CN114563493A - 胆道闭锁评估系统、检测mmp-7的方法、试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了胆道闭锁评估系统、检测MMP‑7的方法、试剂盒和应用。胆道闭锁评估系统为基于MMP‑7和胆汁酸谱的胆道闭锁风险评估系统，胆道闭锁评估系统以受试者样本中MMP‑7的浓度和受试者样本中胆汁酸的浓度为输入，以风险评估结果为输出。采用本发明的技术方案，能够方便、高效、精准地对小儿胆道闭锁进行评估、筛查和/或诊断，显著提高了胆道闭锁诊断准确率，实现了无创精准诊断。

Description

胆道闭锁评估系统、检测MMP-7的方法、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及胆道闭锁评估系统、检测MMP-7的方法、试剂盒和应用。
背景技术
胆道闭锁是小儿严重肝胆外科疾病，以肝外胆管阻塞为特征，进而导致肝内胆汁淤积、肝脏损伤、肝脏进行性纤维化，若不及时诊断及治疗，患儿于1-2岁内即因肝功能衰竭而死亡。有数据统计，由于胆道闭锁所引发的肝移植手术占一岁以下婴幼儿肝移植手术的60％左右。并且亚洲地区发病率最高。
肝门空肠吻合术(Kasai portoenterostomy,KP)即葛西手术是胆道闭锁的首选治疗方案。临床研究表明该手术的预后效果与接受手术时间有着密切的关系。如果能够在病程早期(出生45天以内)进行Kasai手术，术后黄疸消除率和自体肝生存率显著提高，若超过90日龄，则患儿肝脏损伤及肝硬化较严重，往往预后较差，因此及时准确的早期诊断对于患儿有着重要的意义。
目前临床上使用较为广泛的胆道闭锁早期筛查手段为大便比色卡和超声检查。大便比色卡作为一种经济便捷的方法，通过对比婴儿粪便颜色与比色卡的色带，筛选出粪便颜色异常的婴儿并提醒家长及时就医。但是在早期，部分母乳性黄疸和生理性黄疸婴儿的粪便与胆道闭锁造成的阻塞性黄疸的患儿粪便颜色接近，容易混淆，降低了该方法的特异性。且大便比色卡的诊断准确性取决于患儿父母的依从性及医护人员的认知程度，不同观察人员得出的结论可能会有所不同。超声检查对Ⅰ型胆道闭锁有一定意义，能够发现肝门部的囊性占位，但对占大多数比例的Ⅲ型胆道闭锁的诊断价值有限。
胆道闭锁的术前诊断包括肝功能检查、放射性核素胆管显像、磁共振胰胆管成像、十二指肠引流液检查、经内镜逆行胆管造影、肝脏病理检查、腹腔镜探查及术中胆管造影，这些检查都有各自的局限性。
肝功能检查指标包括谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、间接胆红素(IBIL)、总胆汁酸(TBA)等生化指标，在众多指标中，GGT对胆道闭锁的灵敏度和特异性最高，但其灵敏度也只有75％。放射性核素胆管显像特异性较差，因其他胆汁淤积性疾病亦可造成该结果，导致假阳性率较高。磁共振胰胆管成像同样存在特异性较差、假阳性率较高的问题。十二指肠引流液检查操作困难，会加重患儿胆管阻塞情况，假阳性率较高，在临床上较少使用。经内镜逆行胰胆管造影在直视下纤维十二指肠镜通过十二指肠乳头插入胆管进行造影，对于小于3个月的婴儿较难进行，可诱发胰腺炎和胆管炎。肝脏组织活检可有假阴性结果，并且受到年龄限制，需多次穿刺明确诊断，对患儿造成较大痛苦。
对于上述常规检查均无法确诊的情况下，胆道闭锁最终确诊仍然依靠术中探查及术后病理，这些检查的创伤是较大的，且有近20％的患儿术后发现不是胆道闭锁。因此，胆道闭术前无创诊断亟待解决。
发明内容
本发明提供了胆道闭锁评估系统、检测MMP-7的方法、试剂盒和应用。采用本发明的技术方案，能够方便、高效、精准地对小儿胆道闭锁进行评估、筛查和/或诊断，显著提高了胆道闭锁诊断准确率，实现了无创精准诊断。
为解决本发明的技术问题，本发明提供以下技术方案：
一种胆道闭锁评估系统，所述胆道闭锁评估系统为基于MMP-7和胆汁酸谱的胆道闭锁风险评估系统，所述胆道闭锁评估系统以受试者样本中MMP-7的浓度和受试者样本中胆汁酸的浓度为输入，以风险评估结果为输出。
优选地，胆道闭锁评估系统中输入的受试者样本中胆汁酸的浓度为4-20项。
优选地，胆道闭锁评估系统中输入的受试者样本中胆汁酸的浓度为20项。
优选地，输入的胆汁酸浓度包括牛磺熊脱氧胆酸(钠)(TUDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)(THDCA)和牛磺脱氧胆酸(钠)(TDCA)的浓度。
优选地，输入的胆汁酸浓度包括牛磺熊脱氧胆酸(钠)(TUDCA)、牛磺胆酸(钠)(TCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨猪脱氧胆酸(GHDCA)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)(THDCA)、牛磺脱氧胆酸(钠)(TDCA)的浓度。
优选地，输入的胆汁酸浓度包括胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸(钠)、甘氨脱氧胆酸(钠)、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺胆酸(钠)、牛磺鹅脱氧胆酸(钠)、牛磺脱氧胆酸(钠)、牛磺熊脱氧胆酸(钠)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)、牛磺石胆酸、3α，7α-二羟基胆甾烷酸和 /或3α，7α，12α-三羟基胆甾烷酸的浓度。
