PT820522E - Testes e dispositivos para a deteccao de atresia biliar extra-hepatica - Google Patents

Description

Descrição “Testes e dispositivos para a detecção de atresia biliar extra-hepática” 1. Campo da invenção A presente invenção diz respeito ao diagnóstico de atresia biliar extra-hepática. Em particular, a invenção diz respeito à detecção de dipeptidil-peptidase IV como indicador da ocorrência de atresia biliar extra-hepática. 2. Antecedentes A atresia biliar reflecte a agénese total ou parcial da árvore biliar e noimalmente afecta os canais biliares extra-hepáticos em vez dos intra-hepáticos. A atresia biliar extra--hepática (ABEH) é uma doença rara heterogénea que é fatal se não for tratada. A incidência da ABEH varia consideravelmente em diversas zonas geográficas, mas estima-se que afecta anualmente, só nos Estados Unidos da América do Norte, 1 em cada 18 000 nados-vivos. A ABEH resulta do desenvolvimento descontínuo ou defeituoso dos canais biliares que conduzem ao intestino. Sem esses canais, os detergentes biliares começam a degradar a periferia dos feixes biliares do epitélio capilar biliar e estes materiais escapam-se para as formações sinusoides venosas do fígado, ligando-se por fim à circulação sistémica. Na maior parte dos casos, a atresia biliar desenvolve-se várias semanas após o nascimento, provavelmente a seguir a uma inflamação e a uma cicatrização dos canais biliares. Raramente se encontra nos nado-mortos ou no período neonatal imediato. A etiologia da resposta inflamatória é frequentemente desconhecida.

As crianças afectadas podem parecer normais no momento do nascimento e o diagnóstico apenas é feito devido à icterícia obstrutiva progressiva que surge entre as 3 e as 6 semanas de idade. Esta evolução reflecte as alterações patológicas no interior dos canais biliares na atresia biliar, designadamente uma evolução dinâmica que faz passar de um tracto biliar desobstruído no momento do nascimento para uma obstrução progressiva dos canais e cirrose biliar.

Os diagnósticos correctos podem excluir normalmente outras causas específicas de icterícia neonatal obstrutiva, tais como infecções específicas, galactosemia e fibrose cística, mas a diferenciação entre a hepatite neonatal e a ABEH pode ser difícil devido às semelhanças histológicas entre as suas modificações patológicas resultantes. O diagnóstico precoce é essencial, uma vez que a descompressão biliar com êxito passa a ser cada vez mais improvável à medida que aumenta a idade do paciente. Na ausência de avaliação e reconstrução cirúrgicas, a hipertensão biliar prolongada origina lesões hepáticas permanentes e progressivas que podem degenerar em complicações metabólicas, infecções, colangite esclerosante e cirrose e que podem induzir finalmente uma insuficiência terminal hepática. Assim sendo, na ausência de resultados que fundamentem de forma inequívoca um diagnóstico alternativo, a atresia biliar deve ser excluída.

Os valores da bilirrubina directa e total, as enzimas hepáticas, a fosfatase alcalina e os níveis séiicos de ácidos biliares excluem normalmente infecções e doenças metabólicas, mas não permitem distinguir com nitidez entre a ABEH e a hepatite neonatal. Estudos de imagiologia, envolvendo uma avaliação radiográfica e exames por meio de ultra-sons feitos à vesícula biliar e aos canais biliares extra-hepáticos, podem ser úteis mas não são específicos. A aplicação de um tubo nasoduodenal e a recolha de uma amostra de fluído duodenal por drenagem gravítica durante 24 horas pode revelar a presença de bílis (a bilirrubina não pode ser medida); a excreção de bílis é uma prova bastante convincente contra um diagnóstico de atresia biliar completa. No entanto, um procedimento deste tipo é invasivo. Um outro procedimento invasivo é a biópsia hepática percutânea que exige uma interpretação feita por um médico experiente.

Se o diagnóstico continuai a ser duvidoso em termos de exclusão de ABEII, é necessário realizar uma laparotomia antes dos dois meses de idade, uma vez que as crianças que padeçam de ABEH irão desenvolver cirrose biliar irreversível se a operação for adiada. Os canais biliares atréticos podem ser ieanastomosados com êxito em 5% a 10% das crianças. A ABEH é uma doença progressiva e se não for efectuada uma intervenção cirúrgica correctiva antes da idade aproximada de 6 semanas, a hipótese de sobrevivência é apenas de cerca de 25%. Se o procedimento concetivo não for realizado, ou se não tiver êxito, é necessário efectuar um transplante de fígado. Por tal motivo é crítico detectar a ABEH entre as 2 e as 8 semanas de idade.

Depois de ter sido diagnosticada, a ABEH é tratada cirurgicamente. Alguns pacientes (± 15%) com ABEH apresentam lesões anatómicas que são resolvidas por um procedimento anastomótico em que é efectuada a sutura directa da mucosa intestinal à de uma árvore biliar extra-hepática mais próxima que esteja desobstruída. A maior parte dos pacientes (± 85%) não são elegíveis para uma anastomose directa. O prognóstico para estes pacientes era sem esperança e previa-se-lhes um curto período de vida antes dos procedimentos cirúrgicos de Kasai de hepatoportoenterostomia que consiste em fazer a anastomose cirúrgica directa de mucosa-a-mucosa da porta hepática ao intestino. (Karrer et ai, Surg. Clin. North Am., 70:1403-18 (1990) e Tagge et al., Arm. Surg. 214:590-8 (1991)). No caso de haver lesões permanentes no fígado, o tratamento por excelência é a transplantação hepática (Ryckman et al., Semin. Liver Dis. 7:134-54 (1987); Wall W.J., Can. Med Assoe. J. 139:21-8 (1988); e Esquivei et al, J. Pediatr. 111:1039-45 (1987)).

Com o recurso aos procedimentos de pesquisa para um diagnóstico precoce, o número de transplantações precoces desnecessárias pode eventualmente ser reduzido por meio de uma intervenção cirúrgica oportuna. Nos países e nas regiões onde não seja possível fazer «ma transplantação de fígado, o diagnóstico precoce seguido de uma correcção cirúrgica é a única hipótese de sobrevivência para os pacientes que padeçam de ÂBEH.

