CN101735987A - 抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株能同时抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体细胞株，属于B细胞杂交瘤技术领域。一株抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体细胞株，保藏号为CGMCC No.2674。本发明制备出一种针对阿莫西林的单克隆抗体，这株单抗与同是青霉素类抗生素的氨苄西林的交叉反应为100％，与头孢菌素类抗生素头孢唑啉的不存在交叉反应。本发明可用于快速检测动物原性食品中阿莫西林和氨苄西林的残留情况，并可进一步用于开发快速、准确检测动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林含量的免疫检测产品。

Description

抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体细胞株

技术领域

本发明涉及一株能同时抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体，属于B细胞杂交瘤技术领域。

背景技术

抗生素被广泛的应用于预防和治疗家禽家畜的多种微生物感染性疾病。但抗生素存在严重的副作用，长期使用抗生素的危害主要是导致细菌产生抗药性，将造成抗药菌株的扩散、蔓延，甚至使某一特定组织细胞产生抗药性。超量滥用抗生素，造成抗生素在畜产品中残留，并最终以各种途径汇集于人体，导致人体产生大量耐药菌株，失去对某些疾病的抵抗力，引起变态反应、过敏反应，最终对人体器官产生严重的毒害。阿莫西林和氨苄西林属于广泛使用的青霉素类抗生素。欧盟、美国和日本等世界上许多发达国家都对其在畜产品中的最大残留限量做了明确规定。

目前，对畜产品或动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留量的检测主要采用高压液相色谱法和高压液相色谱-质谱串联法。这两种方法虽然灵敏、准确，但检测时间长、时效性差、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的筛选测定，无法满足食品安全管理对检测方法快速、高效的要求。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是建立阿莫西林和氨苄西林免疫检测方法不可缺少的高质量单抗细胞株，从而制备阿莫西林和氨苄西林的单克隆抗体。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一株抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体细胞株，保藏号为CGMCC No.2674。

小鼠单克隆抗体细胞株CGMCC No.2674产生的单克隆抗体。

所述细胞株或单克隆抗体用于制备检测阿莫西林和氨苄西林的试剂的应用。

本发明所涉及小鼠B淋巴瘤细胞杂交瘤，定名为JMAS102，已于2008年9月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.2674。保存地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明将阿莫西林分别交联于两种不同的大分子蛋白载体KLH和BSA，采用阿莫西林-KLH交联物免疫Balb/c小鼠，通过B细胞杂交瘤技术，经过动物免疫、细胞融合、筛选(BSA交联物用于单抗的筛选)及亚克隆获得可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，并制备腹水，Protein G亲和纯化特异性抗体。

本发明制备出一种针对阿莫西林的单克隆抗体，这株单抗与同是青霉素类抗生素的氨苄西林的交叉反应为100％，与头孢菌素类抗生素头孢唑啉的不存在交叉反应。本发明可用于快速检测动物原性食品中阿莫西林和氨苄西林的残留情况，并可进一步用于开发快速、准确检测动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林含量的免疫检测产品。

本发明的优点是：这株细胞可以同时对阿莫西林和氨苄西林起反应(阿莫西林和氨苄西林同属于青霉素类抗生素)，而不与头孢唑啉起反应，(头孢唑啉属于β-内酰胺类抗生素)，从而为开发出检测光谱青霉素类抗生素残留的试剂盒提供可能。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1：抗原交联

一.免疫原合成：

采用碳二亚胺盐酸盐(EDCoHCl)两步法：称取阿莫西林10-20mg，EDCoHC 50-150mg，NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)5-20mg，于一个单口瓶中，加入1-4mL DMF(二甲基甲酰胺)中使充分溶解，放入磁力搅拌器转子，密封避光，室温反应10-20hrs，得到阿莫西林反应液，称为A液。然后称取KLH(钥孔嘁血蓝素)10-50mg充分溶解于1-8mL PBS(磷酸盐缓冲液)中，称为B液。然后将A液逐滴加入B液中，密封避光，在2-8℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至采用PBS预处理10-32hrs的透析袋中，于2-8℃冰箱中，搅拌下用PBS透析12-72hrs，中间多次换液。将透析后的交联产物阿莫西林-KLH置于单口瓶中，冰冻干燥。

二.包被原合成：

采用混合酸酐法：称取阿莫西林10-20mg，置于一个单口瓶中，加入1-4mL DMF，将溶液预冷，随后加入5-20μL三乙胺和5-30μL氯甲酸异丁酯，搅拌混匀，低温下反应10-30min，称为A液。准确称取10-60mg溶于BSA于1-6mL CB中，称为B液。然后将A液逐滴加入B液中，室温下避光搅拌反应2-10hrs。待上述反应完成后，将反应液转移至采用PBS预处理10-32hrs的透析袋中，于2-8℃冰箱中，搅拌下用PBS透析12-72hrs，中间多次换液。将透析后的交联产物阿莫西林-BSA置于单口瓶中，冰冻干燥。