所述胆道闭锁评估系统通过人工智能算法建立MMP-7和胆汁酸整合诊断模型。
本发明胆道闭锁评估系统包括筛选变量模块、逻辑回归模型建立模块、准确性判断模块、分析模块和风险评估结果输出模块。
优选地，胆道闭锁评估系统中的筛选变量模块对输入的受试者样本中的胆汁酸谱进行筛选，筛选出与胆道闭锁有显著相关性的变量。
优选地，输入的受试者样本中的胆汁酸谱为胆汁酸谱4-20项，筛选出的与胆道闭锁有显著相关性的变量为4-12项。
优选地，输入的受试者样本中的胆汁酸谱为胆汁酸谱4-20项，筛选出的与胆道闭锁有显著相关性的变量为4-8项。
优选地，输入的受试者样本中的胆汁酸谱为胆汁酸谱4-20项，筛选出的与胆道闭锁有显著相关性的变量为4项。
优选地，输入的受试者样本中的胆汁酸谱为胆汁酸谱20项，筛选出的与胆道闭锁有显著相关性的变量为4项。
优选地，筛选变量模块应用机器学习算法LASSO，通过留一交叉验证法(LOOCV)调整模型稳定程度，初步筛选出使残差平方和最小化的自变量，最终通过Stepwise方法筛选出胆汁酸谱中与胆道闭锁有显著相关性的变量。
筛选出的胆汁酸谱中与胆道闭锁有显著相关性的变量包括牛磺熊脱氧胆酸(钠)(TUDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)(THDCA)和牛磺脱氧胆酸(钠)(TDCA)。
优选地，逻辑回归模型建立模块以MMP-7浓度和筛选出的与胆道闭锁有显著相关性的变量为自变量，以胆道闭锁风险作为结局变量，使用Sigmoid函数(非线形)映射建立MMP-7 和胆汁酸整合诊断模型。
优选地，准确性判断模块对罹患胆道闭锁风险的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及AUC进行判断。
优选地，分析模块进行风险评估，风险评估结论用于受试者胆道闭锁风险高低的评估。
优选地，分析可以是与诊断模型的截断值(cutoff值)比较。优选地，诊断模型的截断值为 5。
优选地，所述风险评估结果输出模块根据评估结论将受试者分为高风险组和低风险组。其中高风险组提示有必要进行进一步临床诊断以确定检测对象是否具有胆道闭锁。
本发明还提供了一种胆道闭锁评估系统中检测MMP-7的浓度的方法，所述检测MMP-7 的浓度的方法为检测血清中MMP-7浓度的方法，检测血清中MMP-7浓度的试剂盒包括微孔反应板、校准品一、校准品二、校准品三、校准品四、校准品五、校准品六、低值质控品、高值质控品、酶结合物、洗涤液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、终止液、样本稀释液和封片；检测血清中MMP-7浓度的方法包括以下步骤：
(1)将血清样本，试剂盒平衡至室温；
(2)用样本稀释液将血清样本进行稀释；
(3)在微孔反应板上的样本孔中加入已稀释样本、校准质控孔中加入校准品和质控品，混匀、封板、静置孵育；
(4)采用洗涤液洗板；
(5)每孔中加入酶结合物，混匀、封板、静置孵育；
(6)采用洗涤液洗板；
(7)每孔中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺，混匀、封板、静置孵育；
(8)每孔中加入终止液，混匀；
(9)反应终止后读取每孔的吸光值。
所述微孔反应板为人MMP-7抗体包被的96孔酶标板。
所述校准品一为稀释剂。
稀释剂为thermo稀释液。
所述校准品二、校准品三、校准品四、校准品五、校准品六包括人重组MMP-7和稀释剂，其中，MMP-7的浓度分别为10-12ng/mL、22-26ng/mL、50-55ng/mL、100-110ng/mL、 200-220ng/mL。
低值质控品包括人重组MMP-7和稀释剂，其中，MMP-7的浓度为16-20ng/mL。
高值质控品包括人重组MMP-7和稀释剂，其中，MMP-7的浓度为100-120ng/mL。
所述酶结合物包括辣根过氧化物酶标记的人MMP-7抗体和稀释剂。
所述洗涤液包括磷酸盐和氯化钠。
所述终止液为硫酸。
所述样本稀释液包括PBS和小牛血清，其中，小牛血清的浓度为40-60m L/L。
所述采用洗涤液洗板包括手工洗板和自动洗板。
所述吸光值为在450nm处的OD值。
本发明还提供了一种胆道闭锁评估系统中检测MMP-7的方法，所述检测MMP-7的浓度的方法为检测干血片中MMP-7浓度的方法，包括以下步骤：
(1)样本的采集：使用一次性末梢采血器针刺指尖或足跟，取出干血片定量采集装置内的定量采血管，用定量采血管采集指尖血或足跟血，采血结束后将定量采血管插回干血片定量采集装置内的样本收集管中，定量采血管抵靠于样本收集滤纸上，保持整个定量采血管竖直放置，待血液样本全部转移至样本收集滤纸上时，移去定量采血管，放入干燥剂闭管干燥；
(2)样本的处理：将样本收集管内的干燥剂取出，将干血片稀释液加入到样本收集管内，随后将样本收集管置于混匀器上混匀；干血片稀释液包括PBS缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂，其中表面活性剂选自Tween、SPAN、曲拉通中的一种，稳定剂选自甘露醇、牛血清带蛋白、小牛血清中的一种，防腐剂为NaN3、PC300中的一种；
(3)样本的检测：取出一定量处理后的样本，用检测试剂盒进行检测。
所述干血片稀释液中表面活性剂的添加浓度为0.01-0.2％。干血片稀释液中稳定剂的添加浓度为1-10％。干血片稀释液中防腐剂的添加浓度为0.01-0.2％。
