CN104130978A

CN104130978A - 一种杂交瘤细胞株11a2及其应用

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Publication number: CN104130978A
Application number: CN201410232584.5A
Authority: CN
Inventors: 齐智; 史洁; 齐晓龙; 康延申; 松井彦明; 陈仙子; 牛德云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-05-29
Also published as: CN104130978B

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株11A2及其应用。该杂交瘤细胞株11A2能够产生抗人血清白蛋白（humanserumalbumin,HSA）的单克隆抗体。其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.9243。本发明的优点在于：杂交瘤细胞株11A2能够特异性的产生抗HSA的单克隆抗体，该抗体对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性，可以达到0.0012pg/ml（1.2fg/ml）的水平。利用本发明获得的细胞株11A2所产生的单克隆抗体，可用于人极微量白蛋白的检测、药物中残留人白蛋白的检测和纯化白蛋白等多种用途，具有很好的应用价值。

Description

一种杂交瘤细胞株11A2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞能够产生抗人白蛋白的单克隆抗体。

背景技术

人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是人体血液中最为重要的成份，含量达到42 g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物质、保持细胞中内含物的稳定性等多种功能。人白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白作为糖尿病、肾病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿中白蛋白定量检测具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法具有重要的应用价值，而该方法的关键在于抗白蛋白单克隆抗体的灵敏度和特异性，即白蛋白单克隆抗体的对抗原白蛋白特异性的高低，就决定了检测尿中白蛋白的灵敏度和特异性，在临床上决定了是否能及早地发现病人代谢白蛋白出现异常，从而推测病人是否患有糖尿病、肾病、心脑血管等慢性病，这对于及早发现病情，及早治疗具有重要的临床意义。

目前，用于检测尿中白蛋白含量的方法主要是酶联免疫吸附实验（ELISA），该方法检测白蛋白要比溴甲酚紫（BCP）法和溴甲酚绿（BCG）（这两种方法的灵敏度为1μg/ml）、蛋白质电泳法（0.5 μg/ml）的灵敏度和特异性要高的多，是目前检测尿中白蛋白早期诊断的主要方法。据报道，专利ZL2009201520440所述的一种人极微量白蛋白ELISA检测试剂盒，其灵敏度可以达到0.15 ng/ml的水平。目前开发出的ELISA检测试剂盒中，最为灵敏的检测白蛋白的试剂盒是美国Cloud-Clone Corp公司生产的高敏人血清白蛋白检测试剂盒（货号HEB028Hu），其灵敏度可以达到0.048 ng/ml（48 pg/ml）的水平。因此，美国Cloud-Clone Corp公司开发的检测微量人白蛋白试剂盒灵敏度是专利ZL2009201520440试剂盒的3.13倍，这对于尿中微量白蛋白的检测水平明显的提高了一个台阶。但是，在临床上，检测白蛋白灵敏度在pg级水平（48 pg/ml）仍然难于达到一些慢性疾病的早期检测要求，如妊娠子痫前期、2型糖尿病等疾病。在一些药物中，如人的细胞因子中残留的白蛋白的检测，要求其检测试剂盒具有更高的灵敏度。因此，开发出更为灵敏的白蛋白检测试剂盒具有重要的临床价值。而解决这一问题最佳的途径，就是通过高灵敏度白蛋白单克隆抗体的开发，以提高检测白蛋白灵敏度。

另一方面，由于人白蛋白在临床上可以治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化疗、腹水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等多种疾病。因此，人白蛋白使用量越来越大，每针剂量通常达10g或者25g，而大多数蛋白质药物，如细胞因子、激素的剂量仅为μg或ng级，因此相对其他蛋白药物来说，人白蛋白的纯度要求更为严格。利用抗体、抗原具有特异性识别的特点而进行的亲和层析技术，不仅可以大幅度的简化蛋白质的纯化步骤，而且纯化的效率更高，蛋白质的纯度更高，成本更低，这对于临床病人用药的安全性和经济性具有重要的实用意义。

本发明的目的在于：提供一种能产生与人白蛋白（HSA）发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体要对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。

本发明的目的是这样实现的：一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于：在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 9243。保藏日期为2014年5月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明中，一种杂交瘤细胞株的制备方法，其特征如下所述。

① 将免疫抗原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠，每次注射体积为0.2ml，蛋白质用量为50 μg/只，对小鼠实施基础免疫。

② 将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射1次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为40 μg/只。将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 μg/只。

③ 按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按6:1的比例，用PEG3350进行融合；用HAT培养液选择培养。融合后7-14天，取细胞培养上清，采用间接ELISA方法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。

④ 重复进行6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株分泌HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。

