CN108169386A - 一种颈腰康胶囊的hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法。该构建方法包括：供试品溶液的制备：将颈腰康胶囊的内容物采用盐酸甲醇溶液提取，并加入中性氧化铝柱，得到供试品溶液；以士的宁为对照品；将供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，得到颈腰康胶囊的HPLC特征图谱；高效液相色谱检测的条件为：以C18柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水、乙酸和三乙胺的混合溶液，梯度洗脱。用本发明所提供的方法构建的颈腰康胶囊HPLC特征图谱与对照图谱的相似度大于0.90，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。本发明具有方便、快捷、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，特别涉及一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
中成药颈腰康胶囊由制马钱子、伸筋草、香加皮、乳香、没药、红花等十味药组成；具有舒筋活络、活血祛瘀、消肿止痛的功效，用于骨折淤血肿胀疼痛，骨折恢复期，以及肾虚挟湿所致痹痛，增生性脊柱炎，腰间盘脱出症等。该药疗效确切，被广泛应用于临床。但由于中药产地分散，类同品、代用品不断，加之生长环境、采收期、加工炮制方法不同及制剂生产工艺等因素，造成不同厂家生产的同一品种中药产品及同一厂家不同生产批次产品间，其内在质量即其所含化学成分及临床疗效的差异。有效成分不明，作用机制不清，质量的可控性不够等因素严重制约了中药国际化和现代化的步伐，因此，采用有效合理的方式和技术手段进行中药质量一致性评价，以保证中药产品的安全、有效和质量可控，成为了中药国际化和现代化的重点与难点之一。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、薄层鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立中成药特征图谱将能较为全面地反映其所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。中成药颈腰康胶囊标准收载于部颁标准，包括性状特征，红花、香加皮、防己和牛膝的薄层鉴别及制马钱子中士的宁的含量测。其质量标准只控制一味药的一种成分的含量测定及单一成分的定性鉴别，难以从整体上反应产品的质量或从整体上控制产品的质量。目前针对颈腰康胶囊HPLC特征图谱的构建方法暂无相关报道。中药指纹图谱反映的化学成分系统全面，包括该中药所含大部分成分，能区分中药的真伪与优劣及药品的批间一致性。构建颈腰康胶囊HPLC特征图谱，并进行相关性研究，从特征图谱中直接反应出药材及产品的质量，从而在整体上更好的控制产品的质量，为药品的生产和临床应用提供了有效保障。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法。通过该构建方法获得的HPLC特征图谱分离度好，特征峰多，可用于评价和全面控制颈腰康胶囊的质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将颈腰康胶囊的内容物与盐酸甲醇溶液混合，加热回流提取或超声处理后，取续滤液；将续滤液蒸干，残渣溶于甲醇，加入中性氧化铝，蒸干，将加有中性氧化铝的残渣加入中性氧化铝柱，采用三氯甲烷和甲醇的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，将洗脱液残渣溶于甲醇，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：将士的宁对照品溶于甲醇，得到对照品溶液；
(3)高效液相色谱检测：将供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，得到颈腰康胶囊的HPLC特征图谱；高效液相色谱检测的条件为：以C18柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水、乙酸和三乙胺的混合溶液，梯度洗脱。
本发明颈腰康胶囊特征图谱的构建方法：取颈腰康胶囊内容物，用2％～10％的盐酸甲醇溶液提取，并通过柱层析处理，获得供试品溶液，以士的宁为对照品，用甲醇溶液溶解，照高效液相色谱法构建特征图谱。该方法采用高效液相色谱法对颈腰康胶囊的多种指标性成分进行检测，获得包含多个特征峰的特征图谱，分离度好，并将特征峰进行处方中的药味归属，同时应用颈腰康胶囊特征图谱的构建方法建立颈腰康胶囊标准特征图谱，用于评价和控制颈腰康胶囊的质量，保证颈腰康胶囊质量的可控性、稳定性、批间一致性，从而保证产品的安全性和有效性。
作为优选，盐酸甲醇溶液的体积百分浓度为2％～10％。
优选地，在步骤(1)中，盐酸甲醇溶液的体积百分浓度为2％。
作为优选，以g/mL计，内容物与盐酸甲醇溶液的用量比为(2～5)：(20～50)。
优选地，以g/mL计，内容物与盐酸甲醇溶液的用量比为1：10。
作为优选，加热回流提取的时间为1～2h。
优选地，加热回流提取的时间为1h。
作为优选，超声处理的时间为20～40min。
优选地，超声处理的时间为30min。
作为优选，内容物与中性氧化铝的质量比为(2～5)：2。
优选地，内容物与中性氧化铝的质量比为5：2。
作为优选，中性氧化铝柱的规格为：100～200目，6g，内径1.2cm。
作为优选，三氯甲烷和甲醇的混合溶液中，三氯甲烷的体积百分含量为50％～90％。
优选地，三氯甲烷和甲醇的混合溶液中，三氯甲烷的体积百分含量为80％。
作为优选，以g/mL计，内容物与三氯甲烷和甲醇的混合溶液的用量比为(2～5)：50。
优选的，以g/mL计，内容物与三氯甲烷和甲醇的混合溶液的用量比为5：50。
作为优选，在将洗脱液残渣溶于甲醇步骤中，以g/mL计，内容物与甲醇的用量比为(2～5)：10。
优选的，在将洗脱液残渣溶于甲醇步骤中，以g/mL计，内容物与甲醇的用量比为5：10。
作为优选，在对照品溶液的制备步骤中，对照品溶液中士的宁对照品的浓度为10～100μg/mL。
优选的，在对照品溶液的制备步骤中，对照品溶液中士的宁对照品的浓度为50μg/mL。
作为优选，色谱柱的填料粒径5μm，色谱柱内径4.6mm，柱长250mm。
作为优选，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱。
