CN113444157A - 猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物传染病防治技术领域，公开了猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用。所述的外膜蛋白Mhr_0461的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。抗原蛋白Mhr_0461为申请人首次发现的猪鼻支原体功能未知的外膜蛋白，具有较好的免疫原性，Mhr_0461具有极高的特异性，为猪鼻支原体所特有，可作为猪鼻支原体或其抗体检测的分子靶标。同时，外膜基因Mhr_0461是成本较低的基因资源，基于其在大肠杆菌表达系统中的高效表达，易于纯化和制备。与全菌作为包被抗原的诊断方法相比，极大地提高了检测的特异性、显著降低了生产成本。

Description

猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检 测试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用。
背景技术
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)属于原核生物界-软壁菌门-柔膜体纲-支原体目-支原体科-支原体属，是一种无细胞壁、能够进行自我复制的原核微生物。猪鼻支原体最初由Carler和Mckay在1953年从传染性萎缩性鼻炎猪的呼吸道中分离得到，该病原主要通过飞沫和直接接触传播，感染率极高，普遍存在于病猪的鼻腔、气管和支气管分泌物中。猪鼻支原体感染可引起多发性浆膜炎、关节炎、肺炎等症状，常与其他病原混合感染，加大疾病的复杂程度和治疗难度，给养殖业造成巨大的经济损失。
近年来研究发现猪鼻支原体可从人胃癌组织中检测和直接分离得到，进一步发现Mhr的感染与胃癌、肺癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌等多种癌症有明显的相关性，提示Mhr与肿瘤的发生相关，对人类的健康构成了威胁。猪鼻支原体与肿瘤发生的高度相关性引起了人们的广泛关注。然而，猪鼻支原体的研究相对滞后，对其感染、致病以及免疫学状况还知之甚少。目前，国内尚没有猪鼻支原体的诊断试剂盒，无法满足Mhr防控的需求，因此迫切需要甄选出适用于猪鼻支原体特异性诊断的分子靶标，开发出特异、敏感的检测试剂盒。
因此，申请人以猪鼻支原体为研究对象，结合比较基因组学、生物信息学、菌落原位免疫印迹(人工感染的猪鼻支原体阳性血清作为一抗)、Western Blot和iELISA方法，最终筛选到了猪鼻支原体特有的外膜蛋白Mhr_0461，并成功将其作为猪鼻支原体血清学检测的分子靶标，以求获得更特异的成本更低的基因资源。
发明内容
本发明的目的在于提供猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用，所述的猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人以猪鼻支原体基因组为研究对象，使用BLAST和tBLASTn程序，将其基因组上的所有基因比对至其他支原体基因组中，采用双向比对方法获得高得分配对(HSP)组(条件设为：相似度和序列覆盖率>80％，E-value＝1e-4)。随后通过Inparanoid程序和tribeMCL方法对同源基因进行聚类分析，筛选到71个猪鼻支原体特有基因，并利用TMHMM Serverv.2.0和菌落原位免疫印迹方法(人工感染制备的猪鼻支原体阳性血清作为一抗)对特有基因的跨膜特性和免疫原性进行初步筛选，并用Western Blot和iELISA进一步评估猪鼻支原体特有候选基因的免疫原性和交叉反应性，最终筛选到了猪鼻支原体特有的外膜基因Mhr_0461，该基因与其余支原体中基因均不具有同源性，是适用于猪鼻支原体检测的特异性分子靶标，该基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
经检测，所述的蛋白具备免疫原性和特异性，原核表达时，蛋白表达效率高，可用于制备猪鼻支原体抗体的检测试剂盒；本发明的Mhr_0461蛋白还可作为抗原制备单抗或者多抗，用于猪鼻支原体的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、抗原蛋白Mhr_0461为申请人首次发现的猪鼻支原体外膜蛋白，为具有免疫原性蛋白。
2、本发明的抗原蛋白Mhr_0461具有极高的特异性，为猪鼻支原体所特有，可作为猪鼻支原体或其抗体检测的分子靶标。
3、外膜基因Mhr_0461是成本较低的基因资源，基于其在大肠杆菌表达系统中的高效表达，易于纯化和制备。与全菌作为包被抗原的诊断方法相比，极大地提高了检测的特异性、显著降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明中重组质粒pET30a-Mhr_0461的物理图谱。
图2是本发明中的重组质粒pET30a-Mhr_0461的原核表达的胶图；
