CN104730256A

CN104730256A - 用于检测支原体抗体的组合物及其应用

Info

Publication number: CN104730256A
Application number: CN201510157998.0A
Authority: CN
Inventors: 熊祺琰; 邵国青; 王佳; 刘茂军; 冯志新; 韦艳娜; 马庆红; 华利忠; 倪博
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: CN104730256B

Abstract

本发明提供用于检测支原体抗体的组合物及其应用，属于生物技术领域。所述组合物，含有7种多肽，所述各多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。本发明组合物，可以特异性的检测猪鼻支原体抗体，不会与猪常见其他支原体或其他病原感染样品发生交叉反应，假阳性率极低。检测样品易于获得，不会影响猪场正常饲养管理。

Description

用于检测支原体抗体的组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测支原体抗体的组合物及其应用。

背景技术

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)，属于支原体科(Mycoplasmataceae)支原体属(Mycoplasma)成员，最早由Carler和Mckay于1953年从传染性萎缩性鼻炎猪的鼻腔内分离获得，故定名为猪鼻支原体。猪鼻支原体是临床猪场中常见病原菌，通常由母猪或大猪传染给小猪，通常通过飞沫或直接接触由上呼吸道感染传播。猪只一旦感染，该支原体在上呼吸道迅速传播并且能从感染猪的肺脏和鼻咽管中分离到，而后可经呼吸道移行至全身。猪鼻支原体能够引起猪多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎、肺炎等病症。其临床感染率在不同国家地区普遍可达60-70％以上。同时猪鼻支原体亦可与其他病原菌形成混合感染，加重疾病的发生率和严重程度。近年来的研究发现猪鼻支原体属于人兽共患性疾病病原，其感染与多种人类癌症，包括胃癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等有明显的相关性。猪鼻支原体可诱导正常细胞发生恶性转化或诱导肿瘤细胞恶性程度增加，导致这一转化现象发生的机制尚不十分清楚，可能包括诱导遗传不稳定性，如染色体异常、突变率增加；诱导宿主代谢过程的改变；诱导多种肿瘤相关基因的表达改变等。此外猪鼻支原体也是细胞培养中引起培养污染的最常见支原体之一，污染后可导致细胞形态、生长状态、增殖周期等受到影响。

目前报道用于检测猪鼻支原体病原(抗原)或感染后抗体的方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交、免疫组织化学、酶连免疫吸附试验(ELISA)方法。PCR技术用于检测病原，具有特异性强、灵敏度高等特点，因此PCR技术用于猪鼻支原体的检测发展较为迅速，是目前最常用的方法。但PCR技术通常以鼻拭子、支气管肺泡灌洗液或组织为待检样本，其中鼻拭子样本的检出率较低，适合用于群体感染情况的判定，对于个体而言，易出现假阴性的结果；支气管肺泡灌洗液及组织样本的采集通常需要剖杀动物获取，临床上很难操作。原位杂交和免疫组织化学方法用于检测抗原，可以对体内抗原实现组织定位，但同样需要剖杀动物取组织样本才可进行，操作技术要求高、且难以实现量化，临床上很少使用。ELISA方法具有准确、简便、易于推广等优点，可用于抗原或抗体检测，是微生物感染检测的首选方法。有报道利用制备的特异性单抗建立了双抗体夹心ELISA法用于检测猪鼻支原体抗原，但以抗原为检测对象同样面临前述三个方法存在的应用局限；在抗体检测方面，通常可利用全菌蛋白为检测抗原，但由于不同支原体之间存在很多交叉抗原，检测时与宿主中感染的其他支原体产生交叉反应导致假阳性结果。猪群除了猪鼻支原体外，还可能感染另外几种支原体，包括猪肺炎支原体、猪滑液支原体、絮状支原体，其中又以猪肺炎支原体感染严重程度最重，这些支原体的抗体都可能干扰猪鼻支原体抗体的检测和判断，因此必须从猪鼻支原体全蛋白中筛选高特异性的合适蛋白作为检测抗原。近期有文献报道利用猪鼻支原体P37蛋白为包被抗原初步建立ELISA方法检测血清抗体，但实际上通过序列比对可发现P37蛋白与多种其他猪源支原体，尤其是猪肺炎支原体有明显交叉表位，会导致产生严重的假阳性检测结果。故而，建立猪鼻支原体抗体检测ELISA方法的关键在于寻找猪鼻支原体特异性的抗原蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测支原体抗体的组合物，可以特异性的检测猪鼻支原体抗体。

