JPS63503150A - ポリアミド樹脂及び免疫診断用試薬の調整法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ポリアミド樹脂及び免疫診断用試薬の調整法ｌ乳＠ｉ東 本発明は実験動物に免疫反応を誘発する合成ペプチドと蛋白質の合成と利用に関 する。さらに詳しくは、本発明はポリアミド樹脂、同ポリアミド樹脂の製造方法 、同樹脂上に合成したペプチドまたは蛋白質から成る複合体を用いた実験動物で の免疫反応誘発方法、および同樹脂の免疫診断への利用方法に関する。

固相ペプチド合成は蛋白質の構造と作用機序を研究するための貴重なツールであ る。大ていのこのような合成方法はアッセンブリー中に通常はリンカ−分子によ ってペプチドを固定する固相としての架橋ポリスチレンベースド樹脂の利用を含 む、アッセンブリーは固相に保護アミノ酸を加える、同アミノ酸上の保護基を選 択的に除去する（脱保護）、および適当に保護されたアミノ酸をさらに加えるこ とから成る繰返しサイクルによって、得られる〔参考のためには、ビー、ビー、 メリフィールド（Ｂ、Ｂ。

Ｍｅｒｙｆｉｅｌｄ）の「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐ ｔｉｄｅＳ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　」、アドブ、エンザイモロジー（Ａｄｖ、Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）３２巻、２２１頁（１９６９）参照のこと〕。

ポリスチレンベースド樹脂は固相ペプチド合成に支持体として非常に一鍛的に用 いられているが、反応物を溶解するために必要な極性有機媒質に比べてこれらが 比較的疎水性であることがペプチド鎖アッセンブリーでは問題である。このよう な媒質は成長するペプチドを自由に溶媒和して、ポリスチレンマトリックスを不 完全に膨潤させることになる。ポリマー格子中では、試薬拡散低下と立体障害の ために結合サイクル中の効率低下、従って繰返しベースでの最終収率の低下が顕 著になる。樹脂対ペプチド量比が高く、支持体の物理的性質が支配的であるアッ センブリーの早期段階では、この効率低下が特に急激である。

これらの欠点のために、非常に極性であり、ペプチド合成のために必要な溶媒を 自由に透過させる架橋ポリジメチルアクリルアミドベースド支持体が開発された 。イー、アーサトン（Ｅ。

Ａｔｈｅｒｔｏｎ）、ディ、エル、ジェイ、クライブ（Ｄ、Ｌ、Ｊ　、Ｃ１ｉｖ ｅ）およびアール、シー、シェパード（Ｒ、Ｃ、Ｓ　ｈｅｐｐａｒｄ）による「 ポリペプチド合成のポリアミド支持体（Ｐ　ｏｌｙａｍｉｄｅ　Ｓ　ｕｐｐｏｒ ｔｓ　ｆｏｒＰ　ｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）　」、９７ジエイ、アメル、ケム、ツ ク、（９７Ｊ　、Ａｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、６７８４頁（１９７５）　；アール、アルシャディ（Ｒ ，＾ｒｓｈａｄｙ）　。

イー、アーサートン（Ｅ　、Ａ　ｔｈｅｒｔｏｎ）　、エム、ジエイ、ゲイト（ Ｍ、Ｊ。

Ｇａ１ｔ）、ケイ、シー（Ｋ、Ｌｅｅ）およびアール、シー、シェパード（Ｒ。

Ｃ、Ｓ　ｈｅｐｐａｒｄ）による「固相ペプチドおよびオリゴチクレオチド合成 用の製造が容易な極性支持体（Ｅａｓｉｌｙ　Ｐｒｅｐａｒｅｄ　Ｐｏ１ａｒＳ ｕｐｐｏｒｔ　Ｆｏｒ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　八ｎｄ　Ｏ ｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、１９７７ジエイ、シー 、ニス、ツム。コム、（１９７９Ｊ　、Ｃ。

Ｓ　、Ｃｈｅ＋＊、Ｃｏｍｍ、）４２５頁（１９７９年）参照のこと、アミノメ チル誘導体としてのポリアミド樹脂は合成機構に好ましく作用し、支持体にＣ− 末端残基を結合させる適当なリンカ−分子の選択と通して保護手段に代り得るも のとなる。このようにして合成されたペプチドまたは蛋白質を本明細書を通して 「ブロチド」と呼ぶことにするが、これらは多くの研究用途に用いることができ ブロチドの免疫原としての用途が本発明にとって特に重要である。ウィルスコー ド化蛋白質に含まれる配列と同じ配列の合成ペプチドがこのような蛋白質に関連 する生の抗原決定基の同定に有用であることが、今までに実証されている。１！ つかの研究所が種々のＨＢｓλｇ合成ペプチドの抗原活性に関する研究を報告し ている。ジー、アール、ドリースマン（Ｇ　、　Ｒ、Ｄ　ｒｅｅｓａ＋ａｎ）等 、ネイチ’ｒ　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）２９５巻、１５８頁（１９８２）　、アー ル、エイ、レルナ（Ｒ、Ａ　、　Ｌ　ｅｒｎｅｒ）等、ブロク、ナトル、アカド 、サイ、ニー、ニス。

エイ、（Ｒｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ）７８巻、３４ ０３頁（１９８１）　；エイ、エム、プリジス（Ａ、Ｍ、Ｐｒ１ｎｃｅ）等、ブ ロク、ナトル、アカド。

サイ、ニー、ニス、エイ、７９巻、５７９頁（１９８２）参照のこと、このよう なペプチドを用いた、ＨＢｓＡｇに対する抗体反応の誘発は比較的弱いが、免疫 化の前にキャリヤ蛋白質にペプチドを結合させることによって強化されることが 判明している。レルナー等の上記文献；ソイ。サンチェス（Ｙ　、　Ｓ　ａｎｃ ｈｅｚ）等、インターウイロロギイ（Ｉ　ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）１８巻、 ２０９頁（１９８２）参照のこと、−次配列分析に基づく免疫原蛋白質の可能な 抗原決定基の予測は正確ではないので、試行錯誤を通しての推定エピトープの同 定は困難である。従って、合成ペプチドの精製およびキャリヤー蛋白質へのペプ チドの結合を必要としないで、生の抗原配列を合成ペプチドによって明らかにす る方法は重要な利点を提供する。

それ故、本発明の目的は固相合成方法を用いて樹脂上にブロチドを合成し、樹脂 からブロチドを分離せずに実験動物に注入して免疫原反応を誘発することのでき るポリアミド樹脂の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、固相ブロチド合成に利用できるポリアミド樹脂および実験 動物に注入して免疫原反応を誘発することのできる、ポリアミド樹脂と合成プロ チドの複合体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インビトロ免疫学的分析に用いるためのポリアミド 樹脂−プロチド複合体を提供すること−でもある。

本発明のさらに他の目的は、有機溶媒に加え、洗剤によって乳化した水溶液中で のフリーラジカル共重合によって、官能基含有分子によるジメチルアクリルアミ ドモノマーの架橋を行う固相ブロチド合成用ポリアミド樹脂の製造方法を提供す ることである。

本発明のさらに他の目的は、ポリアミド樹脂を製造し、前記ポリアミド樹脂上に ペプチドまたは蛋白質を合成し、前記ポリアミド樹脂−合成ペプチドまたは合成 蛋白質複合体によって実験動物を免疫化することから成る、合成ペプチドまたは 合成蛋白質によって実験動物に免疫原反応を誘発する方法に間する。