Cerca de 1/3 de todos os recém-nascidos parecem ter icterícia no momento do nascimento. Cerca de 1/10 deles continuam a ter um aspecto de quem tem icterícia depois de decorridos aproximadamente 10 dias. Estes recém-nascidos são candidatos possíveis para um diagnóstico de ABEH. No Reino Unido foi aconselhado recentemente um programa de despistagem da ABEH. No entanto, a utilidade do programa de despistagem foi debatida calorosamente devido à falta de uma tecnologia de detecção simples e específica (Logan eí al., Lancet 342:256 (1993)). Assim sendo, a existência de um teste simples, exacto e não invasivo para a avaliação da ABEH seria inestimável para o diagnóstico precoce e subsequente tratamento.

Na obra ‘Chemical Abstracts’, Vol. 104, n° 11 de 17 de Março de 1986, Columbus, Ohio, E.U.A., página 471, coluna 1, Resumo n° 86338 (S. Maeyama) estão indicados níveis maiores de actividade sérica da gbcilprolma-dipeptidil-aminopeptidase (GPDA) em diversas doenças hepáticas e nela se sugere a utilização da avaliação da actividade sérica da GPDA para o diagnóstico de doenças hepatobiliares. O documento US-A-4 191 808 (Nagaísu et al.) descreve a actividade de X-prolil-di-peptidil-aminopeptidase em presença de X-L-prolina-Y, em que o símbolo X representa um resíduo aminoácido e o símbolo Y representa p-nitroanilma, p-fenil-azoanilina ou 4-fenil-azo-l--naftilamina, como medida de carcinomas e doenças hepatobiliares.

Na obra ‘Chemical Abstracts’, Vol. 113, n° 5 de 30 de Julho de 1990, Columbus, Ohio, E.U.A., página 257, coluna 2, Resumo n° 36831 G.W. McCaughan et al.) está descrita a distribuição tecidular, a purificação e a sequência de aminoáddos do terminal N da dipeptidil--peptidase IV da superfície das células canaliculares biliares, utilizando a metodologia de contrastação da iimuiupcioxidasc com um anticorpo monoclonal.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a diversos métodos de ensaio para avaliar a probabilidade de atresia biliar extra-hepática. Um método exemplificativo da presente invenção consiste em fazer contactar uma amostra que se pretenda testar com um substrato de protease reactivo com a dipeptidil-peptidase IV, iniciando-se assim uma reacção, e detectando depois a reacção do substrato ou a formação de um produto de reacção detectável. A existência de reacção ou a presença do produto de reacção são consequência da presença de dipeptidil-peptidase IV na amostra que se pretende testar e são indicadores de atresia biliar extra-hepática O substrato pode ser de tipo substrato cromogénico e a presença de dipeptidil-peptidase IV é indicada pela produção de um produto de reacção corado. Como substratos possíveis refere-se Xaa-Pro-para-nitro-analida e Xaa-pro-coumarina, em que o símbolo Xaa designa qualquer aminoácido sintético ou que ocorra naturalmente.

Outro ensaio possível para a avaliação da probabilidade de haver atresia biliar extra--hepática, de acordo com a presente invenção, consiste em fazer contactar a amostra que se pretende tratar com um primeiro anticorpo específico para a dipeptidil-peptidase IV, para assim se produzir dipeptidil-peptidase IV ligada ao anticorpo. A dipeptidil-peptidase IV ligada ao anticorpo é então levada a contactar com um reagente de detecção, por exemplo, um substrato de protease, um segundo anticorpo marcado específico para a dipeptidil-peptidase IV ou um segundo anticorpo especifico para a dipeptidil-peptidase IV que se ligue indi-rectamente a um marcador detectável, formando assim um produto de reacção detectável. A formação de um produto de reacção detectável resulta da presença de dipeptidil-peptidase IV na amostra que se pretende testar e indica a probabilidade de haver aíresia biliar extra-hepática.

Os ensaios podem ser realizados em dispositivos dc ensaio próprios para analisar uma amostra que se pretenda testar e para avaliar a probabilidade de haver atresia biliar extra--hepática. Na sua forma elementar, esses dispositivos compreendem uma fase sólida que contém ou que está recoberta com um substrato reactivo com a dipeptidil-peptidase IV, reagindo o substrato com a dipeptidil-peptidase IV existente na amostra que se pretende testar e produzindo um produto de reacção detectável que é indicador da existência de atresia biliar extra-hepática.

Outro dispositivo analítico para a determinação da presença ou da quantidade de dipeptidil-peptidase IV numa amostra que se pretenda testar compreende uma fita de um material poroso que tem uma extremidade proximal e uma extremidade distai, em que a amostra que se pretende testar pode ser deslocada da extremidade proximal até à extremidade distai por acção capilar. Imobiliza-se um anticorpo num local de captura situado entre as extremidades proximal e distai, anticorpo esse que se liga à dipeptidil-peptidase IV. Como reagente indicador, colocado no local de captura ou colocado sobre a referida fita a montante do referido local de captura, é possível utilizar um anticorpo marcado que se ligue à dipeptidil--peptidase IV e produza um sinal detectável no local de captura, indicando assim a presença ou a quantidade de dipeptidil-peptidase IV na amostra que se pretende testar. O dispositivo pode conter facultativamente uma almofada de aplicação em que há contacto do fluxo do fluído com a extremidade proximal da fita, em que a referida almofada de aplicação recebe a amostra que se pretende testar e contém o reagente indicador. Além disso, o reagente de captura pode ser imobilizado no interior da fita, em um ou vários locais discretos de captura.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS A figura 1 traduz as acrividades de dipeptidil-peptidase IV e leucina-amino-peptidase em amostras de urina de pacientes de contraprova e naqueles que padeçam de ABEH. A figura 2 traduz a actividade de dipeptidil-peptidase IV em amostras de soro. A figura 3 traduz a actividade de leucina-amino-pcptidase cm amostras dc soro.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A presente invenção compreende o diagnóstico de atresia biliar extra-hepática (ABEH) mediante a detecção de níveis elevados de actividade da dipeptidil-peptidase IV na urina e no soro. A dipeptidil-peptidase IV (DPPIV; E.C.N. 3.4.14.5, também conhecida por proteína co-estimuladora dos timócitos ou CD26) é uma protease com uma distribuição tecidular muito específica. Está localizada na face lumenar das células epiteliais que revestem os canais biliares (ver Bristol et al., J. Immunol. 148:332-338 (1992) e 149:367-372 (1992)). A hipótese em que assentou a presente invenção foi a de se ter considerado, no pressuposto de que os detergentes biliares não libertados degradavam o epitélio, que a DPPIV que estava sob pressão nos canais incompletos poderia então escapar-se através das junções apertadas entre as células e passar para o sangue. Isto sugeriu que se examinasse o sangue e a urina de um paciente para se pesquisar actividade do tipo da actividade da DPPIV.