本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法获得的。

① 通过细胞培养液获得：将杂交瘤细胞株11A2按1×10⁶接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37^oC含5% CO₂的细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在500×g离心5分钟，收集上清液，通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化，获得单克隆抗体。

② 通过动物腹水获得：将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4^oC下，8000×g离心20分钟，收集上清，通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化，获得单克隆抗体。

本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法进行鉴定抗体亚型的。

① 抗体纯度鉴定：将单抗用12% SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定，如图1所示。通过Quantity-One（版本4.62）软件计算，抗体纯度为95%。

② 抗体亚型鉴定：采用小鼠抗体分型试剂盒（Sigma公司生产）鉴定抗体亚型，测定结果表明，抗体亚型为IgG1 κ型。

本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。采用抗原HSA直接包被96孔板（Corning公司生产），直接ELISA法测定杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）特异性的识别能力。具体叙述如下。

用不同浓度的HSA直接包被96孔ELISA检测板，检测中设有空白对照、阴性对照和阳性对照。用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）封闭检测板，依次加入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）。然后加入TMB显色液后，用硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。结果表明（图2），杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml HSA）的水平，而与牛血清白蛋白（BSA）没有任何反应。可见，mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。

杂交瘤细胞11A2细胞产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对HSA特异性的识别能力和超高的灵敏度，具有多种应用，如下所述。

① 用于极微量或残留人白蛋白的检测。

用商业化的人白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被96孔ELISA检测板，用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）封闭检测板，然后加入待检测的样品，如人尿液（含极微量人白蛋白）或人细胞因子溶液（含残留人白蛋白）。检测中设有空白对照，即用PBS代替HSA；设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2（Sigma公司生产）为阳性对照。依次加入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）。加入TMB显色液后，用硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。同时，在96孔板中，建立不同浓度的HSA，制作人白蛋白浓度标准曲线。

结果表明，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）用于ELISA试剂盒的检测，可以检测到稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml，人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。

② 用于免疫亲和层析：用杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2，纯度为95%），与活化的基质或微珠交联后，制备抗体亲和层析柱。然后，将含HSA的样品加入层析柱上，弃掉流穿液和清洗液，最后把目的蛋白质，即与单克隆抗体具有高度特异性的HSA从层析柱上洗脱下来，达到纯化HSA的目的。结果发现，用mAb 11A2抗体免疫亲和层析，HSA的收率为95%，纯度为99%。与其他纯化方法相比，免疫亲和层析纯化HSA的效率要比阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析三者之和（HSA的收率为72%，纯度为94%）还要高，因为以上三者都是非特异性的，而抗体抗原亲和层析，是特异性的。

综合上述，本发明的优点在于，本发明所获得的一种杂交瘤细胞株11A2能够特异性的分泌针对HSA的单克隆抗体，对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。

本发明的优点还在于，利用本发明所获得的细胞株所产生的单克隆抗体，具有多种用途，对实际生产和临床应用上具有非常好的价值。

附图说明

图1：杂交瘤细胞株11A2产生的特异性单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图。1表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体（不加还原剂DTT，也不加热煮沸）；3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。

图2：ELISA检测杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体对抗原HSA的灵敏度和特异性实验。图中横坐标表示不同的浓度的HSA。其中，1是阳性对照；2是阴性对照；3是空白对照。4-12表示不同浓度的HSA：4是1 ng/ml；5是100 pg/ml；6是10 pg/ml；7是1 pg/ml；8是100 fg/ml；9是10 fg/ml；10是1 fg/ml；11是0.1 fg/ml和12是0.01 fg/ml。

具体实施方式

实施例1 杂交瘤细胞株的建立。

一、材料与试剂。

1、材料：Bal B/c小鼠，6-8周龄，雌性。购自北京医科大学动物中心。Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞购自美国ATCC。人血清白蛋白（HSA，用做免疫原）购自Sigma公司。

2、试剂：RPMI-1640、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、HAT和HT培养液购自Invitrogen公司。弗氏完全、不完全佐剂、石油醚、PEG3350、HRP-羊抗鼠抗体购自Sigma公司。其他试剂为分析纯，均购自国药集团公司。

二、杂交瘤细胞株的建立。

1、动物免疫：基础免疫是将免疫原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠。每只每次注射体积为0.2 ml，HSA的用量为50 μg/只。加强免疫是将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射1次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为40 μg/只。将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 μg/只。

2、杂交瘤细胞的制备。

① Sp2/0骨髓瘤细胞的准备：选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，排列整齐，呈半致密分布。用培养液洗涤一次后，用10 ml培养液将Sp2/0骨髓瘤细胞轻轻吹下。

