 24°C i 24 timer med forsiktig rysting.

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryli, S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 49

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av tiolert AP- konsentrasjon.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 jtmol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,7 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: Tre forskjellige løsninger (A-C) for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Løsning A: 0,90 mg SH-AP pr. ml;

0,129 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

Løsning B: 1,8 mg SH-AP pr. ml;

0,258 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

Løsning C: 3,6 mg SH-AP pr. ml;

0,516 mg DVS-aktivert dekstran.

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C med forsiktig rysting. Prøver ble uttatt etter forskjellige inkuberingstidsrom, og innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-300 HR. Resultatene var som følger:

EKSEMPEL 50

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av temperatur.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500frniol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,9 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: En løsning for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

n e

1,9 mg SH-AP pr. ml;

0,271 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Den klare løsning ble delt i to prøver med likt volum (A og B), som deretter ble inkubert i 22 timer med forsiktig rysting med følgende temperaturer:

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 51

Kobling av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av det molare forhold mellom tiolert AP og DVS- aktivert dekstran. Høye forhold.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500/rniol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,9 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: Tre forskjellige løsninger (A-C) for kobling av tiolert AP til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner: *

Alle løsninger inneholdt:

1,9 mg SH-AP pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Løsning A: 0,543 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 12:1);

Løsning B: 0,272 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 25:l);

Løsning C: 0,136 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 50:l).

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 22 timer med forsiktig rysting.

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 52

Koblin<g>av tiolert AP til DVS- aktivert dekstran. Innvirkning av det molare forhold mellom tiolertAP og DVS- aktivert dekstran. Lave forhold.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til DVS-aktivert dekstran med molekylvekttopp 500.000 med 1500 jrniol vinylgrupper pr. gram dekstran ("sats Dex-II"). Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,6 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: Tre forskjellige løsninger (A-C) for kobling av alkalisk SH-fosfatase til DVS-aktivert dekstran ble tillaget under oppnåelse av90 følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

1,8 mg SH-AP pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

Løsning A: 1,07 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 6:l);

Løsning B: 0,536 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 12:l);

Løsning C: 0,357 mg DVS-aktivert dekstran pr. ml

(SH-AP:dekstran = 18:l).

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 22 timer med forsiktig rysting.

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 53

Kobling av tiolert AP til antistoff- dekstran. Innvirkning av pH.

Tiolert AP (SH-AP) ble koblet til antistoff-dekstran [fremstilt som beskrevet i eksempel 24, prøve B, og inneholdende 10 mol antistoff (geite-atnti-mus) pr. mol dekstran]. Den tiolerte AP ble fremstilt som beskrevet i eksempel 45 og inneholdt gjennomsnittlig 1,4 mol SH-grupper pr. mol alkalisk fosfatase.

Koblingsfremgangsmåten var som følger: To forskjellige løsninger for kobling av tiolert AP til antistoff-dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Begge løsninger inneholdt:

0,94 mg tiolert AP pr. ml;

0,134 mg dekstran pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre.

pH-verdiene for dikaliumhydrogenfosfat-bufferne var:

Løsning A: pH 7,0

Løsning B: pH 8,0

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C i 22 timer med forsiktig rysting.

Innholdet av koblet tiolert AP ble bestemt ved gel-filtrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 54

Kobling av tiolert antistoff til alkalisk fosfatase- dekstran.

Geite-anti-muse-Ig (GAM) (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. Z420) ble tiolert med N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat SPSP) (Pharmacia, kat. nr. 17-0458-01) og deretter koblet til to forskjellige alkalisk fosfatase-dekstran-(AP-dekstran)-preparater. Det første AP-dekstran ble fremstilt som beskrevet i eksempel 52, løsning B, og inneholdt 11 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran; det annet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 51, løsning B, og inneholdt 18 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran; det tiolerte antistoff ble fremstilt ifølge den generelle fremgangsmåte for tiolering av proteiner som først ble beskrevet av Carlsson et al., Biochem. J. (1978) 173 723-737, og inneholdt gjennomsnittlig 4 mol SH-grupper pr. mol geite-anti-muse-antistoff.