Foram efectuadas medições de DPPIV e de leucina-aminopeptidase (LAP, CD13, E.C.N. 3.4.11.2) em amostras de soro e de urina de pacientes aos quais havia sido previamente diagnosticada ABEH e também de pacientes com icterícia provocada por hepatite virai ou por incompatibilidade com o grupo ABO. Os resultados indicaram o potencial do diagnóstico diferencial do ensaio e demonstraram que a actividade elevada de DPPIV é um sinal indicador de existência de ABEH. Concluiu-se que um nível de DPPIV na urina, tipicamente não inferior a 1 nmol/min/mL ou mais preferencialmente não inferior a 2 nmol/min/mL ou um nível da mesma substância no soro não inferior a 15 nmol/min/mL, era um sinal indicador de existência de ABEH.

Posto isto, a presente invenção proporciona um método barato e fácil para a realização de ensaios praticáveis para efectuar a despistagem da ABEH. Além disso, as variações dos níveis séricos das actividades de LAP e DPPIV podem constituir uma ajuda complementar aos testes de diagnóstico já existentes, enzimáticos ou de outro tipo, para o diagnóstico diferencial da ABEH. Além do mais, os ensaios da presente invenção e os dispositivos para a execução desses ensaios podem ser utilizados para monitorizar pacientes a seguir a uma intervenção cirúrgica correctiva.

Uma variante da presente invenção compreende um ensaio químico para pesquisa da DPPIV. No ensaio utiliza-se um substrato enzimático que reage com a DPPIV para formar um produto de reacção detectável. Em alternativa, é possível monitorizar a velocidade de reacção do substrato para se determinar a presença ou a quantidade de DPPIV numa amostra que se pretenda testar. Entre os substratos enzimáticos adequados refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os substratos dipeptídicos tais como Xaa-Pro-para-nitro--analida (Xaa-Pro-PNA) ou Xaa-Pro-coumarina. O aminoácido variável, Xaa, pode ocorrer naturalmente ou pode ser um aminoácido sintético. Como exemplo de um substrato dipeptidico refere-se Gli-Pro-para-nitro-analida (Gli-Pro-PNA). Para um comprimento de onda de 405 nm, o substrato não tem nenhuma absorvência; no entanto, se o substrato dipeptidico for clivado (a seguir a Pro) devido à presença de DPPIV, é possível visualizar, por métodos espectrofotométricos, a formação de um produto de reacção, uma vez que aparece uma cor amarelo-esverdeada. E possível visualizar outros substratos, tais como Xaa-Pro-coumarina, por métodos espectrofotométricos, uma vez que é produzida uma emissão fluorescente na reacção.

Os ensaios em que são utilizados tais reagentes e tais reacções podem ser executados num vaso de reacção adequado, por exemplo, um tubo de ensaio ou uma cavidade de uma placa de microtitulação. Em alternativa, é possível conceber dispositivos de ensaio descartáveis, tais como os modelos com fitas de prova ou varetas de prova por imersão que são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e que são fáceis de fabricar c utilizar. Tais dispositivos de ensaio descartáveis podem ser acondicionados sob a forma de estojos que contenham todos os materiais e reagentes necessários e as instruções para utilização. Esses estojos poderiam ser fornecidos aos pais dos recém-nascidos cuja icterícia não tivesse desaparecido ao fim de cerca de 10 dias. Estes recém-nascidos poderiam ser acompanhados de peito e monitorizados pelos testes da presente invenção para se detectar a presença ou a quantidade de DPPIV numa amostra de teste (de preferência a urina para detecção em ensaios domésticos) e para assim se avaliar a probabilidade de haver alresia biliar extra-hepática.

Os dispositivos de ensaio para a execução dos testes da presente invenção poderiam ser concebidos vantajosamente sob a forma de dispositivos com fitas de prova ou varetas de prova por imersão. Por exemplo, é possível fazer uma vareta de prova por imersão a partir de uma peça de um material bíbulo contendo um substrato cromogénico para a DPPIV. Em alternativa, a vareta de prova por imersão pode ser feita a partir de um material não poroso que é recoberto com o substrato. Ao ocorrer o contacto entre o dispositivo e a amostra de teste desejada, irá haver uma interacção entre o substrato e a DPPIV existente na amostra, ocorrendo uma reacção detectável sobre o dispositivo.

Numa variante alternativa, o dispositivo pode ser uma fita de teste em que o substrato fica contido em uma ou várias zonas ao longo do comprimento de uma fita de um material bíbulo. Ao ocorrer o contacto de uma extremidade da fita com a amostra de teste desejada, a amostra de liquido migra ao longo do material bíbulo. A reacção do substrato e a produção de um sinal detectável indicam a presença de DPPIV na amostra de teste. Num dispositivo dc zonas múltiplas, o número de zonas discretas ou isoladas ao longo do comprimento da fita, que produzem um sinal detectável, também podem indicar a quantidade de DPPIV existente na amostra de teste. Em alternativa, uma parte importante da fita de teste pode conter o substrato. O comprimento da zona de reacção de cor que ocorre numa fita dc teste que possua uma única zona de substrato alongada, pode servir para indicar a presença ou a quantidade de DPPIV na amostra de teste.

De acordo com uma variante de ensaio alternativa, a velocidade a que a reacção ocorre pode ser detectada como sinal indicador da quantidade de DPPIV presente na amostra de teste. Por exemplo, a velocidade a que o substrato reage pode servir para indicar a quantidade de DPPIV existente na amostra de teste. Em alternativa, a velocidade a que se forma o produto de reacção pode servir para indicar a quantidade de DPPIV que há na amostra de teste.

Ainda de acordo com outra variante, é possível realizar um ensaio de captura ou de ligação para se detectar e/ou quantificar a protease. Por exemplo, é possível imobilizar um anticorpo reactivo com a proteína DPPIV, mas que não interfira com a actividade de peptidase, sobre uma fase sólida. Faz-se passar a amostra de teste sobre um anticorpo imóvel e a DPPIV, se estiver presente, liga-se ao anticorpo e fica imobilizada para detecção. Depois é possível acrescentar um substrato e é possível detectar o produto de reacção para indicar a presença ou a quantidade de DPPIV existente na amostra de teste. Na presente memória descritiva, a expressão “fase sólida” pode ser utilizada para designar qualquer material ou recipiente no qual ou sobre o qual o ensaio possa ser realizado, e compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, materiais porosos, materiais não porosos e lamelas, cavidades e tubos de ensaio, etc..

