JPS639865A - 脊椎動物の組織中で抗体形成を開始する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は脊椎動物の組織中で抗体形成を開始する方法に
関する。

従来の技術 抗体はヒト−および動物医薬での診断−および治療目的
のためにならびに生化学の分野での分析目的のために幅
広く適用する。ウィルス疾患の治療および予防のための
血清は数十午前から使用されている、古典的な抗体製剤
である。

抗体の発生のための通常の方法はいわゆる免疫反応とし
て抗体を生じる、脊椎動物の組織中での抗体の投与で成
立する。これは直接脊椎動物の血液から得られるか、ま
たは処理された組織を取り除き、これを抗体装造細胞培
地にさらに発展させる。

抗原は脊椎動物の組織中で大体において急速に分解する
ので、抗原は十分に強い抗体形成に至るまで、たいてい
数回投与されねばならない。

既に抗原は、それ自体は脊椎動物の組織中で崩壊しない
、粒子形の担持物質に結合された。

このような支持体結合された抗原は多くの場合強められ
たまたは延長された免疫反応を開始することかできる。

支持体への抗原の結合は吸着により行う。たとえばウィ
ルス、Ｆａｂ−断片または花粉抗原を水酸化アルミニウ
ムーデル、微細結晶セルロース、アクリルアミド、メチ
ルメタクリレートまたはイオンのビニルモノマーを主体
とする合成ポリマーに吸着結合した（米国特許 第３６５１２１３号明細書；　Ｇ、　Ｔ、ステイーブン
ソン（５ｔｅｖｅｎｓｏｎ　）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）１９７４．２４７（５４４１）、第４７７〜４７
８ページ：西ドイツ国特許出願公開第１９４２１９６号
明＃ｌ書；西ドイツ国特許出願公開第１９４２１６１号
明細書）。吸着結合は抗原が結合工程により変化しない
という利点を有するが、結合が可逆的であり、そこで抗
原が結合されていない状態よりよりゆるやかに、しかし
それにもかかわらずひっきりなしに失われるという欠点
を有する。

Ｕ、グレシエルースチュクート（Ｇｒピｓｃｈθ１−８
ｔ１−８ｔｅ　）その他は抗原−タンパク質をポリアク
リルアミド−支持体に共有結合し く　Ｕ、　Ｇｒ’ｏｅｃｈｅｌ−８ｔｅｗａｒｔその他
、ヒストケミスト　リ　−　（Ｈｌｓｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　　）　　５　　Ｑ　　、　　２７１〜２７９（
１９７７年））およびイエクサヤ−組織中で免疫反応を
得た。共有結合はアミド基の形成下に抗原のアミノ基に
影響を及ぼす。根本のアミノ基とは反対にアミド基は電
気的に中性である。

抗原の電気化学的状態はまたこの結合によりアミド基を
介して変化する。これは、免疫反応も変化し、結合され
ていない抗原のためによりわずかに特異的であるという
結果を生じる。さらにアミケ結合は加水分解安定でない
。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、脊椎動物の組織中への抗原の導入の陳
腐められた特異性の抗体の形成が始まり、さらに抗体形
成の時間をできるかぎりさら纜延長することである。

問題点を解決するための手段 この課題は本発明により特許請求の範囲に記載された方
法により解決する。本発明は抗原作用性物質のカルボキ
シル−およびアミ７基がその電気化学的状態でその際変
化されるように結合工程に含まれないような自体公知の
結合方法を使用する。電気化学的状態は、カルボキシル
−およびアミン基が一一価または充電された粒子とのそ
の交換作用に依存して、充填されたイオン、つまりカル
ボキシレート−ないしはアンモニウムイオンに変換する
ことにより可能にされる。この可能性は本発明の方法に
よる結合の際得られたままである。結合された抗原作用
物質の変化されていない電気化学的状態のため、免疫反
応が電気化学的状態の変化下に結合された抗原作用物質
で惹起されたとすれば、結合されていない抗原作用物質
に対するより高い特異性を有する免疫反応が脊椎動物の
組織中で惹起される。