本发明的另一目的是提供所述组合物在检测支原体抗体的试剂盒或金标试纸中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

用于检测支原体抗体的组合物，含有7种多肽，所述各多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。

在本发明中，所述支原体抗体为猪鼻支原体抗体。

由于猪鼻支原体不同菌株vlp家族Ⅲ区重复肽段序列之间存在一定变异，因此，优选的技术方案中，所述7种多肽中的一种或两种以上取代、插入或缺失1-3个氨基酸残基。多肽与载体蛋白进行偶联，得到多肽与载体蛋白的偶联物。

优选的技术方案中，所述7种多肽中的一种或两种以上与载体蛋白进行偶联，以克服长度较短的多肽直接包被酶标板后，受到空间位阻影响表位暴露不好，反应效率不够高的缺点。

优选的技术方案中，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛甲状腺球蛋白(THY)。

本发明还提供所述组合物在制备检测支原体抗体的试剂盒或金标试纸中的应用。在本发明中，所述支原体抗体为猪鼻支原体抗体。

本发明所述多肽可以通过人工化学合成的方式得到，也可以由本领域技术人员知晓的其他生物化学或分子生物学的方法得到。

本发明所述组合物中多肽之间的浓度比不限。优选的技术方案中，所述组合物中各多肽的摩尔浓度相同，即多肽之间的摩尔比为1:1:1:1:1:1:1。

优选的技术方案中，本发明组合物包被酶标板时7种多肽的总浓度为0.1-50μg/ml，每孔加入的体积为100μl。

本发明用于检测支原体抗体的组合物，可以特异性的检测猪鼻支原体抗体，不会与猪常见其他支原体或其他病原感染样品发生交叉反应，假阳性率极低。检测样品易于获得，不会影响猪场正常饲养管理。

附图说明

图1本发明猪鼻支原体抗原肽组合物与四种猪源支原体抗体交叉反应性检测，其中A是以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原的间接ELISA方法检测结果；B是以猪鼻支原体P37蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测结果。

图2本发明猪鼻支原体抗原肽组合物与常见猪病抗体交叉反应性检测。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明进行进一步描述和论证，但是本发明所包括的内容并不局限于此。

实施例1猪鼻支原体抗原肽的制备

1.猪鼻支原体抗原肽的选择

本发明通过对猪鼻支原体全序列进行大量的比对工作，筛选高特异性的合适蛋白作为检测猪鼻支原体抗体的抗原。最终，发现猪鼻支原体表面可变脂蛋白(variable lipoprotein,vlp)家族的部分多肽可以作为抗原肽用于特异性检测猪鼻支原体抗体，不会受到猪肺炎支原体、猪滑液支原体或絮状支原体干扰。vlp家族共包含7个成员，分别为vlpA,vlpB,vlpC,vlpD,vlpE,vlpF,vlpG。vlp成员的基因编码区结构相同，分为三部分：Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区。其中，Ⅲ区编码重复肽段，大约由12-13个氨基酸的肽段串联重复构成，猪鼻支原体各vlp的重复肽段在序列上具有特异性，且重复序列的重复次数容易改变，从而导致vlp产物大小发生变化。由于vlp成员表达的多种组合以及Ⅲ区重复肽段重复次数的改变，使得猪鼻支原体具有多变的表面抗原性，有效躲避宿主的免疫系统，最终达到长期持续感染宿主的状态。

vlp家族蛋白作为猪鼻支原体的表面蛋白，通常具有良好的免疫反应性，适合作为检测抗原。Ⅲ区为vlp蛋白的重要抗原区，通过大量序列比对分析发现，vlp蛋白的Ⅲ区重复肽段序列种属特异性很好，与包括猪肺炎支原体、猪滑液支原体、絮状支原体在内的3种常见猪源支原体，以及其他支原体之间都没有明显的交叉表位，是建立猪鼻支原体抗体特异性检测方法的理想候选抗原。因此，本发明选择7种vlp蛋白的Ⅲ区重复肽段混合物为包被抗原，建立猪鼻支原体抗体检测ELISA方法。