Fremgangsmåten for kobling av det tiolerte geite-anti-muse-Ig (SH-GAM) var som følger: Fire løsninger for kobling av SH-GAM til AP-dekstran ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle løsninger inneholdt:

2,0 mg SH-GAM pr. ml;

0,50 M dikaliumhydrogenfosfat/saltsyre (pH 8,0).

A og B: 10 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran;

C og D: 18 mol alkalisk fosfatase pr. mol dekstran;

A: AP-dekstran svarende til 0,516 mg dekstran pr. ml;

B: AP-dekstran svarende til 0,258 mg dekstran pr. ml;

C: AP-dekstran svarende til 0,516 mg dekstran pr. ml;

D: AP-dekstran svarende til 0,258 mg dekstran pr. ml.

De klare løsningene ble inkubert ved 24°C i 22 timer med forsiktig rysting.

Koblingsgraden for SH-GAM ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacrytø S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 55

Kobling av monoklonalt muse- antistoff til pepperrotperoksvdasedekstran. »•

Protein A-rensede lette muse-anti-human-kappa-kjeder (DAKO A/A, Danmark, kat. nr. M 827) ble koblet til HRP-dekstran. HRP-dekstranet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 12 (48 timers inkubering, 4°C). HRP-dekstranet inneholdt 16 mol pepperrot-peroksydase pr. mol dekstran.

Koblings-fremgangsmåten var som følger: Tre forskjellige løsninger (A-C) for kobling av lette muse-anti-human-kappa-kjeder til HRP-dekstran ble tillaget under oppnåele av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle prøver inneholdt:

HRP-dekstran svarende til 0,30 mg dekstran pr. ml;

2,74 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

0,7 M dkaliumhydrogenfosfat titrert med enten saltsyre eller natriumhydroksyd til:

A: pH 8,4

B: pH 9,2

C: pH 10,0.

De klare løsninger ble inkubert ved 24°C uten omrøring i:

A: 24 timer,

B og C: 6 timer.

Innholdet av koblede lette muse-anti-human-kappa-kjeder ble bestemt ved gelfiltrering på Sephacryl^S-300 HR, og resultatene var som følger:

EKSEMPEL 56

Komplekser mellom monoklonale muse- antistoffer og dekstran koblet med peroksydase og kanin- anti- muse- Ig. Innvirkning av forskjellige konsentrasjoner av monoklonalt antistoff.

Lette muse-anti-human-kappa-kjeder (DAKO A7S, Danmark, kat. nr. M 827) ble kompleksbundet med dekstran koblet med pepperrotperoksydase og kanin-anti-muse-Ig (HRP-dekstran/RAM). Sistnevnte ble fremstilt som beskrevet i eksempel 36C, løsning B.

Kompleksdannelse:

Syv forskjellige prøver (A-G) for kompleksdannelse mellom lette muse-anti-human-kappa-kjeder og HRP-dekstran/RAM ble fremstilt under oppnåelse av følgende sluttkonstrasjoner:

Prøvene inneholdt:

HRP-dekstran/RAM-konjugat svarende til 0,020 mg dekstran pr. ml og

0,042 mg RAM pr. ml og

A: 0,003 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

B: 0,006 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

C: 0,012 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

D: 0,030 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

E: 0,061 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

F: 0,121 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

G: 0,242 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml.

Kompleksdannelse fikk foregå ved romtemperatur i 2 timer, og prøvene ble deretter undersøkt ved ELISA.

ELISA:

ELISA ble utført som en tosjikts-teknikk ifølge "generell ELISA-metode".

Første sjikt dannet under anvendelse av: henholdsvis 5/tg/ml, 1 /tg/ml, 0,2/ig/ml og 0,04 fig/ ml av humane serumproteiner i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, pH 7,2;

Annet sjikt: fortynninger av kompleksene (A-G) svarende til 12 ng dekstran pr. ml

(fortynnet i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, 0,1% Tween® 20, pH 7,2.