本发明还提供了一种检测MMP-7的试剂盒，所述检测MMP-7的浓度的试剂盒为检测干血片中MMP-7浓度的试剂盒，包括包被的微孔板、酶标二抗试剂、底物、终止液、校准品、低值质控品、高值质控品；其中，包被的微孔板的制备包括以下步骤：(1)配制包被液：包被液为碳酸缓冲液；(2)配制封闭液：封闭液包括PBS缓冲液、蔗糖、BSA及海藻糖；(3) 配制洗涤液：洗涤液包括磷酸盐缓冲盐溶液、表面活性剂和防腐剂；(4)将抗MMP-7单克隆抗体溶解于包被液中，用包被液配制成浓度为0.5-2μg/mL的抗体溶液；向微孔板内加入抗体溶液，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置12-36小时；取出微孔板，弃去孔内液体，拍干后每孔加入洗涤液，震荡后弃去洗涤液，加入封闭液，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置1-12小时；取出微孔板，弃去孔内液体，拍干，置于温度和湿度恒定的保温箱内干燥1-12小时，即得到包被完成的微孔板。
所述包被液的浓度为0.01-0.2mol/L。
所述封闭液的添加浓度为在0.001％-0.01％。
所述洗涤液中的表面活性剂为Tween、SPAN、曲拉通中的一种。添加浓度为0.01％-1％。
所述洗涤液中的防腐剂为NaN3、PC300中的一种。添加浓度为0.01％-1％。
所述底物选择3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
终止液为1-3mol/L的硫酸溶液。
选用外购的稀释液倍比稀释MMP-7蛋白，配制成浓度为190-220ng/mL、90-110ng/mL、 40-60ng/mL、15-30ng/mL、10-15ng/mL、0ng/mL的校准品。
低值质控品为16-23ng/mL的MMP-7溶液、高值质控品为80-120ng/mL的MMP-7溶液。
本发明酶标二抗试剂的制备包括以下步骤：(1)配制酶结合物稀释液：包括Tris缓冲液、 NaCl、BSA、蔗糖、防腐剂；(2)抗MMP-7多克隆抗体的标记：首先使用氧化剂高碘酸钠对辣根过氧化物酶进行氧化，反应结束后使用醋酸溶液进行透析，去除多余产物，将MMP-7多克隆抗体用PBS缓冲液溶解至0.1-2μg/mL，加入反应完毕的辣根过氧化物酶溶液，进行标记，辣根过氧化物酶的准确添加量根据待标记抗体的量进行计算，按照20-40：1的摩尔比进行添加，反应管置于混匀器上反应，反应结束后加入NaBH3CN，封闭，最后将反应液用超滤管超滤，收集上清液进行稀释即得到酶标二抗试剂。
所述酶结合物稀释液中，NaCl、BSA、蔗糖的添加浓度均为0.5％-5％,所述防腐剂为NaN3、 PC300中的一种，添加浓度在0.01％-1％之间。
用检测干血片中MMP-7浓度的试剂盒进行检测时，将50-200μL处理后的样本加入到微孔内，同时吸取50-200μL校准品加入到不同的微孔内(校准品加复孔)，震荡10-120秒后用封板机封板，37℃条件下孵育1-2个小时；弃去上清，拍干反应板后每孔加入200-400μL清洗液，重复清洗后拍干反应板；加入酶标二抗50-200μL，37℃条件下孵育1-2个小时；弃去上清，拍干反应板后每孔加入200-400μL清洗液，重复清洗后拍干反应板；加入底物 TMB50-200μL，震荡混匀，封板后37℃孵育5-30分钟；加入终止液20-100μL；放入酶标仪内，激发波长选择450nm，读取OD值，带入校准曲线内计算浓度。
本发明还提供了一种MMP-7在制备小儿胆道闭锁检测试剂盒中的应用，所述MMP-7来源于受试者的血清样本；所述血清样本与小儿胆道闭锁检测试剂盒接触，所述试剂盒采用上述检测血清中MMP-7浓度的试剂盒，MMP-7的截断值为15-25。
本发明还提供了一种MMP-7在制备小儿胆道闭锁检测试剂盒中的应用，所述MMP-7来源于受试者的干血片样本；所述干血片样本在样本收集管中进行处理，处理后的样本收集管中的液体与小儿胆道闭锁检测试剂盒接触，所述试剂盒采用上述检测干血片中MMP-7浓度的试剂盒，MMP-7的截断值为7-15。
本发明通过检测血清中MMP-7浓度的方法、检测干血片中MMP-7浓度的方法、检测MMP-7的试剂盒检测MMP-7的浓度，检测的MMP-7的浓度可以用于本发明胆道闭锁评估系统。
本发明利用自主研发试剂盒和方法检测MMP-7及胆汁酸谱项，确定了MMP-7单项诊断胆道闭锁诊断效能，并结合人工智能算法对MMP-7及胆汁酸谱数据进行整合，形成整合诊断模型，显著提高了胆道闭锁诊断准确率，实现了无创精准诊断。同时创新研发更无创、便捷采样方式，最终给各级医院提供无创精准诊断胆道闭锁的最优解决方案。
干血片普遍应用于新生儿遗传代谢病筛查，基本覆盖各级医疗机构，该种方式采血方便快捷，且样本易于保存及运输，其各项优势可以帮助各地基层医院实现对胆道闭锁的早期筛查与初步诊断，做到早发现早治疗。但是传统的干血片采集方法误操作几率较大。通常为非定量采血，直接将指尖血滴到采血卡上，或者用微量毛细管转移。直接滴血时，血滴的体积差异较大，需过度挤压，且存在重复滴血的可能。滤纸常裸露在外，样本污染的几率非常大。需要用专用工具在样本中心打下固定面积的血片，置于合适的容器中，用适当的萃取液萃取分析物，检测仪器常为高灵敏度的液相色谱(HPLC)或色谱-质谱联用仪(LC-MS)，操作费时费力，且存在交叉污染的可能。还存在滤纸的层析效应(中心边缘差异)，采血体积效应，及红细胞压积效应(又称红细胞比容,Hematocrit,HCT)影响检测准确度。