本発明のさらに他の目的は、本発明のポリアミド樹脂−プロチド複合体を用いて 抗原および抗体のような蛋白質を検出する分析方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、本発明のポリアミド樹脂−プロチド複合体を用いて 実験動物に免疫原反応を誘発する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、例えば免疫原反応を誘発するためにプロチドを用い る前に樹脂からブロチドを分離して精製することを必要としない、固相プロチド 合成用のポリアミド樹脂を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、結合分析にブロチドを用いる前にプロチドを樹脂か ら分離して精製する段階を省略した結果として、蛋白質の抗原基マツプ形成に特 に有用な、固相ブロチド合成用ポリアミド樹脂を提供することである。

本発明の上記その他の目的および利点は、以下の説明から当業者に明らかになる と思われる。

１乳へｉ灸 上記目的は開始剤と促進剤とを用いるフリーラジカル反応において官能基含有分 子によってジメチルアクリルアミドモノマーを架橋することから成る、固相プロ チド合成用ポリアミド樹脂の製造方法を提供することによって解決される。２の 場合、ビーズ状ポリアミド樹脂はこれらの試薬の水溶液を水性媒質中に懸濁させ た場合に生ずるエマルジョン中で合成される０次に、ビーズを単離して、ブロチ ド合成用の固相として用いる。

ポリアミド樹脂を製造し、前記ポリアミド樹脂上にブロチドを合成し、実験動物 を前記ポリアミド樹脂−プロチド複合体によって免疫化することから成る、実験 動物に免疫原反応を誘発する方法も提供する。

さらに、ポリアミド樹脂を製造し、前記ポリアミド樹脂上にプロチドを合成して ポリアミド樹脂−ブロチド複合体を形成し、前記ブロチドに特異的に結合しうる 抗体を含むと考えられる体液に前記ポリアミド樹脂−プロチド複合体を接触させ ることがら成るインビトロ診断検査方法を提供する。この場合、結合した抗体は 例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（Ｅ　ｎｚｙｍｅＬｙｎｈｅｄ　Ｉｍ ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）を用いて検出される。

区Ｉ！１１１４説朋− 第１図は酵素結合イムノソルベントアッセイによって得た、ポリアミド樹脂−Ｂ ＴＬＶｌ［ペプチド５０３〜５２２複合体に対するウサギ抗血清の希釈度逆数の 関数としての４１０ｎｍにおける光学密度のグラフである。丸印は複合体によっ て免疫化されたウサギからのデータを表し、三角印は免疫化する前の同ウサギか らのデータを表す。

凡用！■■」ｒ説明− 上述したように、「ブロチド」なる用語は本発明の方法によって合成されるペプ チドと蛋白質の両方を意味する０本発明の方法の重要な利点は、ポリアミド樹脂 上に合成したペプチドを用いて、ペプチドを樹脂から分離精製することなく、哺 乳動物に免疫原反応を誘発できることにある。

プロチドをポリスチレンベースド樹脂に結合させる通常の方法はペンジスエステ ル誘導体による方法であり、ブロチドの樹脂からの分離は酸性開裂または塩基性 開裂のいずれかによって達成される。ベンジルエステルは幾つかのこのような開 裂方法を受けやすいが、固相合成反応に特徴的な多重脱保護、中和および結合反 応を通して安定である０種々のアミノ酸分解反応〔エム、マンニング（Ｍ　、　 Ｍ　ａｎｎ　ｉｎｇ）　＋ジェイ、アム、ケム、ツク、（Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）９０巻Ｊ３４８頁（１９６８）　）およびその他の 方法におけるように、ヒドラジンを用いて樹脂からプロチドを分離していた〔ダ ブリュ、ケッセラー（Ｗ、Ｋｅｓｓｌｅｒ）とビー、イセリン（Ｂ、ｌ５ｅｌｉ ｎ）、ヘルプ、チム、アクタ（Ｈｅｌｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、）４９巻。

１３３０頁（１９６６））　、　Ｌかし、これらの方法は全てアミノ酸、短いペ プチド、樹脂分解生成物、および時には、保護基を不完全に除去したペプチドを 含めた合成の副生成物からブロチドを精製することによるプロチドの損傷を避け るために、適当な工程を行うことを必要とする。汚染ペプチドが目的のペプチド と大体同じサイズ、同じ組成である合成において、精製を時には直接の結晶化に よって実施することもできるが、さらに特異的な方法を用いなければならない０ 分離精製の方法に関係なく、このような必要条件は時間のかかる工程を合成に加 えることになり、しばしばプロチドの総数率を下げることになる０本発明の方法 はこのような分離と精製を必要としないので、合成の完成に要する時間量は短く なり、プロチドの収率は増大する。

本発明のポリアミド樹脂は水溶液中でジアミノアルカン、好ましくはＮ、Ｎ’− ビス−アルケノイル−ジアミノアルカンのように、分子の各端部にアルケノイル 基を有するジアミノアルカンを用いて、市販のジメチルアクリルアミドモノマー を架橋することによって製造する０本発明の好ましい態様では、架橋リンカ−は ハルベルン（Ｈａｌｐｅｒｎ）とスパロー（Ｓｐａｒｒｏｗ）の方法〔ジェイ、 エイ、ハルベルン（Ｊ　、Ａ、Ｈａｌｐｅｒｎ）とジェイ、ティ、スパ０−（Ｊ 　、Ｔ、Ｓｐａｒｒｏｗ）、ｒＮ　、Ｎ　’−ビスアクリルジアミノアルカン合 成の改良方法（Ａｎ　Ｉ＋＊ｐｒｏｖｅｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｆｏｒ　ｔｈ ｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎ　、Ｎ　’　ｂｉｓａｃｒｙｌｙｌｄｉａｍｉ ｎｏａｌｋａｎｅｓ）」、シンセチックコム（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｃｏｍａｅ 、）１０巻、５６９頁（１９８０）　〕によって製造しなＮ、Ｎ’−ビスアクリ ル−１，３−ジアミノプロパンまたはＮ、Ｎ’−ビスアクリル−１，３−ジアミ ノアルカンのいずれかであり、前記方法はこの特定の参照のために全体的にここ に関係する。プロパン同族体の使用はエチレン同族体の使用によって得られるポ リマーよりも孔径が大きく、ブロチド合成中に改良された膨潤性を示すポリマー を形成するので好ましい、しかし、この文献に記載された他のジアミノアルカン 、すなわちＮ。

Ｎ′−ビスアクリル−１，２−ジアミノエタンとＮ、Ｎ’−ビスアクリル−１， ６−ジアミツーヘキサンならびにその他のジアミノアルカン類も本発明の樹脂の 製造に用いるために適している。

本発明の架橋樹脂には、官能性モノマーが含まれる。「官能性モノマー」なる用 語は合成ペプチドのＣ−末端アミノ酸を樹脂に固定するために用いられるような アルケニルアミンを意味する。官能性モノマーはメチルスルホニルエチルオキシ カルボニル（Ｍ　Ｓ　Ｃ）基で保護した場合には〔ジー、アイ、テラセル（Ｇ。

Ｉ　、Ｔｅ５ｓｅｌ）とアイ、シー、バルベルトーギアース（１，Ｃ，Ｂａ１ｖ ｅｒｔ−Ｇｅｅｒｓ）、「メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基、広い用 途を有する新しいアミノ保護機能（ＴｈｅＭｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｅｔｈ ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ　Ｇｒｏｕｐ、Ａ　Ｎｅｗ　ＡｎｄＶｅｒｓａｔｉ ｌｅ　Ａｍ１ｎｏ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、インド、ジ エイ。