Orto-fenylendiamin/hydrogenperoksyd ble anvendt som fargeutviklings-HRP-substrat, med en reaksjonstid på 10 min.

Resultater:

Resultatene av ELISA-analysen er vist på fig. 6, som viser absorbansen ved 492 nm oppnådd for hver at de fire konsentrasjoner av humane serumproteiner anvendt for det første sjikt i ELISA som funksjon av forholdet mellom lette muse-anti-human-kappa-kjeder og HRP-dekstran/RAM-konjugat anvendt ved kompleksdannelsen (uttrykt som mg lette muse-kanti-human-kappa-kjeder pr. mg dekstran i konjugatet).

Som det vil kunne sees, utflates absorbansen ved et forhold på ca. 4 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. mg dekstran.

EKSEMPEL 57

Komplekser dannet mellom biotin<y>lerte polvklonale kanin- anti- stoffer og dekstran med høv molekylvekt koblet med pepperrot- peroksydase og streptavidin.

Rensede lette kanin-anti-human-kappa-kjeder (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. A192) ble biotinylert med N-biotinyl-€-amino-kapronsyre-N-hydroksysuksinimid-ester (Sigma, kat. nr. B 2643) ifølge Kendall et al., Journal of Immunological Methods (1983) 56 329-339. 0,04fimo\ biotin ble anvendt pr. mg protein.

De biotinylerte lette kanin-anti-human-kappa-kjeder ble deretter kompleksbundet med dekstranet med høy molekylvekt koblet med pepperrotperoksydase og streptavidin (HRP-dekstran/streptavidin). HRP-dekstran/streptavidin ble fremstilt som beskrevet i eksempel 39.

Kompleksdannelse:

Tre forskjellige prøver (A-C) for kompleksdannelse mellom biotinylerte lette kanin-anti-human-kappa-kjeder og HRP-dekstran/streptavidin ble tillaget under oppnåelse av følgende sluttkonsentrasjoner:

Alle prøver inneholdt:

HRP-dekstran/streptavidin-konjugat svarende til 0,2 mg dekstran pr. ml og 0,12 mg streptavidin.

A: 0,156 mg biotinylerte lette kanin-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

B: 0,309 mg biotinylerte lette kanin-anti-human-kappa-kjeder pr. ml;

C: 0,465 mg biotinylerte lette kanin-anti-human-kappa-kjeder pr. ml.

Kompleksdannelse fikk foregå ved romtemperatur i 2 timer, og prøvene ble deretter undersøkt ved en ELISA og ved en immunhistokjemisk metode.

ELISA:

ELISA ble utført som en to-sjikts-teknikk i henhold til følgende fremgangsmåte:

Første sjikt dannet under anvendelse av: 5/tg humane serumproteiner pr. ml, fortynnet i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, pH 7,2;

Annet sjikt: seks seriefortynninger av hver av kompleks-prøvene (A-C) inneholdende mellom 2 fig dekstran pr. ml og 0,0625 /tg dekstran pr. ml (fortynnet i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, 0,1% Tween® 20, pH 7,2.

Ortofenyldiamin/hydrogenperoksyd ble anvendt som fargeut-viklings-HRP-substrat med en reaksjonstid på 2 minutter.

Resultater:

Resultatene av ELISA-analysen er vist på fig. 7, som viser absorbansen ved 492 nm oppnådd for hver av de tre prøver (A-C) som funksjon av fortynningen av hvert kompleksbundet konjugat.

Som det vil kunne sees, nådde absorbansen for en gitt konsentrasjon av kompleksbundet konjugat en maksimumsverdi når komplekset var blitt dannet under anvendelse av en konsentrasjon på ca. 0,309-0,465 mg biotinylere lette kanin-anti-human-kappa-kjeder pr. ml.

Immunhi stokj em i:

Den immunhistokjemiske analyse ble utført ifølge "Handbook. Immunochemical Staining Methods", Sally J. Maish. DAKO Corporation, 1989.