② 脾细胞的准备：取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒小鼠体表5分钟，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。无菌打开腹腔取出脾脏，用DMEM培养液洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM培养液的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。

③ 饲养细胞的制备：取一只健康的小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10 ml注射器，12号针头，注射5-10 ml HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。

④ 细胞融合：将上述制备的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 ml的带盖的无菌离心管中，500×g离心5分钟，上清要充分吸净，以免影响PEG3350的作用。将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，使两种细胞充分混匀。用1 ml吸管将预热的PEG3350在60秒内缓慢加到融合管中，轻轻摇匀，立即滴加37^oC预热的DMEM，使PEG3350失去作用。加入5 ml的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50 ml。分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37^oC，5% CO₂细胞培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出一半培养基。融合后7-14天，观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清，采用间接ELISA法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。

⑤ 杂交瘤细胞株的筛选：经过上述6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为11A2，并于2014年5月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 9243。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

三、杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体的效价测定。

将11A2细胞在含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到20代后进行单克隆抗体测定。

① 细胞培养液上清效价测定：将20代细胞按1×10⁶接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37^oC含5% CO₂细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在500×g离心5分钟，收集上清，用间接ELISA法测定细胞上清液中单克隆抗体效价，结果表明上清效价为1:10,000-1:80,000。

② 小鼠腹水效价测定：将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2×10⁶个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4^oC下，8000×g离心20分钟，收集上清液。用间接ELISA法测定上清中单克隆抗体，效价为1:1×10⁵-1:4×10⁵。

四、杂交瘤细胞株的传代培养。

将细胞株11A2在含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到90代后，细胞株11A2仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10,000-1:80,000的水平。可见，本发明所得的细胞株11A2能够稳定传代，可以持续、稳定产生抗HSA的单克隆抗体。

实施例2 应用细胞株11A2制备抗HSA的单克隆抗体。

一、单克隆抗体的制备。

将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射1-2×10⁶个杂交瘤11A2细胞，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4^oC下，8000×g离心20分钟，收集上清。然后，用nProteinA Sepharose 4 Fast Flow填料（GE Healthcare公司生产）纯化腹水上清。弃掉流穿液和冲洗液，然后用甘氨酸-HCl，pH3.0洗脱液洗脱。收集洗脱液，用Tris-HCl，1M，pH9.0缓冲液中和至pH7.0，最后得到抗HSA的单克隆抗体（mAb 11A2）。

二、单克隆抗体mAb 11A2的鉴定。

1、抗体纯度鉴定：用12%SDS-PAGE电泳鉴定mAb 11A2的纯度。电泳图如图1所示，1表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体（不加还原剂DTT，也不加热煮沸）；3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。电泳凝胶照片通过Quantity-One（版本4.62；BioRad公司）软件计算，单克隆抗体mAb 11A2的纯度为95%。

2、抗体亚型鉴定：采用小鼠抗体分型试剂盒（Sigma公司生产）鉴定抗体亚型，具体操作参照厂家提供的说明书进行。测定结果表明，抗体亚型为IgG1 κ型。

3、抗体与抗原的灵敏度和特异性鉴定：采用抗原HSA直接包被96孔板（Corning公司生产），直接ELISA法测定单克隆抗体mAb 11A2特异性的识别能力。本实验重复3次，每个样品有3个复孔。具体方法如下所述。

① 用HSA直接包被96孔板，浓度依次为1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中设有空白对照，即用PBS代替HSA；设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体（Sigma公司生产）为阳性对照。4^oC包被过夜。

② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37^oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体，在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。然后，加入生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1,1:50,000稀释），在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。再加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP, 1:5,000稀释），在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。

③ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。

结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值等于或小于2.1为阴性。

根据以上结果判断的标准和进一步数据分析显示（图2），杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml HSA）的水平，而与BSA没有任何反应。由此可见，mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。

实施例3 细胞株11A2产生的单克隆抗体用于人白蛋白检测试剂盒。

由于本发明基于所述的细胞株11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对抗原HSA具有超高灵敏度和超强的特异性，可以应用于检测极其微量或残留的HSA的含量。具体方法叙述如下。

1、检测试剂盒的试剂。

① 包被抗体：商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体1和2（Sigma公司生产），抗体浓度为1 μg/ml。

② 检测样品：人尿样（微量HSA）或人细胞因子溶液（残留HSA）。

③ 检测抗体：本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体，浓度为0.5 μg/ml。

④ 底物：四甲基联苯胺（TMB）：100 ml/瓶。

⑤ 封闭液：3%脱脂奶粉。

⑥ TBS缓冲液：Tween-20为0.05%，Na₂HPO₄和NaH₂PO₄缓冲液，pH7.4， 20 mM。

⑦ 生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）：1:50,000稀释。Thermo Fisher公司生产。