ペプチド、プロティンレス、（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｒｅｓ、）７巻、２９５頁（１９７５）　）　、Ｍ　Ｓ　Ｃアルケニルアミンと 呼ばれる。このような官能性モノマーは市販の塩化物誘導体とアルケニルアミン との反応によって製造され、次いでＭＳＣ保護基が塩基によって除去される。し かし＋　Ｍ３Ｃ基は必要ではない０本発明のポリアミド樹脂は単に過剰なアリル アミンを加え、生成した微粒子を炉別または他の方法によって除去することによ っても製造することができる。官能性モノマーの添加量は樹脂１ｇにつき約０． １ｍｍｏｆ〜約０．５ｖ＋＋ｏｌの範囲、好ましくは樹脂１ｇにつき約０．２１ １ｎｏ１〜約０．４ａ＋ｍｏｊ！の範囲の樹脂置換を生ずるように選択する。開 始剤は例えば過ｖＸ酸塩またはりボフラビンのような当業者に公知の開始剤のい ずれかであるが、過硫酸アンモニウムであることが好ましい。

上記物質は水溶液中で一緒にするので、これらの物質を一括して「水相」と呼ぶ ０本発明のポリアミド樹脂製造の第２工程は水相と有機相とを一緒にすることで ある。「有機相」なる用語は、水相と一緒にして撹拌した場合に、本発明の樹脂 を得るもととなる懸濁液を生ずるような有機溶媒を意味する０本発明の好ましい 実施態様では、有機相はヘキサンと四塩化炭素の混合物である。

均一サイズのビーズを形成するために、撹拌中に乳化剤を加える。乳化剤として は当業者に公知の洗剤が用いられるが、本発明の好ましい実施態様では、ソルビ タンセスキオレート、ソルビタンモノラウレートまたはソルビタンデカノエート のいずれかが用いられる。洗剤添加量は大体均一サイズの球状の樹脂が得られる ように調節する。洗剤量が低下すると、粗粒の非晶質物質の量が増加したエマル ジョンが生じ、アミノ酸の内部成長鎖の短縮に寄与する。洗剤量が増大すると微 粒状物質量が増加し、このような微粒状物質をかなりの量の樹脂の損失なしに除 去することは不可能である。このような微粒状物質はペプチド合成器の反応器な らびに反応器に関連するラインおよび弁を詰めることになる。

次に、促進剤を加えて、懸濁液中のモノマーの重合を促進させ、本発明のポリア ミド樹脂のビーズを形成する。多くの促進剤が当業者に公知であるが、本発明の ポリアミド樹脂の製造にＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン （Ｔ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　）を用いると特に有望な結果が得られる０次に、生成し たビーズを炉別し、洗浄し、Ｍ３Ｃ基（存在する場合には）を塩基によって除去 し、ビーズを乾燥させる０次に、ビーズをメツシュ・シーブに通して、比較的均 一なサイズであるようにする０本発明の方法を用いた総数率は出発モノマーを基 準にして約８７％〜約９４％の範囲である。

本発明のアミノメチル、架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂はブロチドを水溶 液中で最大に露出させ、樹脂ポリマーの基幹はプロチドを構造的に制限しない、 ポリアミド樹脂は水によって高度に溶媒和されるとその乾燥床体積の数倍にも膨 潤しうるので、その結果プロチドが露出される。

次に、樹脂に付着するリンカ−に活性化剤を結合させることによって、ビーズ上 にプロチドが合成される。「リンカ−」なる用語はプロチドの第１アミノ酸のカ ルボキシル基をポリマー樹脂に結合させる結合基を意味する０本発明の好ましい 実施態様では、このリンカ−がオキシアルキル安息香酸（ＯＢＡ）であり、これ にアミノ酸残基が結合して、プロチド鎖の第１アミノ酸として役立つ　ＯＢＡリ ンカ−を用いてＣ−末端アミノ酸を本発明のポリアミド樹脂に付着させるので、 無ホフッ化水素を用いて、樹脂からブロチドをあまり失うことなく、プロチドか ら側鎖の保護基を除去することができる。下記の実施例では、選択するアミノ酸 はグリシンであり、これをｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）保護基に よって保護するが、アミノ酸が如何なるアミノ酸でもよいこと、特に合成すべき プロチドの第１アミノ酸になるアミノ酸であること、および他の保護基も同様に 適していることは、本発明の開示の恩恵を受ける当業者によって理解されるであ ろう。グリシン残基はブロチドと樹脂ポリマー基幹との間のスペーサーという付 加的機能を有する。

本発明の好ましいリンカ−であるＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息 香酸はミッチェル等が述べている方法の改良によって製造した〔エイ、アール、 ミッチェル（Ａ　、Ｒ，Ｍ　１ｔｃｈｅｌｌ）。

ニス、ビー、エッチ、ゲント（Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔ）、エム、エンゲルハード （Ｍ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ）およびアール、ビー、メリーフィールド（Ｒ。

Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の「ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノアシル−４ −（オキシメチル）フェニルアセトアミドメチル樹脂の新規な合成ルート、固相 ペプチド合成の改良支持体（Ａ　ｎｅｗ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃｒｏｕｔｅ　ｔｏ 　ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙ　ｃａｒｂｏｎｙｌａＴｆｌｉｎｏａｃｙｌ−４ −（ｏｘｙｎｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｒ ｅｓｉｎ、ａｎ　ｅｍｐｒｏｖｅｄ　５ｕｐｐｏｒｔ　ｏｆｓｏｌｉｄ　ｐｈａ ｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）」ジエイ、オルグ、ケム、（Ｊ。

Ｏｒｇ　、　Ｃｈｅｍ　、　）４３巻、２８４５頁（１９７８）　、これはこの 特定の参照によってここに全体的に関係する〕。ミッチェル等の方法の重要な改 良点は、溶媒としてのジメチルホルムアミドの使用を除いたことである。この溶 媒は蒸発し難いため、温度を上げて蒸発を促進させたとしても、合成法がまだ時 間のかかるものである。上述のように製造したポリアミド樹脂にリンカ−を結合 させるために用いる活性化剤はジイソプロピルカルボジイミドと４−ジメチルア ミノピリジンであるが、ジシクロへキシルカルボジイミドおよび４−メチルビロ ールインジノピリジンのような他の活性化剤も同様にこのような目的に適してい ることは当業者に理解されるであろう。

ポリアミド樹脂上にプロチドを合成した後に、実験動物に免疫反応を誘発するイ ンビトロ免疫検定法または抗原決定基のマツプ形成を含めた多くの用途にポリア ミド樹脂−プロチド複合体を用いることができる０例えば、インビトロ検定法は ビーズ状ポリアミド樹脂−ブロチド複合体を乳鉢と乳棒で粉砕して、粉砕した複 合体をマイクロタイターテストプレートのような固相に中性ｐＨの緩衝液によっ て吸収させることによって実施する。

樹脂上の蛋白質またはペプチドを特異的に結合しうる抗体を含むと考えられる血 清またはその他の体液を吸収複合体とともにインキュベートし、結合しない抗体 を洗浄によって除去し、結合した抗体を酵素結合イミノソルベントアッセイ、ビ オチン−アビジン増強アッセイまたはその他の技術上周知の検出方法によって検 出する。