脊椎動物の組織中で分解可能でない粒子状担持物質への
、アミノ−および／またはカルボキシル基を有する抗原
作用性物質の共有結合のために種々の可能性が成立し、
その際特定の方法で構成された担持物質の使用が決定的
に重要である。

オキシラン基を含有する合成ポリマーを主体とする担持
物質が有利である。オキシラン基は穏かな条件下た第一
または第ニアミノ基を用いて、共有的に、アミノ基で付
加的な置換基としテ生シる、β−ヒｒロキシエチル基に
反応することができ、その際第一アミノ基は第ニアミノ
基におよび第ニアミノ基は第三アミノ基に変換する。ヨ
ーロッパ特許第５４２４９号明細書から、グリシジル（
メタ）アクリレートの重合体ないしは親水性コモノマー
とのその混合重合体から成り、抗原または抗体のような
免疫作用物質が共有結合されている、０．０３〜１０μ
ｍの平均直径を有する粒子が公知である。脊椎動物の組
織中の抗体結合の開始のためのこの種の免疫粒子の使用
は公知でない。生物学的に活性の作用物質の形成のため
のより大きな支持体粒子は、西ドイツ国特許第２７２２
７５１号明細書により、オキシラン基を含有するモノマ
ー、アクリルアミドないしけメタクリルアミＶおよび／
またはメチレンビス−（メタ）アクリルアミドから製造
される。これは５〜１０００μｍの直径を有する。

他の結合方法は西ドイツ国特許 第２２６３２８９号明細書に記載された方法による。こ
れはペプチド構造を有する抗原作用物質のために特に好
適であり、その際殊にグリシン、システィン、シスチン
、メチオニンまたはトリプトファンの単位が結合可能で
ある。結合反応はペプチドの炭化水素基および支持体ポ
リマーのラジカル活性化可能な基の間のラジカル機構に
より行い、その際アミノ−およびカルボキシル基は不変
のままである。この意味でラジカル活性化可能な基はた
とえばアルケニル−おヨヒアルキルフェニル基、特にア
リル−およびトルイル基である。活性化は感光剤の存在
で紫外線光を用いて、または−有機過酸化物の付加的な
存在の際−可視光を用いて酸素の不在で行う。

ペプチド構造を有する抗原作用性物質の、オレフィン性
Ｃ＝Ｃ−二重結合を有する合成支持体ポリマー材料への
結合は、西ドイツ国特許第２４３０１２８号明細書に記
載された方法により、ラジカルに分解する化合物または
レドックス系の存在で成功する。抗原作用物質が共有結
合なしに生じるビニル式すマーのマトリックス中へ結び
付けられる、封入方法とは逆に、ここで挙げられた方法
はラジカル重合可能なモノマーの不在で実施する。

ペプチドまたは他の生物発生物質の、ラテックス形支持
体での抗原作用との結合は、ヨーロッパ特許出願公開第
６５０６９号明細書に記載されている。そこで記載され
た方法が本発明の目的のためた適用されるかぎり、抗原
作用物質のアミノ−およびカルボキシル基の獲得下に共
有結合を生じるような、結合活性基が選択されねばなら
ない。つまりアミノ基とアミド形成下に反応された、活
性カルボン酸−またはスルホン酸基は不適である。既に
挙げられたオキシラン基の他に、結合のためにたとえば
ハロダンアルキル−おヨヒハロゲンーアルコイルー基カ
好適である。

支持体粒子の主な特性は脊椎動物の組織中での分解に対
するその安定性である。その中に結合された物質がその
抗原作用性を保持するように、少なくともその支持体機
能がはたらく限り、支持体は本発明の意味で分解可能で
ないとみなされる。これが組織中に広く分布した加水分
解酵素により分離可能でない、連続する炭素鎖を有する
ので、特に合成ビニルポリマーがこの特性を有する。

既に挙げられた特許文献が好適なポリマーを詳述してい
る。このポリマーの特徴的な構成成分は次のようなもの
である： １、ａ）抗原作用物質のアミ７基と、オキシラン環の開
環および窒素原子のアルキル化下に反応する、オキシラ
ン基を含有するモノマー〇 たとえばニゲリシジルアクリレートおよび一メタクリレ
ート、アルキルグリシジルエーテル； ｂ）アミノ基とＮ−アルキル化下に反応するハロゲンア
ルキル基含有上ツマ−１殊にクロルアルキル−またハブ
ロムアルキル化合物。

