JPH01229965A - 抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体 - Google Patents

抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体

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JPH01229965A
JPH01229965A JP63057299A JP5729988A JPH01229965A JP H01229965 A JPH01229965 A JP H01229965A JP 63057299 A JP63057299 A JP 63057299A JP 5729988 A JP5729988 A JP 5729988A JP H01229965 A JPH01229965 A JP H01229965A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフィニティークロマトグラフィ用担体に関す
る。
（従来の技術〕 バイオテクノロジーの急速な発展は、従来の工業技術と
は異なる多様な付加価値のあるものの生産を可能にして
いる。すなわち遺伝子工学や細胞融合技術などの発展に
伴い、生物機能を利用する有用物質の生産Ｆｉますます
多岐にわたってきているが、それらの効率的な高純度精
製法は実験室的にも工業的にもＮ要な問題となっている
。例えば遺伝子操作はホルモンやリンホカインなどの極
微量の生理活性物質を工業レベルで生産することを可能
にしたが、これらの物質を安定かつ効率良く分離する操
作、不純物を除く操作など、高度の分離ｎ製技術が望ま
れている。この様な分離・精製は従来、ゲル濾過、イオ
ン交換などが利用されてきたが、必要な純度金得るには
多段階の操作を要し、コストも高く収率も低い。
本来、生体内で生理的な機能を発現するこの様な物質の
分離に、生体系における特異的分子認識を利用すること
は目的にかなったことと見られる。従って酵素と阻害剤
、酵素と基質、抗原と抗体、ホルモンとレセプターとい
った特定の生化学物対間の特異的親和力を利用して、分
離するといういわゆるアフイニテイクロマト応を利用す
るものはイムノアフイニテイクロマトグラフイといわれ
、生物学的親和特異性が著しく高いのが特徴である。こ
の方法によれば、目的物質に対する抗体ｋ　ＩＪガント
として不溶性の担体に結合させた吸着体を使用して目的
物質を選択的に吸着し、精製する。イムノアフイニテイ
クロマトグラフイは抗体作表の可能な蛋白質、糖蛋白質
、ペプチド、酵素、ペプチド系ホルモンなどに適用でき
る。
従来のイムノアフイニテイクロマトグラフイは抗原をウ
サギ、馬、牛、山羊などの動物に免疫して血液中より糖
蛋白質の抗体をとりだし、ゲル沖過、イオン交換、プロ
ティンＡアフイニテイクロマトグラフイなどで精製後、
不溶性担体に固定化する。次に抗体という蛋白質と抗原
との特異的結合能を介して免疫学的方法によって抗原を
精製する。抗原と抗体との結合は比較的強力であり、反
応後の複合体は安定である。
結合は可逆的であり、条件を変えることによって抗原は
固定化抗体より解離して精製される。
（発明が解決しようとする課題〕 上記従来の技術で用いられる抗体は蛋白質である。しか
るに抗原金倉む試料溶液は多くの場合、蛋白質分解酵素
（プロテアーゼ）を含む。
このため、固定化抗体が、プロテアーゼにより分解され
、アフイニテイクロマトグラフイ全利用する抗原との結
合の活性を失ってしまう。抗体には高価なものやごく微
量しか入手で゛きないものがあり、これを効率的に、即
ち失活させずに持続的に利用することが重要となる。本
発明はプロテアーゼにより分解されにくく、くり返し使
用しても活性を失ないにくい、抗体が固定。
化されたアフイニテイクロマトグラフイ用担体を提供す
ることを目的とする５゜ （課題全解決するための手段〕 本発明は、活性化ポリエチレングリコールフイニテイク
ロマトグラフイ用担体である。
活性化ＰＥＧの例としてはメトキンポリエチレングリコ
ールと塩化シアヌル酸の縮合物があり、後記実施例で使
用したものはＡ、　Ａｂｕｃｏｗｓｋｉ　：Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　２５巻３５８２ページ（１９７７年）の方法で調整
したものである。この活性化ＰＢＧで抗体を化学修飾す
る方法は次に示すとおりである。
（ＰＥＧ）　　　　　　　　　　　　　塩化シアヌル酸
４．６−ジクロロ−３−トリアジン） （上記式においてＡは抗体を表わす。）即ち、メトキシ
ＰＥＧと塩化シアヌル酸とを反応させてまず活性化ＰＥ
Ｇｋつくり、ついで抗体を付加すると活性化ＰＥＧで修
飾された抗体ができる。
又、他の活性化ＰＥＧとして次の様なものも利用しても
良い（昭和６１年生化学会講演要旨集４Ｐ−４Ｍ１１）
。