Num dispositivo exemplificativo de fita de teste, junta-se facultativamente uma almofada de aplicação da amostra que se pretende testar a uma extremidade de uma fita porosa. A fita contém um anticorpo imobilizado que se irá ligar à DPPIV e consequentemente a irá imobilizar num local predeterminado para subsequente detecção. De forma facultativa, o dispositivo pode compreendei uma extremidade de um indicador de ensaio que esteja colocado na extremidade distai da fita de teste mais afastada do local de contacto da amostra que se pretende testar. A extremidade do indicador de ensaio produz um sinal detectável ao entrar em contacto com a amostra que se pretende testar ou com um reagente de ensaio, indicando assim que o ensaio está completo.

Uma almofada de aplicação de uma amostra que se pretende testar pode ser uma parte da própria fita porosa ou pode ser um material em que haja contacto do fluxo de fluídos com a extremidade da fita porosa, designada por extremidade proximal, de tal modo que a amostra que se pretende testar possa passar ou migrar da almofada de aplicação para a fita porosa. O contacto por fluxo de fluídos pode incluir o contacto fisico da almofada de aplicação com a fita porosa e também a separação da almofada de aplicação da fita porosa por meio de um espaço de permeio ou um material adicional que permita no entanto que os fluídos corram entre a almofada de aplicação e a fita porosa A almofada de aplicação pode sobrepor-se quase toda para permitir que a amostra de teste passe praticamente por todos os pontos da almofada de aplicação até à extremidade proximal da fita porosa Em alternativa, pode haver apenas uma parte da almofada de aplicação que permita o contacto por fluxo de fluídos com a fita porosa A almofada de aplicação pode ser feita de um material que permita transferir a amostra de teste para a fita porosa A fita porosa do dispositivo de ensaio pode ser feita de qualquer material convenientemente absorvente, poroso, bíbulo, possuidor de propriedades cromatográficas ou capilares, através do qual uma amostra que se pretende testar, contendo o analito (substância analisável) possa ser transportada por capilaridade ou por impregnação. Como fita porosa é possível utilizar materiais naturais ou sintéticos ou ainda materiais que ocorram naturalmente e que sejam modificados por via sintética, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os materiais celulósicos, Utis como papel, celulose e derivados dc celulose, por exemplo, acetato de celulose e nitrocelulose; fibras de vidro; tecidos, tanto os de origem natural (v.g. algodão) como os sintéticos (v.g. ‘nylon’); geles porosos, tais como gel de sílica, gelose, dextrano e gelatina; matrizes fibrosas porosas; materiais à base de amido, tais como os materiais com cadeias de dextrano reticuladas; materiais cerâmicos, películas de policloreto de vinilo e combinações de policloreto de vinilo e sílica; e outros que tais. Λ fita porosa não deve interferir com a produção de um sinal detectável. A fita porosa deve ter uma resistência inerente razoável ou então essa resistência pode ser conseguida por meio de um suporte suplementar.

As dimensões particulares da fita porosa são determinadas por razões de conveniência, dependendo isso do tamanho da amostra de teste em causa, do protocolo de ensaio, dos meios para a detecção e da medição do sinal e de parâmetros idênticos. Por exemplo, as dimensões podem ser escolhidas para regular a velocidade de migração dos fluídos e também a quantidade de amostra de teste que se pretende que fique embebida na fita porosa

Num dispositivo possível de fita de teste, é possível imobilizar um substrato de DPPIV e/ou um anticorpo de captura de DPPIV sobre a fita porosa para que se forme pelo menos um local de detecção do analito, isto é, a região da fita porosa na qual são aplicados um ou vários reagentes de ensaio, de uma forma não difusa Num outro dispositivo da invenção, a região de medição ou de detecção da fita de teste pode possuir vários locais que contenham um substrato de DPPIV e/ou um anticorpo imobilizado anti-DPPIV. De forma facultativa, os diferentes locais de detecção podem conter quantidades diferentes de substrato e/ou de anticorpo imobilizado anti-DPPIV, isto é, uma quantidade mais elevada no primeiro local de detecção e quantidades menores nos locais subsequentes. Por exemplo, se 20 ng de anticorpo capturarem a DPPIV numa proporção equivalente a 1 nmol/min/mL, então o primeiro local de detecção de um dispositivo de teste de urina pode conter eventualmente 90 ng de anticorpo anti-DPPIV, ao passo que os locais subsequentes irão conter 10, 20, 30, ctc. nanogramas de anticorpo. Após a adição da amostra de teste, o número de locais que apresenta um sinal detectável constitui uma indicação quantitativa da quantidade de DPPIV existente na amostra. Os locais de detecção podem ser configurados com qualquer forma adequadamente detectável e é normal assumirem a forma de uma barra a toda a largura da fita de teste.

De modo facultativo, o dispositivo com múltiplos locais de captura pode ser preparado de maneira a que praticamente toda a DPPIV, se não houver uma quantidade limiar de DPPIV na amostra de teste, se ligue ao anticorpo no primeiro local de captura e fique pois imobilizada nesse local. Se houver na amostra que se pretende testar uma quantidade acima da quantidade limiar de DPPIV, a parte restante da DPPIV irá ligar-se às zonas subsequentes de detecção do anticorpo imobilizado, existentes ao longo da fita de teste. Quanto maior for a quantidade de DPPIV existente na amostra que se pretende testar, tanto maior irá ser o número de locais de captura que irão apresentar um sinal de detectável devido à presença de DPPIV. Os especialistas na matéria inferem facilmente que também é possível produzir dispositivos que contenham locais múltiplos de substrato de DPPIV, em que a quantidade de substrato em cada um desses locais é dimensionada para produzir um resultado experimental quantitativo ou semiquantitativo.