其中：M：蛋白分子量；1：pET30a-Mhr_0461(BL21)未诱导；2：pET-30a(+)(BL21)37℃IPTG诱导5h；3：pET30a-Mhr_0461(BL21)37℃IPTG诱导5h。
图3是本发明中pET30a-Mhr_0461表达的重组蛋白的表达形式检测结果；
其中：M：蛋白分子量；1：包涵体；2：上清。
图4是本发明中pET30a-Mhr_0461表达的重组蛋白纯化后的胶图；
其中：M：蛋白分子量；1：pET30a-Mhr_0461重组蛋白的纯化。
图5是本发明中猪鼻支原体rMhp_0461蛋白与猪鼻支原体感染后猪阳性血清以及猪阴性血清反应的Western blotting图。
图6是本发明中猪鼻支原体Mhp_0461多抗与猪鼻支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、绵羊支原体反应的ELISA图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为本领域的常规方案。所述试剂或材料，如未特别说明均来源于商业渠道。
本发明涉及到的Mhr_0461蛋白，可用本领域的常规方式，例如原核表达，商业合成等方式得到。本发明以原核表达Mhr_0461蛋白为例，对其制备为猪鼻支原体抗体检测试剂盒的效果进行说明，其他方式获得的该蛋白也能行使相同的功能。本发明的Mhr_0461蛋白还可作为抗原制备单抗或者多抗，用于猪鼻支原体的检测。
实施例1：
猪鼻支原体特有基因的筛选
1、支原体全基因组序列信息
本研究所涉及的支原体基因组序列均下载自GeneBank，具体的支原体菌株信息如(表1)所示。
表1本申请中所使用的支原体菌株信息
Figure BDA0003129298620000031
Figure BDA0003129298620000041
2、猪鼻支原体特有基因分析
以猪鼻支原体基因组为研究对象，使用BLAST和tBLASTn程序，将其基因组上的所有基因比对至其他支原体基因组中，获得高得分配对(HSP)组。为获得更加准确的数据，我们提取了相似度和序列覆盖率均大于80％的HSP(E-value＝1e-4)，并采取双向比对进一步确定HSP。同源基因的分析是一个十分复杂的过程，存在着许多种不同的算法和数据库，早期主要是根据已有的生物学注释信息进行同源基因归类，随后发展出了双聚类算法(王镠璞，2006)、基于全局的Globally Optimized Strategy算法(朱晓然，2011)、Markov聚类方法、MSOAR OrthoSelect基因重排、QuartetS算法等多种算法以及clusters oforthologous groups、eggNOG、orthologous matrix、RoundUp、OrthoDB、BLASTO、Proteinortho等多个同源基因的数据库(杨婧，2013)。各种算法和数据库都有着各自的优点，不同的信息比对人员，最终得到的同源基因分组结果往往是不同的，有着各自的侧重点。本申请设计的HSP方法以固有核酸序列为依据，不依赖基因组原有注释，更加客观，并且可以矫正原有基因组中的错误注释以及编码区的起点和终点。未注释的基因也能通过程序筛出并重新定义，防止同源基因的错漏。最终利用Inparanoid程序和tribe MCL方法对同源基因进行聚类分析。在3669组同源基因群中，有71个基因为猪鼻支原体所特有。
3、猪鼻支原体特有基因的免疫学初筛
外膜蛋白常与病原体的黏附、致病和免疫反应相关，且常常展示与病原的膜外部，是寻找特异性诊断和疫苗分子靶标的重点对象。我们利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)程序对71个猪鼻支原体特有基因进行跨膜区分析，其中9个基因存在1个跨膜区域，并且跨膜区域位于基因的N端，提示这9个基因的C端大部分氨基酸可能展示在病原体的膜外侧。随后我们采用菌落原位免疫印迹方法(人工感染制备的猪鼻支原体阳性血清作为一抗)对这9个基因的免疫原性进行了评估，最终甄选了功能未知且免疫原性良好的外膜蛋白Mhr_0461(SEQ ID NO.2所示)为潜在的分子靶标，并对其在猪鼻支原体诊断中的应用进行了研究。
实施例2：
Mhr_0461蛋白的原核表达和纯化：
A.pET30a-Mhr_0461融合基因的构建
1、Mhr_0461基因的合成
以猪鼻支原体HUB-1株基因组(Liu W,FangLR,LiS,et al.Complete genomesequence of Mycoplasma hyorhinis Strain HUB-1.Journal ofBacteriology.Nov.2010,p.5844–5845)中Mhr_0461(GenBank登录号ADM21918.1)为模板，缺失其跨膜区域，并根据大肠杆菌的密码子偏爱性将1处UGA密码子调整为UGG，得到人工合成的猪鼻支原体外膜基因Mhr_0461(SEQ ID NO.1所示)。
2、pET30a-Mhr_0461重组质粒的构建
将人工合成的Mhr_0461基因通过BamHI和Xho I克隆到原核表达载体pET-32a(+)(Novagen，德国)的相应位点(BamHI和Xho I)，获得表达Mhr_0461基因的重组质粒pET30a-Mhr_0461，经酶切与PCR鉴定证实质粒构建正确，测序证实无碱基误配。重组质粒的结构图如图1所示。