本发明创新性的提出了采用干血片定量采集装置进行检测的过程，采用创新的干血片的制备方法、干血片样本的处理方式，实现了定量采集10μl末梢血并将其全部吸附在管底的滤纸片上，创新设计从采样到分析全程封闭式可防止样本污染，同时可实现常温运输，大大降低检测成本及操作难度，并且诊断准确性高达80％以上。
本发明创新的人工智能整合诊断模型将体外生物标志物诊断胆道闭锁的准确率提高到 96％以上，极高的准确度给医生提供了一个值得信任的无创精准诊断胆道闭锁的方式，可大大避免漏诊误诊，降低手术确诊探查阴性率。
早发现、早诊断、早治疗，合理调配院内资源，减轻医院及患者家庭负担，提高患儿自体肝存活率，改善肝移植预后效果，提高患儿生存质量及生存年限。
附图说明
图1为风险分数在BA和非BA组中的表达情况。
图2为整合诊断模型诊断胆道闭锁的准确率。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一检测血清中MMP-7浓度的方法
1、仪器
酶标仪(检测波长450nm)；
2、检测样本
本试剂盒仅限于检测人血清样本。
血清样本在2℃～8℃条件下可保存7天；在-15℃-25℃条件下可保存6个月。
尽量避免样本的反复冻融，冻融次数不超过6次。
3、试剂盒主要组成成分
3.1微孔反应板：人MMP-7抗体(包被)，96孔酶标板；
3.2 MMP-7校准品一：稀释剂；
3.3 MMP-7校准品二至六：人重组MMP-7和稀释剂；校准品二中MMP-7的浓度为11.98ng/mL，校准品三中MMP-7的浓度为24.96ng/mL，校准品四中MMP-7的浓度为 51.09ng/mL，校准品五中MMP-7的浓度为103.65ng/mL，校准品六中MMP-7的浓度为 207.86ng/mL；
3.4 MMP-7低值质控品：人重组MMP-7和稀释剂；MMP-7的浓度为19.06ng/mL；
3.5 MMP-7高值质控品：人重组MMP-7和稀释剂；MMP-7的浓度为103.05ng/mL；
3.6酶结合物：辣根过氧化物酶标记的人MMP-7抗体(标记)和稀释剂；辣根过氧化物酶标记的人MMP-7抗体的浓度为4000X；
3.7洗涤液(20X)：磷酸盐和氯化钠；磷酸盐的浓度为65g/L，氯化钠的浓度为220g/L；
3.8 TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
3.9终止液：硫酸；
3.10样本稀释液：PBS(磷酸盐缓冲液)和小牛血清；小牛血清的浓度为50mL/L；
3.11封片；
4、检测方法
4.1将血清样本，试剂盒平衡至室温(20℃～25℃)；
4.2配制1X洗涤液：将洗涤液(20X)用纯化水进行20倍稀释，备用。
4.3血清样本进行预稀释：用样本稀释液将样本进行20倍稀释，如190μL样本稀释液中加入10μL血清样本，混匀待用；
4.4样本孔每孔加100μL已稀释样本；校准质控孔每孔加入校准品和质控品各100μL，校准品/质控品进行复孔检测；振荡混匀，封板，37℃静置孵育60min；
4.5手工洗板：弃去孔内液体，每孔加入300μL 1X洗涤液，静置5秒，甩干；共清洗4次并拍干；
自动洗板：用1X洗涤液清洗4次，每次300μL，静置5s，清洗完毕后拍干。
4.6每孔加入100μL酶结合物，混匀，封板，37℃静置孵育60min；
4.7洗板：重复步骤1.5；
4.8每孔加入TMB 100μL，混匀，封板，37℃静置孵育10min；
4.9每孔加入终止液50μL，混匀；
4.10酶标仪读数：反应终止后10分钟内读取各孔在450nm处的OD值。
5、测定结果的计算
5.1以校准品浓度值为X轴，对应OD450为Y轴进行四参数(4PL)拟合；
5.2根据校准曲线及样本OD值计算样本浓度值；
6、质量控制
实验符合以下判断条件，实验结果为有效，否则实验结果为无效。
1)校准曲线相关系数r≥0.9900；校准品六OD450不低于1.000，校准品一OD450不高于0.1500；
2)质控品测定结果在质控范围内，则测定结果有效；质控品测定结果不在质控范围内，则测定结果无效，需重新进行测定。
实施例二检测干血片中MMP-7浓度的方法
1、样本的采集
材料：市售一次性末梢采血器(安全锁卡式)、酒精棉球、干血片定量采集装置、利器盒。
干血片定量采集装置采用CN212513820U公开的干血片定量采集装置。干血片定量采集装置，包括样本收集管、定量采血管和样本收集滤纸。其中，所述样本收集管包括管体和管盖。所述管体为直管，所述管体的上端为圆形的管口，所述管体的下端为封闭的管底。所述定量采血管包括固定件和定量毛细管。所述固定件竖直插入至所述管体内，所述固定件的上部卡合于所述管口，所述固定件的下部伸入于所述管体内。所述样本收集滤纸水平设置于所述管体内，且位于所述管底与所述固定件的下部之间。所述固定件具有固定孔，所述定量毛细管呈竖直状态穿插于所述固定孔，所述定量毛细管的上端低于所述固定件的上部，所述定量毛细管的下端为采血端。所述采血端向下伸出于所述固定件的下部之外且抵靠于所述样本收集滤纸。所述固定件的上部与所述管口之间能在管口所在平面内发生相对转动，所述固定孔位于偏中心位置使所述定量毛细管与所述相对转动的中心轴不重合。