Ainda de acordo com outra variante de ensaio, é possível detectar directamente a presença ou a quantidade de proteína DPPIV sem se medir a actividade de DPPIV. É possível produzir dispositivos e conceber imunoensaios qualitativos ou quantitativos com qualquer anticorpo adequado anti-DPPIV (v.g. o anticorpo anti-CD26 (TA-1) (Couletr Corporation, Miami, FL) ou tal como produzido e ilustrado na obra de Fleischer B. ‘CD26: A surface protease involved in T-cell activation’, “Immunology Todatf\ 15:181-184 (1994)). É possível produzir anticorpos policlonais e monoclonais de acordo com métodos perfeitamente dominados e utilizados fiavelmente pelos especialistas ua matéria. Há vários métodos conhecidos para imunoensaios utilizando imunorreagentes, em que pelo menos um dos imunorreagentes é marcado com um componente detectável de modo a poder ser identificado por via analítica. Por exemplo, a técnica de ensaio em “sanduíche” ou em “dois locais” pode implicar a formação de um complexo ternário entre um analito antigénico, tal como a DPPIV, e dois anticorpos. Um método conveniente para se detectar a formação do complexo numa técnica desse tipo consiste em prever um anticorpo marcado e um anticorpo não marcado ligados a um suporte de fase sólida, por forma a que o complexo possa ser isolado facilmente. Neste exemplo, a quantidade de anticorpo marcado que fica associado à fase sólida é directamente proporcional à quantidade de analito na amostra que se pretende testar.

Uma técnica alternativa é o ensaio “competitivo”. Segundo um exemplo de um ensaio competitivo, no mecanismo de captura é possível utilizar mais uma vez um anticorpo acoplado a uma fase sólida insolúvel, mas há um reagente marcado (em vez de um anticorpo marcado) que compete com o analito, presente na amostra que se pretende testar, pela ligação ao anticorpo imobilizado. De igual modo, um reagente imobilizado pode competir com o analito relevante por um anticorpo marcado. Nestes ensaios competitivos, a quantidade de reagente marcado capturado é inversamente proporcional à quantidade de analito presente na amostra.

Como exemplos de dispositivos que têm por base estes princípios refere-se os que se encontram descritos nas patentes de invenção e nos pedidos de patentes de invenção a seguir

indicados. Deutsch et al. descrevem um dispositivo de fita de teste cromatográfica nas patentes de invenção norte-americanas n— 4 094 647, 4 235 601 e 4 361 537. O dispositivo compreende um material capaz de transportar uma solução por acção capilar. Há diferentes áreas ou zonas da fita que contêm os reagentes necessários para a execução do ensaio de ligação e para que seja produzido um sinal detectãvel quando o analito for transportado para essas zonas ou através delas. O dispositivo é adequado para ensaios químicos e também para ensaios de ligação que são tipificados pela reacção de ligação entre um antigénio e um anticorpo complementar.

Depois disso já foram descritas inúmeras variações do dispositivo de Deutsch et ai. Por exemplo, Tom et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 366 241) descrevem um suporte bíbulo com uma zona imunossorvente onde fica contido um elemento imobilizado de ligação específica A amostra que se pretende testar é aplicada à zona imunossorvente, sendo o resultado do ensaio lido na zona imunossorvente.

Weng et al. (patentes de invenção norte-americanas 4 740 468 e 4 879 215) também descrevem um dispositivo de fita de teste e métodos para a realização de um ensaio de ligação. O dispositivo é utilizado com uma solução de teste que contém a amostra que se pretende testar, sobre a qual se suspeita que contenha o analito relevante, e com um elemento de ligação específica marcado que se liga ao analito. Greenquist et al. (patentes de invenção norte-- americanas n- 4 806 311 e 4 806 312) descrevem um dispositivo de ensaio por estratos para a realização de ensaios de ligação semelhantes aos descritos por Weng et al.. O termo “identificador”, tal como aqui utilizado, designa qualquer substância que directa ou indirectamente se liga à outro reagente ou analito do ensaio de ligação e que é capaz de produzir um sinal detectável visualmente ou por meio de instrumentos. Os diversos identificadores adequados utilizáveis na presente invenção podem ser seleccionados entre cromogénios; catalisadores; compostos fluorescentes; compostos quimioluminescentes; identificadores radioactivos; identificadores visuais directos, incluindo partículas não metálicas e metálicas coloidais, partículas corantes, enzimas ou substratos, ou partículas orgânicas de latexes poliméricos; lipossomas ou outras vesículas que contenham substâncias produtoras de sinais; e outras substâncias idênticas. O identificador pode ser acoplado indircctamcntc a um anticorpo específico para a DPPIV, por meio de outros ligandos, tais como avidina/biotina. Por exemplo, um anticorpo biotinilado pode ligar-se a um reagente constituído por avidina/identificador que se liga ao anticorpo biotinilado antes ou depois do anticorpo se ligar à DPPIV.

Rosenstein (publicação de patente de invenção europeia n° 0 284 232) e Campbell et al (patente de invenção norte-americana n° 4 703 017) descrevem métodos e dispositivos de ensaio para a realização de ensaios específicos de ligação, em que o identificador detectável preferido é uma partícula colorida constituída por um lipossoma que contém um corante. Bahar et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 868 108) descrevem um método e um dispositivo de ensaio para a realização de um ensaio de específico de ligação, em que o dispositivo dispõe de um suporte de zonas múltiplas. Eisinger et al. (patente de invenção norte--americana n° 4 943 522) descrevem um método e um dispositivo de ensaio para a execução de ensaios específicos de ligação utilizando uma membrana de fluxo lateral com poros grandes e de zonas múltiplas através da qual a amostra que se pretende testar é transportada por acção capilar.

Hochstrasser (patente de invenção norte-americana n° 4 059 407) descreve um dispositivo de vareta de prova por imersão que pode ser mergulhado num fluído biológico para a medição semiquantitativa do analito no fluído. A medição semiquantitativa do analito é realizada utilizando um conjunto de almofadas que contêm os reagentes, em que cada almofada do conjunto vai produzir uma cor detectável (isto é, um resultado positivo) na presença de uma quantidade cada vez maior de analito. No domínio dos dispositivos de varetas de prova por imersão também são relevantes as patentes de invenção norte-americanas n~ 3 802 842, 3 915 639 e 4 689 309.

Grubb et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 168 146) descrevem a utilização de um material poroso, sob a forma de fitas de prova, onde é imobilizado um anticorpo específico do antigénio, por ligação covalente à fita Mergulha-se a fita de prova numa solução sobre a qual se suspeite que contém um antigénio e espera-se que tenha lugar a migração capilar ascendente da solução na fita de prova. Há variantes de tais fitas de prova que estão descritas na patente de invenção norte-americana n° 4 435 504, em que se recorre à utilização de um sistema indicador com duas enzimas; na patente de invenção norte-americana n° 4 594 327 que descreve a adição de um agente aglutinante às amostras de sangue integral, o qual vai fazer com que os eritrócitos se agreguem na zona da fita adjacente à superfície interface ar/líquido; e na patente de invenção norte-americana n° 4 757 004 que descreve um sistema para regular a forma da frente de fluído que migra ao longo da fita de prova. O princípio em que se fundamenta o teste é melhor descrito na obra de Zuk et al., ‘Enzyme hnmunochromatography - A Quantitative Immunoassay Requiring No ínstrumentation’, “Clinicai Chemistry\ 31(7): 1144-1150(1985).