プロチド合成中に間隔をおいてポリアミド樹脂−ブロチド複合体の一部を単に除 去し、ブロチドを脱保護し、除去した各部分を連続的にテストして、プロチドが 抗体を結合する点を合成中に確認することによって、ポリアミド樹脂−ブロチド 複合体を用いて抗原決定基のマツプを形成することもできる。この方法は他の合 成方法で必要な分離精製工程を省略して実施することができる。この複合体は粉 砕して、マイクロタイターテストプレートのような固体支持体に吸収させること によって、その抗体結合力に関してテストし、上述のように検定することができ る。このような検定法のために樹脂からブロチドの分離およびプロチドの精製は 必要ではない。

ポリアミド樹脂−プロチド複合体は免疫原としても有用である。アジュバントを 用いてまたは用いずに、この複合体によって実験動物を直接免疫化することがで きる。ここで用いる「実験動物」なる用語は、免疫反応を起しうる動物を意味す る。主な対象動物は哺乳動物であるが、本発明の方法を用いて鳥のような、他の 実験動物に免疫原反応を誘発することもできる０例えば、完全フロインドアジュ バント中でエマルジョン化した、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡＧ）ペプチド１１９− １５９と同じ配列を有する合成ペプチドを含む複合体を用いるウサギの免疫化に よって、ラジオイムノアッセイによる測定でＢ型肝炎に特異的な免疫反応が誘発 された。ラジオイムノ沈澱法によって測定して同じような結果がエイズウィルス ＨＴＬＶ−Ｉ［［の蛋白質被膜に相当するペプチドと本発明のポリアミド樹脂と から成る複合体によって得られた。

次の実施例を参照することによって、本発明をさらに良く理解することができる が、これらの実施例は説明のためのものであって、本発明を限定するものではな い。

去ＪＩＪＬＬ モノマーの　告 ２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニルクロリド（Ｍ　。

ＳＣクロリド）（Ｋ　＋Ｋ　Ｌａｂｓ、　Ｉ　ＣＮ）’１（２６，８ｍ＋＊ｏｌ ）をアセトニトリル１５ｚｆ中に溶解し、再蒸留アリルアミン〔コダック（Ｋｏ ｄａｋ））２．１ｚ１（２８ｍ＋＊ｏ１）と再蒸留ジイソプロピルエチルアミン （ＤＩＦＡ）４．９ｔｅ（２８ｍｍｏＮ）とをアセトニトリル２０１１中に溶か した溶液に撹拌しながら、２０分間にわたって滴加した。この溶液をさらに２時 間撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル２５０ｚ１中に加え、１〜２時 間放置した。多重のＤＩＥＡ塩酸塩が針状結晶として沈澱した。ｒ別し蒸発した 後に、粗生成物を少量のクロロホルム中に溶解し、同溶媒に充填したシリカゲル Ｇ−６０カラム（６０ｇ）上に負荷した。クロロホルムによる溶離によって、純 粋（溶媒＝　ＣＨＣＲｓ　：　ＣＨｓ　ＯＨ、９：　１　）　）残りのＤＩＥＡ 塩はこれらの条件下でカラムに吸着した０時にはＴＬＣ上を溶媒に近似して前進 する物質がＭＳＣアリルアミンカラム分画を汚染した。この物質は塩化メチレン −ヘキサンからＭＳＣアリルアミンを一２０℃において再結晶することによって 除去した。収量は４．８ｇであった（Ｍ　Ｓ　Ｃクロリドから８６％）。

夾旌匠ｌ リン　−の　貴 ヘルベルン（Ｈｅｌｐｅｒｎ）とスパロー（Ｓ　ｐａｒｒｏｗ）の上記文献に記 載の方法によって、架橋リンカ−Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリル−１，３−ジアミノ プロパンを製造した。簡単に説明すると、ジアミノプロパン〔アルドリッヒ（Ａ 　Ｉｄｒｉｃｈ）　）をアセトニトリル中に溶解し、塩化アクリリル−アセトニ トリル溶液に４℃において滴加し、室温にまで温度上昇させ、撹拌した。二塩酸 ジアミノプロパンを沢別し、熱アセトニトリルによって洗浄し、−緒にした炉液 を真空濃縮した。Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリル−１゜３−ジアミノプロパンを４℃ において一晩析出させ、生成した板状結晶を炉別し、真空乾燥した。

夾族匠ｌ ボｌアミド　の　告 窒素供給管と機械駆動ガラススターラーとを備えた、２Ｎ−ガラス製シリンダー 状みぞ付き重合器に、ヘキサン４９０ｘｌおよび四塩化炭素２９０ｚｉ’を加え た。この溶液に窒素を１５分間パージして、酸素を除去した。この溶液に、実施 例■で述べたように製造したＮ、Ｎ’−ビスアクリリル−１，３−ジアミノプロ パン（２，９ｇ、１５．ｈ鴎ｏｌ）をＮ、Ｎ’−ジメチルアクリルアミド〔ポリ サイエンス（Ｐ　ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）　）　１８．２ｚ１（１７５ｍｍｏ ｆ）と混合して含む溶液を加えた０次に、実施例Ｉに述べたように製造したＭＳ Ｃアリルアミン１０ｙ（４８ｍｍｏｌ）と水１２０ｚ１とを加え、溶液を濾過し 、有機相に加える前に脱気した。生成した混合物の密度を調節し、４００〜４５ ０ＲＰＭで撹拌して均一な懸濁液を得た。過硫酸アンモニウム〔バイオラット（ Ｂ　ｉｏ　Ｒａｄ））　（Ｈ２Ｏ’Ｓｚｌ中０．５ｇ）と、ソルビタンセスキオ レートまたはソルビタンモノラウレート〔シグマ（Ｓｉｇｍａ））　１ｉ＋１と を加えた０次に、Ｈｚ０２１１中Ｎ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（バイオラッド’）３ｘｌ の溶液、ｐＨ６，５〜７．５（濃Ｈ（Ｊ）をこの懸濁液に加えた。

懸濁エマルジョンを窒素雰囲気下で２時間撹拌した。生成したビーズ状物質を沢 過し、水（１１）、メタノールはｌ）、ジオキサン：メタノール：２ＮＮａＯＨ （１４：５：１．２１．ＭＳＣ基を除去するため）、水（２Ｎ）、ｌＮＨＣｌ！ （２１）、水（２Ｎ）および次にメタノール（２１）によって連続的に洗浄した 。樹脂をメタノール中に゛懸濁し、デカントすることによって（３×）洗浄した 。塩化メチレン〔ベーカー（Ｂ　ａｋｅｒ）　、ＨＰ　Ｌ　Ｃ等級〕中で膨潤さ せた後に、樹脂をヘキサン中で収縮させ、真空乾燥した。この樹脂を８０メツシ ユ（１８０ミクロン）シーブに通すことによって、大きい非晶質物質を除去した 。

活性剤としてジイソプロピルカルボジイミド、触媒として４−ジメチルアミノピ リジン（酢酸エチルから再結晶したもの）を用いて、樹脂１００ｇにＢｏｃアラ ニンを結合させることによって、官能化度をチェックした。アミノ酸分析はロッ トに依存して０．１５〜０．３５ｍｖａｏ１／樹脂ｇの置換が生じたことを示し 、アリルアミン添加量に依存して、約０．１＋ｅｍｏｌ／樹脂ｇ程度から約０． ５ｍｌ１ｏｌ／樹脂ｇ程度までの置換を生じた樹脂が製造された。負荷した樹脂 はビクリルスルホン酸によって検知可能な着色を示さず、このことは未反応の遊 離アミンが存在しないことを示している。

