EA039760B1 - Антитела к фно-альфа и их функциональные фрагменты - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к молекулам антител и их функциональным фрагментам, способным связываться с фактором некроза опухоли альфа (ФНО), способам их получения и их терапевтическому применению.

Description

ФНОа представляет собой гомотримерный провоспалительный цитокин, который высвобождается клетками иммунной системы и взаимодействует с ними. Также была продемонстрирована положительная регуляция ФНОа при многих заболеваниях человека, включая хронические заболевания, такие как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и рассеянный склероз.

Антитела к ФНОа были предложены для профилактики и лечения эндотоксического шока (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). В источниках Bodmer et al. (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) и Wherry et al. (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) раскрывается терапевтический потенциал антител к ФНОа при лечении септического шока. Применение антител к ФНОа при лечении септического шока также обсуждается в источнике Kirschenbaum et al. (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). С применением моноклонального антитела к ФНОа может быть эффективно осуществлено лечение коллаген-индуцированного артрита (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

Применение антител к ФНОа при лечении ревматоидного артрита и болезни Крона описано в источниках Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) и Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Антитела к ФНОа, применяемые ранее при таком лечении, как правило, представляют собой химерные антитела, такие как описано в патенте США № 5919452.

Моноклональные антитела к ФНОа описаны в уровне техники. В источнике Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) описаны моноклональные антитела мыши к рекомбинантному ФНОа. В источнике Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) описано применение моноклональных антител мыши к рекомбинантному ФНОа при определении нейтрализующих эпитопов ФНОа. Кроме того, в международной патентной заявке WO 92/11383 раскрыты рекомбинантные антитела, включая CDR-привитые антитела, специфичные к ФНОа. В источнике Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) описано применение таких CDR-привитых антител при лечении ревматоидного артрита. В патенте США № 5919452 раскрыты химерные антитела к ФНОа и их применение при лечении патологий, связанных с присутствием ФНОа. Дополнительно антитела к ФНОа раскрыты в источнике Stephens et al. (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, US 8673310, US 2014/0193400, EP 2 390 267 B1, US 8293235, US 8697074, WO 2009/155723 A2 и WO 2006/131013 A2.

Молекулы рекомбинантных антител к ФНОа, известные из уровня техники, в целом имеют пониженную аффинность к ФНОа по сравнению с антителами, из которых получают гипервариабельные участки или CDR. Все доступные в настоящее время на рынке ингибиторы ФНОа вводят внутривенно или подкожно с недельными или более длительными интервалами в виде болюсных инъекций, в результате получаются высокие исходные концентрации, которые постепенно снижаются до следующей инъекции.

Одобренные к применению в настоящее время биотерапевтические средства, нацеленные на ФНОа, включают (i) инфликсимаб, химерное моноклональное антитело, содержащее фрагмент IgG человека (Remicade®; Wiekowski M et al: Infliximab (Remicade), Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEYVCH; Weinheim, 2007-01-01, p.885-904); (ii) этанерцепт, димерный гибридный белок TNFR2 и Fc IgG1 (Энбрел (Enbrel®)); (iii) адалимумаб, полностью человеческое моноклональное антитело (мАТ) (Humira®; Kupper H et al: Adalimumab (Humira), Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.697-732); (iv) цертолизумаб, пегилированный Fab-фрагмент (Cimzia®; Melmed G Y et al: Certolizumab pegol, Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, Vol. 7, No. 8, 200808-01, p.641-642); (v) голимумаб, моноклональное антитело IgG1K человека (Simponi®; Mazumdar S et al: Golimumab, mAbs, Landes Bioscience, US, Vol. 1, No. 5, 2009-09-01, p.422-431). При этом разрабатываются различные биоэквивалентные лекарственные средства, и миметик инфликсимаба, известный как Ремсима (Remsima), уже одобрен к применению в Европе.

Инфликсимаб обладает относительно низкой аффинностью к ФНОа (K_D>0,2 нМ; Weir et al., 2006, Therapy 3: 535) и ограниченной нейтрализующей способностью в анализе с L929. Помимо этого, инфликсимаб демонстрирует по существу отсутствие перекрестной реактивности с ФНОа яванских макак (Cynomolgus) или макак-резусов (Rhesus). Тем не менее, для антител к ФНОа перекрестная реактивность с ФНОа от обезьян весьма желательна, поскольку это позволяет проводить исследования на животныхприматах, что во многих аспектах отражает ситуацию у людей.

Этанерцепт, хотя и является бивалентной молекулой, связывается с ФНОа в отношении один тример на одну молекулу этанерцепта, исключая образование крупных комплексов антигенбиотерапевтическое средство (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis, 8: 601).

Он не подавляет индуцированную липополисахаридами (ЛПС) секрецию цитокинов моноцитами (Kirchner et al., 2004, Cytokine, 28: 67).

- 1 039760

Активность адалимумаба аналогична активности инфликсимаба. Другим недостатком адалимумаба является его невысокая стабильность, например, при определении в анализе тепловой денатурации. Было определено, что температура плавления (Тпл) адалимумаба в таком анализе составляет 67,5°C. Однако, чем ниже значение Т_пл антитела, тем ниже его общая стабильность. Более низкая Т_пл делает антитела менее подходящими для фармацевтического применения, например для перорального введения.

Активность цертолизумаба немного выше, чем активность инфликсимаба, но все еще не является удовлетворительной. Цертолизумаб не подавляет пролиферацию Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) (Vos et al., 2011, Gastroenterology, 140: 221).

В EP2623515 Al раскрыты гуманизированные антитела к ФНОа и их антигенсвязывающие фрагменты (Fab). Как становится ясно из приведенных в указанном источнике примеров, активность полученных гуманизированных Fab-фрагментов сравнима с активностью инфликсимаба в анализе нейтрализации с L929 (см. табл. 2 и 5). Единственное антитело IgG к ФНОа, исследованное в отношении перекрестной реактивности, лишь слабо связывается с ФНО-α макака-резуса (см. [0069]; фиг. 3). Перекрестная реактивность с ФНОа яванского макака не была исследована. Более того, наблюдается слабое связывание с ФНОв человека (см. фиг. 3). Таким образом, в EP2623515 А1 не раскрыты антитела к ФНОа или их функциональные фрагменты, которые обладают более высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929 по сравнению с инфликсимабом и которые обладают перекрестной реактивностью с ФНОа макака-резуса и ФНОа яванского макака.

В WO 2012/007880 A2 раскрыта модифицированная однодоменная антигенсвязывающая молекула (SDAB) в форме гибридного белка, содержащего один или более отдельных антигенсвязывающих доменов, которые связываются с одной или более мишенями (например, ФНОа), линкер и одну или более молекул полимера. Единственный приведенный конкретный пример назван SDAB-01 и содержит два антигенсвязывающих домена, которые связываются с ФНОа, соединенных гибким линкером, и Cконцевой цистеин, обеспечивающий сайт-специфическое пегилирование (см. фиг. 3). Авторам WO 2012/007880 A2 не удалось сравнить активность SDAB-01 с известными антителами к ФНОа такими как инфликсимаб, в анализе нейтрализации на основе клеток L929 или оценить другие специфичные для SDAB-01 характеристики, такие как эффективность блокирования взаимодействия ФНОа-TNFRI/II и селективность связывания ФНОа по сравнению с ФНОв. В исследовании, где сравнивают лечение с применением SDAB-01 и с применением инфликсимаба в трансгенной мышиной модели полиартрита, сопровождающегося сверхэкспрессией ФНОа человека (см. с. 54, пример 8), оба средства представляются одинаково эффективными для предотвращения последующего развития артрита (например, фиг. 17 и 18). Однако приведенная в этом примере доза вводит в заблуждение, поскольку молекулярная масса SDAB-01 составляет менее половины от молекулярной массы инфликсимаба. Таким образом, в WO 2012/007880 не раскрыты антитела к ФНОа, обладающие более высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, чем инфликсимаб.