Indica-se a seguir outros exemplos de dispositivos de diagnóstico do tipo constituído por fitas. Swanson et al. (EP 088 636) descrevem um aparelho para a determinação quantitativa de um analito, o qual compreende um meio sólido, permeável aos fluídos, que contém um número predeterminado de zonas de reacção sucessivas e afastadas entre si. Freisen et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 861 711) descrevem um dispositivo de diagnóstico em forma de folha que contém vários sectores funcionais através dos quais a amostra tem de passar. Há pelo menos um dos sectores que dispõe de um reagente imobilizado que possui uma afinidade biológica para o analito ou para um complexo de analitos.

Neste domínio também são relevantes os trabalhos de Tanswell et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 642 930), Valkirs et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 727 019), Wolters et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 343 896) e Parfldi et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 298 685), Gordon et al., (patente de invenção norte--americana n° 4 956 302), Goidon et al. (patente de invenção nortc-amcricana n° 4 960 691) e Bolz et al. (patente de invenção norte-americana n° 4 020 151).

Conforme se pode inferir desta descrição de possíveis modelos de dispositivos, há uma actividade significativa no domínio dos dispositivos de ensaio descartáveis. Há uma procura cada vez maior de dispositivos em que apenas sejam necessários poucos ou mesmo nenhuns passos manipulativos para a realização do ensaio pretendido, de dispositivos que possam ser utilizados por pessoal com habilitações ligeiras e de dispositivos que permitam obter resultados que sejam minimamente afectados pelas variações na forma como o ensaio é executado. Outras particularidades importantes são a facilidade com que o sinal de detecção resultante pode ser observado e também a facilidade com que qualquer substância sinalizadora imobilizada no local de detecção pode ser distinguida da substância sinalizadora que tenha passado através do local de detecção.

Os resultados dos ensaios seguintes descrevem as medições de dipeptidil-peptidase IV e de CD13 (leucina-amino-peptidase neutra) (LAP, E.C.N. 3.4.11.2) no diagnóstico de ABEH. A DPPIV e a CD13 (LAP) são proteínas grandes associadas às membranas (aproximadamente com 100 kD) expressas no fígado nos canalículos biliares e no epitélio biliar, sobre a superfície do epitélio intestinal e sobre alguns canalículos renais, e também sobre células de origem hematopoiética.

Os resultados demonstram a utilidade do teste de DPPIV como procedimento para a detecção de ABEH. O recurso às medições de DPPIV na urina e também o exame físico rotineiro do paciente e o estudo das fezes e da urina, à procura de sinais de icterícia, proporcionam um procedimento útil de despistagem da ABEH. Os pacientes com elevada actividade urinária de DPPIV podem ainda ser sujeitos a testes para a pesquisa de enzimas séricas. O número de pacientes suspeitos de padecerem de ABEH, nesta altura, deve ser já suficientemente baixo de modo a não sobrecarregar a capacidade de diagnóstico radiológico, ultra-sonográfico e histológico dos hospitais pediátricos, garantindo assim o diagnóstico precoce e o tratamento imediato da ABEH.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Detecção da DPPIV

Mediu-se as actividades de DPPIV e LAP em amostras de urina e de soro em pacientes sobre os quais se sabia que padeciam de ABEH. Os ensaios foram realizados seis vezes antes da intervenção cirúrgica. Os pacientes (idade média igual a 8 semanas) haviam sido internados no hospital devido a icterícia persistente. Todos os casos haviam sido diagnosticados histologicamente por biópsias com agulhas.

As actividades enzimáticas foram medidas em triplicado a 24°C, misturando 100 pL ou 50 pL de amostra com 100 pL ou 50 pL de tampão de reacção (respectivamente DPPIV ou LAP) contendo 200 pmol de substrato cromogénico em ‘Triton X-100’ tamponado com Tris 0,1 M (0,1% v/v) a pH 7. os substratos foram Gli-Pro-PNA para a DPPIV e Leu-PNA para a LAP (qualquer destas duas substâncias é comercializada por Bachem, San Diego, CA).

Manteve-se as misturas a incubar durante 30 minutos em microplacas de 96 cavidades. Foram efectuadas leituras de densidade óptica 4 vezes durante a incubação com um filtro de 405 nm num leitor de EISLE (em inglês ELISÁ), em conformidade com as instruções do fabricante. Exprimiu-se a actividade enzimática em nmol/min/mL com base na curva de progressão calculada a partir da concentração dos substratos hidrolisados. A DPPIV purificada pode ser utilizada como contraprova positiva com a qual se compara os resultados do ensaio de DPPIV. A DPPIV purificada pode sei obtida de acordo com o método descrito por Bristol et al na obra J. lmmunoL 149:367-372 (1992). O tampão de reacção, sem substrato, serviu de contraprova negativa. A contraprova negativa não revelou um aumento na concentração do substrato hidrolisado, sugerindo tal facto que os substratos eram estáveis no ensaio.

As amostras de urina para os estudos de contraprova iniciais foram fornecidas por 50 voluntários saudáveis. Todos os voluntários haviam sido submetidos a testes de pesquisa de creatinina na urina, tendo revelado valores normais. As actividades enzimáticas urinarias não foram corrigidas devido ao nível muito baixo de actividade enzimática existente na urina normal. Para além dos voluntários saudáveis, recolheu-se também amostras de urina e de sangue de 5 recém-nascidos saudáveis com idades sensivelmente iguais (com o consentimento dos pais). Para efeitos de comparação com os pacientes que padeciam de ABEH, as medições de LAP e de DPPIV foram feitas nas amostras de soro e de urina retiradas de 4 recém-nascidos com icterícia devido a uma incompatibilidade do grupo ABO e retiradas de 16 crianças (idade média igual a 9,5 anos) com hepatite virai. Os testes laboratoriais de rotina incluíram as medições de GTP, GOT, yGT, AP e de bilirrubina. A análise estatística foi feita com a aplicação informática ‘Sigma Plot 5.0’ (Jandel Scientific Corporation, San Rafael, CA).