樹脂ビーズは塩化メチレン中で膨潤した場合に、その乾燥床体積の約２．５倍と なった。ジメチルホルムアミドまたは水溶液中で膨潤させると、ビーズはその乾 燥床体積のそれぞれ、約４倍と６倍になった。

犬ｍ 丈ン叉二プコ■１ ミッチェル等の上記文献の方法の改良法によって、リンカ−のＢｏｃ−グリシル −４−（オキシメチル）安息香酸を製造した。

簡単に説明すると、酢酸エチル４５０ｚｆ中に再蒸留ジイソプロピルエチルアミ ン１０．３ｚＮとブロモアセトフェノン１２．０５ｙ（６０，６ｍｍｏ１）とを 溶解することによって、４−（ブロモメチル）安息香酸フェニルアシルエステル を製造した。この撹拌した溶液に４０〜５０℃において、４−（ブロモメチル） 安息香酸（１３，８９１？、６０．６ｍｍｏ１）を７等分して３時間にわたって 加えた。撹拌を室温においてさらに２時間続けた。沈澱したＥ　ｔ　：ｌ　Ｎ　 ＨＢ　ｒを炉別し、酢酸エチル溶液を１０％クエン酸水溶液、飽和塩化ナトリウ ム、飽和重炭酸ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムの各５０ｚｆによって４回 洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下での回転蒸発に よって溶媒を除去した。残渣をＣＨ２（１２−石油エーテル（１：３ｖ／ｖ）か ら再結晶して、４−（ブロモメチル）安息香酸フェニルアシルエステルを得た。

４−（ブロモメチル）安息香酸フェニルエステルをＢｏｃ−グリシル−４−（オ キシメチル）安息香酸に転化するために、Ｂｏｃ−Ｌ−グリシン（２５ｍｍｏ１ ，４．３８ｇ）をエタノール１５１１に溶解し、水酸化テトラメチルアンモニウ ム（メタノール中２５％）で中性になるまで滴定した。溶媒を真空下でのクロロ ホルムとの共沸蒸留によって除去し、塩をアセトニトリル１５０ｉ＋４中に溶解 した。撹拌した溶液に、上述のように製造した４−（ブロモメチル）安息香酸フ ェニルアシルエステル５．８ＦＩ（１７，５＋ｓｍｏ１）を加えた。−晩混合し た後に、沈澱したテトラメチルアンモニウムプロミドを炉別し、溶媒を蒸発させ た。残渣を酢酸エチル４００ｗ１中に溶解し、溶液を濾過した。次に、有機相を １０％クエン酸水溶液（３Ｘ７５ｚｊり、０．５Ｍ重炭酸ナトリウム：０．５Ｍ 炭酸カリウム（２：　１　）ｐＨ９，５（８×７５１１）、次に水（３Ｘ　７５ ｚｆ）によって連続的に洗浄した。溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空 除去した。残渣を８５％酢酸２００ｚｊ！に溶解し、これに酸洗いした亜鉛ダス ト２３．を加えた。ＴＬＣによってフェニルアシルエステルがもはや検出されな くなるまで、混合物を撹拌した（４〜５時間）、亜鉛を炉別し、酢酸５０ｚｌで 洗浄し、−緒にした溶液を凍結乾燥した。残渣を水１００ｚ１：酢酸エチル３０ ０ｍ１中に溶解し、ｐＨを１．５に調節した（ｃｏｎｅ　ＨＣｆ）。

水相を第２の酢酸エチル量（２００ｚｆ）で抽出し、−緒にした抽出物を水（１ ００１１）で洗浄した。乾燥（ＭｙＳＯ２）と蒸発の後で、−１０℃における塩 化メチレン：ヘキサンからの再結晶によって精製した。収量１よ４．５ｙ（１４ ，５ｍｍｏｌ、フェニルアシルエステルからの収率８３％）であった。

夫嵐匠Ｌ ボ１アミド　眉へのリンカ−の＋″′ ′バイオサーチサムＵＢ　１ｏｓｅａｒｃｈ　Ｓ　ａｍ　ｆｌ　）自動ペプチド 合成器において塩化メチレン：ジメチルホルムアミド（１：１）溶液中で活性剤 としてジイソプロピルカルボジイミドとジメチルアミノピリジンを用いて、実施 例■で述べたように製造したＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸 を実施例■に述べたように製造したアミンメチルポリアミド樹脂（１，２１？） に結合させた。塩化メチレン（ベーカーＨＰＬＣ等級）とジメチルホルムアミド 〔ベーカーフォトレツクス（Ｂ　ａｋｅｒ　Ｐ　ｈｏｔｒｅｘ）等級〕の両方は 再精製せずに用いた。フッ化水素による処理後に、グリシル樹脂５０ｇが０．１ ３ｍｏ１／ｇを含有することがアミノ酸分析によって判明した。アミノ酸分析は ベックマンモデル１１９（Ｂ　ｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌｌ　１１９）アミノ酸分 析器を用いて、樹脂結合ペプチドの２時間加水分解（１２Ｎ　ＨＣｊ！：ブロビ オン酸１：１，１３５℃）または２４４時間加水解（６Ｎ　ＨＣＩ！、１１０℃ ）によって実施した。

尺１鮭ｌ Ｂ　Ｓ　７、ベブ　ドの４ バイオサーチサム■自動ペプチド合成器を用いて、実施例■に述べたように製造 したＢＯＣ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸リンカ−が付着したアミ ノメチル架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂に、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡ ｇ）ペプチド１１９〜１５９を結合させたく全ての残基は２重に結合した）。Ｈ ＢｓＡｇペプチドの配列は次の通りであり、ＡＹＷサブタイプに相関する： Ｈ２Ｎ−ＧＬＹ−ＰＲＯ−ＳＥＲ−＾ＲＧ−ＴＨＲ−ＣＹＳ−ＮＥＴ−ＴＨＲ− ＴＨＲ−＾Ｌ＾−ＧＬＮ−このペプチドはジスルフィドループの特異的形成を制 御するために次の置換ニジスティン１２１４３８，１４９の代りにセリンを含む ものであった。システィン１３９と１４７スルフヒドリルは４−メトキシベンジ ル基によってブロックされ、１２４と１３７のシスティンのスルフヒドリルはＳ −アセトアミドメチル誘導体として保膿された。ａ−Ｎ−ｔＢｏｅ保護アミノ酸 はバケム（Ｂ　ａｃｈｅｌｌｌ）から購入した。付加的な側鎖保護基は次の通り であったニトリブトファンのインドール窒素に対するホルミル基；スレオニンと セリンのヒドロキシルに対するベンジルエーテル；上記のシスティンスルフヒド リルに対するアセトアミドメチルまたは４−メトキシベンジル；アスパルチン酸 のβ−カルボキシルとグルタミン酸のγ−カルボキシルに対するベンジルエステ ル；リシンのε−アミノ基に対する２−クロロベンジルオキシカルボニル：チロ シンのフェノール系ヒドロキシルに対する２、６−シクロロペンジルエーテル； およびアルギニンのグアニジンに対するｐ−トシル基基台合成は、塩化メチレン （ベーカーＨＰＬＣ等級）とＤＭＦ（ベーカーフォトレックス等級）を再精製せ ずに用いた。