В WO 2015/144852 А1 исследованы свойства scFv к ФНО-α, обозначенного scFv1. Этот scFv продемонстрировал нейтрализующую способность в отношении ФНОа в анализе клеток PK-15, сопоставимую с нейтрализующей способностью инфликсимаба (см. [0236]). Помимо этого, scFv, по-видимому, обладает некоторой перекрестной реактивностью с ФНО-а макака-резуса и яванского макака (см. пример 8). В WO 2015/144852 данные об аффинности не представлены. Однако одноцепочечный фрагмент антитела DLX105 (также известный как ESBA 105), который, как известно, обладает лишь умеренной аффинностью (KD=157 пМ; см. Urech et al. 2010 Ann Rheum Dis 69: 443), демонстрирует лучшее связывание с ФНО-α, чем scFv1 (см. фиг. 1 в WO 2015/144852 А1). Таким образом, в WO 2015/144852 А1 не раскрыты антитела к ФНО-α, обладающие высокой аффинностью к ФНОа человека (K_D<125 рМ).

В WO 2015/065987 А1 описаны антитела к ФНО-а, антитела к ИЛ-6 и биспецифические антитела, связывающиеся с обоими антигенами. Некоторые антитела к ФНОа демонстрируют некоторую перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака (фиг. 17). Однако указанные антитела к ФНОа проявляли значительно более низкую активность в анализе нейтрализации с L929, чем инфликсимаб ([0152]; фиг. 5). Таким образом, в WO 2015/065987 А1 не раскрыты антитела к ФНО-а, обладающие более высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, чем инфликсимаб.

В источнике Drugs in R&D, Vol. 4 No. 3, 2003, p. 174-178 описано гуманизированное антитело Humicade (CDP 571; BAY 103356), моноклональное антитело к ФНОа с высокой аффинностью. Однако способность Humicade подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, по-видимому, является ограниченной (см., например, US 2003/0199679 A1 в [0189]). Таким образом, в указанном источнике не раскрыты антитела к ФНО-а, обладающие более высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, чем инфликсимаб.

В источнике Saldanha J W et al: Molecular Engineering I: Humanization, Handbook of Therapeutic Antibodies, Chapter 6, 2007-01-01, WILEY-VCH, Weinheim, p. 119-144 раскрыты различные стратегии гуманизации моноклональных антител, включая пересадку CDR, изменение поверхности/рекомбинацию поверхностных остатков, перенос SDR и технологию деиммунизации.

- 2 039760

Существует потребность в улучшенных молекулах антител для лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как воспалительные расстройства кишечника. Молекулы антител должны иметь по меньшей мере (i) высокую аффинность к ФНОа человека (то есть K_D<125 пМ), (ii) высокую способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, (iii) высокую способностью подавлять индуцированную ЛПС секрецию цитокинов, (iv) существенную аффинность к ФНОа яванского макака и макака-резуса (например, K_D<1 нМ) и (v) высокую температуру плавления вариабельного домена при определении в эксперименте по тепловой денатурации (например, Т_пл>70°С).

Сущность изобретения

Авторы изобретения, предложенного в данной заявке, обнаружили, что некоторые антитела к ФНОа и их функциональные фрагменты проявляют комбинацию благоприятных свойств, включая высокую аффинность к ФНОа человека (K_D<125 пМ), более высокую по сравнению с инфликсимабом способность подавлять индуцированный ФНОа апоптоз в клетках L929, более высокую по сравнению с адалимумабом способность подавлять индуцированную ЛПС секрецию цитокинов, существенную аффинность (K_D<1 нМ) к ФНОа животных, таких как яванский макак (Macaca fascicularis) и/или макак-резус (Macaca mulatta). Помимо этого, указанные антитела и их функциональные фрагменты были специфичными для ФНОа, поскольку они в значительной степени не связывались с ФНОв и проявляют значительную стабильность при определении в анализе тепловой денатурации вариабельного домена.

В данном изобретении предложены молекулы антител и их функциональные фрагменты.

Таким образом, данное изобретение относится к объектам, определенным в следующих пунктах (1)(48):

(1) Антитело или его функциональный фрагмент, способное связываться с фактором некроза опухоли альфа (ФНОа) человека, причем указанное антитело или его функциональный фрагмент содержит (i) домен VL, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, и (ii) домен VH, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.

(2) Антитело или функциональный фрагмент по п. (1), причем указанное антитело или функциональный фрагмент содержит (i) домен VL, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, и (ii) домен VH, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

(3) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанное антитело или функциональный фрагмент содержит домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

(4) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанное антитело или функциональный фрагмент содержит домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 54, предпочтительно имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

(5) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанное антитело или его функциональный фрагмент специфически связывается с ФНОа человека.

(6) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанное антитело или его функциональный фрагмент в значительной степени не связывается с ФНОв.

(7) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанное антитело или функциональный фрагмент (i) связывается с ФНОа человека с константой диссоциации (K_D) менее 125 пМ;

(ii) обладает перекрестной реактивностью с ФНОа Macaca mulatta и ФНОа Macaca fascicularis;

(iii) обладает более высокой активностью, чем инфликсимаб, при определении с помощью анализа с L929 и/или (iv) способен связываться с ФНОатример человека в стехиометрическом отношении (антитело : ФНОатример), составляющем по меньшей мере 2.

(1) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, которое связывается с ФНОа человека с KD менее 100 пМ, предпочтительно менее 50 пМ.

- 3 039760 (2) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, которое связывается с ФНОа Macaca mulatta с K_D менее 1 нМ.

(3) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, которое связывается с ФНОа Macaca fascicularis с K_D менее 1 нМ.

(4) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где способность указанного антитела или функционального фрагмента подавлять индуцированный ФНОа апоптоз по отношению к способности инфликсимаба (относительная способность), определенной в анализе с L929, составляет более 5, и причем указанная относительная способность представляет собой отношение значения IC₅₀ в нг/мл инфликсимаба в анализе с L929 к значению IC₅₀ в нг/мл антитела в форме scFv в анализе с L929.

(5) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где температура плавления вариабельного домена антитела в виде scFv, определенная с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии, составляет по меньшей мере 65°C.

(6) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где температура плавления вариабельного домена антитела в виде scFv, определенная с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии, составляет по меньшей мере 68°C.

(7) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где температура плавления, определенная с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии, составляет по меньшей мере 70°C.

(8) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где потеря содержания мономера после пяти последовательных циклов замораживания-оттаивания составляет менее 0,2%.