たとえば：クロルアセトキシアルキル（メタ）アクリレ
ート、ブロムアルキル（メタ）アクリレート、クロル酢
酸ビニルエステル；Ｃ）活性放射の作用下に、抗原作用
物質の炭化水素結合と、共有Ｃ−Ｃ−結合の形成下に反
応する、芳香族基を含有する七ツマ−０これには次のも
のが含まれるニスチロール、ビニルドルオール　ベンジ
ルアク’）Ｌ／−）および−メタクリレート； ｄ）活性放射または化学的に生じたラジカルによる刺激
の際抗原作用性物質の炭化水素結合と、共有ａ−ａ−結
合の形成下に反応できる、アルケニル−側基をラジカル
重合可能なビニル−ないしはビニリデン基と同時に含有
するモノマー。好適な七ツマ−の例は：アリルアクリレ
ートおよび−メタクリレート、トリアリールシアヌレー
トのような多塩基性酸のポリアリールエステル のような結合活性基を有するモノマー。

２、分子中に２またはそれより多くのラジカル重合可能
な炭素二重結合を有する架橋モノマー。１ｄで挙げられ
たモノマーは部分的に重合の際架橋作用する。そこで挙
げられたアルケニルｉｔ含有するモノマーとは逆に、架
橋モノマーは隣接された電子吸引基により活性化される
、少なくとも２つの炭素二重結合全含有する。その例は
エチレングリコール、プロピレングリコールまたはブチ
レングリコールのようなグリコールのジアクリレートま
たはジメタクリレート、トリメチロールプロパンまたは
ペンタエリトリットのような３−または４−価のアルコ
ールのトリーおよびテトラアクリレートないしはトリー
およびテトラメチルアクリレート；メチレンービスーア
クリルアミドまたは−メタクリルアミド、ジビニルペン
ゾールである。

３、　特定の水溶性により特徴づけられる、親水性モノ
マー。特にこれは２５℃で少なくとも１０％の水溶液を
形成する。これにはアクリルアミド、メタクリルアミド
、ビニルぎロリドン、特にヒドロキシアルキル基中に２
〜４のＣ−原子を有する、アクリル−またはメタクリル
酸のヒドロキシアルキルエステル。これが電気的に中性
でありおよび結合された活性作用性物質の電気化学的状
態を影響しないので、このモノマーが有利である。多く
の場合イオン化可能なモノマーも使用できる；これには
エチレン性不飽和、重合可能なモノ−およびジカルボン
酸ならびにその水溶性塩、たとえばアクリル−、メタク
リル−、イタコン−、マレイン−またはフマル酸が属す
る。

さらにこれらの群に、アルキル基中に有利に１〜５のＣ
−原子を含有する、アクリル−およびメタクリル酸のジ
アルキルアミノアルキルエステルまたはジアルキルアミ
ノアルキルアミｒのような不飽和カルボン酸のアミノア
ルキルエステルおよびアミノアルキルアミドが属する。

親水性モノマーの高い配分はポリマーを水溶性にし、こ
れは粒子状抗原としての使用のために不適である。従っ
てこの場合に、ポリマーを水溶性にするために十分な量
の架橋モノマーを共使用する。たとえば５１景％より下
の低い架橋剤配分−般にデル状に膨潤可能なポリマーを
生じ、一方高い架橋剤配分は膨潤可能でない巨大孔性粒
子または中空パールに造を有するようなものを生じる。

４、２５℃で１０％より下の水溶性により卓れている、
疎水性モノマー。これはたとえば、支持体ポリマーをラ
テックス形で製造する場合に適用される。多くの場合こ
れは抗原作用物質との疎水性交換作用によりその結合を
促進することができる。１Ｃおよび１ｄで挙げられたモ
ノマーは同時に疎水性モノマーの群に入る。さらにこれ
には特に１〜１２、殊に１〜４のＣ−原子を含有する脂
肪族アルコールを有する重合可能な不飽和モノ−および
ジカルボン酸のエステル、たとえばメチル−、エチル−
またはブチル−アクリレートまたは−メタクリレート１
．さらにエチレンまたはプロピレンのようなオレフィン
、塩化ビニル、２〜１０のＣ−原子を有する飽和脂肪族
カルＭ７酸のビニルエステルが属する。

