CN103308624A - 冬虫夏草的hplc特征图谱及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草、蛹虫草的HPLC特征图谱，所述HPLC特征图谱是将冬虫夏草或蛹虫草通过高效液相色谱分析而得。所述冬虫夏草或蛹虫草的HPLC特征图谱能全面表征冬虫夏草的成分特征，可用于冬虫夏草及其制品的质量控制，以确保虫草药材及其制品的质量稳定、均一。本发明还公开了所述冬虫夏草HPLC特征图谱的建立方法和应用。

Description

冬虫夏草的HPLC特征图谱及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及中药检测领域，特别涉及冬虫夏草的HPLC特征图谱，其建立方法以及所述HPLC特征图谱在冬虫夏草药材及其制品检测中的应用。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾(Hepialusarmori canusoberthur)越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，为我国特有珍稀名贵中药材。该药具有益精髓，补虚损，保肺，益肾，止血，化痰等功效，主要用于久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛等症。现代药理和临床研究结果表明，冬虫夏草具有镇强心、降血脂、降低胆固醇、调节机体免疫功能、抗肿瘤等多种药理活性，对高血压、冠心病、慢性肝炎、慢性肾炎、支气管炎以及食道癌、肝癌、自身免疫性疾病等均有较好疗效。

由于冬虫夏草的稀缺性，冬虫夏草价格昂贵，以假乱真的现象屡见不鲜，尤其是以冬虫夏草为原料的制品，无法监控是否是使用了冬虫夏草投料，或者是使用了替代品(蛹虫草等)投料。

冬虫夏草收载于中国药典2010年版一部，主要通过性状鉴别、检测腺苷的含量来控制质量，而腺苷并不是冬虫夏草的特有成份，对其成分的检测并不能真正反映药材的质量。因此，目前存在对于能够全面表征冬虫夏草的成分特征的HPLC特征图谱的需求，冬虫夏草制品的质量控制方法和质量控制标准有待于进一步完善。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种冬虫夏草的HPLC特征图谱。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测含冬虫夏草的药物制剂的方法。

本发明的再一个目的是提供上述冬虫夏草HPLC特征图谱在冬虫夏草及其制品的鉴定、检测中的应用。

本发明的还一个目的是提供上述HPLC特征图谱的建立方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供了一种冬虫夏草的HPLC特征图谱，其中，所述HPLC特征图谱包括5个特征峰，以5号峰腺苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对标准偏差为：

1号峰：相对保留时间0.12±0.0012，相对标准偏差为0.14%；

2号峰：相对保留时间0.36±0.0036，相对标准偏差为0.28%；

3号峰：相对保留时间0.61±0.0061，相对标准偏差为0.34%；

4号峰：相对保留时间0.63±0.0063，相对标准偏差为0.22%；

5号峰：相对保留时间1.00，相对标准偏差为0.17%。

另一方面，本发明提供一种用于检测含冬虫夏草的药物制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

1）使用HPLC法得到待检测药物制剂的HPLC特征图谱；并使用腺苷峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2）将步骤1）得到的相对保留时间与上述冬虫夏草HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；

3）将步骤1）得到的相对保留时间与蛹虫草HPLC特征图谱的特征峰相对保留时间比较；优选地，所述蛹虫草HPLC特征图谱包括6个特征峰，以峰d所代表的腺苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对标准偏差为：

峰a：相对保留时间0.11±0.0011，相对标准偏差为0.11%;

峰b：相对保留时间0.36±0.0036，相对标准偏差为0.28%；

峰c：相对保留时间0.63±0.0063，相对标准偏差为0.22%;

峰d：相对保留时间1.00，相对标准偏差为0.17%;

峰e：相对保留时间1.14±0.0114，相对标准偏差为0.06%；

峰f：相对保留时间1.26±0.0126，相对标准偏差为0.01%；

4）根据步骤2）和步骤3）的比较结果判断所述冬虫夏草的药物制剂中是否含有冬虫夏草，使用蛹虫草代替冬虫夏草或者为冬虫夏草与蛹虫草的混合物。

另一方面，本发明提供了上述冬虫夏草HPLC特征图谱或蛹虫草HPLC特征图谱的建立方法，该方法包括以下步骤：

（1）制备冬虫夏草溶液或蛹虫草溶液，以及腺苷对照品溶液；

（2）将步骤（1）所得冬虫夏草溶液或蛹虫草溶液，以及腺苷对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到冬虫夏草或蛹虫草，以及腺苷的HPLC特征图谱；