０　　　　０　　　ＨＯＨ Ｉｆ　　　　　　　　ＩＩ　　　　　Ｉｌｌ　　　　　
：ＨｓＣＯＰＥＧ−０−Ｃ−（ＣＨｔ）ｔ　ＣＮＨ−Ｃ
ＣＮＨ（ＣＬ）− ＣＨ。
ＰＥＧとしては分子量が種々なものがあるが、本発明で
は特に限定されない。
活性化ＰＥＧで修飾された抗体全担体に固定化するとプ
ロテアーゼ抵抗性が未修飾抗体の場合よりも大きくなる
のでアフイニテイカラムの活性が永く保たれ、長期にわ
たりアフイニテイクロマトグラフイによる精製が行ガわ
れ、経済的に効果がある。本発明の様にリガンドを修飾
して、リガンド効率をあげるということは従来の技術で
はないことであり、分離精製の技術の上で画期的なこと
である。
活性化ＰＥＧ修飾抗体固定化担体の調整方法は次の様な
ものがあるが、本発明は特に限定されず、どＸ７な方法
でも良い。
（イ）：活性化ＰＥＧ修飾抗体をつくり、これを担体に
固定化する。
（ロ）：抗体１４ず担体に固定化して、ついで活性化Ｐ
ＥＧで抗体を修飾する。
ｅｔ　：　＜イ）又は（ロ）の方法において抗体をあら
かじめ抗原でブロックしておく。
抗体を担体に固定化する方法は特に限定されるものでは
なく、例えば「実験と応用　アフイニテイクロマトグラ
フイー」（講談社、　　１９７６年）に記述されている
ようなハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビ
スエポキシド法、ヒドラジド誘導体法などを利用するこ
とができる。使用される担体もセルロース、デキストラ
ン、アガロース、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスな
どがあり、特に限定されない、担体の粒度、多孔性も特
に限定されない。
又、本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用担体ヲ裂
造するのに用いる抗体はポリクロナール抗体でもモノク
ロナール抗体でも良い。
実施例１ 抗原として牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する。
）を使用し、このＢＳＡの抗体を作製して担体に結合後
、活性化ＰＥＧで修飾しグロテアーゼ活性を調べた。そ
の詳細は以下のようである。
（１）抗ＢＳＡ抗体の作製・・・ウサギを用いて常法に
従って作製した（例えば、Ｅ、　５ａｄａ　、　Ｓ。
Ｋａｔｏｈ　＋　Ａ、　Ｋｏｎｄｏ　ａｎｄ　Ａ−Ｋｉ
ｙｏｋａｗａ　：　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｊａｐａｎ　１９巻５
０２ページ（１９８６年）参照）。
（２）抗体の担体への固定化・・・抗体’ｉ　０．１　
Ｍホウ酸バッファー＋　０．５　Ｍ塩化ナトリウムに５
Ｗ　／　ｍｌになる様に溶解させて抗体溶液とする。
不溶性担体として市販のファルマシア社のＣＮＢｒ−セ
ファロース（商標）４Ｂｔ−用いた。
抗体の固定化方法は常法通りで（例えば、「実験と応用
　アフイニテイクロマトグラフイ」（講談社、１９７６
年）参照）、次の様にしておこなった。ＣＮＢｒ−セフ
ァロース４Ｂの乾燥品２ｙ全１ｍＭ塩酸４００ｗ１を用
いて数回洗滌する。
これに前記の抗体溶液１４ｍ／を加え、４℃で１夜反応
させる。反応終了後同じリン醒バッファーでよく担体を
洗滌する、次いで０．１　Ｍエタノールアミン溶液１４
ｇ／ｉ加え、室温で２時間攪拌する。最後に上記のリン
酸バッファーでよく洗滌する。
（３）活性化ＰＥＧによる修飾・・・（３）の抗体固定
化担体ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ四ホウ酸ナトリウム水溶液７０ｍ
１に懸濁させ活性化ＰＥＣ１１９５ｍ９加え５°Ｃで１
時間攪拌した。同じ四ホウ酸ナトリウム水溶液でよく洗
滌した。この場合。添加活性化ＰＥＧのモル比は１．０
であった。尚、ここにいうモル比の針−■は次の式によ
る。
アミン残基数はトリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮ
ＢＳ法）で測定した。未修飾抗体固定化担体の場合はこ
の活性化ＰＥＧによる処理がない。
このようにして活性化ＰＥＧ修飾抗ＢＳＡ抗体給合アフ
ィニテイクロマトグラフィ用担体と抗ＢＳＡ抗体給金ア
フィニティクロマトグラフイ用担体が調整でき、抗体の
担体への結合量は紫外吸収スペクトルにおける２　８０
　ｎｍ　Ｌｖ吸収の測定結果者々９．０　！／　（ｍｌ
担体）であった。
（４）抗原（ＢＳＡ）結合針の測定・・・（３）で調整
した抗体結合の担体をカラムにつめて、直径１、８　ａ
ｘ、高さ２．８　ｆｆ、体積７．０　ｍｌのベツドとす
る。ＢＳＡ溶液（０，２”ｆ／　ｍｅ、０．１Ｍリン酸
バッファーｐＨ７，６）を約２００　ｗｔ流しＢＳＡを
飽和吸着させ、その後、０．ＩＮ−塩酸で脱着させ紫外
吸収スペクトルにおける２　８０　ｎｍの吸収の測定か