Kompleksene i prøvene A-C ble utprøvet på tonsill-vevssnitt, idet hver prøve ble fortynnet til konsentrasjoner i området svarende til 0,1-0,0125 mg dekstran pr. ml.

Deiaminobenzidintetrahydroklorid (DAB)/hydrogenperoskyd ble anvendt som fargeutviklings-HRP-substrat.

Som kontrollmetode ble det anvendt en tre-trinns-LSAB-metode (beskrevet i "Handbook. Immunochemical staining methods", DAKO Corporation, 1989.

Følgende resultater ble oppnådd:

Resultater:

Resultatene av den immunhistokjemiske analyse viser at ved det anvendte konsentrasjonsnivå er tre-trinns-LSAB-metoden bare litt bedre enn ett-trinns-metoden basert på de foreliggende komplekser dannet mellom HRP-dekstran/streptavidin-konjugat og biotinylerte lette kanin-anit-human-kappa-kjeder. Ved anvendelse av et kompleksbundet konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse, er det således mulig å forenkle en slik immunhistokjemisk analyse betraktelig og likevel fremdeles oppnå meget tilfredsstillende faring.

EKSEMPEL 58

Komplekser dannet mellom monoklonale muse- antistoffer og dekstran koblet med pe pperrotperoksydase og kanin- anti- muse- IgG. Innvirkning av konsentrasjon.

Lette muse-anti-human-kappa-kjeder (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. M 827) ble kompleksbundet med dekstran koblet med pepperrotperoksydase og kanin-anti-muse-IgG (HRP-dekstran/RAM). HRP-dekstran/RAM-preparatet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 36C, løsning B.

Kompleksdannelse:

Fem foreskjellige prøver (A-E) ble tillaget ved blanding av en konstant mengde av HRP-dekstran/RAM med en konstant mengde lette muse-anti-human-kappa-kjeder i forskjellige sluttvolum. Det ble tillaget prøver med følgende sluttkonsentrasjoner med lette muse-anti-human-kappa-kjeder: A: 0,280 mg pr. ml;

B: 0,140 mg pr. ml;

C: 0,093 mg pr. ml;

D: 0,070 mg pr. ml;

E: 0,056 mg pr. ml.

De klare løsninger ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur før de ble undersøkt i en ELISA og immunkjemisk.

ELISA:

ELISA ble utført som en to-sjiktsteknikk i henhold til følgende fremgangsmåte:

Første sjikt dannet under anvendelse av: 5 fig humane serumproteiner pr. ml, fortynnet i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, 0,1% Tween® 20, pH 7,2;

Annet sjikt: fem seriefortynninger av hver av kompleksprøvene (A-E) inneholdende mellom 0,01 og 0,00013 fig lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml (fortynnet i 0,01 M natriumfosfat, 0,145 M NaCl, 0,1% Tween®, pH 7,2).

Orto-fenylendiamin/hydrogenperoksyd ble anvendt som fargeutviklings-HRP-substrat, med en reaksjonstis på 10 min.

Resultater:

Resultatene av ELISA-analysen er vist på fig. 8, som viser absorbansen ved 492 nm oppnådd for hver av de fem prøver (A-E) som funksjon av konsentrasjonen av lette muse-anti-human-kappa-kjeder i hver kompleksbundet konjugat-prøve.

Som det vil kunne sees, viser absorbansverdien for hver av prøvene (A-E) ved en gitt konsentrasjon av lette muse-anti-human-kappa-kjeder, bare en forholdsvis liten variasjon; dette tyder på at ved de anvendte konsentrasjoner har volumet i hvilket kompleksene dannes, bare mindre betydning.

Immunhi stokj emi:

Den immunhistokjemiske analyse ble utført ifølge "Handbook, Immunochemical Staining Methods", Sally J. Naish, DAKO Corporation, 1989.

Prøvene ble utprøvd på tonsill-vevssnitt, idet hver prøve ble fortynnet til konsentrasjoner i området som svarer til 0,028-0,0035 mg lette muse-anti-human-kappa-kjeder pr. ml.

Diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB)/hydrogenperoksyd ble anvendt som fargeutviklings-HRP-substrat.