As actividades da DPPIV e da LAP na urina dos 50 voluntários jovens normais (idade média igual a 27 anos) foram respectivamente de 0,199 ± 0,224 nmol/min/mL e 0,078 ± 0,272 ητηοΙ/min/mL. As quatro amostras de urina dos pacientes de contraprova com idades a condizer revelaram uma actividade diminuta ou quase indetectável (0,06 ± 0,05 nmol/ /min/ml, para a DPPIV e 0,820 ± 0,215 nmol/min/mL para a LAP). Os pacientes que padeciam de ABEH apresentaram valores de 6,927 ± 3,45 nmol/min/mL e 8,52 ± 13,05 nmol/min/mL respectivamente para as actividades da DPPIV e da LAP na urina, diferindo a DPPIV significativamente (p < 0,05) da contraprova A figura 1 traduz a actividade da DPPIV na unna dos pacientes que padeciam de ABEH e nos de contraprova com idades sensivelmente iguais. As medições no grupo de ABEH foram realizadas seis vezes. Está indicado o número de pacientes de cada grupo (houve amostras de urina de dois pacientes que foram medidas duas vezes). As barras horizontais indicam o erro padrão. Há um único valor elevado (superior a 15 nmol/min/mL) da actividade da LAP que ficou fora da escala na figura.

Quando se fez a comparação da actividade da DPPIV sérica entre os pacientes de contraprova e os diferentes grupos patológicos (figura 2), ficou claro que os pacientes que padeciam de ABEH tinham uma actividade de DPPIV significativamente mais elevada (p < 0,05) do que a normal e também que apresentavam uma actividade de DPPIV mais elevada do que os pacientes com icterícia devido à incompatibilidade de tipo ABO. Os pacientes com hepatite virai apresentaram-se segundo dois grupos: um com valores tão baixos como os do grupo de contraprova (7 dos 16 pacientes) e outro com uma actividade de DPPIV (24-60 nmol/min/mL) cujos valores eram tão elevados como nos pacientes que padeciam de ABEH. Comparativamente com o grupo de contraprova, a actividade de LAP foi significativamente elevada (p < 0,05) nos pacientes com hepatite e foi ligeiramente elevada em três dos quatro pacientes que padeciam de ABEH. A figura 3 ilustra as medições da actividade de LAP sérica. Está indicada uma comparação do grupo de contraprova normal e dos diferentes grupos patológicos. As medições no grupo que padecia de ABEH foram feitas sete vezes. Está indicado o número de pacientes de cada grupo e as barras horizontais indicam o erro padrão.

Estes resultados ilustram o facto de a medição de actividade de DPPIV na urina constituir um método de despistagem da ABEH. Níveis de DPPIV pelo menos iguais a 1-3 nmol/rnin/mL indicam a existência de ABEH. Níveis elevados de DPPIV no soro, quando comparados com os níveis de LAP e de outras enzimas, têm um valor potencial de diagnóstico diferencial, v.g., as actividades de OPT e dc LAP são mais elevadas na hepatite virai do que nos pacientes com ABEH (dados não apresentados).

As CD26, DPPIV e CD 13 (LAP) são proteínas grandes associadas às membranas (têm aproximadamente 100 kD) expressas no fígado nos canalículos biliares e no epitélio biliar, na superfície do epitélio intestinal e em alguns canalículos renais e também nas células de origem hematopoiética. As enzimas existentes no soro são provavelmente formas transformadas e mais provavelmente possuem massas moleculares consideravelmente inferiores. Os níveis séricos elevados mostram a existência de uma boa correlação linear com os níveis urinários elevados para as duas enzimas (rLAP = 0,843, rDpprv = 0,87), sugerindo isso que as enzimas existentes no soro podem ser filtradas ou expelidas para a urina. Uma vez que as duas enzimas são expressas nos canalículos renais, as infecções urinárias podem representar eventualmente um problema de diagnóstico diferencial se forem medidos na urina níveis elevados de DPPIV ou LAP.

Exemplo 2

Ensaio da DPPIV com vareta de prova por imersão Aplica-se um substrato cromogénico, tal como Gli-Pro-PNA, a uma fita de papel de filtro e depois seca-se. A quantidade de substrato pode ser predeterminada de modo a que a reacção com DPPIV produza uma reacção detectável visualmente, v.g., é possível utilizar cerca de 80 nmol/cm2 de substrato/local de reacção. Depois faz-se contactar a ponta do papel com uma amostra de urina. Se a amostra testada contiver DPPIV, o substrato reage com a DPPIV e produz uma mudança de cor detectável.

Exemplo 3

Ensaio da DPPIV com uma fita dc prova

Aplica-se um substrato cromogénico (Gli-Pro-PNA, 80 nmol/cm2) em uma ou em várias zonas isoladas, sob a forma de barras dispostas a toda a largura de uma fita comprida de papel de filtro, e depois seca-se. A seguir faz-se contactar a ponta do papel com uma amostra do fluído que se pretende testar, tal como soro ou urina. A amostra vai embeber por capilaridade a fita de prova e consequentemente entra em contacto com o substrato isolado. Se a amostra que se pretende testar contiver DPPIV, o substrato reage com a DPPIV e produz uma mudança de cor detectável em uma ou em várias zonas de detecção. Fazendo variar a quantidade de substrato presente em cada uma das zonas, a produção de um sinal detectável pode ser quantitativa.

Exemplo 4

Dispositivo de fita de prova para a DPPIV

Na presente invenção, os ensaios de ligação podem envolver a ligação específica de DPPIV e/ou de um reagente indicador (que compreenda um identificador directa ou indi-rectamente acoplado a um anticorpo específico para a DPPIV) a um reagente de captura (que compreenda um segundo anticorpo anti-DPPIV). O reagente de captura imobiliza a DPPIV sobre um material cromatográfico ou então, pelo menos, atenua a migração do analito ou do reagente indicador através do material cromatográfico. O identificador, conforme descrito supra, vai permitir que o reagente indicador produza um sinal detectável que está relacionado com a presença ou com a quantidade de analito na amostra que se pretende testar. A selecção de um identificador particular não é crítica, mas o identificador deve ser capaz de gerar um sinal detectável quer por si próprio, tal como um sinal detectável visualmente, gerado por partículas orgânicas de látex polimérico coloridas, quer em conjunto com um ou vários componentes suplementares produtores de sinais, tais como um sistema produtor de sinais de tipo enzima/ /substrato.