（3）通过比较不同冬虫夏草的HPLC特征图谱确定冬虫夏草的共有特征峰，或通过比较不同蛹虫草的HPLC特征图谱确定蛹虫草的共有特征峰。

优选地，步骤（1）中所述制备冬虫夏草或蛹虫草溶液的方法包括如下步骤：精密称取冬虫夏草或蛹虫草，精密加入水加热回流，取上清液，用微孔滤膜滤过即得；所述制备腺苷对照品溶液的方法包括如下步骤：精密称取腺苷对照品，加入甲醇溶解定容，取续滤液即得。

优选地，步骤（2）中所述高效液相色谱分析的条件包括：采用反相填料色谱柱；检测波长为200～400nm，流速0.1～5ml/min，柱温0～60℃，进样量1～100μl，流动相为甲醇-水梯度洗脱液。

更优选地，步骤（2）中所述高效液相色谱分析的条件包括：采用岛津WondaSil C185μm×250mm×4.6mm色谱柱；检测波长为260nm，流速1.0ml/min，柱温35℃，分析时间45min，进样量10μl，流动相为甲醇-水梯度洗脱液。

优选地，所述步骤（2）中采用甲醇-水梯度洗脱液进行洗脱，洗脱条件包括：0～5min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持2%，5～30min的洗脱液中甲醇体积百分含量为2%～15%，30～35min的洗脱液中甲醇体积百分含量为15%～95%，35～40min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持95%，40～41min的洗脱液中甲醇体积百分含量为95%～2%，41～45min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持2%。

优选地，步骤（3）所述冬虫夏草或蛹虫草的共有特征峰的确定方法为，采用药典委员会规定的HPLC指纹图谱计算软件A版，通过比较不同冬虫夏草的HPLC特征图谱从而确定冬虫夏草的共有特征峰，或通过比较不同蛹虫草的HPLC指纹图谱从而确定蛹虫草的共有特征峰。

进一步优选地，步骤（3）还包括将步骤（2）所得腺苷色谱峰在冬虫夏草的HPLC特征图谱中所对应的色谱峰为参照峰，计算冬虫夏草的各特征峰的相对保留时间和相对标准差；或者，将步骤（2）所得腺苷色谱峰在蛹虫草的HPLC特征图谱中所对应的色谱峰作为参照峰，计算蛹虫草的各特征峰的相对保留时间和相对标准差。

另一方面，本发明还提供了上述冬虫夏草HPLC特征图谱和或蛹虫草HPLC特征图谱在冬虫夏草以及含冬虫夏草的药物制剂的检测中的应用。

再一方面，本发明提供了一种冬虫夏草的检测方法，包括将待测冬虫夏草的HPLC特征图谱与上述冬虫夏草的HPLC特征图谱进行比较。

本发明通过全面、系统的研究，依据国家药品监督管理局颁布的《中药注射剂HPLC指纹图谱研究的技术要求（暂行）》和国家药典委员会印发的《中药注射剂HPLC指纹图谱实验研究技术指南（试行）》，对不同批次的冬虫夏草和蛹虫草进行了液相特征测定，建立的HPLC特征图谱具有稳定、重现性好的特点，该研究有助于冬虫夏草及其制品的质量控制，同时可将冬虫夏草HPLC特征图谱与腺苷、虫草素等含量测定结合起来全面控制冬虫夏草及其制品的质量奠定坚实的基础。此外，该HPLC特征图谱的建立方法可操作性强，重现性好，为更好地控制冬虫夏草及其制品的质量提供了科学依据。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为腺苷对照品的HPLC特征图谱。

图2为10批冬虫夏草HPLC色谱分离叠加图，其中从下到上依次为第1至第10批。

图3为7批蛹虫草HPLC色谱分离叠加图，其中从下到上依次为第1至第7批。

图4为冬虫夏草HPLC特征图谱的标准图谱，其中5号峰为腺苷。

图5为蛹虫草HPLC特征图谱的标准图谱，其中d号峰为腺苷。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：冬虫夏草或蛹虫草HPLC特征图谱的高效液相色谱法的建立