For kontrollformål ble det anvendt et vanlig konjugat, dvs. pepperrotperoksydase-merkede lette kanin-anti-human-kappa-kjeder (DAKO A/S, Danmark, kat. nr. P129), fortynnet i henhold til fabrikantens anbefalinger, og LSAB-metoden ("Handbook, Immunochemical Staining Methods", DAKO Corporation, 1989) ble også anvendt.

Følgende resultater ble oppnådd:

Resultater:

Resultatene av den immunhistokjemiske analyse viser at ett-trinns-metoden basert på de foreliggende komplekser dannet mellom HRP-dekstran/RAM-konjugat og lette muse-anti-human-kappa-kjeder er litt bedre enn tre-trinns-LSAB-metoden og betydelig bedre enn ett-trinns-metoden basert på det vanlige konjugat. Dette illustrerer igjen fordelene som er forbundet med anvendelse av et kompleksbundet konjugat ifølge den foreliggende oppfinnelse med hensyn til analyse-oppbyggjngens enkelhet og den oppnåelige fargeintensitet.

Claims (26)

1. Vannløselig reagens,karakterisert vedat det omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet mer enn én del avledet fra divinylsulfon, idet hver av delene er bundet via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper i et divinylsulfon-molekyl og en reaktiv funksjonalitet på det polymere bærermolekyl, og den gjenværende vinylgruppe på mer enn én slik del i den tilknyttede tilstand, er fri og i stand til å reagere med en molekylforbindelse som er forskjellig fra polymert bærermolekyl med en funksjonell gruppe som er reaktiv overfor den frie vinylgruppe.t

2. Reagens ifølge krav 1,karakterisert vedden polymere bærer valgt fra gruppen som består av: naturlige og syntetiske polysakkarider; homopoly(aminosyre)r; naturlige og syntetiske polypeptider og proteiner; og syntetiske polymerer med nukleofile funksjonelle grupper, innbefattende polyvinylalkoholer, polyallylalkohol, polyetylenglykoler og substituerte polyakrylater.

3. Reagens ifølge krav 1,karakterisert vedat den polymere bærer er valgt fra gruppen som består av: dekstraner, innbefattende karboksymetyldekstraner; stivelsesforbindelser, hydroksyetyl-stivelsesforbindelser og hydroksypropyl-stivelsesforbindelser; glykogen; agarosederivater; cellulosederivater, innbefattende hydroksyetyl- og hydroksypropylcelluloser; og naturlige gummiarter.

4. Vannløselig konjugat,karakterisert vedat det omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet mer enn én av en gitt molekyltype som er forskjellig fra polymert bærermolekyl, hver via en sammenbindende gruppe avledet fra divinylsulfon, idet tilknyttingen av hver sammenbindende gruppe til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfon-molekyl og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og tilknyttingen av en molekyltype til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfon-molekylet, og en funksjonell gruppe på molekyltypen.

5. Konjugat ifølge krav 4,karakterisert vedat det polymere bærermolekyl videre har kovalent tilknyttet én eller flere deler avledet fra divinylsulfon, idet hver av delene er tilknyttet via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfon-molekyl og en reaktiv funksjonalitet på det polymere bærermolekyl, og den gjenværende vinylgruppe på minst én av delene i sin tilknyttede tilstand er fri og i stand til å reagere med en ytterligere molekyltype med en funksjonell gruppe som er reaktiv overfor den frie vinylgruppe.

6. Konjugat ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat den kovalent til-nyttede molekyltype er valgt fra gruppen som består av: proteiner, innbefattende ferritin, fykoerytriner, fykocyaniner og fykobiliner; enzymer, innbefattende pepperrotperoksydase, alkalisk fosfatase, glukoseoksydaser, galaktosidaser og ureaser; toksiner; legemidler; fargestoffer; fluorescerende, luminescerende, fosforescerende og andre lys-utsendende substanser; metallchelaterings-substanser, innbefattende iminodieddiksyre, etylendiamintetra-ddiksyre (EDTA), dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) og desferrioksamin B; substanser merket med en radioaktiv isotop; og substanser merket med et tungt atom.

