CN113063871B - 一种代谢小分子检测方法及检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种代谢小分子的检测方法及检测系统，通过自动化前处理系统，可以实现取样准确、稳定性高、有效防止交叉污染，通过液相色谱串联质谱法，实现了特异性好、准确性高的优势，本发明通过偶联有特异性强的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品，取代谢小分子样品通过液相色谱串联质谱法检测实现对样本中代谢小分子样品的浓度测定，实现全自动化样本处理以及精准检测，可以应用于目标代谢小分子、蛋白质的临床定量分析。

Description

一种代谢小分子检测方法及检测系统
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种基于免疫方法与液相色谱串联质谱法结合的代谢小分子检测方法及检测系统。
背景技术
目前市场上有许多小分子样品检测方法，其中，免疫方法可以实现自动化操作，检测时间短，是目前临床实验室常用检测方法。质谱方法的检测原理能够保证对分析物进行准确定量，是国际公认的可准确测定小分子化合物和类固醇激素的分析方法。
例如，醛固酮。
醛固酮是人体内重要的盐皮质激素，促进肾脏对钠的吸收，维持水平衡。但醛固酮异常分泌导致原发性醛固酮增多症，简称"原醛症"，是继发性高血压最主要的病因之一。原醛患者的心、脑等多器官损害严重，早期诊断至关重要。醛固酮（aldosterone,Ald）是原醛症筛查、确诊与治疗的重要指标之一。
醛固酮检测方法按照原理不同可分为两大类：一类是免疫方法，包括放射免疫方法（radioimmunoassay,RIA）、化学发光免疫方法（chemiluminescenceImmunoassay，CLIA）；但抗原抗体反应特点使其易受交叉反应的干扰，且线性范围窄等缺点的存在，影响免疫法的使用；
另一类是质谱方法，通常是液相色谱串联质谱法（LiquidChromatographyTandemMassSpectrometry，LC-MS/MS），但是液相色谱串联质谱法的样本的前处理为非特异性富集方法，富集的样本成分较为复杂，在色谱分离时，一些非目标分析物物质易在色谱柱上发生变形沉淀或难以从色谱柱上洗脱，造成较高的基质效应，引起柱压升高，影响后续目标产物的分离分析的有效性和稳定性，增加液相质谱维护的难度和负担，实用色谱将目标分析物和其同分异构体或结构类似物完全分离的难度极大，同时十分耗费时间，未完全分离的基质物质还可能会干扰分析物的质谱定量，并且液相色谱串联质谱法的操作步骤较多，不能自动化等因素，严重阻碍了临床应用。
类似醛固酮的小分子物质在许多实用场景都需要检测，传统的手动检测费时费力而且准确性不高，还有交叉污染的风险。
发明内容
本发明的一个目的在于为了解决现有对于目标代谢小分子或蛋白质临床定量分析方法或易受交叉反应的干扰或检测费时费力，准确性不高的缺陷而提供一种代谢小分子检测方法。
本发明的另一个目的是为了提供一种代谢小分子检测系统。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种代谢小分子检测方法，包括在前处理系统上，利用偶联有特异性强的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品，取代谢小分子样品通过液相色谱串联质谱法检测实现对样本中代谢小分子样品的浓度测定；
其中，所述的代谢小分子样品包括但不限于类固醇激素、维生素、血管紧张素或其它多肽等。
在本发明中，本发明基于免疫法与液相色谱串联质谱法的优点，将两种方法结合起来，提供了一种实现自动化前处理与液相色谱串联质谱法的代谢小分子的检测方法，通过自动化前处理系统，可以实现取样准确、稳定性高、有效防止交叉污染，通过液相色谱串联质谱法，实现了特异性好、准确性高的优势，本发明通过偶联有特异性强的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品，取代谢小分子样品通过液相色谱串联质谱法检测实现对样本中代谢小分子样品的浓度测定，实现全自动化样本处理以及精准检测，可以应用于目标代谢小分子、蛋白质的临床定量分析。
作为本发明的一种优选方案，所述检测方法包括以下步骤：
1）获得偶联有特异性强的抗体的磁珠：经过磁珠活化、抗体偶联、磁珠洗涤、磁珠封闭与磁珠保存后制备得到偶联有特异性强的抗体的磁珠；
2）步骤1）得到的偶联有特异性强的抗体的磁珠加入至待检测的样本中，进行孵育；
3）步骤2）孵育完成后，使用甲醇溶液至少洗涤1次；
4）步骤3）洗涤完成后，洗脱步骤3）得到磁珠数次，得到代谢小分子样品；
5）将步骤4）得到的代谢小分子样品进行液相色谱串联质谱法检测。
作为本发明的一种优选方案，所述孵育步骤中，偶联有特异性强的抗体的磁珠的含量为1mg/mL，加入量为30-50μL，样本的加入量为50-100μL，孵育的时间为5-15min，每隔2-10min吹打混匀。