作为优选，在流动相B中，水、乙酸与三乙胺的体积比为(500～700)：(4～8)：(0.5～1.5)。
优选的，在流动相B中，水、乙酸与三乙胺的体积比为600：6：1。
作为优选，梯度洗脱的程序为：0～20min，流动相A 5％～20％，流动相B95％～80％；20～30min，流动相A 20％～15％，流动相B80％～85％；30～90min，流动相A 15％～80％，流动相B 85％～20％。
作为优选，高效液相色谱的柱温为25℃～40℃。
优选地，高效液相色谱的柱温为30℃。
作为优选，流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，高效液相色谱的流速为1.0mL/min。
作为优选，检测波长为230～283nm。
优选地，高效液相色谱的检测波长为230～240nm。
更优选地，高效液相色谱的检测波长为240nm。
作为优选，供试品溶液或对照品溶液的上样量为5～20μL。
优选的，供试品溶液或对照品溶液的上样量为10μL。
本发明提供了一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法。该构建方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将颈腰康胶囊的内容物与盐酸甲醇溶液混合，加热回流提取或超声处理后，取续滤液；将续滤液蒸干，残渣溶于甲醇，加入中性氧化铝，蒸干，将加有中性氧化铝的残渣加入中性氧化铝柱，采用三氯甲烷和甲醇的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，将洗脱液残渣溶于甲醇，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：将士的宁对照品溶于甲醇，得到对照品溶液；
(3)高效液相色谱检测：将供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，得到颈腰康胶囊的HPLC特征图谱；高效液相色谱检测的条件为：以C18柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水、乙酸和三乙胺的混合溶液，梯度洗脱。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)用本发明所提供的方法构建的颈腰康胶囊HPLC特征图谱与对照图谱的相似度大于0.90，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品质量。
(2)特征图谱注重各特征峰的关联性及特征图谱的整体的面貌特征，避免了颈腰康胶囊质量控制的单一性和片面性。能区分中药的真伪与优劣及药品的批间一致性，保证颈腰康胶囊质量的可控性、稳定性、批间一致性，减少了人为处理样品质量达标的可能性。
(3)本发明所构建颈腰康胶囊HPLC特征图谱，进行了处方中药味的相关性研究，将特征峰进行归属，从特征图谱中直接反应出药材及产品的质量，从而在整体上更好的控制产品的质量，为药品的生产和临床应用提供了有效保障。
(4)本发明具有方便、快捷、精密度高、重复性好等优点，可准确可靠的控制颈腰康胶囊的质量。
附图说明
图1是颈腰康胶囊特征图谱；
图2是10批次颈腰康胶囊的特征图谱及共有模式；图中，R为共有模式；S1～S10为10批颈腰康胶囊特征图谱；
图3是颈腰康胶囊的标准特征图谱；其中以士的宁峰为S峰，1～8为峰号，0.40-峰1、0.90-峰2、1.00-峰S、1.05-峰4、2.17-峰5、2.36-峰6、2.46-峰7；3.93-峰8；
图4是颈腰康胶囊相关性图谱，其中S6为骨碎补阴性HPLC色谱图，S5香加皮阴性HPLC色谱图，S4为伸筋草阴性HPLC色谱图，S3为防己阴性HPLC色谱图，S2为制马钱子阴性HPLC色谱图，S1为颈腰康胶囊标准特征图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供一种中成药“颈腰康胶囊”HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取本品内容物2～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％～10％盐酸甲醇溶液20～50mL，称定重量，加热回流提取1～2小时，或超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5～10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为50％～90％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得；
(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，照高效液相色谱法测定色谱图，图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析，即得颈腰康胶囊的特征图谱；
步骤(3)中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
以Agilent ZORBAX SB-C18柱为色谱柱，填料粒径5μm，色谱柱内径4.6mm，柱长250mm；流动相A为乙腈，流动相B为水-乙酸-三乙胺的混合溶液，体积比为600：6：1，梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～20min，A相5％～20％，B相95％～80％；20～30min，A相20％～15％，B相80％～85％；30～90min，A相15％～80％，B相85％～20％；柱温为25℃～40℃；流速为1mL/min；检测波长为230～283nm。
优选地，最佳构建方法如下：
(1)供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得；
(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，照高效液相色谱法测定色谱图，图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析，即得颈腰康胶囊的特征图谱；
步骤(3)中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