7. Konjugat ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat den kovalent tilknyttede molekyltype er en målsøkingsforbindelse som er i stand til å bindes selektivt til, eller til å reagere selektivt med, et komplementært molekyl eller et komplementært strukturelt område på et materiale av biologisk opprinnelse.

8. Vannløselig konjugat,karakterisert vedat det omfatter et vannløselig polymert bærermolekyl til hvilket det er kovalent bundet to eller flere molekyltyper, hvorav minst én er forskjellig fra den annen (de andre), idet hver molekyltype er tilknyttet via en sammenbindende gruppe av ledet fra divinylsulfon, og tilknyttingen av hver sammen-indende gruppe til det polymere bærermolekyl er via en kovalent binding dannet mellom én av de to vinylgrupper på et divinylsulfonmolekyl og en reaktiv funksjonalitet på bærermolekylet, og tilknyttingen av en molekyltype til den sammenbindende gruppe er via en kovalent binding dannet mellom den annen vinylgruppe som stammer fra divinylsulfon-molekylet, og en funksjonell gruppe på molekyltypen.

9. Konjugat ifølge krav 4,5 eller 8,karakterisert vedat den polymere bærer er valgt fra gruppen som består av: naturlige og syntetiske polysakkarider; homopoly(aminosyre)r; naturlige og syntetiske polypeptider og proteiner; og syntetiske polymerer med nukleofile funksjonelle grupper, innbefattende polyvinylalkoholer, polyallylalkohol, polyetylenglykoler og substituerte polyakrylater.

10. Konjugat ifølge krav 4, 5 eller 8,karakterisert vedat det polymere bærermolekyl er valgt fra gruppen som består av: dekstraner, innbefattende karboksymetyldekstraner; stivelsesforbindelser, hydroksyetyl-stivelsesforbindelser og hydroksypropyl-stivelsesforbindelser; glykogen; agarosederivater; cellulosederivater, innbefattende hydroksyetyl- og hydroksypropylcelluloser; og naturlige gummiarter.

11. Konjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat minst én av molekyltypene er valgt fra gruppen som består av: proteiner, innbefattende ferritin, fykoerytriner, fykocyaniner og fykobiliner; enzymer, innbefattende pepperrotperoksydase, alkalisk fosfatase, glukoseoksydaser, galaktosidaser og ureaser; toksiner; legemidler; fargestoffer; fluorescerende, luminescerende, fosforescerende og andre lysutsendende substanser; metallchelaterings-substanser, innbefattende iminodieddiksyre, etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) og desferrioksamin B; substanser merket med en radioaktiv isotop; og substanser merket med et tungt atom.

12. Konjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat minst én av molekyltypene er en målsøkende forbindelse som er i stand til å bindes selektivt til, eller reagere selektivt med, et komplementært molekyl eller et komplementært strukturelt område på et materiale av biologisk opprinnelse.