1.1仪器与试剂：

Agilent1100型高效液相色谱仪，含在线真空脱气机、四元梯度泵、柱温箱、DAD检测器；

甲醇为色谱纯，水为超纯水；

10批冬虫夏草均来自于康美药业，批号分别为

130152041（产地：青海，规格：统装4000条）、

121252631（产地：青海，规格：统装4000条）、

130151401（产地：青海，规格：20g盒装4000条）、

121050461（产地：青海，规格：统装3400条）、

121250411（产地：青海，规格：统装）、

130150901（产地：青海，规格：统装4000条）、

130152121（产地：青海，规格：20g选装3400条）、

130152111（产地：青海，规格：统装4000条）、

121150591（产地：青海，规格：20g选装3400条）、

130151351（产地：青海，规格：统装4000条），

经康美药业QA鉴定为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanusoberthur)越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体；

7批蛹虫草均来自于康美药业，批号分别为

120851071（产地：广东，规格：统装）、

121050681（产地：广东，规格：统装）、

121051011（产地：广东，规格：统装）、

121251361（产地：广东，规格：50g）、

130151201（产地：广东，规格：100g）、

130150611（产地：广东，规格：250g）、

121151181（产地：广东，规格：1kg），

经康美药业QA鉴定为蛹虫草；

对照品：腺苷（879-200001、中国药品生物制品检定所）；

色谱柱为岛津WondaSil C185μm×250mm×4.6mm色谱柱；

微孔滤膜为津腾0.45μm的微孔滤膜，购自天津市津腾实验设备有限公司。

1.2分析方法：

色谱分析条件包括：采用岛津WondaSil C185μm×250mm×4.6mm色谱柱；检测波长260nm，流速l.0ml／min，柱温35℃，分析时间45min，进样量10μl，流动相为甲醇-水梯度洗脱，梯度洗脱：0～5min甲醇比例保持2%，5～30min为2%～15%，30～35min为15%～95%，35～40min保持95%，40～41min为95%～2%，41～45min保持2%。

用于高效液相色谱分析的冬虫夏草或蛹虫草溶液的制备：

取冬虫夏草或蛹虫草粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，称重，加热回流30min，放置至室温，再次称重，用水补足减失的重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品2mg，置10ml容量品中，加90%甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，取续滤液即得。

HPLC结果：取冬虫夏草、蛹虫草滤液和对照品溶液各10μl，按上述色谱条件分析，得到各样品的HPLC特征；对照品腺苷的HPLC结果见图1；10批冬虫夏草的HPLC叠加图见图2；7批蛹虫草的HPLC叠加图见图3。

对比图1、图2、图3可得冬虫夏草和蛹虫草HPLC特征图谱中的腺苷峰位置，分别为图2中的峰（5）以及图3中的峰（d）。

实施例2：用于建立冬虫夏草HPLC特征图谱的高效液相色谱法的方法学考 察

对实施例1中建立的冬虫夏草HPLC特征图谱的高效液相色谱法进行了以下几个方面的考察。

2.1重现性试验：

取冬虫夏草（批号130151401），按实施例1中供试品的制备方法制备样品6份，依次测定，考察参比色谱峰的保留时间、峰面积的一致性。计算保留时间、峰面积RSD值均小于3.0%，结果表明该方法具有良好的重现性。

2.2精密度试验：

取同一份供试品溶液（批号130151401），连续进样6次，考察参比色谱峰的保留时间、峰面积比值的一致性。计算保留时间和面积RSD值均小于3.0%，结果表明仪器精密度符合要求。

2.3稳定性试验：

取同一供试品溶液（批号130151401），在0小时、5小时、10小时、15小时、25小时、43小时内连续进样6次，记录参比色谱峰的保留时间和面积，通过计算保留时间和面积RSD均小于3.0%，结果表明常温下供试品溶液在24小时内保持稳定。

实施例3：冬虫夏草HPLC特征图谱的建立

将10批冬虫夏草供试品按照实施例1所述方法对样品进行处理、进样，通过药典委员会提供的HPLC指纹图谱计算软件A版，得到260nm下的共有模式色谱图，即冬虫夏草的HPLC特征图谱，见图4。选择5号峰(腺苷峰)为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间（各个色谱峰的保留时间与参照峰的保留时间的比值）及相对保留时间的相对标准偏差，其结果见表1。