(9) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где потеря содержания мономера после хранения при 4°C в течение четырех недель составляет менее 1%.

(10) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где способность антитела или функционального фрагмента блокировать взаимодействие ФНОа человека с рецептором ФНО I (TNFRI) по отношению к способности инфликсимаба (относительная способность) при определении с помощью ингибиторного ИФА составляет по меньшей мере 2, причем указанная относительная способность представляет собой отношение значения IC₅₀ в нг/мл инфликсимаба к значению IC₅₀ в нг/мл антитела в форме scFv.

(11) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где способность антитела или функционального фрагмента блокировать взаимодействие ФНОа человека с рецептором ФНО II (TNFRII) по отношению к способности инфликсимаба (относительная способность) при определении с помощью ингибиторного ИФА составляет по меньшей мере 2, причем указанная относительная способность представляет собой отношение значения IC₅₀ в нг/мл инфликсимаба к значению IC₅₀ в нг/мл антитела в форме scFv.

(12) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, способное подавлять клеточную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови в реакции смешанной культуры лимфоцитов.

(13) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, способное подавлять индуцированную ЛПС секрецию интерлейкина-1в CD14+моноцитами.

(14) Антитело или функциональный фрагмент по п. (20), где значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции интерлейкина-1в составляет менее 1 нМ.

(15) Антитело или функциональный фрагмент по п. (21), где значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции интерлейкина-1в, рассчитанное в виде молярной концентрации, меньше, чем значение IC₅₀ адалимумаба.

(16) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, способное подавлять индуцированную ЛПС секрецию ФНОа CD14+моноцитами.

(17) Антитело или функциональный фрагмент по п. (23), где значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции ФНОа составляет менее 1 нМ.

(18) Антитело или функциональный фрагмент по п. (24), где значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции ФНОа, рассчитанное в виде молярной концентрации, меньше, чем значение IC₅₀ адалимумаба.

(19) Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое представляет собой иммуноглобулин G (IgG).

(20) Функциональный фрагмент по любому из пп. (1)-(25), который представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

(21) Функциональный фрагмент по п. (27), причем указанный scFv содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 55, предпочтительно аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоит из указанной аминокислотной последовательности.

- 4 039760 (22) Функциональный фрагмент по любому из пп. (1)-(25), который представляет собой диатело.

(23) Функциональный фрагмент по п. (29), причем указанное диатело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51, или состоит из указанной аминокислотной последовательности.

(24) Антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с по существу тем же эпитопом ФНОа человека, что и антитело, содержащее домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, в частности, причем указанное антитело или функциональный фрагмент демонстрирует один или более признаков, упомянутых выше в пп. (1)-(30).

(25) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, где сумма (i) количества аминокислот в каркасных участках I-III вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента, которые отличаются от соответствующих консенсусных последовательностей Vk1 человека с SEQ ID NOs: 56-58 (см. табл. 15), и (ii) количества аминокислот в каркасном участке IV вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента, которые отличаются от наиболее схожей последовательности, основанной на последовательности λ зародышевой линии человека, выбранной из SEQ ID NOs: 59-62 (см. табл. 16), составляет менее 7, предпочтительно менее 4.

(26) Антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, причем указанные каркасные участки I-III вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента состоят из консенсусных последовательностей Vk1 человека с SEQ ID NOs: 56-58, соответственно, а каркасный участок IV состоит из последовательности, основанной на последовательности λ зародышевой линии человека, выбранной из SEQ ID NOs: 59- 62.

(27) Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов.

(28) Вектор или плазмида, содержащие нуклеиновую кислоту по п. (34).

(29) Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п. (35) или вектор или плазмиду по п. (34).

(30) Способ получения антитела или функционального фрагмента по любому из пп (1)-(33), включающий культивирование клетки по п. (36) в среде при условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело или функциональный фрагмент, и выделения антитела или функционального фрагмента из указанных клеток или среды.

(31) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или функциональный фрагмент по любому из пп. (1)-(33), и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.

(32) Антитело или функциональный фрагмент согласно определению в любом из пп. (1)-(33) для применения в способе лечения воспалительного расстройства или связанного с ФНОа расстройства.

(33) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (39), причем указанное воспалительное расстройство выбрано из перечня заболеваний и расстройств, перечисленных ниже в разделеРасстройства, подлежащие лечению.

(34) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (39), причем указанное воспалительное расстройство представляет собой воспалительное расстройство желудочнокишечного тракта.

(35) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (41), причем указанное воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой воспалительное заболевание кишечника.

(36) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (41) или (42), причем указанное воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой болезнь Крона.

(37) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п (43), причем указанная болезнь Крона выбрана из группы, состоящей из болезни Крона с поражением подвздошной кишки, толстого кишечника, подвздошной кишки и толстого кишечника и/или болезни Крона с изолированным поражением верхних отделов (желудка, двенадцатиперстной кишки и/или тощей кишки) и включающей нестриктурирующий/непенетрирующий, стриктурирующий, пенетрирующий и включающий перианальные поражения характер течения заболевания, с возможностью любой комбинации локализации и характера течения заболевания из указанных выше.

(39) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (41) или (42), причем указанное воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой язвенный колит.

(39) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (45), причем указанный язвенный колит выбран из группы, состоящей из язвенного проктита, проктосигмоидита, левостороннего колита, язвенного панколита и паучита.

(40) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с п. (41) или (42),

- 5 039760 причем указанное воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой микроскопический колит.

(41) Антитело или функциональный фрагмент для применения в соответствии с любым из пп. (39)(47), причем указанный способ включает пероральное введение антитела или функционального фрагмента субъекту.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1: схематическое представление процесса гуманизации.

Фиг. 2: хроматограммы эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC) очищенных препаратов гуманизированных scFv. Мономерный scFv элюируется с временами удерживания от 8,5 до 9,5 мин, в то время как компоненты буфера элюируются >10 мин. Все пики мертвого объема колонки до соответствующего мономерному scFv объединяли как агрегаты/олигомеры и использовали для расчета относительной площади пика.

Фиг. 3: кривые тепловой денатурации по данным дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF) двух конструкций scFv. Для каждой конструкции показаны данные двух измерений. Полученные значения Т_пл были определены путем подбора значений уравнения Больцмана для получения средней точки перехода.

Фиг. 4: зависимость содержания мономера двух конструкций scFv от времени при хранении. Представлен график содержания мономера, определенного методом эксклюзионной ВЭЖХ, для температур хранения 4, -20 и <-65°C в течение 4 недель.

Фиг. 5: наложение хроматограмм эксклюзионной ВЭЖХ для двух молекул scFv. Для каждого scFv представлен образец (10 мг/мл) в начальный момент времени и после хранения при 4°C в течение 4 недель. Помимо этого представлена хроматограмма образца после 5 циклов замораживания и оттаивания. На вставленной панели показано примерно 15-кратное увеличение оси y для каждой молекулы для визуализации в том числе минимальных изменений в содержании олигомеров.

Фиг. 6: зависимость содержания мономера гуманизированных scFv от времени при хранении. Представлен график содержания мономера, определенного методом эксклюзионной ВЭЖХ, для образцов с концентрацией 10 мг/мл при температуре хранения 37°C в течение 4 недель.

