CN113884597A

CN113884597A - 一种苣荬菜hplc-it-tof/ms指纹图谱的检测方法及其指纹图谱

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Publication number: CN113884597A
Application number: CN202111160424.0A
Authority: CN
Inventors: 林永强; 孙仟; 汪冰; 林林; 徐兴燕
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113884597B

Abstract

本发明涉及中药检测技术领域，涉及一种苣荬菜HPLC‑IT‑TOF/MS指纹图谱的检测方法及其指纹图谱，包括以下步骤：对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；色谱条件：以水(A，含0.05％甲酸)‑甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱：0～15min，15％～32％甲醇；15～35min，32％～38％甲醇；35～60min，38％～65％甲醇；质谱条件：离子源为ESI源，正离子扫描模式，离子积聚时间10ms；雾化气流速1.5L/min；扫描范围为m/z100～1500；干燥气气压140kPa。该方法有效避免了相似保留时间成分及漂移保留时间带来的干扰，提供更多更准确的信息，大大提高了质量检测的准确性和灵敏度。

Description

一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法及其指纹图谱

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法及其指纹图谱。

背景技术

苣荬菜为菊科植物苣荬菜(Sonchus arvensis L.)的干燥全草，《中国药典》1977年版收载名称为苣荬菜(北败酱)。目前我国华北、西北等地多使用苣荬菜习称为北败酱。始载于明代早期《救荒本草》，具有清湿热，消肿排脓，化瘀解毒的功效。现代药理学研究发现，苣荬菜水煎液有明显的降血糖及促进肝再生的作用。苣荬菜为民间常用药材，许多地区也有做野菜食用的习惯，同时也被应用在儿童清咽解热口服液及六味五灵片等中成药制剂中。

目前，人们对苣荬菜的成分解析及质量控制还有所欠缺，在地方质量标准及现有的研究中，大多是规定其显微性状及检查项，亦或是仅对其中几种成分的含量进行研究，现有技术中有通过毛细管电泳研究苣荬菜指纹图谱的，但是检测的灵敏度和准确度不高，无法避免相似保留时间成分及漂移保留时间带来的干扰。

发明内容

针对上述的问题，本发明提供了一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法及其指纹图谱，该方法有效避免了相似保留时间成分及漂移保留时间带来的干扰，提供更多更准确的信息，大大提高了质量检测的准确性和灵敏度。

本发明的目的之一是保护一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备；

(2)供试品溶液的制备；

(3)色谱条件：以水(A，含0.05％甲酸)-甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度：0～15min，15％～32％甲醇；15～35min，32％～38％甲醇；35～60min，38％～65％甲醇；

质谱条件：离子源为ESI源，正离子扫描模式，离子积聚时间10ms；雾化气(氮气)流速1.5L/min；

扫描范围为m/z 100～1500；干燥气(氮气)气压140kPa。

进一步地：所述步骤(3)中色谱条件为：色谱柱为Agilent C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。

进一步地：所述步骤(3)中色谱条件为：色谱柱柱温：35℃，样品温度20℃，流速：1mL/min，进样量3-10μL(优选的：进样量为3-10μL之间的某一单值)。

进一步地：所述步骤(3)中质谱条件为：曲线脱溶剂管温度200℃；加热模块温度200℃；CID能量50％；检测器电压，1.61kV。

进一步地，所述步骤(1)中，对照品溶液制备的具体方法为：精密称取咖啡酰酒石酸、绿原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷及木犀草素对照品，以甲醇为溶剂，制得各成分质量浓度分别为27.1μg/mL，35.5μg/mL，45.3μg/mL，29.6μg/mL及28.7μg/mL的混合对照品溶液，将以上对照品溶液置4℃保存，备用。

进一步地，所述步骤(2)中，供试品溶液制备的具体方法为：分别取样品适量，粉碎过筛(四号)，精密称取约0.5g粉末置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，称定重量，超声处理45min，放冷，摇匀，70％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

本发明的目的之二是保护上述方法构建的苣荬菜指纹图谱。

本发明的目的之三是保护上述方法在苣荬菜混淆品检测中的应用。

进一步地：上述方法在苣荬菜药材真伪鉴别中的应用。

有益效果：

本发明实施例示例的苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法，即使在色谱峰出峰时间存在稍有偏移的情况下，仍可以根据MS信息确认参照峰，进而进行校正，同时TIC指纹图谱可以提供更多更准确的成分信息，弥补了液相色谱分析存在的不足。

本实验首次采用HPLC-IT-TOF/MS技术建立了苣荬菜的指纹图谱，信息量丰富、分离效果好，较全面的反映了苣荬菜的成分信息，可以辅助鉴别药材的真伪，对于建立科学、合理的苣荬菜质量评价方法，提高其质量控制标准具有一定的参考意义。