2.7条猪鼻支原体vlp抗原肽的制备

每个vlp抗原肽的重复肽段选取两段重复以保证涵盖所有线性表位，同时兼顾菌株之间可能存在的个别氨基酸变异。申请人共设计了7条猪鼻支原体vlp抗原肽，命名为vlpA抗原肽、vlpB抗原肽、vlpC抗原肽、vlpD抗原肽、vlpE抗原肽、vlpF抗原肽和vlpG抗原肽，如表1所示。为便于偶联载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)，在每条抗原肽的N端添加一个半胱氨酸，分别命名为PepvlpA、PepvlpB、PepvlpC、PepvlpD、PepvlpE、PepvlpF和PepvlpG。PepvlpA、PepvlpB、PepvlpC、PepvlpD、PepvlpE、PepvlpF和PepvlpG(由Synpeptide有限公司合成)合成肽经高效液相色谱纯化，纯度大于85％。

表1 vlp抗原肽名称、序列及对应的各衍生物命名

各vlp抗原肽的具体序列如下：

vlpA抗原肽(SEQ ID NO:1)：KTENTQQSEAPGTKTENTQQSEAPGT；

vlpB抗原肽(SEQ ID NO:2)：GTGSDSQDSGAKGTGSDSQDSGAK；

vlpC抗原肽(SEQ ID NO:3)：EAAPKSPESGSQEATPKSPESGSQ；

vlpD抗原肽(SEQ ID NO:4)：SDSTSTSKEQGSSDSTSTSKEQGS；

vlpE抗原肽(SEQ ID NO:5)：DPKESNPSNPTTSDGQHSNPSNPTTS；

vlpF抗原肽(SEQ ID NO:6)：GSTPTPEQGNNQGGSTPTPEQGNNQG；

vlpG抗原肽(SEQ ID NO:7)：GSTTESSGQADSGSTTESSGQADS。

采用常规方法，将抗原肽PepvlpA、PepvlpB、PepvlpC、PepvlpD、PepvlpE、PepvlpF和PepvlpG分别与载体蛋白KLH偶联，获得抗原肽偶联物KLH-PepvlpA、KLH-PepvlpB、KLH-PepvlpC、KLH-PepvlpD、KLH-PepvlpE、KLH-PepvlpF、KLH-PepvlpG。具体步骤如下：用DMSO溶解双功能试剂3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS，Sigma公司)，获得浓度为10mM的MBS溶液。将4mgKLH溶解于2ml含1mM EDTA的PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)中，加入200μlMBS溶液，于室温下搅拌30min，得到KLH/MBS溶液。取N端添加半胱氨酸后的抗原肽2.5mg溶解于2ml PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)中，然后与KLH/MBS溶液混合，于室温、搅拌状态下进行偶联反应，采用PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)进行透析，得到抗原肽偶联物。

实施例2猪鼻支原体抗原肽组合物的制备

分别配制7种抗原肽偶联物KLH-PepvlpA、KLH-PepvlpB、KLH-PepvlpC、KLH-PepvlpD、KLH-PepvlpE、KLH-PepvlpF、KLH-PepvlpG的水溶液，浓度均为1mg/ml。将上述7种抗原肽偶联物的水溶液混合，得到猪鼻支原体抗原肽组合物。猪鼻支原体抗原肽组合物中各抗原肽偶联物的摩尔浓度相同。

实施例3以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原用间接ELISA方法检测猪鼻支原体血清抗体具体方法

1.本实施例中试剂的配制方法：

PBS缓冲液(浓度为0.01M，pH7.2)：取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水，用盐酸调节pH至7.2，最后加蒸馏水定容至1L。