Фиг. 7: способность двух scFv нейтрализовать ФНОа человека в анализе с L929. Для каждого эксперимента представлены кривые зависимости доза-ответ для scFv и эталонного антитела, представляющего собой инфликсимаб. Максимальные концентрации scFv и инфликсимаба и отрицательные контроли принимали за 100% и 0% роста.

Фиг. 8: способность двух scFv нейтрализовать ФНОа приматов, не являющихся человеком, и ФНОа человека в анализе с L929. Представлены кривые зависимости доза-ответ для нейтрализации ФНОа человека, яванского макака и макака-резуса. Максимальную концентрацию scFv и отрицательные контроли принимали за 100% и 0% роста.

Фиг. 9: способность двух scFv блокировать взаимодействие ФНОа-TNFRI. Представлены кривые зависимости доза-ответ. Максимальную концентрацию scFv и отрицательные контроли принимали за 0% и 100% связывания ФНОа с TNFRI.

Фиг. 10: способность двух scFv блокировать взаимодействие ФНОа-TNFRII. Представлены кривые зависимости доза-ответ. Максимальную концентрацию scFv и отрицательные контроли принимали за 0% и 100% связывания ФНОа с TNFRII.

Фиг. 11: специфичность scFv к мишени. Способность подавлять взаимодействие биотинилированного ФНОа с scFv с применением ФНОа и ФНОв анализировали методом конкурентного ИФА. Представлены дозозависимые эффекты ФНОа и ФНОв.

На фиг. 12 изображено образование комплексов 16-22-H5-scFv:ФНОα, определенное методом эксклюзионной ВЭЖХ (пример 4).

На фиг. 13 изображено одновременное связывание двух молекул ФНОа с 16-22-H5-scDb, определенное методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (пример 5).

На фиг. 14A изображено образование комплексов 16-22-H5-IgG:ФНОα (пример 5).

На фиг. 14B изображено образование комплексов 16-22-H5-scDb:ФНОα (пример 5).

На фиг. 15 представлено подавление пролиферации клеток в реакции СКЛ после обработки антителами к ФНОа. *: p<0.05; **: p<0.01 по сравнению с контрольным IgG (пример 6).

На фиг. 16 представлена способность различных форм антител 16-22-H5 и адалимумаба дозозависимым образом подавлять индуцированную ЛПС секрецию ИЛ-1в (фиг. 16A) и ФНОа (фиг. 16B) моноцитами (пример 7).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к антителу или его функциональному фрагменту, способному связываться с ФНОа человека.

В контексте данной заявки термин антитело использован как синоним для термина иммуноглобулин (Ig), который определен как белок, принадлежащий к классу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD (или любому их подклассу), и включает все традиционно известные антитела и их функциональные фрагменты.

- 6 039760

В контексте данного изобретения функциональный фрагмент антитела/иммуноглобулина определен как антигенсвязывающий фрагмент или другое производное исходного антитела, которое по существу сохраняет одно или более свойств такого исходного антитела, упомянутых выше в пп. (1)-(30) данного описания. Антигенсвязывающий фрагмент антитела/иммуноглобулина определен как фрагмент (например, вариабельный участок IgG), который сохраняет антигенсвязывающий участок. Антигенсвязывающий участок антитела, как правило, находится в одном или более гипервариабельном участке (участках) антитела, то есть участках CDR-1, -2 и/или -3. Антигенсвязывающие фрагменты согласно данному изобретению включают домен F(ab')₂-фрагмента и Fab-фрагмент. Функциональные фрагменты согласно данному изобретению включают scFv, dsFv, диатела, триотела, тетратела и Fc-гибридные белки. F(ab')₂ или Fab может быть сконструирован таким образом, чтобы минимизировать или полностью удалить межмолекулярные дисульфидные взаимодействия, происходящие между доменами СН1 и CL. Антитела или функциональные фрагменты согласно данному изобретению могут представлять собой часть би- или многофункциональных конструкций.

Предпочтительными функциональными фрагментами в данном изобретении являются scFv и диатела.

scFv представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент, в котором вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) соединены пептидным мостиком.

Диатело представляет собой димер, состоящий из двух фрагментов, каждый из которых имеет вариабельные участки, соединенные линкером или тому подобным (далее называемые образующими диатело фрагментами), и, как правило, содержит два V_Ls и два V_Hs. Образующие диатело фрагменты включают фрагменты, состоящие из V_L и V_H, V_L и V_L, VH и VH и т.д., предпочтительно VH и VL. В образующих диатело фрагментах линкер, соединяющий вариабельные участки, не имеет конкретных ограничений, но предпочтительно является достаточно коротким, чтобы избежать образования нековалентных связей между вариабельными участками одного фрагмента. Длина такого линкера может быть определена специалистами в данной области техники в зависимости от ситуации, но, как правило, составляет 2-14 аминокислот, предпочтительно 3-9 аминокислот, в частности 4-6 аминокислот. В этом случае V_L и VH, кодируемые в одном и том же фрагменте, соединены достаточно коротким линкером, чтобы избежать образования нековалентных связей между V_L и V_H в одной цепи и чтобы избежать образования одноцепочечных фрагментов вариабельного участка для того, чтобы могли быть получены димеры с другим фрагментом. Димеры могут быть образованы с помощью ковалентных связей, нековалентных связей или и тех и других между образующими диатело фрагментами.

Более того, образующие диатело фрагменты могут быть соединены линкером или тому подобным с получением одноцепочечных диател (sc(Fv)₂). При соединении образующих диатело фрагментов длинным линкером, состоящим из примерно 15-20 аминокислот, могут быть образованы нековалентные связи между образующими диатело фрагментами, расположенными в одной цепи, с получением димеров. Основываясь на том же принципе, что и при получении диател, полимеризованные антитела, такие как тримеры или тетрамеры, также могут быть получены путем соединения трех или более образующих диатело фрагментов.

Предпочтительно антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению специфически связывается с ФНОа. В контексте данного описания антитело или его функциональный фрагмент специфически распознает или специфически связывается с ФНОа человека, когда антитело или функциональный фрагмент способно/способен различать ФНОа человека и одну или более молекул сравнения. Предпочтительно значение IC₅₀ для связывания с каждой молекулой сравнения по меньшей мере в 1000 раз превышает значение IC₅₀ для связывания с ФНОа, в частности как описано в примере 2, раздел 2.1.4. В наиболее общей форме (и когда не упоминается определенная ссылка), специфическое связывание относится к способности антитела или функционального фрагмента различать ФНОа человека и неродственные биомолекулы, при определении, например, в соответствии с конкретными методами анализа, известными в данной области техники. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, методы вестерн-блоттинга и ИФА. Например, может быть выполнен стандартный анализ ИФА. Как правило, определение специфичности связывания проводят с использованием не одной молекулы сравнения, а группы из примерно трех-пяти неродственных биомолекул, таких как сухое молоко, БСА, трансферрин или тому подобное. В одном из вариантов реализации специфическое связывание относится к способности антитела или фрагмента различать ФНОа человека и ФНОв человека.