⑧ 链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）：1:5,000稀释。Thermo Fisher公司生产。

2、检测试剂盒的检测方法。

① 用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被96孔板（Corning公司生产）。4^oC包被过夜。

② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37^oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。

③ 加入待检测的样品，人尿液用0.9%生理盐水稀释或人细胞因子溶液，上样量为100 μl。同时，用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线，分别是1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中空白对照：用PBS代替HSA；阴性对照：用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml；阳性对照：商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2（Sigma公司生产）。37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。

④ 加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。

⑤ 加入生物素标记的羊抗鼠抗体，在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。

⑥ 加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP），在37^oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。

⑦ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。

本实验重复3次，每个样品有3个复孔。结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。

根据以上结果判断标准、HSA标准曲线，结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml。人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。

实施例4 细胞株11A2产生的单克隆抗体用于免疫亲和层析。

一、免疫亲和层析柱的制备。

1、材料和试剂。

① 材料：细胞株11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）；活化层析填料（NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare公司生产）；微株（GE Healthcare公司生产）。

② 试剂：平衡缓冲液（0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH8.3）。封闭缓冲液（0.5 M 氨基乙醇，0.5 M NaCl，pH8.3）。冲洗缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH8.9）。

2、制备方法。

详细的操作方法见厂家说明书。将活化层析填料或微珠用平衡缓冲液平衡后，加入mAb 11A2单抗进行偶联。用封闭缓冲液封闭未偶联的填料或微珠，再用冲洗缓冲液冲洗层析柱或微珠，免疫亲和层析柱制备完成。

经过检测，mAb 11A2免疫亲和填料或微珠的亲和量为：40 mg HSA/ml。

二、用免疫亲和层析柱纯化HSA。

1、材料和试剂。

① 材料：mAb 11A2单克隆抗体偶联的免疫亲和层析填料。

② 试剂：平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄和NaH₂PO₄, pH7.2）；冲洗缓冲液（20 mM Na₂HPO₄和NaH₂PO₄, pH7.2）；洗脱缓冲液（20 mM Na₂HPO₄和NaH₂PO₄, 2M NaCl, pH7.2）。

2、方法。

① 装柱和平衡：将偶联好mAb 11A2层析填料或微珠上柱，用平衡缓冲液平衡5个柱体积，流速为1 ml/分钟。

② 上样：按照亲和量40 mg HSA/ml计算样品的上样量。

③ 冲洗杂质：样品上样后，弃掉流穿液（Flow through），用冲洗缓冲液（Wash Buffer）冲洗10个柱体积。

④ 洗脱目的蛋白质：用洗脱缓冲液（Elution Buffer）洗脱结合在填料柱上的HSA，洗脱体积为2个柱体积。

⑤ 平行试验：用阳离子交换柱（SP Sepharose 4 Fast Flow，GE Healthcare公司生产）、疏水柱（Phenyl Sepharose 4 Fast Flow，GE Healthcare公司生产）、阴离子交换柱（Q Sepharose Fast Flow，GE Healthcare公司生产）对照。具体操作参照生产厂家的说明书。

⑥ 纯度检测，用SDS-PAGE电泳检测纯化后HSA的纯度。用Quantity-One软件（版本4.62；BioRad公司）计算HSA的纯度。

结果显示，上样前HSA的纯度为70%，通过mAb 11A2免疫亲和层析柱纯化后HSA的纯度为99%，收率95%。通过阳离子交换柱、疏水柱和阴离子交换柱3步纯化后，HSA的纯度为94%，收率为72%，由此可见，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）用于免疫亲和层析，显著特征在于，纯化HSA具有更高的纯度和收率，具有很好的工业化应用价值。

Claims

1.一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于：在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO.9243。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株11A2，其制备方法的特征在于，按如下步骤获得：

① 用抗原人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）免疫小鼠；

② 收集免疫小鼠的脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT培养基进行选择性培养；

③ 用HSA抗原包被ELISA平板，采用间接ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清中的抗体含量进行检测，筛选获得一株稳定分泌抗HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。

3.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体与HSA发生抗原抗体反应，属IgG1亚型抗体。

4.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体具有多种的应用。

5.根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量白蛋白的检测。

6.根据权利要求5所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量的白蛋白ELISA检测试剂盒。

7.根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于纯化HSA。

8.根据权利要求7所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体制成用于纯化HSA的免疫亲和柱。

9.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，可应用于工业化生产。