附图说明

图1为本发明实施例中11批苣荬菜图谱；

图2为本发明实施例中共有峰图谱；

图3为本发明实施例中聚类分析结果；

图4为本发明实施例中正伪品比对图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例一

本实施例提供一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备；

(2)供试品溶液的制备；

扫描范围为m/z 100～1500；干燥气(氮气)气压140kPa。

本发明实施例首次建立了苣荬菜药材HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱分析方法，专属性强，为苣荬菜的真伪鉴别及质量控制研究提供了一种新方法，为质量控制标志物的选择提供参考。

以苣荬菜提取物为研究对象，建立苣荬菜的HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱，同时鉴别共有峰成分。以市场上常见的易混淆品进行验证，并对不同来源苣荬菜进行聚类分析。建立了苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的共有模式，根据对照品和参考文献指认5个共有峰。

优选的色谱条件为：色谱柱为Agilent C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；色谱柱柱温：35℃，样品温度20℃，流速：1mL/min，进样量10μL。

优选的色谱条件为：曲线脱溶剂管温度200℃；加热模块温度200℃；CID能量50％；检测器电压，1.61kV。

实施例二

本实施例为实施例1所述的检测方法构建的苣荬菜指纹图谱，该图谱确定了17个共有峰。

实施例三

本实施例为实施例1所述的检测方法在苣荬菜混淆品检测中的应用，对11批不同来源的样品进行相似度考察，相似度均大于0.9，易混淆品相似度均小于0.7。

实施例四

本实施例示例了苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法。

1仪器与材料

1.1仪器

LC-ESI-IT-TOF-MS液质联用仪(日本，岛津公司)；LCMSsolution工作站软件(日本，岛津公司)；ChemPattern 2020版软件(中国，科迈恩科技有限公司)；XSE205DU电子天平(瑞士，METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(中国，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药材与试剂

1.2.1药材S1-S11为菊科植物苣荬菜(Sonchus arvensis L.)的干燥全草，S12-S13为中华小苦荬(Ixeris chinensis(Thunb.)Nakai)的干燥全草，S14-S15为败酱草(Patrinia scabiosaefolia Fisch.)的干燥全草，不同批次样品信息见表1。

表1样品信息表

1.2.2试剂咖啡酰酒石酸对照品(批号:ZZS-21-J003-A6，99.71％，上海甄准生物科技有限公司)，绿原酸对照品(批号:110753-201817，96.1％，中国食品药品检定研究院)，木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品(批号:111720-201810，93.3％，中国食品药品检定研究院)，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品(批号:J7150009，99.8％，上海安谱实验科技股份有限公司)，木犀草素对照品(批号:111520-200504，中国食品药品检定研究院)。甲酸(质谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；水为屈臣氏蒸馏水。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备精密称取咖啡酰酒石酸、绿原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷及木犀草素对照品，以甲醇为溶剂，制得各成分质量浓度分别为27.1μg/mL，35.5μg/mL，45.3μg/mL，29.6μg/mL及28.7μg/mL的混合对照品溶液，将以上对照品溶液置4℃保存，备用。

2.1.2供试品溶液的制备分别取S1-S11样品适量，粉碎过筛(四号)，精密称取约0.5g粉末置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，称定重量，超声处理45min，放冷，摇匀，70％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.2色谱条件色谱柱为Agilent C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：35℃，样品温度20℃，流速：1mL/min，进样量10μL；以水(A，含0.05％甲酸)-甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度：0～15min，15％～32％甲醇；15～35min，32％～38％甲醇；35～60min，38％～65％甲醇。

2.3质谱条件离子源为ESI源，正离子扫描模式，离子积聚时间10ms；雾化气(氮气)流速1.5L/min；曲线脱溶剂管温度200℃；加热模块温度200℃；CID能量50％；检测器电压，1.61kV；

扫描范围为m/z 100～1500；干燥气(氮气)气压140kPa。

2.4方法学考察

本研究方法学考察在正扫描模式下进行。

2.4.1精密度实验称取苣荬菜样品(编号：S2)粉末1g，依“2.1.2”项制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件与“2.3”项下质谱条件连续进样6次，11号峰(木犀草素-7-O葡萄糖醛酸苷)的保留时间为25.11min，由于其出峰时间适中，峰面积及峰高比较稳定，故选择该峰作为参照峰，以此峰的保留时间和峰面积为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD<1.11％，相对峰面积RSD<3.98％。表明进样和仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.2重复性实验平行称取苣荬菜样品(编号：S2)粉末6份，依“2.1.2”项制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件与“2.3”项下质谱条件测定，以11号峰(木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷)的保留时间和峰面积为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.91％，相对峰面积RSD<5.00％。表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.3稳定性实验称取苣荬菜样品(编号：S2)粉末，依“2.1.2”项制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件与“2.3”项下质谱条件，在0h，2h、4h，8h，12h，24h分别测定，以11号峰(木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷)的保留时间和峰面积为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD<2.42％，相对峰面积RSD<5.96％。表明样品溶液在24h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.5苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱

2.5.1指纹图谱建立将11批不同来源的样品按“2.1.2”项制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件与“2.3”项下质谱条件进行HPLC-IT-TOF/MS分析，得到各个样本的正离子总离子流色谱图，将各色谱图导入ChemPattern 2020版软件，将S1设为参照图谱，得到不同批次苣荬菜样品的指纹图谱，见图1，同时生成共有峰图谱，见图2。

