SU883053A1 - Иммуносорбент - Google Patents

Description

(54) 1{ММУНОСОРБЕНТ

Ti3o6peTeHHe относитс  к области получени  иммуносорбентов дл  иммунологических исследований. Иммуносорбенты представл ют собой иммобилизованные антигены (или антитела , способные к специфическим реакци м . Переведенные в нерастворимую форму они св зьшают антитела (или антигень ) , которые при этом также стано в тс  нерастворимыми. Отмыва  затем иммуносорбент, удал ют все возможные примеси, загр зн юцц е препарат антител (или антигенаУ, которые далее, после диссоциации иммунного комплекса можно выделить в чистом виде. Одной из главных характеристик иммуносорбента  вл етс  его емкость, т.е. то максимальное количество антител , которое можно извлечь одним миллилитром сорбента. Емкость в основном определ етс  количеством антигена, иммобилизованного на одном миллиметре носител  и стерической доступностью этого св занного антигена. Известны различные иммуносорбенты. Дл  их получени  белок ковалентно св зывают с матрицей . Сложность синтеза иммуносорбентов состоит в том, что различные антигены имеют очень широкий спектр физико-химических и иммунологических свойств, и поэтому фактически каждый антиген требует индивидуального подхода . Известен иммуносорбент, представл ющий собой коллаген 1 типа, св занный с диазотированной парааминОбензилцеллюлозой (РАВ-целлюлоза l,, Указанный сорбент получают следующим образом. Парааминобензилцеллюлозу модифицируют - диазотируют смесью сол ной кислоты и нитрита натри  на холоде . Затем при смешивании диазотированного производного ПАБ-целлюлозы с раствором коллагена происходит иммобилизаци  последнего с образованием иммуносорбента. Недостатком сорбента  вл етс  его мала  емкость (0,06 мг антител/мг 38 j/larena в сорбенте , поскольку не удаетс  иммобилизовать достаточно большое количество антигена (коллагена) на единицу объема иммуносорбента. Это происходит по многим причинам. Во-пер вых, коммерческий препарат ПАБ-целлюлозы имеет малое количество параамйно бензильных групп и- они труднодоступны дл  таких крупных неглобул рных белков как коллаген. Во-вторых, получаемое при диазотировании активное производное ПАБ-целлюлозы не стабильно в физиологических услови х, при которых происходит иммобилизаци . Кроме этого, стерические затруднени  привод т также к тому, что иммобилизованны белки, имеющие малое количество антигенных детерменант, как, например, коллаген, плохо работают как иммуносорбёнты . Кроме того, изготовление им муносорбентов на основе ПАБ-целлюлозы очень трудоемко. Полученные по этому методу сорбенты мало подход т дл  колоночной аффинной хроматографии вслед ствие малой механической прочности, котора  вызывает усадку сорбента в ко лонке и затрудн ет работу с ним. Целью изобретени   вл етс  новый иммуносорбент на основе коллагена 1 типа, обладающего высокой емкостью, механической прочностью и минимальной неспецифической сорбцией компонентов сывороток. Указанна  цель достигаетс  свойствами нового иммуносорбента, представл ющего собой коллаген 1 типа, св зан ный с модифицированным полиакриламидным гелем и имеющий следующий элементарный состав .(на сухое вещество) ,%: С 50,,02 Н 7,04±0,01 О 22,53tO,01 N 19,72±0,01 S 0,003 ±0,001 Соединение представл ет собой белый водонаполненный гель с содержанием воды от 75% до 97%, слаборастворимо в диамине и не растворимо в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне , эфире и уксусной кислоте. Способ получени  нового иммуносорбента основан на известном методе 2 иммобилизации белков на полиакриламид ном геле, модифицированном глутаровым альдегидом и осуществл етс  следующим образом. Сначала провод т модификацию полиакриламидного гел , которую ведут дли тельно и в больщом избытке глутарово3 го альдегида при комнатной температуре , так как амидные группы полиакриламида реагируют с альдегидами не очень активно. При использовании 3-10% глутарового альдегида в реакционной смеси за 10-30 ч при комнатной температуре достигаетс  высока  степень модификации исходного гел . После окончани  активации удал ют избыток глутарового альдегида и тщательно омывают водой активированный гель. Так как получаемое на этой стадии активное производное полиакриламида-и глутарового альдегида вполне устойчиво при физиологических услови х в широком инТ рвале температур, дальнейшую иммобилизацию коллагена с полученным ранее гелем провод т в фосфатном буфере рН 8,0-9,4 при 16-25С в течение 20-60 ч с последующим восстановлением азометиновых св зей и альдегидных групп продукта. В результате степень пришивки белка подчас превьшает 90%, т.