分配されたモノマーの比較配分はその機能、即ちその作
用のために必要な必要量に左右される。上述の特許文献
に既に好適なモノマー配分が記載されていないかぎり、
次の範囲を概算値として使用する。

１）結合活性モノマー：１〜８０ｆｔ％、特に５〜５０
重量％ ２）架橋モノマー：０〜５０重量％、特に０．０１〜３
０重量％ ３）親水性モノマー二〇〜９９重量％、特に２０〜９５
Ｎ量％ ４）疎水性モノマー：０〜５０重量％、特に０〜３０Ｊ
！量％ 支持体ポリマーの得ようと努められた作用のために、ポ
リマー粒子の最外部層が、多孔性ないしは巨大孔性ポリ
マー粒子の際は孔壁も記載されたポリマー材料から成る
場合、これは十分である。その中には他の材料から成る
核、たとえば無機支持体またはポリスチロール、ポリ（
メタ）アクリルエステルおよびそのようなもののような
疎水性ポリマーから成る種ラテックス核が存在していて
よい。

支持体ポリマーの粒子の大きさは脊椎動物の組織中への
導入の＆ｅｈに左右される。血管中へ粒子状抗原を導入
し、そこで粒径は有利に０．０１〜１０μｍの範囲にあ
る。組織中への貯蔵の際、たとえば１００μｍまでのよ
り大きな粒子も使用できる。０．０１〜２μｍの範囲の
支持体粒子が有利に乳化重合により生じる。１〜５０μ
ｍの大きさでの粒子は沈殿重合により、モノマーのため
の溶剤およびポリマーのための非溶剤を表わす、媒体中
で容易に得られる。モツマー相もポリマー粒子も溶解し
ない、媒体中の懸濁−ないしはパール重合は２〜１００
μｍの粒子に導く。より粗大な粒子または物質重合体は
ハンマーミル、ホモジナイザーおよびそのようなものに
よりこの範囲の粒子に細分化される。抗原作用物質と担
持物質の量比は広い範囲にある。高い作用性−般に１＝
１０〜１：１０００の範囲で達成される。

抗原作用物質は脊椎動物の組織中で免疫反応を開始でき
る、全ての物質を表わす。これには２０００より上の分
子量を有する、全ての異質の、天然または合成粗大分子
、同様にこの種の粗大粒子から構成されている、活性ま
たは不活性微生物またはウィルスのような異質粒子の表
面構造が属する。本発明は１種またはそれより多くのカ
ルボキシル−および／またはアミノ基を含有する、この
ような抗原作用物質の使用を企図する。方法は抗原作用
物質を用いてカルボキシル−およびアミノ基なした同様
の方法で実施でき、しかしその後電気化学的状態の獲得
に因る、本発明による利点を示す。塩形成によりこれか
ら生じるアンモニウム−ないしはカルボキシレート基は
アミノ−ないしはカルボキシル基と同じである。アミン
基は第一、第二または第三であってよい。そのつど少な
くとも１つのアミノ基およびカルボキシル基の存在が標
準であるにもかかわらず、ただ１種または数種のアミノ
基を有し、しかしカルボキシル基を有さないか、または
１種または数種のカルボキシル基を有し、しかしアミン
基を有しない、抗原作用性物質が本発明の範囲に属する
。

本発明の意味で抗原作用物質にはへブタンも属し；これ
は結合されていない状態で抗原を表わさないだけでなく
、支持体での結合後初めて抗原にされる。実際、免疫反
応が多くの場合溶解されない生体に特有な物質への結合
後初めて開始されるので、特定の物質が結合されていな
くても抗原として作用するかどうかという問いは決定す
るのが難しい。従って分子量または抗原作用物質の量の
原則的な種類の限界は存在しない。物質は水溶性または
非水溶性であってよく、および後者の場合共有結合のた
めに好適な液体中で溶性でなげればならない。