PBST：在浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液中添加体积百分浓度为0.05％的tween-20。

Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(浓度为0.05M,pH9.6)：取1.59g Na₂CO_3、2.93gNaHCO₃，加蒸馏水溶解，然后定容至1000mL。

酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(或羊抗猪)IgG，武汉博士德生物工程有限公司。

显色液：TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液，上海碧云天生物技术有限公司。

终止液：浓度为2M的H₂SO₄水溶液。

2.间接ELISA方法检测猪鼻支原体血清抗体的具体步骤：

(1)用Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将猪鼻支原体抗原肽组合物(实施例2制备)稀释至7种抗原肽偶联物的总浓度为10μg/ml，每孔加入100μl包被酶标板，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，每次5min；

(2)用含有2％(质量百分浓度)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液封闭酶标板，每孔加入200μl，37℃封闭孵育2h，用PBST洗涤3次，每次5min；

(5)用含1％(质量百分浓度)BSA的PBS缓冲液按稀释度为1:100稀释血清样本。将稀释后的血清样本加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次5min；

(6)用含1％(质量百分浓度)BSA的PBS缓冲液按稀释度为1:8000稀释酶标二抗。每孔加入稀释后的酶标二抗100μl，37℃孵育30min，用PBST洗涤4次，每次5min；

(7)每孔加入100μl显色液，37℃显色10min,然后每孔加入50μl终止液，于酶标仪上以450nm为检测波长、630nm为参比波长测定OD值。

各待检血清样本可根据需要设置1个孔或设置2个复孔，阴性对照血清样本应大于3个样本，设置1个孔或设置2个复孔。阴性对照血清样本是指预先已检测血清中不含有猪鼻支原体抗体且利用本方法检测结果为阴性的动物血清，其来源优选为未免疫的健康动物血清。

(8)结果判定：阳性判定值(cut offvalue)＝阴性对照血清样本孔OD值的平均值+2×阴性对照血清样本孔OD值的标准差。当待检血清样本孔OD值>cutoffvalue，判为阳性，即待检血清样本含猪鼻支原体抗体。当待检血清样本孔OD值<cut offvalue，判为阴性，即待检血清样本不含猪鼻支原体抗体。当待检血清样本设置2个复孔时，待检血清样本孔OD值取两孔OD值的平均值。

实施例4以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原检测猪鼻支原体血清抗体的间接ELISA方法的特异性

采用实施例3中方法，以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原检测各样品，同时采用猪鼻支原体P37蛋白为检测抗原包被酶标板做为对照板考察本发明方法的特异性。采用猪鼻支原体P37蛋白为检测抗原时，以阴性对照血清样本孔OD值的平均值+2×阴性对照血清样本孔OD值的标准差为cut offvalue，当待检血清样本孔OD值>cut offvalue，判为阳性，即待检血清样本含猪鼻支原体抗体；当待检血清样本孔OD值<cut offvalue，判为阴性，即待检血清样本不含猪鼻支原体抗体。

(1)考察本发明猪鼻支原体抗原肽组合物与四种猪源支原体抗体之间的交叉反应性

待检血清样本：猪鼻支原体(HUB－1株)免疫兔血清、猪肺炎支原体(168株)免疫兔血清、猪滑液支原体(M60株)免疫兔血清、絮状支原体(Ms42株)免疫兔血清。该样本由本实验室自制，具体方法如下：将新鲜培养的支原体培养液加入0.1％甲醛灭活，用三倍体积的白油制备油包水乳剂，免疫家兔，每只皮下注射1ml，间隔2周免疫一次，免疫四次后采血。阴性对照血清样本分别采自4只健康阴性兔。待检血清样本、阴性对照血清样本均设置2个复孔。

结果：按照实施例3中方法，以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原的检测方法中，cut offvalue＝0.21，从图1中可以看出，该方法可以成功检测到血清中的猪鼻支原体抗体，与其他三种猪源常见支原体抗体(猪肺炎支原体抗体、猪滑液支原体抗体和絮状支原体抗体)之间无交叉反应。按照实施例3中方法，仅仅将包被抗原改为猪鼻支原体P37蛋白，cut offvalue＝0.08，从图1中可以看出该方法虽然可以成功检测到血清中的猪鼻支原体抗体，但是猪鼻支原体P37蛋白与其他支原体，特别是猪肺炎支原体抗体之间有较高的交叉反应，检测值大大高于cut offvalue，反应呈阳性。