作为本发明的一种优选方案，所述洗涤步骤中，甲醇溶液的质量分数为20%-90%。
作为本发明的一种优选方案，所述样本包括血清、全血、体液或尿液；所述代谢小分子样品包括但不限于醛固酮、睾酮、皮质醇、孕酮、维生素D、叶酸、血管紧张素或其它多肽等。
可选的，样本还可以包括其它能够提供代谢小分子样品的样本。
作为本发明的一种优选方案，所述代谢小分子样品为类固醇激素时，色谱条件：色谱柱和预柱：Waters HSS T3 2.1*50 mm，1.8μm，HSS T3 2.1*5.0mm，1.8μm；流动相A：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵水溶液；流动性B：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵甲醇溶液；梯度洗脱程序：0 min：A：B=55：45，4.0 min :A：B=40：60，6.5 min：A：B=25：75，7.5min：A:B=10：90，7.6min：A:B=55：45，8.0 min：A:B=55：45；流速：0.45mL/min；柱温：45℃；进样：10μL；
质谱条件为：质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS ，正离子模式；毛细管电压： 3.2kv；脱溶剂温度：650℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：0L/hr；扫描模式：多反应监测。
作为本发明的一种优选方案，所述代谢小分子样品为维生素是，色谱条件为：色谱柱和预柱：Waters Cortecs C18 2.7 um 2.1 mm×50 mm，流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动性B：0.1%甲酸、5 mM甲酸铵甲醇溶液，梯度洗脱程序：0~1min：A：B=20：80，1~2min：A：B=0：100， 2~3min：A：B=0：100， 3~3.2min：A:B=20：80，3.2~4min：A:B=20：80，流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样：10μL；
质谱条件：质谱型号和扫描模式：AB 4500MD，正离子模式；电喷雾电压： 5500v；离子源温度：550℃；雾化气：55 psi；辅助气 ： 55 psi ；气帘气：30 psi；扫描模式：多反应监测。
本发明还提供了一种代谢小分子检测系统，所述检测系统包括前处理系统与液相色谱串联质谱联用仪，上述的检测方法中，利用偶联有特异性强的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品均在前处理系统中完成；其中，所述前处理系统包括磁吸模块、排枪模块、试剂载架、废吸头位、新吸头位和工作台，所述磁吸模块、试剂载架、废吸头位和新吸头位均位于工作台上，所述试剂载架设有多条，所述试剂载架用于放置试剂条，所述磁吸模块上设有与试剂条对应的凹槽，所述试剂载架下方设有移动工装，所述试剂载架的另一端设有废吸头位和新吸头位，所述排枪模块位于试剂载架上方，所述排枪模块内设有提取和排放试剂或者样品的结构，各个模块连接有控制系统。
在本发明中，磁吸模块用于吸住羧基磁珠，羧基磁珠是磁珠偶联法的常用物质。试剂载架用于承托试剂条以及试剂条定位。废吸头位用于暂时放置用过的吸头，新吸头位用于放置未用过的吸头，方便排枪模块更换吸头。工作台为整个平台，所有底座均在工作台上完成，
作为本发明的一种优选方案，所述废吸头位和新吸头位的数量与试剂载架的条数相同且位置相对；所述排枪模块上设有吸头、移动工装和吸排驱动结构，移动工装和吸排驱动结构连接于控制系统，吸头探入试剂条的试剂或样品孔内进行动作；所述吸排驱动结构与控制系统配合进行吹打动作，所述吹打动作为对试剂或样品进行快速吸取排放。
作为本发明的一种优选方案，所述的试剂条包括条面、第一孔、第二孔至第十五孔，其中，所述第三孔、第四孔和第五孔为溶剂添加孔，所述第七孔内添加抗体偶联磁珠，所述第十三孔为洗涤液添加孔，所述第十四孔为代谢小分子样品添加孔。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）本发明提供了一种实现自动化前处理与液相色谱串联质谱法的代谢小分子的检测方法，通过自动化前处理系统，可以实现取样准确、稳定性高、有效防止交叉污染，通过液相色谱串联质谱法，实现了特异性好、准确性高的优势，本发明通过偶联有特异性强的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品，取代谢小分子样品通过液相色谱串联质谱法检测实现对样本中代谢小分子样品的浓度测定，实现全自动化样本处理以及精准检测，可以应用于目标代谢小分子、蛋白质的临床定量分析；