将各样品与参照图谱进行比较，分别以夹角余弦及相关系数的方法进行计算，相似度见表2。根据11批苣荬菜的指纹图谱共确定了17个共有峰，图谱的整体特征一致，各来源样品的指纹图谱相似度均>0.90，表明11份样品相似度较高，总体质量较为均一稳定。各批次17个共有峰的相对保留时间RSD<2.76％，相对峰面积RSD较大，说明各批次样品中所含成分的含量存在一定差异。

表2各批次样品相似度

2.5.2不同来源苣荬菜的聚类分析将17个共有峰的峰面积数据导入ChemPattern2020版软件中进行系统聚类分析，其中样品间距离的计算采用欧氏距离法，见图3。结果发现样品没有清晰的聚类，不同来源的苣荬菜间差异不明显。聚类分析结果表明苣荬菜样品质量没有明显的地域差异。

2.5.3指纹图谱的专属性验证中华小苦荬及败酱草均为目前市场上常见的苣荬菜的混淆品，由于历史沿革及地区习惯等原因，山东地区常以中华小苦荬做北败酱使用，而败酱草还由于名称、饮片形态相似等原因，屡屡在市场上发现与苣荬菜的混淆现象。为评价苣荬菜药材指纹图谱在药材真伪鉴别方面的有效性，将S12-S15以“2.1.2”项制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件与“2.3”项下质谱条件进行分析，将中华小苦荬及败酱草样品总离子流色谱图导入ChemPattern 2020版软件，将样品图谱与共有峰图谱进行比对，比对图谱见图4。同样使用ChemPattern 2020版软件对四批样品进行相似度评价，相似度结果均<0.7，结果见表2。

2.5.4结果显示两种伪品与苣荬菜对照指纹图谱均存在显著差异，表明本研究建立的方法可以实现苣荬菜药材的真伪鉴别。

2.5.5主要共有峰的鉴定为进一步阐明苣荬菜的化学成分组成，采用电喷雾离子化(ESI)方式，以正离子扫描的方式获得了苣荬菜指纹图谱共有峰的一些结构信息，通过对照品指认，结合保留时间及质谱碎片信息，最终指认了5个指纹成分的化学结构，峰2、峰3、峰11、峰12及峰16分别为咖啡酰酒石酸、绿原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷及木犀草素，详细结果见表3。

表3共有峰成分鉴定结果

提取条件的选择对提取溶剂50％甲醇、70％甲醇、甲醇、水进行考察，对提取方法加热回流提取、超声提取进行考察，对提取时间30min，45min，60min进行考察，以色谱峰数、峰面积及峰形等为指标，最终选择以70％甲醇为提取溶剂，以超声45min作为提取方法。

质谱条件的选择分别对质荷比50～1000、100～1000和100～1500进行比较，结果100～1500范围内色谱峰信息相对较多，最终选择m/z 100～1500区间作为扫描范围。

依附HPLC-IT-TOF/MS技术建立的指纹图谱即使在色谱峰出峰时间存在稍有偏移的情况下，仍可以根据MS信息确认参照峰，进而进行校正，同时TIC指纹图谱可以提供更多更准确的成分信息，在一定程度上弥补了液相色谱分析存在的不足。

最后，需要说明的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种苣荬菜HPLC-IT-TOF/MS指纹图谱的检测方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备；

(2)供试品溶液的制备；

(3)色谱条件：以水(A，含0.05％甲酸)-甲醇(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱梯度：0～15min，15％～32％甲醇；15～35min，32％～38％甲醇；35～60min，38％～65％甲醇；质谱条件：离子源为ESI源，正离子扫描模式，离子积聚时间10ms；雾化气流速1.5L/min；扫描范围为m/z 100～1500；干燥气气压140kPa。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(3)中色谱条件为：色谱柱为Agilent C18色谱柱，5μm，4.6mm×250mm。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(3)中色谱条件为：色谱柱柱温：35℃，样品温度20℃，流速：1mL/min，进样量进样量3-10μL。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(3)中质谱条件为：曲线脱溶剂管温度200℃；加热模块温度200℃；CID能量50％；检测器电压，1.61kV。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(1)中，对照品溶液制备的具体方法为：精密称取咖啡酰酒石酸、绿原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷及木犀草素对照品，以甲醇为溶剂，制得各成分质量浓度分别为27.1μg/mL，35.5μg/mL，45.3μg/mL，29.6μg/mL及28.7μg/mL的混合对照品溶液，将以上对照品溶液置4℃保存，备用。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(2)中，供试品溶液制备的具体方法为：分别取样品适量，粉碎过筛，精密称取约0.5g粉末置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，称定重量，超声处理45min，放冷，摇匀，70％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

7.权利要求1-6任一所述的方法构建的苣荬菜指纹图谱。

8.权利要求1-6任一所述的方法在苣荬菜混淆品检测中的应用。

9.权利要求1-6任一所述的方法在苣荬菜药材真伪鉴别中的应用。