B.重组质粒pET30a-Mhr_0461的原核表达
1、质粒的转化
将含有猪鼻支原体Mhr_0461基因的表达质粒pET30a-Mhr_0461(卡那抗性)转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
具体操作如下：
1)取100μL大肠杆菌BL21感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入3μL连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。
2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。
3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
4)每管加400μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。
5)取100μL转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。
6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。
2、原核表达
挑取单菌落扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取其质粒进行酶切鉴定并保存菌液。鉴定正确后，将保存的菌液按照1：1000的体积比进行复苏。次日，按照1：100的体积比进行诱导。在终浓度为0.8mM IPTG、37℃和180r/min的条件下进行诱导。分别在诱导前和诱导后5h取样1mL，并以转化pET-30a载体的E.coli BL21(DE3)的细菌诱导产物作为空白对照。12000r/min离心1min后，加入100μL ddH2O重悬菌液后，加入25μL 5×Loading Buffer，在100℃的沸水中煮沸10min，冰浴10min后，通过12％SDS-PAGE进行样品分析，确定重组的原核蛋白是否表达。
在确定原核重组蛋白可以稳定表达后，再次诱导100mL重组菌，通过高压破碎仪破碎后，12000r/min离心10min，将上清和沉淀分别煮样，进行12％SDS-PAGE检测，确定重组蛋白的表达形式，pET30a-Mhr_0461以可溶性形式表达在上清中。试验结果如图2所示。
C.pET30a-Mhr_0461融合蛋白的纯化
以可溶性形式表达的pET30a-Mhr_0461融合蛋白用AKTA FPLC(AmershamBiosciences UPC-900)进行纯化，纯化步骤如下：
(1)将诱导5h后的菌液200mL，12000r/min离心1min，弃掉上清，将沉淀用BindingBuffer(1/10)重悬，置于-80℃冰箱，反复冻融三次后，用超高压波破碎仪将其破碎至清亮，12000r/min离心30min，取上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，置于冰上备用。
(2)打开分析仪，再打开电脑，选择UNICORNS.1.0，选default，点击OK。
(3)选择System control，将A，B两个探头放入20％无水乙醇中，依次打开：Manual→Pump→Pump Wash→A：ON，B：ON→Execute；Flow→Flow Rate 1.0mL/min，开始吸泵，直到系统自动清洗结束后为止。
(4)在无水乙醇流动的状态下，将蛋白纯化柱装入指定位置，继续流动无水乙醇清洗纯化柱，约30mL。
(5)Pause→蒸馏水清洗清洗探头(A，B泵)后，将A泵放入Binding Buffer中，B泵放入Elution Buffer中→Continue。Gradient 0.0％不需要调节。
(6)约60mL以后，待红、蓝线平行后，Pause，清洗A泵，放入样品中，Continue，0.5mL/min，上样完成后，Pause，清洗A泵，放入Binding Buffer中，Continue，直到红线下降到最低为止，再流10mL，开始洗脱，Flow rate1.0mL/min。
(7)从10％开始，可使用不同的洗脱浓度进行洗脱，每更换一次不同的洗脱浓度，必须是红、蓝线保持平行时才能更换，最终为100％，每个洗脱浓度的峰值处全部收集样品。
(8)Pause，清洗A，B泵，都放入无水乙醇中，Continue，直到红、蓝线均降至最低切平行为止,End。拆下纯化柱，关闭所有操作窗口，关掉分析仪和计算机。
(9)利用分光光度计测定纯化蛋白的浓度，并通过SDS-PAGE检测其纯度，保存于-80℃备用。试验结果如图3所示。纯化后的蛋白浓度为3.39mg/mL，这里原核表达的Mhr_0461蛋白带有6×His标签，命名为重组蛋白rMhr_0461。
实施例3：
猪鼻支原体Mhr_0461抗原反应性验证