抗原作用物質の傑出した群は、単独でまたは非蛋白質−
ないしはペプチげ種類の配分との結合で生じてよい、蛋
白質−ないしはペプチド構造を有するようなものである
。ペプチドおよび蛋白質は大体において各々１つのアミ
ノ−およびカルボキシル基を末端基として含有する。実
際に重要な他の基は多糖および核酸である。これがそれ
自体カルボキシル−またはアミノ基を有しないかぎり、
これはそのような基を含有する物質と結合されて込てよ
い。ハプテンの例としてペニシリン、テトラサイクリン
およびジゴキシンが挙げられる。　　　′ 本発明により治療される脊椎動物は有利に温血動物であ
る。たとえばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、
ネコ、ウサギ、ラットおよびネズミが哺乳動物としてお
よびニワトリ、アヒル、ガチョウ、雌のシチメンチョウ
、ハトが鳥として適している。本発明は魚およびハ虫類
のような冷血動物でも適用できる。

投与のために粒子状抗原を等張溶液に懸濁しおよび血管
中に注入するかまたは皮膚−または結合組織中に貯蔵す
る。免疫反応はたいてい３〜２０日の潜伏期間後観察さ
れる。大体において、このために抗原の１回の投与で十
分である。

細胞培地の設置のための、抗体を含有する血液ないしは
血清または抗体を生じる細胞の除去は、担持物質粒子で
結合されていない抗原を用いる免疫反応の惹起によるよ
うな自体公知の方法で行う。

実施例 例： 結合活性オキシラン基を含有する、粉末状の、約１マイ
クロメーター直径の粒子に再分散可能な担持物質（市販
生成物オイペルギット（Ｋｕｐｅｒｇｉｔ　）　ＣＩＺ
　、　　レーム（Ｒ′６ｈｍ　）　ＧｍｂＨ。

ダルムシュタット）（西ドイツ国特許 第３１１６９９５号明細書；ないしは米国特許出願第９
３００２３号明細書）２ｇをｐＨ７，３の緩衝溶液（１
，０ＭＮａ−リン酸塩＋〇、１５　ＮａＣ１）４　ｍｇ
に忍濁し、ウシ血清アルブミン（ゝＢＳＡ“、製造者ミ
ルズ（Ｍｉｌｅ８　）　Ｌａｂ　％Ｌｏｔ　／１６６３
、コードＡ３１−００１　）２０１ｎｇを添加する。懸
濁液を７２時間室温で放置さ７せる。その後数回水で洗
浄し、遠心分離する。ブラッドフォート（Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄ　）による蛋白質試験（ビオ−ラード（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）社のテストキラトラ用いて実施）担持物質！毎に
共有結合されたＢＳＡ　、７１．４■の含量を生じる。

Ｂ５Ａ２．Ｑｍ９を含有する、得られた不動態化物４５
５■を不完全なフロイド（Ｆｒｅｕｄ　）のアジュバン
ト（免疫化学で一般に公知の助剤）　１ｍｌと混合し、
４０分間超音波を用いて水−油中−エマルジョンに懸濁
する。懸濁液を１０の個々の配量に分配してウサギに皮
下投与する。全処理１＆：３週間後免疫効果の強化のた
めに繰り返す。

さらに４週間後処理されたウサギから、血液１ｏｍｔｔ
耳静脈から採取する。除去された血液を３７℃で１時間
および冷却棚でさらに３６時間放置する。その後通常の
方法で抗−血清を血餅から分離する。抗血清中での抗体
濃度は間車な方法で毛管試験で測定できる。このために
抗原、つまりＢＳＡをＰＢＳ　（Ｉ）ン酸塩緩衝液、生
理食塩水、ｐＨ７，３）中１ｍｔ）　／　ｍｌの濃度に
溶解する。