表1冬虫夏草特征峰相对保留时间

峰号	相对保留时间	RSD%
			1	0.12	0.14%
2	0.36	0.28%
			3	0.61	0.34%
4	0.63	0.22%
			5（s）	1	0.17%

冬虫夏草供试品HPLC特征图谱中呈现5个特征峰，其中5号特征峰的保留时间与参照物腺苷保留时间相同，计为S峰，计算特征峰1～4的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±1%以内，规定值为：0.12(峰1)、0.36(峰2)、0.61(峰3)、0.63(峰4)。

实施例4：蛹虫草HPLC指纹图谱中的特征峰分析

将7批蛹虫草供试品按照实施例1所述方法对样品进行处理、进样，通过药典委员会提供的HPLC指纹图谱计算软件A版，得到260nm下的共有模式色谱图，即蛹虫草的HPLC特征图谱，见图5。选择d号峰(腺苷峰)为参照峰。计算各特征峰的相对保留时间（计算公式同实施例3）及相对保留时间的相对标准偏差，其结果见表2。

表2蛹虫草特征峰相对保留时间

峰号	相对保留时间	RSD%
			a	0.11	0.11%

b	0.36	0.28%
			c	0.63	0.22%
d(s)	1	0.17%
			e	1.14	0.06%
f	1.26	0.01%

蛹虫草供试品HPLC特征图谱中呈现6个特征峰，其中特征峰（d）的保留时间与参照物腺苷保留时间相同，计为S峰，计算特征峰a、b、c、e、f的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±1%以内，规定值为：0.11(峰a)、0.36(峰b)、0.63(峰c)、1.14(峰e)、1.26(峰f)。

实施例5：使用本发明所述冬虫夏草HPLC特征图谱和蛹虫草HPLC特征 图谱对虫草投料进行检测

将已知其成分的冬虫夏草、蛹虫草、制品1（其实际成分为冬虫夏草：西洋参=1：1）、制品2（其实际成分为冬虫夏草：西洋参：蛹虫草=1：2：1）、制品3（其实际成分为冬虫夏草：西洋参：三七=1：1：1）、制品4（其实际成分为蛹虫草：西洋参：三七=1：1：1）的供试品按照实施例1所述方法对样品进行处理、进样，得到260nm下的色谱图。选择腺苷峰为参照峰，计算各特征峰相对保留时间，并与冬虫夏草及蛹虫草各特征峰的相对保留时间比较，并同时记录其峰面积，结果见表3。

表3虫草制品中的特征峰验证

结果：由表3可见，制品1（冬虫夏草：西洋参为1:1）具有冬虫夏草所有的特征峰，而不具有蛹虫草的特征峰a、e、f号峰，表明：制品1含有冬虫夏草而不含有蛹虫草；该结论与其实际成分相符。

制品2（冬虫夏草：西洋参：蛹虫草为1：2：1）具有冬虫夏草的所有特征峰，但同时也具有蛹虫草的所有特征峰，表明：制品2既含有冬虫夏草也含有蛹虫草；该结论与其实际成分相符。

制品3（冬虫夏草：西洋参：三七为1:1:1）具有冬虫夏草所有的特征峰，而不具有蛹虫草的特征峰a、e、f号峰，表明：制品3含有冬虫夏草而不含有蛹虫草；该结论与其实际成分相符。

制品4（蛹虫草：西洋参：三七1:1:1）具有蛹虫草所有特征峰，而不具有冬虫夏草的1、3号峰，表明：制品4含有蛹虫草而不含有冬虫夏草；该结论与其实际成分相符。

以上结果充分验证了本发明所述冬虫夏草和/或蛹虫草的HPLC特征图谱，可以有效地作为监控虫草制品中虫草投料的检测方法。

Claims (10)

1.一种冬虫夏草的HPLC特征图谱，其中，所述HPLC特征图谱包括5个特征峰，以5号峰腺苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对标准偏差为：

1号峰：相对保留时间0.12±0.0012，相对标准偏差为0.14%；

2号峰：相对保留时间0.36±0.0036，相对标准偏差为0.28%；

3号峰：相对保留时间0.61±0.0061，相对标准偏差为0.34%；

4号峰：相对保留时间0.63±0.0063，相对标准偏差为0.22%；

5号峰：相对保留时间1.00，相对标准偏差为0.17%。

2.一种用于检测含冬虫夏草的药物制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

1）使用HPLC法得到待检测药物制剂的HPLC特征图谱；并使用腺苷峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2）将步骤1）得到的相对保留时间与权利要求1所述的冬虫夏草HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；