干血片定量采集装置特点：1.定量毛细管可进行10μl定量采血，依靠毛细作用充满液体实现定量，无需借助外部吸力，玻璃毛细管的长度固定且均一，定量结果准确，适合于微量样本采血分析。2.采血载体为玻璃纤维滤纸，定量采血后全部转移至滤纸片上，分析时将所有样本全部萃取(不同于传统的部分打卡萃取)，相比棉花滤纸有更高的萃取回收率，能够大幅改善HCT对萃取回收率的影响，使干血斑定量检测结果更加准确，能够进一步应用于内源分析物检测或治疗药物监测(TDM)。3.玻璃纤维滤纸直接使用萃取液处理，相当于是采用预打孔设计，无需再进行干血斑打孔操作，配合定量采血，可实现对样本的全部回收。传统采血卡样本萃取时需要用专用工具在样本中心打下固定面积的血片，操作费时费力，无法定量，且存在交叉污染的可能。本方法采用预成型微型滤纸片收集样本，省去打孔步骤，直接将萃取液加在收集管内萃取，节省了大量时间及耗材。4.一体化采血装置设计，可在同一个装置实现样本的采集、干燥、运输保存和萃取，避免了样本的污染。传统的采血卡滤纸曝露在外，采血后需裸露干燥，不同样本间交叉污染的风险很大。在保存、转移、萃取等过程中，由于持握不当等原因，样本也容易受到不明来源的污染。本方法采用的样本采集管，从采样到分析全程封闭式，内含干燥剂使样本无需曝露干燥，将样本污染的几率降到最低。
检测样本：干血片。采集部位：如指尖采血，取右手无名指内侧；如足跟采血，取小儿足跟内、外踝连线于足底中线相交点下0.2cm再向外旁开0.2～0.3cm处。
采集方法：使用酒精棉球对待采血处进行擦拭消毒，右手持一次性采血针，以30°～40°斜刺进针，然后轻轻挤压，用干棉签擦去第一滴血后继续挤压出血点，将干血片定量采集装置内的定量采血管取出，以水平的角度将定量毛细管的末端接触血液，待血液端到端充满整个定量毛细管。将定量采血管插回样本收集管，使定量采血管抵靠于样本收集滤纸上，保持整个采血管竖直放置，待血液样本全部转移至收集滤纸上时，移去定量采血管，放入干燥剂闭管干燥。
2、样本的处理
1)样本稀释液的配制：样本稀释液为PBS缓冲体系加入表面活性剂、稳定剂、防腐剂；其中缓冲液浓度为通用浓度，表面活性剂选自Tween、SPAN、曲拉通中的一种，添加浓度为 0.05％；稳定剂选自甘露醇、牛血清白蛋白、小牛血清中的一种，添加浓度为5％；防腐剂为 NaN3、PC300中的一种，添加浓度为0.05％。
2)将干血样本收集管内的干燥剂取出丢弃，使用移液枪吸取样本稀释液加入到样本收集管内(稀释比例为15～20倍，加入稀释液的准确体积依据采血管的规格确定)，随后将样本收集管置于混匀器上以500rpm的转速混匀1小时。
3、检测试剂盒的制备
a)微孔板的制备
配制包被液：包被液为碳酸缓冲液，浓度为0.05mol/L；
配制封闭液：PBS缓冲液(浓度为通用浓度)，依次加入蔗糖、BSA及海藻糖，添加浓度在0.001％；
配制洗涤液：PBS缓冲液(浓度为通用浓度)，加入表面活性剂(Tween、SPAN、曲拉通中的一种)和防腐剂(NaN3、PC300中的一种)，添加浓度为0.01％；
将外购的抗MMP-7单克隆抗体溶解于包被液中，用包被液配制成浓度为0.5μg/mL的溶液；
向96孔板内加入抗体溶液，每孔加样量为100μL，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置24小时；
取出96孔板，弃去孔内液体，拍干后每孔加入300μL洗涤液，震荡30秒后弃去洗涤液，加入封闭液，每孔300μL，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置4小时；
取出96孔板，弃去孔内液体，拍干，置于温度和湿度恒定的保温箱内干燥2小时，即得到包被完成的微孔板。
b)酶标二抗试剂的制备
配制酶结合物稀释液：Tris缓冲液依次加入NaCl、BSA、蔗糖，添加浓度为0.5％，防腐剂(NaN3、PC300中的一种)，添加浓度为0.01％；
抗MMP-7多克隆抗体的标记：首先使用氧化剂高碘酸钠对辣根过氧化物酶进行氧化，该氧化反应须在避光条件下进行。反应结束后使用醋酸溶液(浓度为1mM)进行透析，去除多余产物。将MMP-7多克隆抗体用PBS缓冲液溶解至0.5μg/mL，加入上述反应完毕的HRP溶液，进行标记，HRP的准确添加量根据待标记抗体的量进行计算，按照20：1的摩尔比进行添加。反应管置于混匀器上室温下反应两小时即可，反应结束后加入4mg/ml的NaBH3CN (反应体积的1/10)，在4℃条件下封闭两小时。最后将反应液用超滤管超滤，收集上清液进行稀释即得到酶标二抗试剂。
c)底物和终止液的制备
本试剂盒选用拉根过氧化酶，相应的底物选择3,3',5,5'-四甲基联苯胺，直接购买赛默飞世儿公司生产的TMB(货号：Thermo Scientific-34029)，开盖即用。
终止液的配制：终止液为2mol/L的硫酸溶液。
d)校准品的配制
选用外购的稀释液倍比稀释MMP-7蛋白，配制成浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、 25ng/mL、12.5ng/mL、0ng/mL，使用软件对浓度和OD值进行拟合即得到校准曲线。另配制100ng/mL和20ng/mL的MMP-7溶液作为高低质控品。
4、样本的检测
按照上文叙述的样本处理方法对样本进行处理后，取100μL加入到微孔内，同时吸取 100μL校准品加入到不同的微孔内(校准品加复孔)，震荡三十秒后用封板机封板，37℃条件下孵育一个小时；
弃去上清，拍干反应板后每孔加入300μL清洗液，重复清洗三次后拍干反应板；
加入酶标二抗100μL，37℃条件下孵育一个小时；
弃去上清，拍干反应板后每孔加入300μL清洗液，重复清洗三次后拍干反应板；
加入底物TMB100μL，震荡混匀，封板后37℃孵育十分钟；
加入终止液50μL；