2）本发明提供了一种代谢小分子检测系统，结构简单，方便操作，前处理高效快捷，防止交叉污染，稳定性和准确性高，特异性好。
附图说明
图1是本发明前处理系统的一种结构示意图。
图2是图1的俯视图。
图3是实施例1的线性回归方程。
图4是实施例2的25羟基维生素D2线性回归方程。
图5是实施例2的25羟基维生素D3线性回归方程。
图中，1.磁吸模块；2.排枪模块；3.试剂载架；4.废吸头位；5.新吸头位；6.工作台。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1与图2，本发明提供了一种代谢小分子检测系统，包括前处理系统与液相色谱串联质谱联用仪，前处理系统包括磁吸模块1、排枪模块2、试剂载架3、废吸头位4、新吸头位5和工作台6，所述磁吸模块1、试剂载架3、废吸头位4和新吸头位5均位于工作台6上，所述试剂载架3设有多条，所述试剂载架3用于放置试剂条，所述磁吸模块1上设有与试剂条对应的凹槽，所述试剂载架3下方设有移动工装，所述试剂载架3的另一端设有废吸头位4和新吸头位5，所述排枪模块2位于试剂载架3上方，所述排枪模块2内设有提取和排放试剂或者样品的结构，各个模块连接有控制系统。磁吸模块1用于吸住羧基磁珠，羧基磁珠是磁珠偶联法的常用物质。试剂载架3用于承托试剂条以及试剂条定位。废吸头位4用于暂时放置用过的吸头，新吸头位5用于放置未用过的吸头，方便排枪模块2更换吸头。工作台6为整个平台，所有动作均在工作台6上完成。
所述的试剂条呈长条形，具有第一孔至第十五孔的条状结构，其中，第三孔、第四孔和第五孔为溶剂添加孔，所述第七孔内添加抗体偶联磁珠，所述第十三孔为洗涤液添加孔，所述第十四孔为代谢小分子样品添加孔。
液相色谱串联质谱联用仪为Waters TQS质谱仪或者AB 4500MD 液相色谱-三重四极杆质谱仪，也可以采用实验室常规使用的其他型号，在此不做限定，仅为列举。
本发明中，甲酸购自于阿拉丁，甲醇购自于默克，超纯水购自于屈臣氏，抗体购自于Thermo，磁珠购自于英芮诚生化科技有限公司。
本发明中，抗体偶联磁珠的制备方法包括以下步骤：
1）抗体溶液预处理：使用超滤管将1 mg抗体（醛固酮、孕酮、皮质醇和睾酮，或者维生素D，叶酸）12000g离心10min超滤，加500 μL PBS，12000g离心10 min12000g离心10 min超滤，重复3次使抗体保存液置换为PBS缓冲液；
2）将磁珠混合均匀，取1000μL (10mg)磁珠加入到2mL EP管中，磁力架上磁性分离去除上清液；
3）加入去离子水，混合均匀，磁性分离去除上清液，再重复2 次；
4）加入100 μL PBS重悬磁珠，磁性分离去除上清液，再重复2 次；
5）加入50 μL PBS重悬磁珠，加入1 mg抗体 (提前溶于PBS)，室温旋转混合30min；
6）加入10 μL现配的10mg/mL或1mg/mL碳化二亚胺溶液，补充PBS使体系总体积为1000 μL，室温涡旋偶联1~3 h，磁性分离去除上清液；
7）加入100 μL淬灭缓冲液（50mM Tris-HCl, pH7.4）重悬磁珠，涡旋混合30 min，磁性分离去除上清液；
8）加入1000μL PBS，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液，再重复2次，将磁珠分散于1000μL 10%甲醇中，4℃保存。
实施例1
本实施例提供了醛固酮的检测方法，包括以下步骤：
1）将所需试剂和样本加入到试剂条对应的样品孔中，然后使用自动化前处理仪器完成第2至第4操作步骤；
2）在第七孔中手工加入50μL 1mg/mL抗体偶联磁珠、100μL 血清或标线和50μL 内标，孵育10min，每2min吹打5次混匀，吹打动作采用排枪模块2进行；
3）第三孔、第四孔和第五孔中分别加200μL PBS，孵育完后依次洗涤1次；
4）第十三孔中加200μL 20%-90%甲醇，洗涤完后，吸取100μL 20%-90%甲醇，在14孔中吹打数次洗脱，得到醛固酮样品；
5）第十四孔取出70μL 样品到96孔板或进样品，再加70μL水混匀，上WatersTQS质谱仪检测。
色谱参数
1、色谱柱和预柱：Waters HSS T3(2.1*50 mm，1.8μm)，HSS T3 (2.1*5.0mm，1.8μm)；
2、流动相A：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵水溶液；流动性B：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵甲醇溶液；
2、梯度洗脱程序：0 min：A：B=55：45，4.0 min :A：B=40：60，6.5 min：A：B=25：75，7.5min：A:B=10：90，7.6min：A:B=55：45，8.0 min：A:B=55：45；