Антитело согласно данному изобретению или функциональный фрагмент согласно данному изобретению содержит домен VL и домен VH. Домен VL содержит участок CDR1 (CDRL1), участок CDR2 (CDRL2), участок CDR3 (CDRL3) и каркасные участки. Домен VH содержит участок CDR1 (CDRH1), участок CDR2 (CDRH2), участок CDR3 (CDRH3) и каркасные участки.

Термин CDR относится к одному из шести гипервариабельных участков в вариабельных доменах антитела, преимущественно участвующих в связывании антигена. Одно из наиболее часто используемых определений для шести CDR было предложено Кабатом (Kabat E. A. et al., (1991) Последовательности of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). В контексте данного описания определение

- 7 039760

CDR согласно Кабату применимо только для CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3), а также для CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR H2, CDR H3 или H2, H3). CDR1 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR H1 или H1), однако, в контексте данного описания, определяется следующими остатками (нумерация Кабата): начинается с положения 26 и заканчивается до положения 36.

Участок CDR1 домена V_L состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно участок CDR1 домена VL состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. Наиболее предпочтительно участок CDR1 домена V_L состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7.

Участок CDR2 домена VL состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Предпочтительно участок CDR2 домена VL состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26. Наиболее предпочтительно участок CDR2 домена V_L состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8.

Участок CDR3 домена V_L состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3. Предпочтительно участок CDR3 домена V_L состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32. Наиболее предпочтительно участок CDR3 домена VL состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.

Участок CDR1 домена V_H состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4. Предпочтительно участок CDR1 домена VH состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36. Наиболее предпочтительно участок CDR1 домена V_H состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.

Участок CDR2 домена V_H состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5. Предпочтительно участок CDR2 домена V_H состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41. Наиболее предпочтительно участок CDR2 домена VH состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 11.

Участок CDR3 домена VH состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. Предпочтительно участок CDR3 домена VH состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48. Наиболее предпочтительно участок CDR3 домена V_H состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12.

В конкретном варианте реализации антитело согласно данному изобретению или функциональный фрагмент согласно данному изобретению содержит (i) домен VL, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, и (ii) домен V_H, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.

В конкретном варианте реализации антитело согласно данному изобретению или функциональный фрагмент согласно данному изобретению содержит (i) домен V_L, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, и (ii) домен VH, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

В более предпочтительном варианте реализации антитело согласно данному изобретению или функциональный фрагмент согласно данному изобретению содержит домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. В другом более предпочтительном варианте

- 8 039760 реализации антитело или функциональный фрагмент содержит домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 54. Наиболее предпочтительно антитело согласно данному изобретению или функциональный фрагмент согласно данному изобретению содержит (i) домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:

13, и (ii) домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В особенно предпочтительном варианте реализации функциональный фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), содержащее домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 54. Домен VH и домен V_L предпочтительно соединены пептидным линкером. Пептидный линкер (далее называемый линкер A), как правило, имеет длину от примерно 10 до примерно 30 аминокислот, более предпочтительно от примерно 15 до примерно 25 аминокислот. Линкер A, как правило, содержит остатки глицина (Gly) и серина (Ser), но возможны и другие аминокислоты. В предпочтительных вариантах реализации линкер содержит множественные повторы последовательности GGGGS (SEQ ID NO: 50), например, от 2 до 6, или от 3 до 5, или 4 последовательных повторов аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 50. Наиболее предпочтительно линкер A состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 49. scFv может иметь следующую структуру (N-конец слева и C-конец справа):

VL-линкер A-VH или

VH-линкер A-VL.

Более предпочтительно функциональный фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), состоящее из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 55. Наиболее предпочтительно функциональный фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), состоящее из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15.

В другом особенно предпочтительном варианте реализации функциональный фрагмент представляет собой диатело, содержащее домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, и домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 54. Домен V_H и домен V_L соединены пептидным линкером. Пептидный линкер (далее называемый линкер B) предпочтительно имеет длину от примерно 2 до примерно 10 аминокислот, более предпочтительно примерно 5 аминокислот. Линкер B, как правило, содержит остатки Gly и Ser, но возможны и другие аминокислоты. Наиболее предпочтительно линкер В состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 50.

Диатело предпочтительно представляет собой моноспецифическое диатело, то есть направлено только на один эпитоп. Диатело предпочтительно представляет собой гомодимер. Диатело может представлять собой димер из двух полипептидных цепей, нековалентно связанных друг с другом. Каждый мономер может представлять собой полипептидную цепь, имеющую структуру:

VL-Линкер B-VH или

VH-Линкер B-V_L.

Кроме того, образующие диатело фрагменты могут быть соединены линкером A или тому подобным с получением одноцепочечных диател (sc(Fv)2). При соединении образующих диатело фрагментов с использованием длинного линкера, содержащего примерно 15-20 аминокислот, могут образовываться нековалентные связи между образующими диатело фрагментами, находящимися в одной цепи, с получением димеров. Примеры структурной организации одноцепочечных диател включают следующие.

VH - линкер B - VL - линкер A - VH линкер B - VL

VL - линкер B - VH - линкер A - VL - линкер B - VH

Предпочтительно диатело согласно данному изобретению имеет следующую структуру:

VL - линкер B - VH - линкер A - VL - линкер B - VH

Наиболее предпочтительно диатело состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51.

Основываясь на том же принципе, что и при получении диател, полимеризованные антитела, такие как тримеры или тетрамеры, также могут быть получены путем соединения трех или более образующих диатело фрагментов.

В другом конкретном варианте реализации антитело согласно данному изобретению представляет собой иммуноглобулин, предпочтительно иммуноглобулин G (IgG). Подкласс IgG согласно данному изобретению не ограничен и включает IgG1, IgG2, IgG₃ и IgG4. Предпочтительно IgG согласно данному изобретению принадлежит к подклассу 1, то есть представляет собой молекулу IgG1. В одном из вариантов реализации каждая легкая цепь молекулы IgG согласно данному изобретению имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, и/или каждая тяжелая цепь молекулы IgG согласно данному изобретению имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53. Конкретный IgG согласно данному изобретению состоит из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, где каждая из двух легких цепей имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, и каждая из двух тяжелых цепей имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53.

- 9 039760

Аффинность

Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению имеет высокую аффинность к ФНОа человека. Термин KD относится к константе равновесия диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению связывается с ФНОа человека с константой равновесия диссоциации (KD) менее примерно 2х10^-10 М, предпочтительно менее 1,5х10^-10 М, предпочтительно менее 1,25 х10^-10 М, более предпочтительно менее 1х10^-10 М, наиболее предпочтительно менее 7,5х10^-11 М или даже менее 5х10^-11 М, при определении с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIACORE. В частности, определение KD проводят, как описано в примере 2, раздел 2.1.1.

Перекрестная реактивность с ФНОа яванских макак или макак-резусов

В конкретных вариантах реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению имеет существенную аффинность к ФНОа животных, таких как яванские макаки (Macaca fascicularis) и/или макаки-резусы (Macaca mulatta). Это является преимуществом, поскольку доклинические тесты антител к ФНОа человека, такие как исследования токсичности, предпочтительно проводят с такими животными. Соответственно, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению предпочтительно обладает перекрестной реактивностью с ФНОа животных, таких как яванские макаки и/или макаки-резусы. Определение аффинности проводят, как описано в примере 2, раздел 2.1.1.

