DE10039112A1

DE10039112A1 - Verfahren zum Herstellen von Antikörper aus einer verunreinigten Antigenlösung

Info

Publication number: DE10039112A1
Application number: DE2000139112
Authority: DE
Inventors: Holger Maerz; Reinhard Jonas; Uwe Kempin
Original assignee: Pe Diagnostik GmbH
Current assignee: Pes Gesellschaft Fuer Medizinische Diagnose Systeme
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2002-03-07

Abstract

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern aus einer verunreinigten Antigenlösung für ein Antigen mit strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen zu ermitteln, wobei mit der gezielten Immunisierung die notwendigen spezifischen Antikörper herstellbar sind. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass DOLLAR A - ein schon vorhandener Antikörper (1) an hochmolekulares Dextran zu einem Dextran-Antikörper-Komplex gebunden wird; DOLLAR A - der Dextran-Antikörper-Komplex zu einer gepufferten, verunreinigten Antigenlösung gegeben wird und ein Dextran-Antikörper-Antigen-Komplex entsteht; DOLLAR A - nachfolgend der Dextran-Antikörper-Antigen-Komplex aus der verunreinigten Lösung isoliert und über Dialyse eine gereinigte Antigen-Fraktion gewonnen wird; DOLLAR A - die gereinigte Antigen-Fraktion zur Immunisierung eingesetzt wird und DOLLAR A - nach Isolation von B-Lymphozyten aus dem Gewebe die B-Lymphozyten mit einer immortalisierten Myelomzelllinie zu Klonen fusioniert und zu mehreren monoklonalen Hybridomzelllinien vereinzelt werden, deren Produkt ein neuer monoklonaler Antikörper (5) ist, der zu dem schon vorhandenen monoklonalen Antikörper (1) komplementär ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Antikörper aus einer verunreinigten Antigenlösung für ein Antigen mit strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen.

Bekannt ist, dass bei der Herstellung spezifischer Antikörper das entsprechende, korrespondierende Antigen zur Immunisierung eingesetzt wird (I. A. Roitt, J. Bosthoff, D. K. Male. Kurzes Lehrbuch der Immunologie. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1995). Dabei wird einem geeignetem Tier, z. B. einer Maus, das Antigen intravenös appliziert. Um eine Immunantwort hervor zu rufen, in deren Verlauf Antikörper produziert werden, muss das Tier das Antigen als Fremdkörper erkennen, und das Antigen muss ausreichend groß sein. Kleine Moleküle, sogenannte Haptene, induzieren in derivatisierter Form eine Immunantwort (C. A. Janeway & P. Travers. Immunologie. Heidelberg, Berlin, Oxford: Spektrum Akademischer Verlag, 1997). Die effektivste Methode, eine Immunantwort hervor zu rufen, ist eine kontinuierliche Verabreichung des Antigenes zusammen mit einem Agens, welches prinzipiell eine Stimulation des Immunsystems bewirkt (E. Lidell & I. Weeks. Antikörpertechniken. Heidelberg, Berlin, Oxford: Spektrum Akademischer Verlag, 1996). Der am häufigsten eingesetzte Agens ist das Freudsche Adjuvans. Das Antigen wird mit dem Adjuvans zu einer viskosen Emulsion vermischt, die zur Immunisierung eingesetzt wird. Dem mit Antigenen intravenös applizierte Tier wird nach der Immunantwort bespielsweise die Milz entnommen, da sich in diesem Organ die B-Lymphozyten anreichern und in großer Zahl verfügbar sind. Danach werden die B-Lymphozyten mit unterschiedlichen Verfahren immortalisiert, überlicherweise durch Fusion mit einer Zelllinie, zum Beispiel murine Myelomzelllinie. Nach einer Klonierung in einem speziellen Minimalmedium überleben nur die erfolgreichen, immortalisierten Fusionsprodukte. Nach Vereinzelung werden die Klone nach ihrer Antikörperspezifität selektioniert und vermehrt. Mit dem fertigen Klon kann dann in einer Zellkultur oder in der Bauchhöhle von Tieren der gewonnene monoklonale Antikörper vermehrt werden.