放入酶标仪内，激发波长选择450nm，读取OD值，带入校准曲线内计算浓度。
实施例三胆汁酸谱检测
对样本进行液相色谱串联质谱分析，检测的胆汁酸谱20项包含项目：
胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、猪脱氧胆酸(HDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(钠)(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸 (钠)(GDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨猪脱氧胆酸(GHDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(钠)(TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(钠)(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(钠)(TDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(钠)(TUDCA)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)(THDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、3α， 7α-二羟基胆甾烷酸(DHCA)、3α，7α，12α-三羟基胆甾烷酸(THCA)。
实施例四胆道闭锁评估系统
1、建模
应用机器学习算法LASSO，通过留一交叉验证法(LOOCV)调整模型稳定程度，初步从胆汁酸谱20项中筛选出6个使残差平方和最小化的自变量，最终通过Stepwise方法筛选出 4项胆汁酸谱中与胆道闭锁有显著相关性的变量。
2、建立整合诊断模型
以胆道闭锁风险作为结局变量，以MMP-7及20项胆汁酸谱中与胆道闭锁BA有显著相关性的变量作为自变量，使用Sigmoid函数(非线形)映射建立逻辑回归模型。逻辑回归算法中的风险评估函数采用如下公式：
Fit(v)＝wi×v1+w2×v2+...+wn×vn+wn+1×M确定整合诊断模型准确性。
其中Fit(v)代表风险评估函数，vi(i＝1,2…n)代表筛选出的胆汁酸谱变量，M代表 MMP-7变量，wi(i＝1,2…n+1)代表各项自变量在评估函数中的权重。
3、联合临床诊断信息计算出整合诊断模型的截断值，并根据截断值计算模型判断是否罹患BA的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及AUC。
4、分析所述诊断标志物的表达水平以进行风险评估，所述分析可以是与整合诊断模型的截断值(cutoff值)比较，该风险评估结论可以用于检测对象胆道闭锁风险高低的评估。
下表展示了综合诊断模型对两例样本的风险分数计算以及根据截断值进行的风险评估结果。
样本 TUDCA CDCA THDCA TDCA MMP-7 风险分数 风险评估
样本01 0.051 0.033 0.118 <0.025 73.93 212 高风险
样本02 17.00 0.085 <0.025 <0.025 13.48 -65 低风险
由图1可知，风险分数在BA和非BA组中的表达情况中，整体人群中BA组的风险分数明显高于非BA组(p<0.001)。
5、根据评估结论将检测对象分为高风险组和低风险组，其中高风险组提示有必要进行进一步临床诊断以确定检测对象是否具有胆道闭锁。
准确度，特异性和敏感性检测：采用318份BA相关患者的血清、干血斑、胆汁酸谱数据进行准确度，特异性和敏感性检测，其中172例BA患儿，146例非BA患儿。由图2可知，本整合诊断模型诊断胆道闭锁的准确度达到96.9％，AUC达到99.2％，敏感度达到97.1％，特异度达到96.6％，皆高于单一MMP-7诊断模型(敏感度93％，特异度93.8％)以及单一胆汁酸谱诊断模型(敏感度84％，特异度88％)。
本发明胆道闭锁评估系统诊断胆道闭锁的准确率达到了96％以上，极高的准确度给医生提供了一个值得信任的无创精准诊断胆道闭锁的方式，大大避免了漏诊误诊，降低了手术确诊探查阴性率。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种胆道闭锁评估系统，其特征在于，所述胆道闭锁评估系统为基于MMP-7和胆汁酸谱的胆道闭锁风险评估系统，所述胆道闭锁评估系统以受试者样本中MMP-7的浓度和受试者样本中胆汁酸的浓度为输入，以风险评估结果为输出；输入的受试者样本中的胆汁酸谱为胆汁酸谱4-20项。
2.权利要求1所述的胆道闭锁评估系统，其特征在于，输入的胆汁酸浓度包括胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸(钠)、甘氨脱氧胆酸(钠)、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨猪脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺胆酸(钠)、牛磺鹅脱氧胆酸(钠)、牛磺脱氧胆酸(钠)、牛磺熊脱氧胆酸(钠)、牛磺猪脱氧胆酸(钠)、牛磺石胆酸、3α，7α-二羟基胆甾烷酸和/或3α，7α，12α-三羟基胆甾烷酸的浓度。