3）将步骤1）得到的时间与蛹虫草HPLC特征图谱的特征峰相对保留时间比较；优选地，所述蛹虫材药材HPLC特征图谱包括6个特征峰，以峰d所代表的腺苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对标准偏差为：

峰a：相对保留时间0.11±0.0011，相对标准偏差为0.11%;

峰b：相对保留时间0.36±0.0036，相对标准偏差为0.28%；

峰c：相对保留时间0.63±0.0063，相对标准偏差为0.22%;

峰d：相对保留时间1.00，相对标准偏差为0.17%;

峰e：相对保留时间1.14±0.0114，相对标准偏差为0.06%；

峰f：相对保留时间1.26±0.0126，相对标准偏差为0.01%；

4）根据步骤2）和步骤3）的比较结果判断所述冬虫夏草的药物制剂中是否含有冬虫夏草，使用蛹虫草代替冬虫夏草或者为冬虫夏草与蛹虫草的混合物。

3.如权利要求1或2所述的冬虫夏草HPLC特征图谱或蛹虫草HPLC特征图谱的建立方法，该方法包括以下步骤：

（1）制备冬虫夏草溶液或蛹虫草溶液，以及腺苷对照品溶液；

（2）将步骤（1）所得冬虫夏草溶液或蛹虫草溶液，以及腺苷对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到冬虫夏草或蛹虫草，以及腺苷的HPLC指纹图谱；

（3）通过比较不同冬虫夏草的HPLC特征图谱确定冬虫夏草的共有特征峰，或通过比较不同蛹虫草的HPLC特征图谱确定蛹虫草的共有特征峰。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述制备冬虫夏草或蛹虫草溶液的方法包括如下步骤：精密称取冬虫夏草或蛹虫草，精密加入水加热回流，取上清液，用微孔滤膜滤过即得；所述制备腺苷对照品溶液的方法包括如下步骤：精密称取腺苷对照品，加入甲醇溶解定容，取续滤液即得。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效液相色谱分析的条件包括：采用反相填料色谱柱；检测波长为200～400nm，流速0.1～5ml/min，柱温0～60℃，进样量1～100μl，流动相为甲醇-水梯度洗脱液。

6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效液相色谱分析的条件包括：采用岛津WondaSil C185μm×250mm×4.6mm色谱柱；检测波长为260nm，流速1.0ml/min，柱温35℃，分析时间45min，进样量10μl，流动相为甲醇-水梯度洗脱液；

优选地，所述甲醇-水梯度洗脱的洗脱条件包括：0～5min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持2%，5～30min的洗脱液中甲醇体积百分含量为2%～15%，30～35min的洗脱液中甲醇体积百分含量为15%～95%，35～40min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持95%，40～41min的洗脱液中甲醇体积百分含量为95%～2%，41～45min的洗脱液中甲醇体积百分含量保持2%。

7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述冬虫夏草或蛹虫草的共有特征峰的确定方法为，采用药典委员会规定的HPLC指纹图谱计算软件A版，通过比较不同冬虫夏草的HPLC特征图谱从而确定冬虫夏草的共有特征峰，或通过比较不同蛹虫草的HPLC特征图谱从而确定蛹虫草的共有特征峰。

8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）还包括将步骤（2）所得腺苷色谱峰在冬虫夏草的HPLC特征图谱中所对应的色谱峰为参照峰，计算冬虫夏草的各特征峰的相对保留时间和相对标准差；或者，将步骤（2）所得腺苷色谱峰在蛹虫草的HPLC指纹图谱中所对应的色谱峰作为参照峰，计算蛹虫草的各特征峰的相对保留时间和相对标准差。

9.如权利要求1所述的冬虫夏草HPLC特征图谱在冬虫夏草以及含冬虫夏草的药物制剂的检测中的应用。

10.一种冬虫夏草的检测方法，包括将待测冬虫夏草的HPLC特征图谱与权利要求1所述的冬虫夏草的HPLC特征图谱进行比较。

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