3、流速：0.45mL/min；柱温：45℃；进样：10μL。
质谱参数
1、质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS ，正离子模式
2、毛细管电压： 3.2kv；脱溶剂温度：650℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：0L/hr；
3、扫描模式：多反应监测（MRM）,各化合物质谱参数见表1:
Figure DEST_PATH_IMAGE002
参见图3，线性回归方程见表2：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
结论：低、中、高浓度平均回收率均分别为94.44%、99.57%、100.07%，平均回收率为98.03%，介于90%-110%之间。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
结论：低浓度批内、批间精密度CV值小于10%。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
结论：高浓度批内、批间精密度CV值小于5.5%。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
结论：低、中、高浓度基质效应均介于±15之间，不影响目标分析物的准确定量。
从本实施例可以看出，本发明的检测方法稳定性和准确性高，特异性好，回收率高。
实施例2
本实施例提供了25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的检测方法，包括以下步骤：
1）孔7中加30 μL 1mg/ml抗体偶联磁珠、50μL血清或标线（50%甲醇配置）和25μL（50%甲醇配置）内标，200 μL样本稀释液，孵育10 min，每5 min吹打5次混匀；
2）孔3、4、5中各加300 μL PBS，孵育完后依次洗涤1次；
3）孔13加200 μL 20%-90%甲醇，洗涤完后，吸取120 μL 20%-90%甲醇，在14孔中吹打数次洗脱抗体磁珠上的25羟基维生素D；
4）孔14取出100 μL 样品，上AB 4500MD质谱仪检测，合计共12 min。
色谱参数：
1、色谱柱和预柱：Waters Cortecs C18 2.7 um (2.1 mm×50 mm)；
2、流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动性B：0.1%甲酸、5 mM甲酸铵甲醇溶液；
3、梯度洗脱程序：0~1min：A：B=20：80，1~2min：A：B=0：100， 2~3min：A：B=0：100， 3~3.2min：A:B=20：80，3.2~4min：A:B=20：80；
4、流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样：10μL；
质谱参数：
1、质谱型号和扫描模式：AB 4500MD，正离子模式；
2、电喷雾电压： 5500v；离子源温度：550℃；雾化气（gas1）：55 psi；辅助气（gas1）： 55 psi ；气帘气（Curtain gas）：30 psi；
3、扫描模式：多反应监测（MRM）参数如下:
Figure DEST_PATH_IMAGE014
参见图4，25羟基维生素D2的线性回归方程为：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
参见图5，25羟基维生素D3的线性回归方程为：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
Figure DEST_PATH_IMAGE020
结论：低、中、高浓度平均回收率均分别为93.11%、101.67%、113.28%，平均回收率为102.69%，介于90%-115%之间。
Figure DEST_PATH_IMAGE022
结论：低、中、高浓度平均回收率均分别为100.76%、108.90%、100.45%，平均回收率为103.37%，介于95%-110%之间。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种代谢小分子检测方法，其特征在于，包括在前处理系统上，利用偶联有特异性的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品，取代谢小分子样品通过液相色谱串联质谱法检测实现对样本中代谢小分子样品的浓度测定；
其中，所述的代谢小分子样品包括类固醇激素、维生素、血管紧张素或多肽；