е. почти весь коллаген св зываетс  с нерастворимой матрицей-гелем. Предлагаемый иммуносорбент позвол ет сорбировать более 0,2 мг белка антител на 1 мл сорбента, что более чем втрое превышает аналогичный показатель известного сорбента. Полученный иммуносорбент отличаетс  механической прочностью и химической стабильностью. Высока  механическа  прочность обеспечиваетс  использованием в качестве матрицы гранулированного полиакриламидного гел . Химическа  стабильность св зана с химической стабильностью гел -носител  и „высокой устойчивостью коллагеновых белков к различным денатурационным воздействи м , и с тем, что образовавщиес  в ходе иммобилизации относительно лабильные азометиновые св зи (основани  ШнФфа) в конечном продукте восстановлены . Указанные свойства позвол ют в хроматографических колонках, наполненных сорбентом, обеспечить высокую скорость подачи раствора. Так, нанесение сыворотки и элюци  провод тс  со скоростью 1-2 мл/см, а отмывка колонки от неспецифически св завшихс  белков - со скоростью 3-20 мл/см, что вдвое быстрее, чем с известным сорбентом . Сорбент выдерживает многократные обработки водными растворами буфером с рН от 2 до 11, водными растворами 8 М мочевины, 5 М гуанидина, 3,5 М роданида натри . 5 Отмеченные химическа  стабильность и механическа  прочность предлагаемого иммуносорбента позвол ют использовать его в различных иммунологических исследовани х лабораторий и клиник де с тки раз без заметного изменени  сор ционных свойств и не перепаковыва  хроматографические колонки. Предлагаемый иммуносорбент обладает также очень низкой неспецифической сорбцией (около 1,7 мкг неспецифических белков на 1 мл.сорбента). Пример 1. 60 гсухого гранулированного полиакриламидного гел  (ра,змер гранул 35-75 мкм) суспендируЮ1 в 300 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 8,5. Набухший гель занимает объем 230 мл. В суспензию внос т 150 мл 25%-ного глутарового альдегида, довод т рН до 8,0 и оставл ют перемешиватьс  на магнитной мешалке при комна ной температуре на сутки. После этого полученньй активированный глутаровым альдегидом гель отмывают на ворон ке со стекл нным фильтром раствором хлористого натри  до полного исчезновени  запаха глутарового альдегида и еще 1,5 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0. Отфильтрованный насухо гель внос т в 230 мл раствора с концентрацией 2,3 мг коллагена первого типа в миллилитре фосфатного буфера 0,15 М, рН 9,0. Общий объем реакционной смеси 440 мл, в ней содержитс  в общей сложности 529 мг коллаге.на. После тре . суток перемешивани  на магнитной мешалке при комнатной температуре гель отфильтровывают, промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, 1 л 1 М хло ристого натри  и снова 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0. Охлаждают гель в 0,15 М фосфатном буфере рН 9,0 до и, насухо отфильтровав, вн с т его в охлажденный до 0°С раствор 5 г боргидрида натри  в 150 мл этого же буфера. Реакционную смесь интенсив но перемешивают на холоде магнитной мешалкой в течение 40 мин, а затем отфильтровывают. . ПолучениъпЧ восстанов ленный гель проьшвают 1 л холодного 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, а за тем при комнатной температуре заливают гель буфером 0,2 М глицин-НС 1 рН 2,2 дл  полного разложени  остатков боргидрида натри . После прекращени  выделени  пузырьков водоуида 1ело про мывают 1 л О,15 М фосфатного буфера рН 9,0 и затем 2 л изотонического , раствора хлористого натри . Получает534 с  240 мл гел , пригодного дл  использовани  в качестве иммуносорбента. Один миллилитр конечного продукта содержит 2 мг иммобилизованного коллагена I типа (т.е. 90,7% введенного в реакционную смесь белка иммобилизуетс  на носителе . Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,70% углерода, 7,04% водорода, 22,53% кислорода , 19,72% азота, 0,003% серы. Полученное вещество представл ет собой водонаполненный гель белого цвета, содержащий 75% воды, который не раствор етс  в воде, водных растворах солей и ни в каких распространенных органических растворител х за исключением диамина. Хран т полученньй иммуно- сорбент при в изотоническом растворе хлористого натри  с добавлением 0,02% азида натри . П р и М е р 2. Услови  получени  соединени  идентичны описаннь1М в примере 1 за исключением того, что в качестве носител  дл  приготовлени  иммуносорбента берут 5 г крупнопористого гранулированного полиакриламидного ,ч гранулированного полиакриламидного гел  (с тем же размером гранулV Общий объем полученного гел  составл ет .. 180 мл. Полученное соединение содержит 1,1 мг иммобилизованного коллагена I типа на 1 мл гел  конечного продукта . Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,70% углерода, 7,04% водорода, 22,53 кислорода, 19,72% азота, 0,002% серы. Полученное вещество представл ет собой водонапол- ненный полиакриламидный гель, содержащий 97% воды. Как видно из примеров 1 и 2, понижение содержани  сухого вещетсва в составе гел -носител  с 25% (пример l) до 3% (пример 2) приводит к снижении содержани  иммобилизованного коллагена в конечном продукте из-за уменьшени  количества активных групп, возникающих в результате активации матрицы . Пример 3. Услови  получени  соединени  идентичны описанным в примере 1 за исключением времени активации носител  глутаровым альдегидом, которое в данном случае составл ет 9 ч. Полученное соединение содержит 1,2 мг иммоби-тизованного коллагена 1 типа на 1 мл гел  конечного продукта. Общий объем полу--.енного гел  составл ет 240 мл. Количество соединенногос носителем коллагена зависит o-i степени активации носител .