13. Konjugat ifølge krav 7 eller 12,karakterisert vedat den målsøkende forbindelse er valgt fra gruppen som består av: antigener; haptener; monoklonale og polyklonale antistoffer; genprober; naturlige og syntetiske oligo- og polynukleotider; naturlige og syntetiske mono-, oligo- og polysakkarider; lektiner; avidin og streptavidin; biotin; vekstfaktorer; hormoner; reseptor-molekyler; protein A og protein G.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig reagens ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter omsetting av den vannløselige polymere bærer med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH på over 5.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat den omfatter følgende: (i) den vannløselige polymere bærer omsettes med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH på over 5, under dannelse av en vandig Løsning inneholdende et vannløselig mellomproduktreagens som omfatter molekyler av den vannløselige polymere bærer til hvilken det er kovalent knyttet mer enn én reaktiv del avledet fra divinylsulfon, (ii) det vannløselige mellomproduktreagens underkastes eventuelt et rensetrinn, og (iii) det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens omsettes, via reaksjon mellom de reaktive deler og en molekyltype i vandig løsning ved en pH på over 5.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat den omfatter omsetting av et vannløselig reagens ifølge krav 1 med en molekyltype i vandig løsning ved en pH på over 5.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat den vandige løsning i hvilken molekyltypen og det vannløselige reagens reagerer, inneholder et lyotropisk salt.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat den omfatter: (i) den vannløselige polymere bærer omsettes med divinylsulfon i vandig løsning ved en pH på over 5 under dannelse av en vandig løsning inneholdende et vannløselig mellomproduktreagens som omfatter molekyler av den vannløselige polymere bærer til hvilke det er kovalent knyttet to eller flere reaktive deler avledet fra divinylsulfon, (ii) det vannløselige mellomproduktreagens underkastes eventuelt et rensetrinn, (iii) det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens omsettes, via reaksjon mellom de reaktive deler og en molekylforbindelse, i vandig løsning ved en pH på over 5 under dannelse av et vannløselig mellomproduktkonjugat, idet betingelsene er slik at ikke alle de reaktive deler reagerer med en molekyltype, (iv) det vannløselige mellomproduktkonjugat underkastes eventuelt et rensetrinn, og (v) det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktkonjugat omsettes, via reaksjon mellom på forhånd ikke-omsatte reaktive deler og en ytterligere molekyltype, i vandig løsning ved en pH på over 5, idet den ytterligere molekyltype er forskjellig fra den som allerede er bundet i mellomproduktkonjugatet.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14,15 eller 18,karakterisert vedat det polymere bærermolekyl er valgt fra gruppen som består av: dekstraner, innbefattende karboksymetyldekstraner; stivelsesforbindelser, hydroksyetyl-stivelsesforbindelser og hydroksypropyl-stivelsesforbindelser; glykogen; agarosederivater; cellulosederivater, innbefattende hydroksyetyl- og hydroksypropylcelluloser; og naturlige gummiarter.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 18,karakterisert vedat den vandige løsning i hvilken molekyltypen reagerer med det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktreagens i trinn (iii), inneholder et lyotropt salt.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat den vandige løsning i hvilken den ytterligere molekyltype reagerer med det eventuelt rensede vannløselige mellomproduktkonjugat i trinn (v), inneholder et lyotropt salt.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannløselig konjugat ifølge krav 8,karakterisert vedat den omfatter omsetting av et vannløselig konjugat ifølge krav 11, med en ytterligere molekyltype, i vandig løsning ved en pH på over 5, idet den ytterligere molekyltype er forskjellig fra den som allerede er knyttet til det reagerende konjugat.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat den vandige løsning i hvilken den ytterligere molekyltype og det vannløselige konjugat reagerer, inneholder et lyotropisk salt.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 17, 20,21 eller 23,karakterisert vedat det lyotropiske salt er valgt fra gruppen som består av: sulfater, fosfater, citrater og tartrater av litium, natrium, kalium og ammonium.

25. Anvendelse av et vannløselig konjugat ifølge krav 4 eller 5, ved: immunkjemiske analyseteknikker, innbefattende enzymatiske immunanalyser (EIA) såsom ELISA, radioimmunanalyser (RIA), og nefelometriske og turbidimetriske immunanalyser; immunhistokjemiske metoder; cytokjemiske metoder; strømnings-cytometri; in situ-hybridiseringsteknikker; membran-hybridiseringsteknikker, innbefattende Southern og Northern blotting; biosensorer, eller metoder basert på lektin/karbohydratvekselvirkninger.

26. Anvendelse av et vannløselig konjugat ifølge krav 8, ved: immunkjemiske analyseteknikker, innbefattende enzymatiske immunanalyser (EIA) såsom ELISA, radioimmunanalyser (RIA), og nefelometriske og turbidimetriske immunanalyser; immunhistokjemiske metoder; cytokjemiske metoder; strømningscytometri; in situ-hybridiseringsteknikker; membran-hybridiseringsteknikker, innbefattende Southern og Northern blotting; biosensorer; og fremgangsmåter basert på lektin/karbohydratvekselvirkninger.