ジイソプロピルエチルアミン（Ｄ　Ｉ　ＥＡ）（アルドリツヒ）はニンヒドリン 上で還流させて再蒸留した。トリフルオロ酢酸〔へロカーボン（Ｈａｌｏｃａｒ ｂｏｎ）　）は再蒸留して、中間留分を脱ブロツク工程に用いた。他の全ての化 学薬品は試薬等級以上であり、再精製せずに用いた。

完成ペプチジル樹脂をアニソール１０％とエタンジチオール２％とを含む無水Ｈ Ｆ　（２０ｚｊ！／樹脂２）によって０℃において３０分間処理することによっ て、これから側鎖保護基を除去した。ＨＦを蒸発させた後、ペプチジル樹脂をエ ーテル、１％酢酸、メタノール、塩化メチレン中５％ＤＩＥＡ、メタノール、ｉ ｆ＆に１％酢酸によって連続的に洗浄した。ペプチジル樹脂を真空乾燥させた。

０℃でのエタノールアミンによる処理によってトリプトファンからホルミル基を 除去した。フェリシアン化カリウム処理によってシスティン１３９と１４７の間 にジスルフィド橋が形成された、システィン１２４と１３７の間の第２ジスルフ イド橋は酢酸中ヨウ素の溶液によってアセトイミドメチル基を同時に除去する間 に生成した。

夫隨匠１ ＨＢｓＡｒ　の　のインビトロ　− 次のインビトロ検定法によって、ＨＢｓＡｇペプチド１１９−１５９■で述べた ように製造したＨＢｓＡｇペプチド１１９〜１５９−ポリアミド樹脂若干量を乳 鉢と乳棒によって粉砕した。顕微鏡を用いて、ポリアミド樹脂−ペプチド複合体 が粉砕されたことを実証する０例えばリン酸緩衝剤添加食塩水（ＰＢＳ）のよう な中性ｐＨ緩ｆｔ’ｒ液中に粉砕ポリアミド樹脂−ペプチド複合体約２０Ｏｒ＋ ｇ〜約１０μｇを含む溶液的１００μｒをグイナテツクイムノロン■（Ｄ　ｙｎ ａｔｅｃｈ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｎ　■）マイクロフィルターテストプレートの ような固相に吸着させる。非特異的結合部位を１０％正常ヤギ血清（ＮＧｔＳ） によってブロックし、プレートをトウイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）　Ｐ　Ｂ　 Ｓ　（Ｔ　−Ｐ　Ｂ　Ｓ　）によって洗浄して未結合抗体を除去した。

ＨＢｓＡｇペプチド１１１１５９に特異的な抗体を含有すると考えられるヒト血 清と、１０％ＮＧｔＳで希釈したポリアミド樹脂−ＨＢｓＡｖペプチド１１９− １５９でウサギを免疫化することによって製造したウサギ抗血清をポリアミド樹 脂−ペプチド被覆プレートに加え、３７℃において１時間インキュベートし、次 にＴ−ＰＢＳで洗浄した。次に、ビオチンヤギ抗ヒトＩｇＧまたはビオチンヤギ 抗ウサギＩｇＧ（：ベクターラボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）　、カンリフオルニア州、バーリンガム〕をそれぞれ、結合したヒト およびウサギ血清とともに、３７℃において１時間インキュベートする。孔を洗 浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したアビジン（Ａｖ−ＨＲＰ）を 室温において２０分間加える。次に、孔をＴ−ＰＢＳで洗浄して、未結合Ａｖ− ＨＲＰを除去し、１．２′−アジノージ（３−エチル−ベンズチアゾリンスルホ ン酸〔シグマケミカル社（Ｓ　ｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、））の１ｍＭ 溶液と基質としての０．０３％Ｈ２０２とを用いてペルオキシダーゼ活性を測定 する。水中５％（ＩＩｌ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを用いて反応を停止した 後、ダイナチックプレート読取り機を用いて４１０ｒ＋ｍにおいて分光測光的に 定量する。滴定によって各試薬の最適希釈度を測定する。基質以外の特異的結合 測定用試薬は全て、１０％ＮＧｔＳ中で希釈する。

夫族匠Ｉ ＨＢｓＡ　の　のインビ　ロ　− 次のインビトロ検定法によってＢ型肝炎表面抗原に対する抗体の存在に関して、 ヒト血清を分析した。ポリアミド樹脂−ＨＢｓＡ４ペプチド１１９−１５９複合 体の１０％溶液を、テトラヒドロフラン４０％の最終濃度を含む緩衝化ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）溶液中に製造した。　Ｉ　＋２’１００，０００〜１，０ ００，０００ｃｏｕｎｔｓ／分を含む、ＨＢｓＡｇペプチド１１９−１５９に特 異的な抗体の等量を加え、おだやかに揺らしながらインキュベートした。生成し た懸濁液を遠心分離し、ペレットを１％ＢＳＡ−）ウィーン２０ＰＢＳによって 洗浄してから、再び遠心分離した。次にガンマ−カウンター内でペレットの放射 能を計測した。結果は生のＨＢｓＡｇ抗体によるポリアミド樹脂ＨＢｓＡｇペプ チド１１９−１５９複合体の識別を明確に示している： ＩｇＧヒト抗ＨＢ　１　１２４０ｃｐｍ　２２，８４０ＩｇＧヒト抗ＨＢ　２　 １９２１　２８，７３２正常ヒトＩ　ｇＧ　１４３２　１９４９本　測定値は全 てｃｏｕｎｔｓ／分 夾度匠１ におζる　７、；　へのボリアミド ーブロチド　合　の 実施例■に述べたように製造したポリアミド樹脂−ペプチド複合体を用いて、ウ サギに下記のように免疫原反応を誘発した。

ニューシーラント産白ウサギ（雌）を、完全フロインドアジュバント中にエマル ジョン化したＨＢｓＡｇペプチド１１９−１５９２００μ＋？（ペプチド−樹脂 複合体として）またはグリシル樹脂のみ（免疫原の範囲、ウサギに対して５０μ ｌｉＩ〜１　ｍｇ）のいずれかの月１回筋肉内注射３回によって免疫化した。

２週間毎の採血後に血清を回収し、市販のラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）キ ット（ＡＵＳＡＢ、アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）　）を用いて抗−ＨＢｓＡｇ活性含調べた０ウサギに誘発された抗ペ プチド１１１１５９抗体反応による生のＨＢｓＡｇ表面抗原の識別は、ＲＩＡに よって得られた次のデータによって実証される： （ＲＩ　Ａ単位／１１） ａ　ｂ Ｎｏ、１　グリシン−樹脂　免疫前　＝８第１回　＝８ 第２回　≦８ 第３回　二８ Ｎｏ、２　ＨＢｓＡｇペプチド／樹脂　免疫前　＝８第１回　≦８ 第２回　１８３ 第３回　９２Ｏ Ｎｏ、３　ＨＢｓＡｇペプチド／樹脂　免疫前　ヱ８第１回　５：８ 第２回　７２ 第３回　２６２ ａ、免疫化前に得た血清 す、ＨＢｓＡｇに対する抗体力価はＲＩＡキットの感度以下であり、特異的抗体 を含まないと考えられる。

このデータから分るように、システィン１３９と１４７の間に単独のジスルフィ ド橋を含むポリアミド樹脂−）（ＢｓＡｇペプチド１１９−１５９複合体は、ウ サギの免疫化に用いた場合に、ＨＢｓＡｇと交差反応する抗ペプチド抗血清を生 じた。