В одном из вариантов реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает перекрестной реактивностью с ФНОа Macaca fascicularis. Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению предпочтительно обладает аффинностью к ФНОа Macaca fascicularis, которая менее чем в 20 раз, в частности менее чем в 10 раз, еще более конкретно менее чем в 5 раз отличается от аффинности к ФНОа человека. Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению связывается с ФНОа Macaca fascicularis с константой равновесия диссоциации (KD), где отношение R_M._fascicularis (i) KD для связывания с ФНОа Macaca fascicularis к (ii) KD для связывания с ФНОа человека составляет менее 20.

Kd (М fascicularis)

R-M.fascicularis ,ί ' 7 \

Rd

RM.fascicularis предпочтительно составляет менее 20, в частности менее 10, еще более конкретно менее 5.

В другом варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает перекрестной реактивностью с ФНОа Macaca mulatta. Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению предпочтительно обладает аффинностью к ФНОа Macaca mulatta, которая менее чем в 20 раз, более конкретно менее чем в 10 раз отличается от аффинности к ФНОа человека. Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению связывается с ФНОа Macaca mulatta с константой равновесия диссоциации (KD), где отношение R_M._mulatta (i) KD для связывания с ФНОа Macaca mulatta к (ii) KD для связывания с ФНОа человека составляет менее 20.

Kd (М.mulatta)

Rm.mulatta ^— Kotegs),

RM._mulatta предпочтительно составляет менее 20, в частности менее 10.

В еще одном варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает перекрестной реактивностью с ФНОа Macaca fascicularis и ФНОа Macaca mulatta. Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению предпочтительно обладает аффинностью к ФНОа Macaca fascicularis, которая менее чем в 20 раз, в частности менее чем в 10 раз, еще более конкретно менее чем в 5 раз отличается от аффинности к ФНОа человека, и предпочтительно обладает аффинностью к ФНОа Macaca mulatta, которая менее чем в 20 раз, более конкретно менее чем в 10 раз отличается от аффинности к ФНОа человека. Отношение R_M._fascicularis антитела или функционального фрагмента предпочтительно составляет менее 20, в частности менее 10, еще более конкретно менее 5, а отношение R_M._mulatta антитела или функционального фрагмента предпочтительно составляет менее 20, в частности менее 10.

Способность подавлять индуцированный ФНОа апоптоз клеток L929

Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз клеток L929. В конкретном варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает более высокой по сравнению с известным антителом, представляющим собой инфликсимаб, способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз клеток L929.

Способность относительно инфликсимаба может быть определена в анализе с L929, как описано в примере 2, раздел 2.1.2, данной заявки. Относительная способность антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению составляет более 1,5, предпочтительно более 2, более предпочтительно более 3, более предпочтительно более 5, более предпочтительно более 7,5 или даже более 10, где относительная активность представляет собой отношение (i) значения IC₅₀ инфликсимаба в ана- 10 039760 лизе с L929 к (ii) значению IC₅₀ антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению в анализе с L929 и где IC₅₀ означает концентрацию соответствующей молекулы в нг/мл, необходимую для достижения 50% максимального ингибирования индуцированного ФНОа апоптоза клеток L929.

В другом варианте реализации относительная способность антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению составляет более 1,5, предпочтительно более 2, более предпочтительно более 3, более предпочтительно более 5, более предпочтительно более 7,5 или даже более 10, где относительная способность представляет собой отношение (i) значения IC₉₀ инфликсимаба в анализе с L929 к (ii) значению IC₉₀ антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению в анализе с L929 и где значение IC₉₀ относится к концентрации соответствующей молекулы в нг/мл, необходимой для достижения 90% максимального ингибирования индуцированного ФНОа апоптоза клеток L929.

Подавление индуцированной ЛПС секреции цитокинов

Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен подавлять индуцированную ЛПС секрецию цитокинов моноцитами. Индуцированная ЛПС секреция цитокинов моноцитами может быть определена, как описано в примере 7.

В одном из вариантов реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен подавлять индуцированную ЛПС секрецию интерлейкина-1в CD14+ моноцитами. Значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции интерлейкина-1в предпочтительно составляет менее 1 нМ и/или менее 100 пг/мл. Значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции интерлейкина-1в, рассчитанное в виде молярной или массо-объемной концентрации, предпочтительно является более низким, чем значение IC50 адалимумаба.

В другом варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен подавлять индуцированную ЛПС секрецию ФНОа CD14+ моноцитами. Значение IC50 для подавления индуцированной ЛПС секреции ФНОа предпочтительно составляет менее 1 нМ и/или менее 150 пг/мл. Значение IC₅₀ для подавления индуцированной ЛПС секреции ФНОа, рассчитанное в виде молярной или массо-объемной концентрации, предпочтительно является более низким, чем значение IC₅₀ адалимумаба.

Подавление клеточной пролиферации

Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению, как правило, способно/способен подавлять клеточную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови в реакции смешанной культуры лимфоцитов. Подавление клеточной пролиферации может быть определено как описано в примере 6. Индекс стимуляции антитела или функционального фрагмента, например, scFv или диатела согласно данному изобретению, определенный в соответствии с примером 6, предпочтительно составляет менее 5, более предпочтительно менее 4,5. В конкретных вариантах реализации индекс стимуляции антитела, например, IgG согласно данному изобретению, составляет менее 4 или даже менее 3.

Подавление взаимодействия ФНОа с рецептором ФНО

Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен подавлять взаимодействие ФНОа человека с рецептором ФНО I (TNFRI). Подавление взаимодействия ФНОа человека с TNFRI может быть определено с помощью ингибиторного ИФА, как описано ниже в примере 2, раздел 2.1.3.

Способность антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению подавлять взаимодействие ФНОа человека с TNFRI относительно инфликсимаба (относительная способность) при определении с помощью ингибиторного ИФА предпочтительно составляет по меньшей мере 2, причем указанная относительная способность представляет собой отношение значения IC₅₀ в нг/мл инфликсимаба к значению IC₅₀ в нг/мл антитела или его функционального фрагмента.

Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен подавлять взаимодействие ФНОа человека с рецептором ФНО II (TNFRII). Подавление взаимодействия ФНОа человека с TNFRII может быть определено с помощью ингибиторного ИФА, как описано ниже в примере 2, раздел 2.1.3.

Способность антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению подавлять взаимодействие ФНОа человека с TNFRII относительно инфликсимаба (относительная способность) при определении с помощью ингибиторного ИФА предпочтительно составляет по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 3, причем указанная относительная способность представляет собой отношение значения IC50 в нг/мл инфликсимаба к значению IC50 в нг/мл антитела или его функционального фрагмента.