实施例2：单克隆抗体制备

一.免疫小鼠与效价测定

以阿莫西林-KLH交联物为免疫抗原，免疫Balb/c纯系小鼠，按30-150μg/只小鼠取抗原，与弗氏完全佐剂等量混合，充分乳化后，小鼠颈背部皮下多点注射。第一次免疫后3周进行第二次免疫，剂量与第一次相同，采用弗氏不完全佐剂乳化，小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫后3周，采用相同剂量的抗原溶于生理盐水中，腹腔注射。免疫结束后5-15天，小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA法测定抗血清效价。

间接ELISA法测定抗体效价方法：用PBS将阿莫西林-BSA稀释至1-5μg/ml，100μl/孔加入酶标板。2-8℃过夜。洗板3次。1-5％BSA封闭液，1-300μl/孔，室温孵育1-3小时，洗板。第三次免疫后一周，小鼠断尾取血，分离血清，从1∶1000开始做倍比稀释，依次加入各孔，100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠Ig(H+L)，37℃孵育30分钟。洗板3次。每孔加TMB底物100μl，室温避光显色5-15分钟。每孔加终止液50μl。酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。

免疫5只Balb/c纯系小鼠。每次免疫间隔3周，总计免疫4次。抗血清效价检测结果见表1，选择3#小鼠做融合。

表1：小鼠抗血清效价ELISA检测结果

效价       OD of 1#  OD of2#  OD of 3#  OD of 4#  OD of 5#

1∶1000    1.718     0.920    2.213     0.646     0.280

1∶2000    1.440     0.583    1.801     0.438     0.178

1∶4000    1.133     0.388    1.751     0.296     0.151

1∶8000    0.815     0.247    1.515     0.186     0.123

1∶16000     0.546    0.191    1.133    0.137    0.098

1∶32000     0.351    0.140    0.765    0.130    0.102

1∶64000     0.247    0.119    0.577    0.109    0.099

1∶128000    0.249    0.204    0.433    0.119    0.097

二.细胞融合

融合前5-10天复苏SP2/0细胞，于5-10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基中传代培养至所需数量1-5×10⁷，必须保证融合时SP2/0的数量及处于对数生长状态。冲击免疫：于融合前3-5天取抗原小鼠腹腔注射冲击免疫，30-150μg/只小鼠。于融合前一天取小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞板。断颈处死小鼠，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒3-5分钟。将小鼠移入超净台，腹部向上放置，剪开腹部皮肤，钝性剥离充分暴露腹膜。剪开腹膜，吸取1-5ml无血清培养基注入腹腔冲洗2-3遍，将培养基吸入离心管中。1,000-1,500rpm离心5-10分钟，弃上清，将细胞移入适量完全培养基混匀，制备5块滋养细胞板。将滋养细胞悬液加入96孔板。把96孔板放入37℃孵箱，10-24小时后使用。将0.5-1.5ml PEG和5-20ml无血清RPMI-1640置于37℃孵箱预热。将处于对数生长期的SP2/0收集到50ml离心管中，计数，取1-5×10⁷个骨髓瘤细胞，1,000-1,500rpm离心5-10分钟，弃上清，加入20-50ml无血清RPMI-1640，洗涤2次。将效价已达到要求，已冲击免疫的免疫小鼠摘眼球放血，断髓处死，浸泡于75％的酒精中消毒3-5分钟，无菌剪开腹腔，暴露腹膜，取出脾脏，放入平皿中，将脾脏置于200目钢网上，加少量RPMI-1640，研磨，制成单个脾细胞悬液，将脾细胞悬液移入50ml离心管中，加RPMI-1640至20-40ml，1,000-1,500rpm离心5-10分钟，洗涤2遍。骨髓瘤细胞和脾细胞充分混合，加RPMI-1640，1,000-1,500rpm离心5-10分钟，倒尽上清。缓缓加入37℃预热的PEG0.5-1.5ml，在30-60秒加完，作用30-60秒。向融合体系中加入无血清培养基5-20ml以终止PEG的作用，先慢后快，第一个1ml加1-3分钟，第二个1ml加1-3分钟，其余3-18ml在3-5分钟内加完。1,000-1,500rpm离心5-10分钟，弃上清，加入10-30ml的含有5-20％FBS的RPMI-1640，轻轻吹打混匀。将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中。融合后第二天加入HAT选择性培养基。每天观察细胞形态，在加入HAT后3-5天后，融合的细胞会有克隆形成，此时用负压吸引器吸出1/3-1/2培养基，加入新的HAT培养基。根据细胞生长状态，在筛选前再换液1-3次，筛选前一天必须换液。一般在融合后8-15天，未融合的骨髓瘤细胞和其他细胞早已全部死亡，融合细胞克隆生长，可在细胞铺满孔低的1/2或2/3时进行筛选。采用ELISA法进行筛选。亚克隆前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞滋养板。取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬液，加入计数板计数，计算细胞密度。按每板100个细胞，取所需的体积，加入适量完全培养基中，充分混匀后加入96孔板。