火厳匠及 ＨＴＬＶ−１原ベプ　ドの４ 実施例■に述べたように製造したＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息 香酸リンカ−を実施例Ｖに述べた方法によって付着させた、実施例■で述べたよ うに製造した架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂に、ＨＴＬＶ−１［Ｉペプチ ドｇｐ１２０５０３〜５３２を実施例■でＨＢｓＡｇペプチド１１９−１５９合 成に関して述べた方法と同じ方法で結合させた、唯一の相違点は保護アミノ酸を 加えた順序である。ＨＴＬＶ−Ｉペプチド１ｐ１２０５０３〜５３２の配列は次 の通りである。

！？ｐ１２０５０３〜５３２ Ｈ２Ｎ−ＶＡＬ−＾Ｌ＾−ＰＲＯ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＡＬ＾−ＬＹＳ−八ＲＣ− ＾ＲＧ−■＾Ｌ−Ｖ＾Ｌ−ＧＬＮ−＾Ｒに−ＧＬ［Ｉ−ＬＹＳ−＾ＲＧ−＾Ｌ＾ −■＾Ｌ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−にＬＹ−＾Ｌ＾−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＬＥＵ−にＬＹ −ＰＨＥ−ＬＥＵ−夫厩匠孔 ７、否　へのポリアミド　−ＨＴＬＶ−１人複鵠」慕ケ侠月− ボリアミド樹脂−ＨＴＬＶ−Ｉ［ペプチド５０３〜５３２複合体で免疫化したウ サギは、実施例■の方法に従って実施した酵素結合イムノソルベントアッセイに よって測定すると特異的な抗ペプチド反応を示した〔実施例■で用いたＨＢｓＡ ｇペプチド１１９−１５９ではなく、ポリアミド樹脂−ＨＴＬＶＩ［ペプチド５ ０３〜５３２複合体によってウサギを免疫化して得た抗血清を用いた〕、このイ ムノアッセイの結果は第１図にグラフ化して示す、丸印によって表すデータは複 合体によって免疫化したウサギからのデータであり、三角印によって表すデータ は免疫化する前の同じウサギからのデータである（実大と実三角は両方とも１匹 のウサギからのものであり、空丸と空三角は両方とも１匹のウサギからのもので あり、他の空丸と空三角は両方とも第２のウサギからのものである）、ポリアミ ド樹脂と第３ペプチドとからの複合体は有意な結合を示すことができなかった。

ウサギの１匹は、ジェイ、ビー、アラン（Ｊ　、Ｂ　、Ａ　１ｌａｎ）等のサイ エンス（Ｓ　ｃ　１ｅｎｃｅ）２２８写、１０９１頁（１９８５）およびエフ、 バリン（Ｆ、Ｂａｒｉｎ）等のサイエンス２２８写、１０９４頁（１９８５）の 方法に従って実施したラジオイムノ沈降アッセイに基づくと、ＨＴＬＶ−Ｉ［１ のｇｐ−１２０被覆蛋白質に対して特異的な抗ＨＴＬＶ−１［［反応を生じた。

前記両文献はこの特定の参照によって全体的にここに関係する。

ペプチド５０３〜５３２に対して生じたウサギ抗血清がＨＴＬＶ−１［５染性を 中和しうろことは、一定量の抗血清によるＨＴＬＶ−■ストックの１０倍希釈を 用いて、逆転写酵素活性の低下に基づいて評価した。エフ、バッレーシノッシ（ Ｆ　、　Ｂ　ａｒｒｅ−Ｓ　１ｎｏｕｓｓｉ）等のサイエンス２２０写、８６８ 頁（１９８３）５１３照のこと、単独ウサギ抗ペプチド５０３〜５３２抗血清は ウィルスの１０倍希釈時に、エイズ患製を効果的に減少させた。第２のウサギの このペプチドに対する抗血清はＨＴＬＶ−■複製を減少させることができなかっ たので、ＲＴアッセイを通して対照として用いた。ウサギが同じ免疫原を受容し て検出可能な抗ペプチド反応を生じたにも拘わらず、ラジオイムノ沈降アッセイ に基づくと抗ＨＴＬＶ−１１活性はこの特定の血清中に検出されなかった。

ＨＴＬＶ−ｎ［を中和する抗血清はｆＩｐ１２０とｙｐｌｓｏの両方の被覆糖蛋 白質を検出する。このウサギ抗血清はＨＴＬＶＪ感染後１感染後１ニ 和に効果的でないことが判明した。

上記実施例は本発明の方法を例示するために述べたものである．これらの方法の 変更態様は当業者が理解するものであり、このような変更態様の全てが次の請求 の範囲に述べる本発明の精神および範囲から逸脱することな〈実施されると考え られる。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１功 昭和６２年１２月２８８ １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１００９７１ 、発明の名称 ポリアミド樹脂及び免疫診断用試薬の調整法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国テキサス用７８２８４．サン・アントニオ。

ビー・オー・ボックス　２８１４７ 名　称　サウスウエスト・ファウンデーション・フォー・バイオメディカル・リ サーチ　（外１名）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室 ５、補正書の提出日 請求の範囲（１９条補正） （１）　水溶液中でジメチルアクリルアミドモノマーと官能性モノマーとを共重 合することによって、ジメチルアクリルアミ開始剤と促進剤とを加えることによ って生成したポリアミド（２）　ジメチルアクリルアミドモノマーをジアミノア ルカンによって架橋する請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　ジアミノアルカンがＮ，Ｎ’−ビスアルケノイル−ジアミノアルカンで ある請求の範囲第２項記載の方法。

（４）　ジアミノアルカンを、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリル−１。

３−ジアミノプロパン；Ｎ　、Ｎ　’ービスアクリリルー１．３ージアミノエタ ン；Ｎ，Ｎ”−ビスアクリリル−１．３−ジアミノブタンおよびＮ，Ｎ’−ビス アクリリル−１．３−ジアミノヘキサンからなる群から選択する請求の範囲第３ 項記載の方法。

（５）官能性モノマーがアルケニルアミンである請求の範囲第１項記載の方法。

（６）　アルクニルアミンがさらに保護基を含む請求の範囲第５項記載の方法。

（１７）　リンカ−がＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸である 請求の範囲第１５項記載の方法。

（１８）請求の範囲第１項記載の方法に従って製造したポリアミド樹脂。

（１９）　塩化メチレン中で膨潤すると、その乾燥床体積の約２．５倍になり； 約８％−約１２％が架橋し； 樹脂１ｇにつきアリルアミン約５０−約４００μｍｏｌを含有し；アミド結合に よってｔ！Ｉ脂に結合した時に、樹脂１ｇにつきアミノ酸約０．１−約０．５μ ｍ０１と置換しうる；および負荷した時に、未反応遊離アミンを有しないこと； を特徴として含むポリアミド樹脂。

（２０）　ビーズの直径が約１８０μ未満であることをさらに特徴とする請求の 範囲第１９項記載のポリアミド樹脂。

する段階； から成る哺乳動物に免疫原反応を誘発する方法。

（２２）　ポリアミド樹脂が架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂である請求の 範囲第２１項記載の方法。

（２３）　ポリアミド樹脂にリンカ−を介して蛋白を結合させることによって、 ポリアミド樹脂上に蛋白を合成する請求の範囲第２１項記載の方法。

（２４）　リンカ−がオキシアルキル安息香酸誘導体である請求の範囲第２３項 記載の方法。

（２５）　リンカ−がＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸である 請求の範囲第２３項記載の方法。