纯化的rMhr_0461蛋白，加入5×Loading Buffer，在100℃的沸水中煮沸10min，冰浴10min后，进行12％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，使用硝酸纤维素膜转印蛋白，转膜完毕后使用5％脱脂牛奶，4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，每次5分钟，然后与人工感染的猪鼻支原体阳性血清孵育1小时(阳性血清用TBST按照1:1000体积比稀释)，同时设立阴性血清对照组。TBST洗膜三次，每次5分钟，然后与HRP标记的羊抗猪酶标二抗孵育1小时(体积比1:3000)。孵育完成后，用TBST洗膜五次，每次5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。
试验结果表明：rMhr_0461蛋白可以与人工感染猪鼻支原体的猪阳性血清反应，而不与阴性血清反应，证明rMhr_0461蛋白与猪鼻支原体感染阳性血清具有良好的反应原性。
实施例4：
猪鼻支原体Mhr_0461蛋白在诊断猪鼻支原体野毒株自然感染中的应用
1、ELISA方法的操作流程
(1)抗原包被：用包被液(Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加ddH20至1000mL)将rMhr_0461蛋白稀释至4μg/mL，将稀释后的rMhr_0461蛋白按每孔100μl加入96孔酶标板，4℃包被过夜。弃去板孔中的液体，每孔加200μl PBST(PBS：NaCl 8.0g，KC1 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4 0.2g，加ddH2O至1000ml；PBST：加入0.05％比例的Tween-20到PBS中)，洗涤5次，每次静置2分钟后甩掉孔内液体。在最后一次甩干后，在吸水材料上拍干，去掉剩余的液体。
(2)封闭：每孔加入100μL 5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶加PBST至100ml)，置于37℃温箱中封闭1h，弃去板孔中的液体，加入200μL PBST，洗涤5次，每次静置2分钟后甩掉孔内液体。在最后一次甩干后，在吸水材料上拍干，去掉剩余的液体。
(3)加样：用PBST按1：40(V/V)比例稀释待检血清和对照血清，每孔加100μL稀释后的样本，37℃孵育1h，弃去板孔中的液体，加入200μL PBST，洗涤5次，每次静置2分钟后甩掉孔内液体。在最后一次甩干后，在吸水材料上拍干，去掉剩余的液体。
(4)加酶标二抗：用PBST按1:5000(V/V)的比例稀释HRP标记的羊抗猪酶标二抗(购自ProteinTech公司)，每孔加入100μL稀释后的二抗，置于37℃温箱培养60分钟。弃去板孔中的液体，加入200μL PBST，洗涤5次，每次静置2分钟后甩掉孔内液体。在最后一次甩干后，在吸水材料上拍干，去掉剩余的液体。
(5)加底物显色：每孔加入TMB底物显色液A液和TMB底物显色液B液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)各50μL，避光显色10min，随后每孔加50uL终止液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD630值。样品S/P值由公式(样品OD630值－阴性对照OD630值)/(阳性对照OD630值－阴性对照OD630值)计算获得。
阴阳性临界值通过公式(X)+3(SD)确定，其中X为阴性血清的平均值，SD为标准偏差。样品S/P值≥(X)+3(SD)，则样品判定为阳性；当样品S/P值<(X)+3(SD)，则样品判定为阴性。结果判定标准为：血清样品S/P值≥0.52判定为阳性，血清样品S/P值<0.52判定为阴性。
2、基于rMhr_0461抗原蛋白的猪鼻支原体诊断试剂盒的组装
本发明的试剂盒包括猪鼻支原体rMhr_0461抗原包被板2块(96孔/块，400ng/孔)，猪鼻支原体抗体ELISA阴性、阳性对照各1管(0.5mL/管)，样品稀释液1瓶(40mL/瓶)，羊抗猪酶标记二抗(IgG，HRP)(购自ProteinTech公司)1管(200μL/管)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30ml/瓶)，TMB底物显色液A液，TMB底物显色液B液各1瓶(10mL/瓶；购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)，终止液1瓶(10mL/瓶，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)。
(1)20倍浓缩洗涤液的配制：NaCl 160g、KC1 4g、Na2HPO4·12H2O 58g、KH2PO4 4g，Tween-20 10mL定容至1000mL纯化水中，调至pH值至7.4。
(2)羊抗猪(IgG，HRP)酶标二抗(购自ProteinTech公司)的配制：用保护剂(含1％BSA的PBST溶液)1:5000倍稀释。
(3)封闭液：含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液。
(4)样品稀释液：含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。