Стехиометрия и перекрестное связывание

Антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению, как правило, способно/способен связываться с ФНОа_Тример человека в стехиометрическом отношении (антитело : ФНОа_Тример), составляющем по меньшей мере 2. Стехиометрическое отношение (антитело : ФНОа_Тример) предпочтительно составляет более 2, или по меньшей мере 2,5 или по меньшей мере 3. В одном из вари- 11 039760 антов реализации стехиометрическое отношение (антитело : ФНОа_Тример) составляет примерно 3. Стехиометрическое отношение (антитело : ФНОа_Тример) может быть определено, как описано в примере 4 ниже.

В другом варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению способно/способен образовывать комплекс с ФНОа человека, причем указанный комплекс содержит по меньшей мере две молекулы ФНОа и по меньшей мере три молекулы антитела или функционального фрагмента. Функциональный фрагмент согласно этому варианту реализации содержит по меньшей мере два отдельных сайта связывания для ФНОа, таких как, например, диатела. Образование комплекса может быть определено, как описано в примере 5 ниже.

В одном из вариантов реализации антитело представляет собой IgG и способно образовывать с ФНОа комплекс молекулярной массой по меньшей мере 600 кДа. В другом варианте реализации функциональный фрагмент представляет собой диатело и способен образовывать с ФНОа комплекс молекулярной массой по меньшей мере 300 кДа.

Селективность в отношении мишени

В некоторых вариантах реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению обладает высокой селективностью в отношении мишени, то есть может различать ФНОа и ФНОв. Предпочтительно значение IC₅₀ для ФНОв по меньшей мере в 1000 раз превышает значение IC₅₀ для ФНОа при определении с помощью конкурентного ИФА, как описано в примере 2, раздел 2.1.4. Более предпочтительно значение IC₅₀ для ФНОв по меньшей мере в 5000 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10000 превышает значение IC₅₀ для ФНОа при определении с помощью конкурентного ИФА, как описано в примере 2, раздел 2.1.4.

Выход продукта экспрессии и выход продукта рефолдинга

В других вариантах реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению, предпочтительно scFv или диатело, могут быть рекомбинантно экспрессированы с высокими выходами в микроорганизмах, таких как бактерии, или в других клетках. Предпочтительно выход продукта экспрессии в Е. coli, определенный, как описано в примере 2, составляет по меньшей мере 0,25 г/л. В частности, это применимо к функциональным фрагментам, таким как scFv.

Выход продукта рефолдинга, определенный, как описано в примере 2, составляет по меньшей мере 5 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 15 мг/л и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20 мг/л. В частности, это применимо к функциональным фрагментам, таким как scFv.

Стабильность

Как правило, антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению, предпочтительно scFv или диатело, обладает высокой стабильностью. Стабильность может быть оценена с помощью различных методик. Температура плавления Т_пл вариабельного домена антитела или функционального фрагмента согласно данному изобретению, определенная с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), как описано в примере 2, раздел 2.2.4, предпочтительно составляет по меньшей мере 65°C, более предпочтительно по меньшей мере 68°C, наиболее предпочтительно по меньшей мере 70°C. Температура плавления вариабельного домена в контексте данного описания относится к температуре плавления scFv, состоящего из последовательности V_L - Линкер A - VH, где аминокислотная последовательность линкера A состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 49. Например, температура плавления вариабельного домена IgG определена как температура плавления соответствующего ему scFv, как определено выше.

Потеря содержания мономера (при концентрации 10 г/л; исходное содержание мономера >95%) после хранения в течение четырех недель при 4°C, определенная с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии, как описано в примере 2, раздел 2.2.5, предпочтительно составляет менее 5%, более предпочтительно менее 3%, более предпочтительно менее 1%, наиболее предпочтительно менее 0,5%. Потеря содержания мономера (при концентрации 10 г/л; исходное содержание мономера >95%) после хранения в течение четырех недель при -20°C, определенная с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии, как описано в примере 2, раздел 2.2.5, предпочтительно составляет менее 5%, более предпочтительно менее 3%, более предпочтительно менее 1%, наиболее предпочтительно менее 0,5%. Потеря содержания мономера (при концентрации 10 г/л; исходное содержание мономера >95%) после хранения в течение четырех недель при -65°C, определенная с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии, как описано в примере 2, раздел 2.2.5, предпочтительно составляет менее 5%, более предпочтительно менее 3%, более предпочтительно менее 1%, наиболее предпочтительно менее 0,5%.

Потеря мономера после пяти последовательных циклов замораживания-оттаивания, определенная, как описано в примере 2, составляет менее 5%, более предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,5%, наиболее предпочтительно менее 0,2%, например, 0,1% или 0,0%.

Антитела и функциональные фрагменты

Конкретные варианты реализации данного изобретения относятся к функциональным фрагментам антител, описанных в данном описании. Функциональные фрагменты включают, но не ограничиваются

- 12 039760 ими, F(ab')₂-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv, диатела, триотела и тетратела. Предпочтительно функциональный фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело (scFv) или диатело. Более предпочтительно не являющиеся CDR последовательности scFv или диатела представляют собой последовательности человека.

Предпочтительно для минимизации потенциала иммуногенности у людей выбранный акцепторный каркас состоит из каркасных участков, полученных из консенсусных последовательностей человека или последовательностей зародышевой линии человека. В частности, каркасные участки I-III вариабельного домена легкой цепи состоят из консенсусных последовательностей Vk1 человека, соответствующих SEQ ID NOs: 56-58, и каркасного участка IV последовательности, основанной на последовательности λ зародышевой линии, выбранной из SEQ ID NOs: 59-62. Поскольку остатки, которые не являются остатками консенсусной последовательности человека или последовательности зародышевой линии человека, могут вызывать иммунные реакции, количество таких остатков в каждом вариабельном домене (V_h или V_l) должно быть как можно более низким, предпочтительно менее 7, более предпочтительно менее 4, наиболее предпочтительно 0.

Предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело. Термин моноклональное антитело в контексте данного описания не ограничен антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, которое получают из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, которым его получают. Моноклональные антитела могут быть получены с применением широкого спектра методик, известных в данной области техники, включая применение гибридомной, рекомбинантной технологий и технологии фагового дисплея или их комбинации. (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

В других вариантах реализации, включая варианты реализации, относящиеся к применению антител к ФНОа in vivo у людей, могут быть применены химерные, приматизированные, гуманизированные антитела или антитела человека. В предпочтительном варианте реализации антитело представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело, более предпочтительно моноклональное антитело человека или моноклональное гуманизированное антитело.

Термин химерное антитело в контексте данного описания относится к антителу, содержащему вариабельные последовательности, полученные из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, такого как антитело крысы или мыши, и константные участки иммуноглобулинов человека, как правило, выбранные из матрицы иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; патенты США № 5807715; 4816567 и 4816397, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки.