以Agilent ZORBAX SB-C18柱为色谱柱，其中色谱柱内径为4.6mm，柱长250mm，填料颗粒内径为5μm；流动相A为乙腈，流动相B为水-乙酸-三乙胺的混合溶液，体积比为600：6：1，梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～20min，A相5％～20％，B相95％～80％；20～30min，A相20％～15％，B相80％～85％；30～90min，A相15％～80％，B相85％～20％；柱温为30℃；流速为1mL/min；检测波长为240nm。
本发明提供的颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长为240nm。
梯度洗脱程序的体积比浓度配置如下：
表1梯度洗脱程序
| 洗脱时间 | 流动相A的比例 | 流动相B的比例 |
| 0～20min | 5％～20％ | 95％～80％ |
| 20～30min | 20％～15％ | 80％～85％ |
| 30～90min | 15％～80％ | 85％～20％ |
测定：精密吸取供试品溶液10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到颈腰康胶囊的特征图谱。如图1所示。
供试品特征图谱与颈腰康胶囊标准特征图谱相似度不低于0.90，参照峰为3号峰，为士的宁峰。
精密度试验：取上述供试品溶液连续进样6次，每次10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，比较各主要共有峰的相对保留时间，计算结果RSD值应小于3％。见表2。
表2精密度测定结果
结果：本方法的精度度较好。
实施例2：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长为240nm。
梯度洗脱程序的体积比浓度配置同表1。
测定：精密吸取上述6份供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，比较各主要共有峰的相对保留时间，计算结果RSD值应小于3％。见表3。
表3重复性试验测定结果
结果：本方法重复性较好。
实施例3：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加5％盐酸甲醇25mL，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为50％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温35℃，检测波长为254nm。
梯度洗脱程序的体积比浓度配置同表1。
测定：精密吸取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到颈腰康胶囊的特征图谱。与图1相近。
供试品特征图谱与颈腰康胶囊标准特征图谱相似度不低于0.90，参照峰为3号峰，为士的宁峰。
实施例4：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加10％盐酸甲醇20mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为90％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，柱温40℃，检测波长为283nm。
梯度洗脱程序的体积比浓度配置同表1。
测定：精密吸取供试品溶液5μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到颈腰康胶囊的特征图谱。与图1相近。
供试品特征图谱与颈腰康胶囊标准特征图谱相似度不低于0.90，参照峰为3号峰，为士的宁峰。
实施例5：颈腰康胶囊标准特征图谱的建立
采用实施例1所述的方法测定共10个批次颈腰康胶囊(批号分别为：160301、160302、160303、160304、160305、160501、160502、160503、160504、160505；由吉林长白山药业集团股份有限公司提供)。
10个批次颈腰康胶囊特征图谱及共有模式如图2所示。
通过10个批次颈腰康胶囊HPLC特征图谱的比较，进行相似度评价：采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版”对10批次颈腰康胶囊特征图谱进行相似度计算，10批次颈腰康胶囊特征图谱与对照指纹图谱(10批次颈腰康胶囊生成的共有模式R)相似度均大于0.95(表2)。
表4颈腰康胶囊相似度比较结果
| 编号 | R | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 |
| 相似度 | 1.000 | 0.994 | 0.986 | 0.992 | 0.979 | 0.997 | 0.992 | 0.992 | 0.993 | 0.982 | 0.995 |
用前述颈腰康胶囊特征图谱的构建方法建立10批次颈腰康胶囊HPLC特征图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”生成有8个共有峰构成的颈腰康胶囊HPLC标准特征图谱。其中第3号峰为士的宁峰。如图3所示。
在标准特征图谱中，以士的宁峰为S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±8％之内，所述第一规定值为：0.40-峰1、0.90-峰2、1.00-峰S、1.05-峰4、2.17-峰5、2.36-峰6、2.46-峰7；3.93-峰8。
取颈腰康胶囊样品，按上述同法操作，得到颈腰康胶囊特征图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”软件对颈腰康胶囊标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度应大于0.90。
实施例6：颈腰康胶囊特征图谱相关性研究——共有峰的归属
阴性供试品溶液的制备：分别取颈腰康胶囊缺制马钱子的阴性样品、缺伸筋草的阴性样品、缺香加皮的阴性样品，缺乳香的阴性样品，缺没药的阴性样品，缺红花的阴性样品，缺地龙的阴性样品，缺骨碎补的阴性样品，缺防己的阴性样品，缺牛膝的阴性样品按前述颈腰康胶囊特征图谱的构建方法中供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液，即得。
用前述颈腰康胶囊特征图谱的构建方法的色谱条件，取上述阴性样品溶液，照高效液相色谱法进行检测，得颈腰康胶囊相关性图谱。如图4所示。