ら得られた脱着量より、プロテアーゼ処理前の抗体結合
担体のＢＳＡの結合量を算出した。実験は２５°Ｃで行
なった。
（５）　　プロテアーゼ分解処理・・・（４）のカラム
の担体を種々のプロテアーゼ溶液（５ｑ／ｍｌ：ペプシ
ン　０．１　Ｍ酢酸バッファー　ｐＨ８，６、トリプシ
ン、プロナーゼ　０．１　Ｍリン酸バッファーｐＨ７，
６）中に３０分間浸漬すること金１サイクルとし、これ
を繰返しおこなった。、実験温度は２５°Ｃである。
（６）　　プロテアーゼ処理後の抗原（ＢＳＡ）の担体
へ″の結合量・・・（り）の様にしてプロテアーゼ処理
した担体の各サイクル後の抗原（ＢＳＡ）の結合１１’
に測定してプロテアーゼ低抗性１ｍべた。ＢＳＡ結合量
の測定方法は（４）の通りである。
その結果全図１に示す。図１において、縦軸は処理前の
初期ＢＳＡ吸着！　（’１４／ｙｘｌ　）　Ａｉに対す
る分解処理後のＢＳＡ吸着量（’％’／　ｍｌ　）　Ａ
の比率を表わす。横軸はプロテアーゼ分解処理回数を表
わす。この結果から明らかな様に、特異的にペプチド結
合を切断するトリプシン、ペプシンでも活性化ＰＥＧで
修飾された抗体の方が分解を受けず、吸Ｎｉ：の減少率
が少なく、プロテアーゼに対する低抗性がある。非特異
的にペプチド結合を切断するプロナーゼでは、活性化Ｐ
ＥＧで修飾された抗体の方がプロテアーゼに対する低抗
性が著しく増加している。
実施例２ 次に活性化ＰＥＧの修飾モル比を種々変えて抗体の修飾
率を変化させた場合のプロナーゼに対する抵抗性を調べ
た。その方法は添加活性化ＰＥＧがモル比３の場合２９
２〜、モル比０．７の場合６８Ｍｆ、モル比０．５の場
合４９ｑと変わる以外は実施例１と同様である。
その結果を図２に示す。モル比０．７以上になると明ら
かにプロナーゼに対する抵抗性が増加していることが明
らかである。
〔発明の効果〕
本発明によればアフイニテイクロマトグラフイ用担体に
おける固定化された抗体がプロテアーゼにより分解され
にくく、くり返し使用によっても、その活性が持続する
。
【図面の簡単な説明】
れてなるアフイニテイクロマトグラフイ用担体用担体の
、種々のプロテアーゼでくり返し処理したときの活性低
下の様子を示す図である。第２図は、活性化ＰＥＧの修
飾モル比を種々変え４ヒ たときの不溶性担体に同価れた抗体をプロナーゼでくり
返し処理したときの該抗体の活性低下の様子を示す図で
ある。 これらの図において、Ａｔはプロテアーゼ処理前のＢＳ
Ａ吸着量（ｑ／ｍｅベツド）、Ａはプロテアーゼ処理後
のＢＳＡ吸着量（Ｗ　／　ｗｌペッド）を表わす。 又、第１図において、 ｒＯＪのプロットは非修飾固定化抗体のプロナーゼ処理
に対する活性低下の様子、 「△」のプロットは非修飾固定化抗体のトリプシン処理
に対する活性低下の様子、 「「口」のプロットは非修飾固定化抗体のペプシン処理
に対する活性低下の様子、 「・」のプロットは修飾された固定化抗体のプロナーゼ
処理に対する活性低下の様子、「ム」のプロットは修飾
された固定化抗体のペプシン処理に対する活性低下の様
子、をそれぞれ表わす。 図２において、「Δ」のプロットは未修飾固定化抗体の
、「・」のプロットは添加活性化ＰＥＧのモル比が３の
場合の修飾された固定化抗体の、「ム」のプロットは添
加活性化ＰＥＧのモル比が１の場合の修飾された固定化
抗体の、「關」のプロン′Ｆ−は添加活性化ＰＥＧのモ
ル比が０．７の場合の修飾された固定化抗体の、「マ」
のプロットは添加活性化ＰＥＧのモル比が０．５の場合
の修飾された固定化抗体の、プロナーゼ処理に対する活
性低下の様子を表わす。 以上

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 活性化ポリエチレングリコールで修飾された抗体が不溶
    性担体に固定化されてなるアフイニテイクロマトグラフ
    イ用担体。
JP63057299A 1988-03-10 1988-03-10 抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体 Expired - Lifetime JP2761881B2 (ja)

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CA000592993A CA1337402C (en) 1988-03-10 1989-03-07 Carrier for affinity chromatography immobilized antibodies and preparation thereof
KR1019890002875A KR910004069B1 (ko) 1988-03-10 1989-03-09 항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법
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