(5)TMB底物显色液：包括TMB底物显色液A液：Na2HP04·12H2O 14.6g，柠檬酸9.33g，30％双氧水2mL，加纯化水800mL，调至pH值5.0-5.4，最后定容至1000mL；TMB底物显色液B液：TMB0.02g，无水乙醇10mL，加纯化水至1000mL。
(6)终止液：10mL的去离子水中加入25uL氢氟酸。
3、基于rMhr_0461抗原蛋白的猪鼻支原体诊断试剂盒的应用
使用rMhr_0461-iELISA方法对临床上猪常见病原的阳性血清样品进行了检测，包括猪鼻支原体、猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌(4型、5型、6型、10型)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒等阳性血清，结果表明，除猪鼻支原体阳性血清(人工感染、临床阳性)以外，其余样品均为阴性，确定rMhr_0461与其他病原体的阳性血清无交叉反应性，rMhr_0461-iELISA方法具有良好的特异性。结果见表2。
表2 rMhr_0461-iELISA特异性试验
阳性血清 S/P
猪鼻支原体(人工感染) 1.00
猪鼻支原体临床阳性样品1 1.86
猪鼻支原体临床阳性样品2 2.23
猪肺炎支原体 0.29
猪絮状支原体 0.25
猪胸膜肺炎放线杆菌4型 0.15
猪胸膜肺炎放线杆菌5型 0.28
猪胸膜肺炎放线杆菌6型 0.19
猪胸膜肺炎放线杆菌10型 0.38
猪繁殖与呼吸道综合征病毒 0.10
猪伪狂犬病毒 0.25
猪瘟病毒 0.29
口蹄疫病毒 0.07
猪流行性腹泻病毒 0.31
实施例5：
猪鼻支原体Mhr_0461兔多克隆抗体的制备及效价测定
以纯化的rMhr_0461蛋白免疫新西兰大白兔，共免疫5次，每周免疫1次，每次免疫蛋白量为1mg。免疫前于兔耳缘静脉取2mL血作为阴性对照血清。首免将纯化蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，以皮下多点注射的方式免疫。第2、3、4、5次免疫，采用弗氏不完全佐剂制备的免疫原以同样的注射方式进行免疫，每只兔免疫蛋白含量为1mg。最后一次免疫10d后心脏采血。血样4℃放置过夜，8000r/min离心10min所得上清即为多抗血清。
采用间接ELISA法测定抗血清的效价。以免疫前健康兔血清作为阴性对照。将纯化的rMhr_0461蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释后包被酶标板，4℃反应过夜。用0.01mol/LPBST溶液洗涤3次，每次5min，加入封闭液(含3％脱脂奶粉的PBST溶液)，37℃封闭1h，同上洗涤后加入用PBST连续倍比稀释(100×21～100×214)的rMhr_0461多克隆抗体和阴性血清，每个梯度设置3个重复，37℃孵育1.5h，同上洗涤后加入HRP标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1.5h，同上洗涤后加入显色液，37℃显色20min，加入100μL终止反应。通过酶标仪检测OD630值，每个梯度取平均值进行比较，若阳性与阴性的比值大于2.0，则视为阳性，否则为阴性。结果显示，抗体稀释100×212倍时OD阳性/OD阴性＞2.0，说明该抗体效价约为1﹕409 600。
实施例6：
猪鼻支原体Mhr_0461多抗在猪鼻支原体检测中的应用
具体操作如下：
(1)使用KM2培养基分别进行猪鼻支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、绵羊支原体的体外培养，待培养物PH值从7.6达到6.8时，12000rpm离心30min收获菌体。
(2)随后分别对PBST重悬的不同菌体进行超声破碎，获得猪鼻支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、绵羊支原体的全菌蛋白。
(3)将猪鼻支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、绵羊支原体的全菌蛋白分别用包被液稀释至4μg/mL后，加入酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；
(4)PBST洗涤3次，2min/次，拍干。用含5％(W/V)脱脂奶粉的PBST封闭，200μL/孔，37℃1h；
(5)同上洗涤后，加入按1：2000比例稀释好的Mhr_0461多抗兔血清，100μL/孔，37℃1h。
(6)再次洗涤后，加入按比例1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体，100μL/孔，37℃1h；
(7)洗涤后，加入底物液A和B，各50μL/孔,避光显色10-15min；
(8)加入终止液；
(9)在630nm波长下，用酶标仪读取其吸光值(OD 630nm值)。