Utiliza-se o reagente de captura, no ensaio de DPPIV, para facilitar a observação do sinal detectável, separando praticamente a DPPIV e/ou o reagente indicador relativamente a outros reagentes de ensaio e relativamente aos componentes restantes existentes na amostra que se pretende testar. De forma típica, imobiliza-se o reagente de captura no material croma-tográfico para se formar um “local de captura”, isto é, uma região do material cromatográfico à qual estão acoplados um ou vários reagentes de captura, de uma forma não difusa. O dispositivo de ensaio pode compreender um material cromatográfico que possui uma extremidade próxima! e uma extremidade distai, em que a amostra que se pretende testar se pode deslocar desde a extremidade proximal até à extremidade distai por acção capilar. O material cromatográfico contém o reagente de captura, isto é, o anticorpo anti-DPPIV, que é imobilizado num local de captura e que é capaz de se ligar à DPPIV. É possível prever uma almofada facultativa de aplicação da amostra que se pretende testar, onde ocone o contacto do fluxo de fluídos, na extremidade proximal do material cromatográfico. A almofada de aplicação pode ser utilizada para receber a amostra que se pretende testar e para fazer passar essa amostra para o material cromatográfico. A almofada de aplicação pode conter facultativamente um reagente indicador difusivo capaz de migrar da almofada de aplicação para o material cromatográfico. De preferência, o reagente indicador é capaz de se ligar à DPPIV, v.g., é um segundo anticorpo marcado anti-DPPIV. A ligação do reagente indicador à DPPIV tem como consequência a formação e um complexo ternário ou em sanduíche e um sinal detectável no 25 local de captora, indicando assim a presença ou a quantidade de DPPÍV na amostra que se pretende testar.

O reagente de captura pode ser colocado por cima ou no interior do material croma-tográfíco, segundo inúmeras configurações. Em variantes alternativas, o reagente de captura pode ser distribuído segundo um padrão qualquer conveniente para a dctccção, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os padrões segundo barras, riscas, números, letras, pontos e símbolos, tais como “%”, e quejandos que mostrem um sinal detectável depois de completado o ensaio. O método de ensaio é praticado facilmente colocando a amostra que se pretende testar, sobre a qual se presume que possa conter o analito, sobre a almofada de aplicação, assim se estabelecendo o contacto com o reagente indicador. A amostra que se pretende testar e o reagente indicador são transferidos para o material cromatográfico e migram através do material cromatográfico para estabelecerem contacto com o reagente de captura, daí resultando a produção de um sinal detectável no local de captura.

A descrição anterior dos casos específicos revela perfeitamente a natureza geral e a aplicabilidade da presente invenção por forma a que outras pessoas possam modificar, adaptar e/ou optimizar facilmente esses casos específicos para efeitos de escolha dos métodos e dispositivos de ensaio, utilizando diversos reagentes e materiais, sem que haja afastamento do presente conceito inventivo. Pretende-se que todas essas modificações e adaptações fiquem abrangidas no âmbito e no espírito dos equivalentes da presente invenção. Faz-se observar também que a fraseologia e a terminologia aqui utilizadas se destinam a fins descritivos, sem imporem nenhuma limitação.

Lisboa, 3 de Dezembro de 2001

Claims (2)

1. (?/y\ /y r 1 Reivindicações Método para avaliar a probabilidade de existência de atresia biliar extra-hepática, o qual compreende os passos seguintes: a) fazer contactar uma amostra que se pretende testar com um substrato de protease reactivo com dipeptidil-peptidase IV, para assim se iniciar uma reacção e b) detectar a reacção do referido substrato ou a formação de um produto de reacção detectável, em que a reacção ou a presença do produto de reacção resultam da presença de dipeptidil-peptidase IV na amostra que se pretende testar e constituem um sinal indicativo de atresia biliar extra-hepática Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido substrato é cromogénico e a presença de dipeptidil-peptidase IV é indicada pela produção de um produto de reacção colorido. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido substrato é seleccionado entre o conjunto constituído por Xaa-Pro-para-nitro-andida e Xaa-Pro-coumarina em que o símbolo Xaa representa um aminoácido sintético ou que ocorra naturahnente. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido substrato é Gli-Pro-para-nitro--anilida Método de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende também o passo que consiste em ligar primeiro a dipeptidil-peptidase IV, na amostra que se pretende testar, a um anticorpo anti-dipeptidil-peptidase IV. Ensaio para avaliar a probabilidade de existir aíresia biliar extra-hepática, o qual compreende os passo seguintes: a) fazer contactar uma amostra que se pretende testar com um primeiro anticorpo específico para a dipeptidil-peptidase IV, para assim se produzir dipeptidil-peptidase IV ligada ao anticorpo, b) fazer contactar a dipeptidil-peptidase IV, ligada ao anticorpo, com um reagente de detecção seleccionado entre o conjunto constituído por um substrato de protease, um segundo anticorpo marcado específico para a dipeptidil-peptidase IV e um segundo anticorpo específico para a dipeptidil-peptidase IV que se vai ligar indirectamente a um identificador detectável, para assim se formar um produto de reacção detectável; e c) detectar a formação do referido produto de reacção detectável, resultante da presença de dipeptidil-peptidase IV na amostra que se pretende testar, em que a presença de dipeptidil-peptidase IV é indicativa da existência de atresia biliar extra-hepática. Ensaio de acordo com a reivindicação 6, em que o referido reagente de detecção é um substrato de protease seleccionado entre o conjunto constituído por Xaa-Pro-para-nitro--anilida e Xaa-Pro-coumarina, em que o símbolo Xaa representa um aminoácido sintético ou que ocorra naturalmente. Ensaio de acordo com a reivindicação 6, em que o referido reagente de detecção é um anticorpo marcado anti-dipeptidil-peptidase IV. Ensaio de acordo com a reivindicação 6, em que o referido primeiro anticorpo é imobilizado num local isolado de uma fita de prova ou de uma vareta de prova por imersão. 3
2. 10. Método para avaliar a probabilidade de existir atresia biliar extra-hepática, o qual consiste em testar uma amostra de urina para se investigar a quantidade de dipeptidil-peptidase IV existente na amostra que se pretende testar, em que a presença de dipeptidil-peptidase IV numa quantidade não inferior a 1 nmol/min/mL é indicativa da existência de atresia biliar cxU a-hepática.

   Método para avaliar a probabilidade de existir atresia biliar extra-hepática, o qual consiste em testar uma amostra de soro para se investigar a quantidade de dipeptidil-peptidase IV existente na amostra que se pretende testar, em que a presença de dipeptidil-peptidase IV numa quantidade não inferior a 15 nmol/min/mL é indicativa da existência de atresia biliar extra-hepática. Lisboa, 3 de Dezembro de 2001