所述检测方法所用的检测系统包括前处理系统与液相色谱串联质谱联用仪，利用偶联有特异性的抗体的磁珠吸附待检测的样本，孵育、洗涤后洗脱后得到代谢小分子样品均在前处理系统中完成；其中，所述前处理系统包括磁吸模块、排枪模块、试剂载架、废吸头位、新吸头位和工作台，所述磁吸模块、试剂载架、废吸头位和新吸头位均位于工作台上，所述试剂载架设有多条，所述试剂载架用于放置试剂条，所述磁吸模块上设有与试剂条对应的凹槽，所述试剂载架下方设有移动工装，所述试剂载架的另一端设有废吸头位和新吸头位，所述排枪模块位于试剂载架上方，所述排枪模块内设有提取和排放试剂或者样品的结构，各个模块连接有控制系统；所述检测方法包括以下步骤：
1）获得偶联有特异性的抗体的磁珠：经过磁珠活化、抗体偶联、磁珠洗涤、磁珠封闭与磁珠保存后制备得到偶联有特异性的抗体的磁珠；
2）步骤1）得到的偶联有特异性的抗体的磁珠加入至待检测的样本中，进行孵育；
3）步骤2）孵育完成后，使用PBS至少洗涤1次；
4）步骤3）洗涤完成后，洗脱步骤3）得到磁珠数次，得到代谢小分子样品；
5）将步骤4）得到的代谢小分子样品进行液相色谱串联质谱法检测
步骤4）中，洗脱用的溶液为质量分数20-90%的甲醇溶液。
2.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，步骤2）中，偶联有特异性的抗体的磁珠的含量为1mg/mL，加入量为30-50μL，样本的加入量为50-100μL，孵育的时间为5-15min，每隔2-10min吹打混匀。
3.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，所述样本包括血清、全血或尿液；所述代谢小分子样品包括醛固酮、睾酮、皮质醇、孕酮、维生素D、叶酸或血管紧张素。
4.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，所述代谢小分子样品为类固醇激素时，色谱条件：色谱柱和预柱：Waters HSS T3 2.1*50 mm，1.8μm，HSS T32.1*5.0mm，1.8μm；流动相A：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵水溶液；流动性B：0.1%甲酸、2 mM乙酸铵甲醇溶液；梯度洗脱程序：0 min：A：B=55：45，4.0 min :A：B=40：60，6.5 min：A：B=25：75，7.5min：A:B=10：90，7.6min：A:B=55：45，8.0 min：A:B=55：45；流速：0.45mL/min；柱温：45℃；进样：10μL；
质谱条件为：质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS ，正离子模式；毛细管电压：3.2kv；脱溶剂温度：650℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：0L/hr；扫描模式：多反应监测。
5.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，所述代谢小分子样品为25羟基维生素D，色谱条件为：色谱柱和预柱：Waters Cortecs C18 2.7 um 2.1 mm×50mm，流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动性B：0.1%甲酸、5 mM甲酸铵甲醇溶液，梯度洗脱程序：0~1min：A：B=20：80，1~2min：A：B=0：100， 2~3min：A：B=0：100， 3~3.2min：A:B=20：80，3.2~4min：A:B=20：80，流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样：10μL；
质谱条件：质谱型号和扫描模式：AB 4500MD，正离子模式；电喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气：55psi；辅助气：55 psi ；气帘气：30 psi；扫描模式：多反应监测。
6.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，所述废吸头位和新吸头位的数量与试剂载架的条数相同且位置相对；所述排枪模块上设有吸头、移动工装和吸排驱动结构，移动工装和吸排驱动结构连接于控制系统，吸头探入试剂条的试剂或样品孔内进行动作；所述吸排驱动结构与控制系统配合进行吹打动作，所述吹打动作为对试剂或样品进行快速吸取排放。
7.根据权利要求1所述的一种代谢小分子检测方法，其特征在于，试剂条包括条面、第一孔、第二孔至第十五孔，其中，第三孔、第四孔和第五孔为溶剂添加孔，第七孔内添加抗体偶联磁珠，第十三孔为洗涤液添加孔，第十四孔为代谢小分子样品添加孔。
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