结果：颈腰康胶囊标准特征图谱中的8个共有峰，通过阴性样品及对照品做对照，对其进行归属，结果表明：1号峰、2号峰归属为香加皮药材；3号峰、4号峰、7号峰归属为制马钱子药材；5号峰归属为骨碎补药材；6号峰归属为防己药材；8号峰归属为伸筋草药材。
比较例1：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：供试品溶液的制备方法不同，等度洗脱，洗脱液不同。
仪器：Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪，DAD检测器；MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱。
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，以甲醇-1％冰乙酸-三乙胺(24：76：0.1)为流动相，流速1mL/min，柱温25℃，DAD检测器。
测定：精密吸取供试品溶液及参照物溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定颈腰康胶囊的色谱图。
结果：供试品色谱图中，通过DAD检测器进行190nm～400nm下波长扫描，在230～283nm波长下色谱峰信息较多。色谱峰数量多，但多数响应值小，影响峰分离，基线不平稳，不适合用于构建特征图谱检查方法。
比较例2：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：供试品溶液的制备方法不同，等度洗脱，洗脱液不同。
仪器：Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪，DAD检测器；MS205DU型分析天平
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水20mL是溶解，用稀盐酸调节pH值至1～2，用乙醚脱脂2次，每次20mL，弃去乙醚液，酸液用氨水调节pH值至10～11，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣甲醇适量使溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱。
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，以甲醇-1％冰乙酸-三乙胺(24：76：0.1)为流动相，流速1mL/min，柱温25℃，DAD检测器。
测定：精密吸取供试品溶液及参照物溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定颈腰康胶囊的色谱图。
结果：供试品色谱图，色谱峰较少，信息量少，不适合用于构建特征图谱检查方法。
比较例3：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：等度洗脱，洗脱液不同。
仪器：Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪，DAD检测器；MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，以甲醇-1％冰乙酸-三乙胺(24：76：0.1)为流动相，流速1mL/min，柱温25℃，DAD检测器。
测定：精密吸取供试品溶液及参照物溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定颈腰康胶囊的色谱图。
结果：供试品色谱图，通过DAD检测器进行190nm～400nm下波长扫描，在230～283nm波长下色谱峰信息较多，色谱图中，色谱峰数量及响应值均适中，在240nm波长处响应值最高，峰信息量大，但此流动相系统峰分离效果不好。
比较例4：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：洗脱液不同，洗脱程序不同。
仪器：Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪，DAD检测器；MS205DU型分析天平
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，以流动相A为水：乙酸：三乙胺(100：0.2：0.2)溶液，B为乙腈；梯度洗脱，洗脱条件：0→20min：A(％)90→79，B(％)10→21，20→50min：A(％)79→60，B(％)21→40，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长240nm。
测定：精密吸取各供试品溶液及参照物溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定颈腰康胶囊的色谱图。
结果：供试品色谱图，色谱峰多集中在40～50分钟区域内，上述洗脱梯度不能有效进行峰分离，且保留时间相对延后，需调整流动相梯度组成及酸碱性。
比较例5：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：洗脱程序不同。
仪器：Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪，DAD检测器；MS205DU型分析天平
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱，0→100min：A(％)5→80，B(％)95→20；流速1mL/min，柱温25℃，检测波长240nm。
测定：精密吸取各供试品溶液及参照物溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定颈腰康胶囊的色谱图。
结果：供试品色谱图，通过两种流动相比例的线性洗脱，确定色谱峰主要的出峰时间集中在20～30分钟及40～50分钟时，从而确定两相比列，进行梯度洗脱比例的设计。
比较例6：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
与实施例1相比，本对比例的区别在于：所用色谱柱不同。
仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平。
试剂与试药：士的宁对照品(110705-201307)、液相色谱分析用乙腈为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、颈腰康胶囊由吉林长白山制药集团股份有限公司提供。