3.权利要求1所述的胆道闭锁评估系统，其特征在于，所述胆道闭锁评估系统通过人工智能算法建立MMP-7和胆汁酸整合诊断模型。
4.一种检测MMP-7的方法，其特征在于，所述检测MMP-7的方法为检测血清中MMP-7浓度的方法，检测血清中MMP-7浓度的试剂盒包括微孔反应板、校准品一、校准品二、校准品三、校准品四、校准品五、校准品六、低值质控品、高值质控品、酶结合物、洗涤液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、终止液、样本稀释液和封片；检测血清中MMP-7浓度的方法包括以下步骤：
(1)将血清样本，试剂盒平衡至室温；
(2)用样本稀释液将血清样本进行稀释；
(3)在微孔反应板上的样本孔中加入已稀释样本、校准质控孔中加入校准品和质控品，混匀、封板、静置孵育；
(4)采用洗涤液洗板；
(5)每孔中加入酶结合物，混匀、封板、静置孵育；
(6)采用洗涤液洗板；
(7)每孔中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺，混匀、封板、静置孵育；
(8)每孔中加入终止液，混匀；
(9)反应终止后读取每孔的吸光值。
5.一种检测MMP-7的方法，其特征在于，所述检测MMP-7的方法为检测干血片中MMP-7浓度的方法，包括以下步骤：
(1)样本的采集：使用一次性末梢采血器针刺指尖或足跟，取出干血片定量采集装置内的定量采血管，用定量采血管采集指尖血或足跟血，采血结束后将定量采血管插回干血片定量采集装置内的样本收集管中，定量采血管抵靠于样本收集滤纸上，保持整个定量采血管竖直放置，待血液样本全部转移至样本收集滤纸上时，移去定量采血管，放入干燥剂闭管干燥；
(2)样本的处理：将样本收集管内的干燥剂取出，将干血片稀释液加入到样本收集管内，随后将样本收集管置于混匀器上混匀；干血片稀释液包括PBS缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂，其中表面活性剂选自Tween、SPAN、曲拉通中的一种，稳定剂选自甘露醇、牛血清带蛋白、小牛血清中的一种，防腐剂为NaN3、PC300中的一种；
(3)样本的检测：取出一定量处理后的样本，用检测试剂盒进行检测。
6.一种检测MMP-7的试剂盒，其特征在于，所述检测MMP-7的试剂盒为检测干血片中MMP-7浓度的试剂盒，包括包被的微孔板、酶标二抗试剂、底物、终止液、校准品、低值质控品、高值质控品；其中，包被的微孔板的制备包括以下步骤：(1)配制包被液：包被液为碳酸缓冲液；(2)配制封闭液：封闭液包括PBS缓冲液、蔗糖、BSA及海藻糖；(3)配制洗涤液：洗涤液包括磷酸盐缓冲盐溶液、表面活性剂和防腐剂；(4)将抗MMP-7单克隆抗体溶解于包被液中，用包被液配制成浓度为0.5-2μg/mL的抗体溶液；向微孔板内加入抗体溶液，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置12-36小时；取出微孔板，弃去孔内液体，拍干后每孔加入洗涤液，震荡后弃去洗涤液，加入封闭液，包膜后置于温度和湿度恒定的保温箱内，静置1-12小时；取出微孔板，弃去孔内液体，拍干，置于温度和湿度恒定的保温箱内干燥1-12小时，即得到包被完成的微孔板。
7.权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，酶标二抗试剂的制备包括以下步骤：(1)配制酶结合物稀释液：包括Tris缓冲液、NaCl、BSA、蔗糖、防腐剂；(2)抗MMP-7多克隆抗体的标记：首先使用氧化剂高碘酸钠对辣根过氧化物酶进行氧化，反应结束后使用醋酸溶液进行透析，去除多余产物，将MMP-7多克隆抗体用PBS缓冲液溶解至0.1-2μg/mL，加入反应完毕的辣根过氧化物酶溶液，进行标记，辣根过氧化物酶的准确添加量根据待标记抗体的量进行计算，按照20-40：1的摩尔比进行添加，反应管置于混匀器上反应，反应结束后加入NaBH3CN，封闭，最后将反应液用超滤管超滤，收集上清液进行稀释即得到酶标二抗试剂。
8.一种MMP-7在制备小儿胆道闭锁检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述MMP-7来源于受试者的血清样本；所述血清样本与小儿胆道闭锁检测试剂盒接触，所述试剂盒采用权利要求4所述的检测MMP-7的方法中的试剂盒，MMP-7的截断值为15-25。
9.一种MMP-7在制备小儿胆道闭锁检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述MMP-7来源于受试者的干血片样本；所述干血片样本在样本收集管中进行处理，处理后的样本收集管中的液体与小儿胆道闭锁检测试剂盒接触，所述试剂盒采用权利要求6-7任一项所述的试剂盒，MMP-7的截断值为7-15。
10.权利要求4或5所述的方法、或权利要求6-7任一项所述的试剂盒检测的MMP-7的浓度在权利要求1-3任一项所述的胆道闭锁评估系统中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115064267A (zh) * 2022-07-25 2022-09-16 苏州药明泽康生物科技有限公司 一种胆道闭锁风险评估系统及其建立方法