溶液を３ｃｒＩＬの充填高さでガラス毛管中へ充填する
。その後毛管の斜め保持により、ウサギ血液から得られ
た抗血清のほぼ同量を同じ毛管中へ入れ、毛管の下端を
結合剤で閉鎖する。毛管を３７℃で１時間および５〜８
℃でさらに４８時間放置し、毛管の下端で沈殿された沈
殿物の高さを測定する。１２龍の沈殿物高さを測定する
。

１０＋ｎｉの沈殿物高さは約１ｍ９／ｍｌの抗体濃度に
相当する。これから抗血清中１．２ｍｙ／ｍｌの抗体−
濃度が生じる。

比較のために未処理のウサギの血清を同じ方法で抗血清
で処理する。その際毛管中で全く沈殿が形成しない。

他の試験で不動態化されたＢＳＡ　（不完全なフロイド
のアジュバントなしに）のみをウサギに皮下投与し、上
述のように処理を繰り返す。免疫試験の際４！１！の沈
殿物高さのみが生じ、これは０．４■／　ｍｌの抗体濃
度に相当する。これから不完全なフロイドのアジュバン
トの存在での不動態化されたＢＳＡの高められた作用が
生じる。

相当する方法でＢＳＡの代わりにインシュリンまたは甲
状腺刺激ホルモン（’ＴＳＨ“）の使用で、相当する抗
血清を製造する。これはインシュリンないしはＴＳＨの
確定のための診断目的用に使用する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原作用性アミノ−および／またはカルボキシル基
   を含有する溶性物質を脊椎動物の組織中で分解できない
   粒子状の支持体への共有結合により粒子状抗原の形成下
   に不動態化し、この抗原を脊椎動物の組織中へ導入する
   ことにより脊椎動物の組織中で抗体形成を開始する方法
   において、抗原作用物質をそのアミノ−およびカルボキ
   シル基を得ながら支持体に共有結合させることを特徴と
   する、脊椎動物の組織中で抗体形成を開始する方法。 ２、オキシラン基を含有する支持体を使用し、抗原作用
   物質をオキシラン基との反応により不動態化する、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３、アルケニル基および／またはアルキルフェニル基含
   有支持体を使用し、抗原作用物質を感光剤の存在で紫外
   線光を用いて、または−有機過酸化物の付加的な存在の
   際−可視光を用いて酸素の不在で共有的に支持体で不動
   態化する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、オレフィン性Ｃ＝Ｃ−二重結合を有する支持体を使
   用し、抗原作用物質がラジカルに分解する化合物または
   レドックス系の存在で、ラジカル重合可能なモノマーの
   不在で支持体に共有結合する、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ５、１）１〜８８重量％オキシラン基、ハロゲンアルキ
   ル基、芳香 族基また−重合可能 なビニル−またはビニ リデン基と同時に−ア ルケニル側基を含有す る、結合活性モノマー、 ２）０〜５０重量％　分子中に２つまたはそれより多く
   のラジカル 重合可能な炭素二重結 合を有する架橋モノマ ３）０〜９９重量％２５℃で少なくとも １０％の水溶液を形成 する、親水性モノマー、 ４）０〜５０重量％　２５℃で少なくとも １０％の水溶液として 形成する、疎水性モノ マー から構成される支持体を使用する、特許請求の範囲第１
   項から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６、抗原作用物質が０．０１〜１００μｍの平均粒子直
   径を有する粒子状支持体に結合される、特許請求の範囲
   第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法。 ７、抗原作用物質が０．０１〜２μｍの粒径を有する、
   水性ラテックスとして存在する支持体に結合される、特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、抗原作用物質として蛋白質−ないしはペプチド構造
   を有する物質を使用する、特許請求の範囲第１項から第
   ７項までのいずれか１項記載の方法。 ９　抗原作用物質として１つまたはそれより多くのアミ
   ノ−および／またはカルボキシル基含有ハプテンを使用
   する、特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか
   １項記載の方法。 １０、粒子状抗原を温血脊椎動物の組織中へ導入する、
   特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか１項記
   載の方法。 １１、粒子状抗原を脊椎動物の組織中へ皮下注入する、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、粒子状抗原を水−油中−エマルジョンの形で脊椎
   動物の組織中へ導入する、特許請求の範囲第１０項記載
   の方法。