供试品溶液的制备：取本品内容物约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加2％盐酸甲醇50mL，称定重量，回流提取1小时，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，加2g中性氧化铝拌匀，蒸干，加在中性氧化铝柱上，100～200目，6g，内径1.2cm，用三氯甲烷-甲醇混合溶液50mL洗脱，混合溶液中三氯甲烷所占体积比为80％，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取士的宁对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
色谱条件：Agilent C18(5μm，4.6×250mm)柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水：乙酸：三乙胺(600：6：1)混合溶液，梯度洗脱；流速1mL/min，柱温25℃，检测波长240nm。梯度洗脱程序的体积比浓度配置同表1。
结果：供试品色谱图，色谱峰分离效果不好，个别色谱峰存在叠加现象。为进一步分离色谱峰，需更换柱效及分离度更高的色谱柱。
比较例7：颈腰康胶囊基于特征图谱的质量控制方法
参照公开号为CN101721475A实施例1中公开的提取和色谱方法，对颈腰康胶囊进行分析。具体方法为：
腰痛宁胶囊的指纹图谱测定方法为：取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入浓盐酸0.63mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率450W，40kHz进行超声处理45分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液10u1注入液相色谱仪，进行分析，色谱条件为：照高效液相色谱法(药典四部通则0512)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙睛)由8％～18％～98％～98，流动相B(含0.2甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为lml/min；理论板数按士的宁峰计算应不低于6000。
对照品溶液的配制：精密称取士的宁对照品适量，加三氯甲烷制成每1mL含士的宁0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液2m1，置l0ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每lml中含士的宁0.1mg；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10u1，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图，即得。
结果显示：颈腰康胶囊供试品色谱图，色谱峰多而杂，分离度不好，上述供试品溶液制备方法及色谱条件不能有效进行峰分离，无法得到本品的特征图谱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种颈腰康胶囊的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将颈腰康胶囊的内容物与盐酸甲醇溶液混合，加热回流提取或超声处理后，取续滤液；将续滤液蒸干，残渣溶于甲醇，加入中性氧化铝，蒸干，将加有中性氧化铝的残渣加入中性氧化铝柱，采用三氯甲烷和甲醇的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，将洗脱液残渣溶于甲醇，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：将士的宁对照品溶于甲醇，得到对照品溶液；
(3)高效液相色谱检测：将供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，得到颈腰康胶囊的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱检测的条件为：以C18柱为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水、乙酸和三乙胺的混合溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述盐酸甲醇溶液的体积百分浓度为2％～10％；以g/mL计，所述内容物与所述盐酸甲醇溶液的用量比为(2～5)：(20～50)。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述加热回流提取的时间为1～2h，所述超声处理的时间为20～40min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述内容物与所述中性氧化铝的质量比为(2～5)：2。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述中性氧化铝柱的规格为：100～200目，6g，内径1.2cm。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述三氯甲烷和甲醇的混合溶液中，三氯甲烷的体积百分含量为50％～90％。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述色谱柱的填料粒径5μm，色谱柱内径4.6mm，柱长250mm。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在流动相B中，水、乙酸与三乙胺的体积比为(500～700)：(4～8)：(0.5～1.5)。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0～20min，流动相A 5％～20％，流动相B 95％～80％；20～30min，流动相A 20％～15％，流动相B 80％～85％；30～90min，流动相A 15％～80％，流动相B 85％～20％。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱的柱温为25℃～40℃，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为230～283nm。
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