In der in-vitro Diagnostik können diese Antikörper zum qualitativen (z. B. HIV- Test) oder quantitativen Nachweis (z. B. Tumormarker) eingesetzt werden. Eine übliche Methode ist der Sandwich-ELISA-Nachweis, bei dem ein spezifischer Antikörper das Antigen bindet. Mit einem zweiten Antikörper wird das Antigen dann nachgewiesen. Voraussetzungen für ein Sandwich-ELISA-Nachweis sind demgemäß zwei Antikörper, ein Fänger- und ein Detektorantikörper. Dabei hat das Antigen strukturell zwei Antikörper mit unterschiedlichen Bindungsstellen. Deshalb werden zum Nachweis zwei Antikörper mit unterschiedlicher Bindungsstellenspezifität benötigt (F. Breitling & S. Dübel. Rekombinante Antikörper. Heidelberg, Berlin, Oxford: Spektrum Akademischer Verlag, 1997). Beide Antikörper binden spezifisch an das gleiche Antigen an, aber an unterschiedlichen Bindungsstellen. Dieser Sandwich-ELISA-Nachweis erfordert für eine gezielte Immunisierng eine möglichst reine Antigenlösung. Da die übliche Manipulation der Immunantwort ein statistisches Ergebnis ist, können Verunreinigungen zur Induktion unterschiedlich spezifischer B-Lymphozyten und damit auch zu Antikörpern verschiedener Spezifität führen. Es ist daher möglich, dass eine Verunreinigung zu einem hohen Antikörpertiter führt, während gegen das eigentliche Antigen keine Antikörper gebildet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen von Antikörper aus einer verunreinigten Antigenlösung für ein Antigen mit strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen zu ermitteln, wobei mit der gezielten Immunisierung die notwendigen spezifischen Antikörper herstellbar sind.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass

- ein schon vorhandener gereinigter, komplementärer, monoklonaler Antikörper an hochmolekulares Dextran zu einem Dextran-Antikörper Komplex gebunden wird;
- nach einer Abtrennung nicht reagierter Komponenten der Dextran-Antikörper Komplex zu einer gepufferten, verunreinigten Antigenlösung gegeben wird, wobei der Antikörper mit hoher Spezifität als Fängerantikörper an das Antigen anbindet, seine Bindungsstelle maskiert und so ein Dextran-Antikörper- Antigen Komplex entsteht;
- nachfolgend der Dextran-Antikörper-Antigen Komplex mit Hilfe der Ausschlusschromatografie aus der verunreinigten Lösung isoliert und über Dialyse eine gereinigte Antigen-Fraktion gewonnen wird;
- die gereinigte Antigen-Fraktion zur Immunisierung eingesetzt wird, wobei eine der Bindungsstellen am Antigen schon durch den verwendeten dextrangebundenen, monoklonalen Antikörper besetzt ist und daher nur gegen eine noch freie Bindungsstelle eine Immunantwort in Form von Antikörpern induziert wird und
- nach Isolation von B-Lymphozyten aus dem Gewebe die B-Lymphozyten mit einer immortalisierten Myelomzelllinie zu Klonen fusioniert und zu mehreren monoklonalen Hybridomzelllinien vereinzelt werden, deren Produkt ein neuer monoklonaler Antikörper ist, der zu dem schon vorhandenen monoklonalen Antikörper komplementär ist, und beide monoklonalen Antikörper daher für ein Sandwich-ELISA eingesetzt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer Herstellung eines monoklonalen murinen Antikörpers gegen humanes alpha-Fetoprotein dargestellt. Die dazugehörigen Zeichnungen zeigen:

Fig. 1: einen Dextran-Antikörper-Antigen Komplex und

Fig. 2: Sandwich-ELISA mit Antikörperpaar

Das alpha-Fetoprotein ist ein Glykoprotein, das aus humanem Plasma gewonnen wird. Für ein Sandwich-ELISA zum qualitativen und quantitativen Nachweis von alpha-Fetoprotein wird wie folgt ein korrespondierender monoklonaler Antikörper 5 hergestellt:
Es wird ein schon vorhandener, gereinigter monoklonaler Antikörper 1 an hochmolekulares Dextran (500-2000 kD) gebunden. Nach einer Abtrennung der nicht reagierten Komponenten wird dieser Dextran-Antikörper Komplex zu einer gepufferten, verunreinigten alpha-Fetoproteinlösung gegeben. Dabei ist darauf zu ächten, dass das Antigen 2 stöchiometrisch im Überschuss vorgelegt wird. Die Lösung wird über 4 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wird die Lösung über eine Ausschlusschromatografiesäule (Superose) gegeben. Während die kleineren Moleküle nicht von der Säule zurückgehalten werden wird die Antikörper-Dextran Fraktion in der Säule zurückgehalten und erscheint als späte Fraktion im Eluat. Durch den Antigenüberschuss ist jeder dextrangebundene Antikörper 1 mit Antigen 2 beladen. Dabei ist die Antikörper- Antigenbindung durch den hochaffinen Antikörper 1 so fest, dass dieser Dextran-Antikörper-Antigen Komplex (siehe Fig. 1) sich nicht mehr ohne weiteres lösen lässt. Die so gewonnene Antigen-Fraktion wird über eine Dialyse über Nacht gereinigt und über eine Diafiltration bis zu einer relativen Antigenkonzentration von 1 mg/ml eingeengt. Das Konzentrat wird in 10 BalbC Mäuse in regelmäßigen Abständen über einen gesamten Zeitraum von insgesamt 120 Tagen intravenös appliziert. Die erfolgreiche Induktion einer Immunantwort wird durch Bestimmung des Antikörpertiters im Blutplasma überprüft. Üblicherweise werden in den ersten Tagen in einer Primärantwort nur spezifische IgM Antikörper gebildet, erst nach einem Klassenwechsel nach 2-3 Wochen erhält man hochaffine IgG Antikörper. Weitere Immunisierungen führen zu einem Boosteffekt, einer spezifischen Antikörperproduktion im hohem Titer. Nach der Milzentnahme werden aus dem Gewebe B-Lymphozyten isoliert und mit einer immortalisierten Myelomzelllinie zu Klonen fusioniert und zu mehreren monoklonalen Hybridomzelllinien vereinzelt. Nach weiteren Selektionsprozeduren, wobei auf Spezifität, Stabilität, Produktivität, Wachstumsrate und generelle Antikörpereigenschaften geachtet wird, erhält man mehrere oder mindestens eine antikörperproduzierende Zelllinie. Die so hergestellten, gereinigten Antikörper 5 werden schließlich noch auf ihre immunologischen und biochemischen Eigenschaften hin untersucht und in einem Sandwich-ELISA mit dem schon vorher existierenden monoklonalen Antikörper 1 an einer noch freien Bindungsstelle gepaart (siehe Fig. 2) und die Nachweisgrenzen des jeweiligen Antikörperpaares 1; 5 bestimmt.

Bezugszeichenliste

1

Antikörper

2

Antigen

3

Bindungsstelle

4

Bindungsstelle

5

Antikörper

Claims

Verfahren zum Herstellen von Antikörper aus einer verunreinigten Antigenlösung für ein Antigen mit strukturell unterschiedlichen Bindungsstellen, dadurch gekennzeichnet, dass
ein schon vorhandener gereinigter, komplementärer, monoklonaler Antikörper (1) an hochmolekulares Dextran zu einem Dextran-Antikörper Komplex gebunden wird;
nach einer Abtrennung nicht reagierter Komponenten der Dextran-Antikörper Komplex zu einer gepufferten, verunreinigten Antigenlösung gegeben wird, wobei der Antikörper (1) mit hoher Spezifität als Fängerantikörper an das Antigen (2) anbindet, seine Bindungsstelle (3) maskiert und so ein Dextran- Antikörper-Antigen Komplex entsteht;
nachfolgend der Dextran-Antikörper-Antigen Komplex mit Hilfe einer Ausschlusschromatografie aus der verunreinigten Lösung isoliert und über Dialyse eine gereinigte Antigen-Fraktion gewonnen wird;
die gereinigte Antigen-Fraktion zur Immunisierung eingesetzt wird, wobei eine der Bindungsstellen (3; 4) am Antigen (2) schon durch den verwendeten dextrangebundenen, monoklonalen Antikörper (1) besetzt ist und daher nur gegen eine noch freie Bindungsstelle (4) eine Immunantwort in Form von Antikörpern (5) induziert wird und
nach Isolation von B-Lymphozyten aus dem Gewebe die B-Lymphozyten mit einer immortalisierten Myelomzelllinie zu Klonen fusioniert und zu mehreren monoklonalen Hybridomzelllinien vereinzelt werden, deren Produkt ein neuer monoklonaler Antikörper (5) ist, der zu dem schon vorhandenen monoklonalen Antikörper (1) komplementär ist, und beide monoklonalen Antikörper (1; 5) daher für ein Sandwich-ELISA eingesetzt werden.