CN115561458A (zh) * 2022-07-08 2023-01-03 华中科技大学同济医学院附属协和医院 用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102818866A (zh) * 2012-08-03 2012-12-12 上海交通大学医学院附属新华医院 用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物的应用
CN108267585A (zh) * 2017-12-28 2018-07-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于血清标志物mmp-7的胆道闭锁诊断试剂盒
WO2019094777A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for identifying and treating liver diseases and monitoring treatment outcomes
CN212513820U (zh) * 2021-01-07 2021-02-09 上海药明奥测医疗科技有限公司 一种干血片样本定量采集装置
CN113533596A (zh) * 2021-07-22 2021-10-22 上海市儿科医学研究所 基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102818866A (zh) * 2012-08-03 2012-12-12 上海交通大学医学院附属新华医院 用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物的应用
WO2019094777A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for identifying and treating liver diseases and monitoring treatment outcomes
CN108267585A (zh) * 2017-12-28 2018-07-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于血清标志物mmp-7的胆道闭锁诊断试剂盒
CN212513820U (zh) * 2021-01-07 2021-02-09 上海药明奥测医疗科技有限公司 一种干血片样本定量采集装置
CN113533596A (zh) * 2021-07-22 2021-10-22 上海市儿科医学研究所 基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUKOKA, T 等: "Total bile acid concentration in duodenal fluid is a useful preoperative screening marker to rule out biliary atresia", JOURNAL OF PEDIATRIC GASTROENTEROLOGY AND NUTRITION, vol. 67, no. 3, pages 383 - 387 *
KEJUN ZHOU 等: "Distinct plasma bile acid profiles of biliary atresia and neonatal hepatitis syndrome", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 14, no. 11, pages 1 - 27 *
ZHOU KEJUN 等: "Elevated bile acids in Newborns with Biliary Atresia（BA）", PLOS ONE, vol. 7, no. 11, pages 1591 - 1598 *
李明明: "血清胆汁酸谱诊断胆道闭锁的价值", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 8, pages 069 - 67 *
谌亚星 等: "血清基质金属蛋白酶-7在胆道闭锁儿童诊断中的临床价值评价", 中华小儿外科杂志, vol. 42, no. 9, pages 781 - 787 *
郑超 等: "基于高通量检测发现并验证胆道闭锁血清标志物", 中国循证儿科杂志, vol. 13, no. 5, pages 343 - 347 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115561458A (zh) * 2022-07-08 2023-01-03 华中科技大学同济医学院附属协和医院 用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法
CN115561458B (zh) * 2022-07-08 2023-12-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡及其制备方法
CN115064267A (zh) * 2022-07-25 2022-09-16 苏州药明泽康生物科技有限公司 一种胆道闭锁风险评估系统及其建立方法
CN115064267B (zh) * 2022-07-25 2022-11-29 苏州药明泽康生物科技有限公司 一种胆道闭锁风险评估系统及其建立方法

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