三.筛选阳性克隆及亚克隆

阳性克隆的ELISA筛选方法：用包被缓冲液将阿莫西林-BSA稀释至1-5μg/ml，100μl/孔加入酶标板。2-8℃过夜。洗板3次。1-5％BSA封闭液，100-300μl/孔，室温1-3小时，洗板。取单克隆孔中的细胞培养上清，加入筛选板，100μl/孔，37℃孵育1小时。洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠Ig(H+L)，37℃孵育30-60分钟。洗板3次。每孔加晶美TMB底物100μl，室温避光显色5-15分钟。每孔加终止液50μl。酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。

四.杂交瘤细胞亚型检测

杂交瘤细胞亚型检测方法：用PBS将Goat anti mouse Ig(H+L)稀释至1-5μg/ml，100μl/孔加入酶标板。2-8℃过夜。洗板3次。1-5％BSA封闭液，100-300μl/孔，室温1-3小时，洗板。取筛选好的杂交瘤细胞培养上清，每孔100μl，加入一条酶标板中(竖条A-H，8孔)，37℃孵育60分钟。洗板3次。向A-H孔，每孔分别加入HRP标记的抗亚型抗体，顺序为IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，kappa和lambda，每孔100μl，37℃孵育30-60分钟。洗板3次。每孔加晶美公司TMB底物100μl，室温避光显色5-15分钟。每孔加终止液50μl。酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。

融合后得到5株可以分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，亚型检测结果表2。

表2：杂交瘤亚型检测结果

实施例3：单克隆抗体的生产和亲和纯化

一.单抗的生产

为保证抗体的纯度，采用无血清培养基(Hyclone产品，目录号SH30800)，培养杂交瘤细胞。按常规培养细胞(细胞密度为5-10×10⁵时传代培养，接种密度1-2×10⁵)，扩增至1L后，不再更换培养基，直至10天左右后，杂交瘤细胞全部死亡，离心收集上清，上清中即含有高度特异性的抗体。

二.Protein G亲和纯化

用于抗体纯化的Protein G层析柱(Bio-Rad，伯乐)用3-5倍柱床体积平衡缓冲液(10mM PBS，pH7.4)预平衡。将收集的上清用一次性0.22μm滤器过滤后经蠕动泵上样至Protein G层析柱中。收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，一直洗到基线。更换洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH2.3)，用含适量中和缓冲液的收集管收集洗脱峰。纯化抗体用过量0.01M PBS，pH7.4透析过夜。透析抗体超滤浓缩，浓度＞1mg/ml。浓缩后抗体经10,000rpm，2-8℃离心5-15分钟去除沉淀。抗体中可加入防腐剂分装冻存。

实施例4：单抗亲和力测定

将阿莫西林-BSA分别制成2μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml的PBS溶液，包板，2-8℃过夜。洗板后加入已知浓度，且进行倍比稀释的单抗纯品，37℃孵育1小时，洗板，加入羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30-60分钟，洗板，显色，用酶标仪读取各孔OD值。以单抗不同浓度的对数值为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制出包被抗原不同浓度的三条反应曲线，取曲线上趋于平坦段的OD值为OD-100，查出其OD-50点的单抗浓度[Ab]t，故可以得到[Ab]t，[Ab’]t和[Ab”]t三个值，按下面公式计算Ka值：

$\mathrm{Ka}=\frac{n-1}{2\left(n\right[{\mathrm{Ab}}^{\′}]t-[\mathrm{Ab}\left]t\right)}$

这样每个单抗可以测得三个Ka值，平均值既是亲和常数Ka。

5株单抗亲和力测定结果见表3。

表3：抗体亲和力测定结果

实施例5：单抗交叉反应测定

分别以阿莫西林、氨苄西林和头孢唑啉的BSA交联物包被酶标板，1-5μg/ml，100μl/孔，2-8℃过夜。洗板后加入已知浓度，且进行倍比稀释的单抗纯品，37℃孵育1小时，洗板，加入羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30-60分钟，洗板，显色，用酶标仪读取各孔OD值。

经交叉反应检测，本抗体与氨苄西林的交叉反应为100％，与头孢唑啉无交叉反应。

由于阿莫西林和氨苄西林均为小分子物质，只具有一个表位，5株杂交瘤所针对的位点是同一个，故选择并保藏了亲和力最好的细胞株03号。小鼠B淋巴瘤细胞杂交瘤，定名为JMAS102，已于2008年9月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.2674。保存地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

Claims (4)

1.一株抗阿莫西林和氨苄西林小鼠单克隆抗体的细胞株，保藏号为CGMCCNo.2674。

2.权利要求1所述的小鼠单克隆抗体细胞株CGMCC No.2674产生的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的细胞株CGMCC No.2674用于制备检测阿莫西林和氨苄西林的试剂的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体用于制备检测阿莫西林和氨苄西林的试剂的应用。