（２６）　哺乳動物をアジュバント中のポリアミド樹脂−≠中学（２７）ポリア ミド樹脂を製造し； 蛋白をポリアミド樹脂上に合成して、ポリアミド樹脂−蛋白複合体を形成する； 蛋白と特異的に結合しうる抗体を含むと思われる体液にポリアミド樹脂−蛋白複 合体を接触させる；および結合した抗体を検出する段階： から成るインビトロ診断検定方法。

（２８）ポリアミド樹脂−蛋白複合体を血清との接触前に固相に吸着させる請求 の範囲第２８項記載の方法。

（２９）ポリアミド樹脂製造工程が次の段階：水溶液中でジメチルアクリルアミ ドモノマーと官能性七ツマ−とを共重合することによって、ジメチルアクリルア ミドモノマーを架橋し； 有機溶媒中で前記水溶液を乳化し；および開始剤と促進剤とを加えることによっ て生成したポリアミド樹脂ビーズを単離する段階； を含む請求の範囲第２７項記載の方法。

国際調査報告 ｌＩｌ′ａｍｌ　Ａｅｋａｋ　Ｎ＆　Ｐｃ’ｒ７ｏＳ８７　／　Ｑ　Ｑ　９７１ ＰＣＴ／ＵＳ８７１００９７１ Ａヒｔａｃｈｍｅｎ仁Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　 ＶＩ。

ＰＣＴ／ＵＳ８７１００９７１ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ｐａｒ／ＩｓＡ／２１ｏ、Ｐａｒｔ、 　ｖ工。

Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ　ａｐｐｒｏｖａｌ：Ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉ ｎｇ　１ａｃｋ　ｏｆ　ｕｎｉセｙ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｔｉｍｅ　Ｌ ｉｍ１ｔ　ｆｏｒ　Ｆｉｌｉｎｇ　ａ　Ｐｒｏｔｅｓｔ＝

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）水溶液中でジメチルアクリルアミドモノマーと官能性モノマーとを共重合 することによって、ジメチルアクリルアミドモノマーを架橋し； 有機溶媒中で前記水溶液を乳化し；および開始剤と促進剤とを加えることによっ て生成したポリアミド樹脂どーズを単離する工程； を含む固相蛋白合成用ポリアミド樹脂の製造方法。
2. （２）ジメチルアクリルアミドモノマーをジアミノアルカンによって架橋する請 求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）ジアミノアルカンがＮ，Ｎ′−ビスアルケノイル−ジアミノアルカンであ る請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）ジアミノアルカンを、Ｎ，Ｎ′−ビスアクリリル−１，３−ジアミノプロ パン；Ｎ，Ｎ′−ビスアクリリル−１，３−ジアミノエタン；Ｎ，Ｎ′−ビスア クリリル−１，３−ジアミノブタンまたはＮ，Ｎ′−ビスアクリリル−１，３− ジアミノヘキサンからなる群から選択する請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）官能性モノマーがアルケニルアミンである請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）アルケニルアミンがさらに保護基を含む請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）保護基がビーズに塩基を接触させることによって除去される請求の範囲第 ５項記載の方法。
8. （８）保護基がメチルスルホニルエチルカルボニル基である請求の範囲第６項記 載の方法。
9. （９）開始剤がリポフラビンまたは過硫酸塩である請求の範囲第１項記載の方法 。
10. （１０）開始剤が過硫酸アンモニウムである請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）有機溶媒がヘキサンと四塩化炭素との混合物である請求の範囲第１項記 載の方法。
12. （１２）水溶液をソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノデカノエートまた はソルビタンセスキオレートによって乳化する請求の範囲第１項記載の方法。
13. （１３）促進剤がＮ．Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを含む請 求の範囲第１項記載の方法。
14. （１４）ビーズをろ過、洗浄および乾燥によって単離する請求の範囲第１項記載 の方法。
15. （１５）リンカーをポリアミド樹脂に結合させることをさらに含む請求の範囲第 １項記載の方法。
16. （１６）リンカーがオキシアルキル安息香酸誘導体である請求の範囲第１５項記 載の方法。
17. （１７）リンカーがＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸である請 求の範囲第１５項記載の方法。
18. （１８）請求の範囲第１項記載の方法に従って製造したポリアミド樹脂。
19. （１９）塩化メチレン中で膨潤すると、その乾燥床体積の約２．５倍になり； 約８％−約１２％が架橋し； 樹脂１８につきアリルアミン約５０−約４００μｍｏｌを含有し；アミド結合に よって樹脂に結合した時に、樹脂１８につきアミノ酸約０．１−約０．５μｍｏ ｌと置換しうる；および負荷した時に、未反応遊離アミンを有しないこと；を特 徴として含むポリアミド樹脂。
20. （２０）ビーズの直径が約１８０μ未満であることをさらに特徴とする請求の範 囲第１９項記載のポリアミド樹脂。
21. （２１）ポリアミド樹脂を製造し； ポリアミド樹脂上に蛋白を合成し；および哺乳動物をポリアミド樹脂−蛋白複合 体によって免疫化する段階； から成る哺乳動物に免疫原反応を誘発する方法。
22. （２２）ポリアミド樹脂が架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂である請求の範 囲第２１項記載の方法。
23. （２３）ポリアミド樹脂にリンカーを介して蛋白を結合させることによって、ポ リアミド樹脂上に蛋白を合成する請求の範囲第２１項記載の方法。
24. （２４）リンカーがオキシアルキル安息香酸誘導体である請求の範囲第２３項記 載の方法。
25. （２５）リンカーがＢｏｃ−グリシル−４−（オキシメチル）安息香酸である請 求の範囲第２３項記載の方法。
26. （２６）哺乳動物をアジュバンド中のポリアミド樹脂−蛋白複合体によって、免 疫化する請求の範囲第２１項記載の方法。
27. （２７）ポリアミド樹脂を製造し； 蛋白をポリアミド樹脂上に合成して、ポリアミド樹脂−蛋白複合体を形成する； 蛋白と特異的に結合しうる抗体を含むと思われる体液にポリアミド樹脂−蛋白複 合体を接触させる；および結合した抗体を検出する段階； から成るインビトロ診断検定方法。
28. （２８）ポリアミド樹脂−蛋白複合体を血清との接触前に固相に吸着させる請求 の範囲第２８項記載の方法。
29. （２９）ポリアミド樹脂製造工程が次の段階：水溶液中でジメチルアクリルアミ ドモノマーと官能性モノマーとを共重合することによって、ジメチルアクリルア ミドモノマーを架橋し； 有機溶媒中で前記水溶液を乳化し；および開始剤と促進剤とを加えることによっ て生成したポリアミド樹脂ビーズを単離する段階； を含む請求の範囲第２７項記載の方法。
30. （３０）ポリアミド樹脂が次の特徴： 塩化メチレン中で膨潤すると、その乾燥床体積の約２．５倍になり； 約８％−約１２％が架橋し； 樹脂１８につきアリルアミン約５０−約４００μｍｏｌを含有し；アミド結合に よって樹脂に結合した時に、樹脂１８につきアミノ酸約０．１−約０．５μｍｏ ｌと置換しうる；および負荷した時に、未反応遊離アミンを有さない；ならびに 前記ポリアミド樹脂に蛋白が結合する特徴；を有することから成るインビトロ診 断検定方法。