(2)考察本发明猪鼻支原体抗原肽组合物与常见猪病抗体之间的交叉反应性

待检血清样本：临床来源的猪鼻支原体阳性猪血清、猪肺炎支原体阳性猪血清、伪狂犬病阳性猪血清、猪瘟阳性猪血清、猪蓝耳病阳性猪血清、猪圆环病阳性猪血清。阴性对照血清样本采自健康阴性猪。

结果：按照实施例3中方法，以猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原的间接ELISA方法中，cut offvalue＝0.11。据此判断，该方法可成功检测到血清中的猪鼻支原体抗体，且与其他临床常见猪病抗体之间亦无交叉反应，结果如图2所示。

由上述试验结果可见，利用猪鼻支原体抗原肽组合物为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于特异性检测猪鼻支原体抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于检测支原体抗体的组合物及其应用

<130> 20150403

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpA抗原肽

<400> 1

Lys Thr Glu Asn Thr Gln Gln Ser Glu Ala Pro Gly Thr Lys Thr Glu

1 5 10 15

Asn Thr Gln Gln Ser Glu Ala Pro Gly Thr

20 25

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpB抗原肽

<400> 2

Gly Thr Gly Ser Asp Ser Gln Asp Ser Gly Ala Lys Gly Thr Gly Ser

1 5 10 15

Asp Ser Gln Asp Ser Gly Ala Lys

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpC抗原肽

<400> 3

Glu Ala Ala Pro Lys Ser Pro Glu Ser Gly Ser Gln Glu Ala Thr Pro

1 5 10 15

Lys Ser Pro Glu Ser Gly Ser Gln

20

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpD抗原肽

<400> 4

Ser Asp Ser Thr Ser Thr Ser Lys Glu Gln Gly Ser Ser Asp Ser Thr

1 5 10 15

Ser Thr Ser Lys Glu Gln Gly Ser

20

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpE抗原肽

<400> 5

Asp Pro Lys Glu Ser Asn Pro Ser Asn Pro Thr Thr Ser Asp Gly Gln

1 5 10 15

His Ser Asn Pro Ser Asn Pro Thr Thr Ser

20 25

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpF抗原肽

<400> 6

Gly Ser Thr Pro Thr Pro Glu Gln Gly Asn Asn Gln Gly Gly Ser Thr

1 5 10 15

Pro Thr Pro Glu Gln Gly Asn Asn Gln Gly

20 25

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> vlpG抗原肽

<400> 7

Gly Ser Thr Thr Glu Ser Ser Gly Gln Ala Asp Ser Gly Ser Thr Thr

1 5 10 15

Glu Ser Ser Gly Gln Ala Asp Ser

20

Claims

1.用于检测支原体抗体的组合物，含有7种多肽，所述各多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。

2.根据权利要求1所述用于检测支原体抗体的组合物，其特征在于所述支原体抗体为猪鼻支原体抗体。

3.根据权利要求2所述用于检测支原体抗体的组合物，其特征在于所述7种多肽中的一种或两种以上取代、插入或缺失1-3个氨基酸残基。

4.根据权利要求2或3所述用于检测支原体抗体的组合物，其特征在于所述7种多肽中的一种或两种以上与载体蛋白进行偶联。

5.根据权利要求4所述用于检测支原体抗体的组合物，其特征在于所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或牛甲状腺球蛋白。

6.根据权利要求5所述用于检测支原体抗体的组合物，其特征在于所述各多肽的摩尔浓度相同。

7.权利要求1-6之一所述组合物在制备检测支原体抗体的试剂盒或金标试纸中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述支原体抗体为猪鼻支原体抗体。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于所述组合物用于包被酶标板时，7种多肽的总浓度为0.1-50μg/ml，包被体积为100μl/孔。