试验结果表明：Mhr_0461多抗可以与猪鼻支原体反应，而不与猪肺炎支原体、牛支原体、绵羊支原体反应，证明Mhr_0461多抗与猪鼻支原体的反应原性具有特异性(图6)。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctaaaa ctaatgtgtt acaaacttct tcaaatattg aagtaaataa agaaattaaa 60
ttttcaatca caaaaacagt ttcagattta aaagattttt tatccagaac agatgaatcg 120
gatacagata aaacaagcga aaatgaagat agtaaaaaaa taaatttagc agatattcct 180
gatttaattg acaaacaaat ttattttgca cttacaaacg ataaacaagg tcttgaagat 240
aaagaaaaag ttgaagagta taaaagaaaa aatcctaaag ttttttctat tttgggagat 300
tttttataca taatcaaaga tccacaaagt cttgatgaat ttgtacaatg gaattcttta 360
gttgataaaa attatcaaca aatgttatct tcttataaac aaaatccaga ttttttcatt 420
gagaataatt taattgttta tcgtggtttt cttcttcctt caacttcctc tcttgcaaca 480
caagtagatg ttaatatttt taaaattgat tatgatcaga aattaaataa attagatttt 540
tacttacttg ctccatttga ttttggtcaa gcaagtgctt attccaatgc aaagtcaata 600
tcccaaaaag tattcatttt tcaagtaaaa aagaataatt tattgaataa taaaacaaaa 660
gttagtgaga aaatttttca acaatag 687
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Lys Thr Asn Val Leu Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Val Asn
1 5 10 15
Lys Glu Ile Lys Phe Ser Ile Thr Lys Thr Val Ser Asp Leu Lys Asp
20 25 30
Phe Leu Ser Arg Thr Asp Glu Ser Asp Thr Asp Lys Thr Ser Glu Asn
35 40 45
Glu Asp Ser Lys Lys Ile Asn Leu Ala Asp Ile Pro Asp Leu Ile Asp
50 55 60
Lys Gln Ile Tyr Phe Ala Leu Thr Asn Asp Lys Gln Gly Leu Glu Asp
65 70 75 80
Lys Glu Lys Val Glu Glu Tyr Lys Arg Lys Asn Pro Lys Val Phe Ser
85 90 95
Ile Leu Gly Asp Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Asp Pro Gln Ser Leu Asp
100 105 110
Glu Phe Val Gln Trp Asn Ser Leu Val Asp Lys Asn Tyr Gln Gln Met
115 120 125
Leu Ser Ser Tyr Lys Gln Asn Pro Asp Phe Phe Ile Glu Asn Asn Leu
130 135 140
Ile Val Tyr Arg Gly Phe Leu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Leu Ala Thr
145 150 155 160
Gln Val Asp Val Asn Ile Phe Lys Ile Asp Tyr Asp Gln Lys Leu Asn
165 170 175
Lys Leu Asp Phe Tyr Leu Leu Ala Pro Phe Asp Phe Gly Gln Ala Ser
180 185 190
Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Ser Ile Ser Gln Lys Val Phe Ile Phe Gln
195 200 205
Val Lys Lys Asn Asn Leu Leu Asn Asn Lys Thr Lys Val Ser Glu Lys
210 215 220
Ile Phe Gln Gln
225

Claims (2)

1.猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用，所述的猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用。
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