Как видно из примеров 1 и 2, на свойства полученного сорбента вли ет врем  активации носител  глутаровым альдегидом, которое должно быть не менее 10 ч. Активаци  длительнее 30 ч нецелесообразна, так как это не ведет к увеличению степейи пришивки коллагена к носителю.

Сорбционна  активность полученных соединений иллюстрируетс  следующим примером.

Пример 4. 30 мл иммуносорбента , полученного в примере 1, заполн ют колонку диаметром 16 мм и длиной 160 мм. Колонку с сорбентом, предварительно обработанным нормальной сывороткой , промывают 100 мл буфера 0,1 глицин-НС 1 рН 2,2, а затем изотоническим раствором хлористого натри  до нейтрального рН выход щего раствора . После этого наноситс  100 мл иммунной сыворотки с титром 1:1000 по РИГА (реакци  пассивной гемагглютинации ) со скоростью 20-30 мл/ч, котора  смываетс  изотоническим раствором хлористого натри  до нул  оптической Плотности при 280 нм выход щего из лонки раствора. Обычно требуете 300500 мл жидкости дл  полного отмывани  колонки от неспецифических белков. Дл элюцйи св завшихс  с сорбентом антител используют 100 мл 0,1 М буфера глицин-HGl рН 2,2 при скорости протока 5-10 мл/ч. Из 100 мл указанной иммунной сыворотки элюируетс  около 6 м чистых антител, причем основна  их часть выходит из колонки в объеме 6-10 мл. При этом выход щие из колонки антитела растворены и изотопическом растворе хлористого натри  Heirrрального рН, не содержащем глицина. Полученные элюаты, содержащие чистые антитела, при необходимости концентрируют ультрафильтрацией и хран т замороженными при -25°С.

Claims (2)

1.R. Timpl, Н. Furthmayr, C.Steffen , W.Ooleschel, Isolation of pure anti-collagen antibodies using a specific Immunoadsorbent technigue,

Z. Ifnmupitatsforsch, 1967, 134, 4, 391-396.

2.Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова,

1, М., 1976, изд-во

к. Мартинека. Т. МГУ, с. 184.