Среднему специалисту в данной области техники доступны различные рекомбинантные методики, для того чтобы сделать антитело, не являющееся антителом человека (например, антитело мыши), более подобным антителу человека путем получения иммуноглобулинов, цепей иммуноглобулинов или их фрагментов (таких как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие связывающиеся с мишенью подпоследовательности антител), которые содержат минимальные последовательности, полученные из такого иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. В целом, полученное рекомбинантное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют участкам CDR иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, а все или по существу все участки FR представляют собой участки FR последовательности иммуноглобулина человека, в частности консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. CDR-привитые антитела представляют собой молекулы антител, имеющие один или более определяющих комплементарность участков (CDR) антитела, первоначально полученного от видов, не являющихся человеком, которые связываются с желаемым антигеном, и каркасные (FR) участки молекулы иммуноглобулина человека (EP239400; публикация PCT WO 91/09967; патенты США № 5225539; 5530101 и 5585089). Часто в процессе, называемом гуманизацией, каркасные остатки в каркасных участках, полученных из иммуноглобулина человека, будут дополнительно замещены соответствующим остатком антитела - донора CDR для изменения, предпочтительно улучшения связывания антигена. Эти каркасные замены идентифицируют способами, хорошо известными в данной области техники, например путем моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания с антигеном, и сравнения последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. См., например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7 и Queen et al., патенты США № 5530101; 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370 (каждый из указанных источников полностью включен посредством ссылки). Антитела могут быть сделаны более подобным антителу человека с применением множества дополнительных методик, известных в данной области техники, включая, например, рекомбинацию поверхностных остатков или изменение поверхности (EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973, и перестановку цепей (патент США

- 13 039760 № 5565332)), все указанные источники полностью включены в данное описание посредством ссылки.

CDR-привитое или гуманизированные антитело также может содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, константного участка выбранной матрицы иммуноглобулина человека.

В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела получают, как описано в источнике Queen et al., патентах США № 5530101; 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370 (каждый из указанных источников полностью включен посредством ссылки).

В некоторых вариантах реализации антитела к ФНОа представляют собой антитела человека. Полностью человеческие антитела к ФНОа могут быть желательны для терапевтического лечения пациентов, являющихся людьми. В контексте данного описания антитела человека включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или от животных, трансгенных по одному или более иммуноглобулинам человека и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины. Антитела человека могут быть получены различными способами, известными в данной области техники, включая методы фагового дисплея, описанные выше, с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. патенты США № 4444887 и 4716111 и публикации PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741, каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки. Антитела человека также могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но могут экспрессировать гены иммуноглобулинов человека. См., например, публикации PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; патенты США №№ 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 и 5939598, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки. Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, получены с использованием методики, называемой управляемым отбором. В этом подходе выбранное моноклональное антитело, не являющееся антителом человека, например антитело мыши, используют для управления отбором полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

В некоторых вариантах реализации антитела к ФНОа представляют собой приматизированные антитела. Термин приматизированное антитело относится к антителу, содержащему вариабельные участки антитела обезьяны и константные участки антитела человека. Способы получения приматизированных антител известны в данной области техники. См., например, патенты США № 5658570; 5681722 и 5693780, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации антитела к ФНОа представляют собой дериватизированные антитела. Например, но не в качестве ограничения, дериватизированные антитела, которые были модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком (см. ниже описание конъюгатов антител) и т.д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или более неканонических аминокислот.

В других аспектах антитело к ФНОа содержит одну или более аминокислот, введенных в один или более из его гипервариабельных участков, например, как описано в US 2007/0280931.

Конъюгаты антител

В некоторых вариантах реализации антитела к ФНОа представляют собой конъюгаты антител, которые модифицированы, например, путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу таким образом, что ковалентное присоединение не препятствует связыванию с ФНОа. Методики конъюгирования эффекторных фрагментов с антителами хорошо известны в данной области техники (см., например, Hellstrom et al., Controlled Drag Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58, и Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

В одном из примеров антитело или его фрагмент подвергают слиянию посредством ковалентной связи (например, а пептидной связи), с N-конца или C-конца, с аминокислотной последовательностью другого белка (или его части; предпочтительно содержащей по меньшей мере 10, 20 или 50 аминокислот части белка). Предпочтительно антитело или его фрагмент связан с другим белком с N-конца константного домена антитела. Для осуществления такого слияния могут быть применены технологии рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и EP0392745. В другом примере эффекторная молекула может увеличивать период полужизни in vivo. Примеры подходящих эффекторных молекул такого типа включают полимеры, альбумин, альбуминсвязывающие белки или связывающие альбумин соединения, такие как описанные в WO 2005/117984.

В некоторых вариантах реализации антитела к ФНОа могут быть присоединены к фрагментам по- 14 039760 ли(этиленгликоля) (ПЭГ). Например, если антитело представляет собой фрагмент антитела, фрагменты ПЭГ могут быть присоединены через любую доступную боковую цепь аминокислоты или функциональную группу концевой аминокислоты, расположенной во фрагменте антитела, например любую свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут находиться во фрагменте антитела естественным образом или могут быть встроены во фрагмент методами генной инженерии с использованием методов рекомбинантной ДНК.

См., например, патент США № 5219996. Для присоединения двух или более молекул ПЭГ могут быть использованы несколько сайтов. Предпочтительно фрагменты ПЭГ ковалентно связаны через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, расположенного во фрагменте антитела. В случае если в качестве места присоединения используют тиольную группу, могут быть использованы подходящим образом активированные эффекторные фрагменты, например, селективные в отношении тиолов производные, такие как малеимиды и производные цистеина.

В другом примере конъюгат антитела к ФНОа представляет собой модифицированный Fab'фрагмент, который является пегилированным, то есть содержит ковалентно присоединенный к нему ПЭГ (поли(этиленгликоль)), например, в соответствии со способом, раскрытым в EP0948544. См. также Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); и Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998), а также Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531- 545.

Фармацевтические композиции и лечение

Лечение заболевания охватывает лечение пациентов, уже имеющих согласно диагнозу любую форму заболевания на любой клинической стадии или в любых проявлениях; задержку начала или развития или усугубления или ухудшения симптомов или признаков заболевания и/или предотвращение и/или снижение тяжести заболевания.

Субъект или пациент, которому вводят антитело к ФНОа или его функциональный фрагмент, может представлять собой млекопитающее, такое как млекопитающее, не являющееся приматом (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т.д.), или примата (например, обезьяну или человека). В некоторых аспектах человек представляет собой пациента детского возраста. В некоторых аспектах человек представляет собой взрослого пациента.

Композиции, содержащие антитело к ФНОа и, необязательно, один или более дополнительных терапевтических агентов, таких как вторые терапевтические агенты, описанные ниже, описаны в данном описании. Указанные композиции, как правило, поставляются в качестве части стерильной фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция может находиться в любой подходящей форме (в зависимости от желаемого способа ее введения пациенту).

Антитела к ФНОа и функциональные фрагменты могут быть введены пациенту различными путями, как то перорально, трансдермально, подкожно, интраназально, внутривенно, внутримышечно, интратекально, местно или локально. Наиболее подходящий путь введения в любом конкретном случае будет зависеть от конкретного антитела, субъекта, характера и тяжести заболевания и физического состояния субъекта. Как правило, антитело к ФНОа или его функциональный фрагмент вводят внутривенно.

В особенно предпочтительном варианте реализации антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению вводят перорально. Если введение осуществляют пероральным путем, функциональный фрагмент предпочтительно представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), диатело или IgG.

В типичных вариантах реализации антитело к ФНОа или функциональный фрагмент присутствует в фармацевтической композиции в концентрации, достаточной для обеспечения внутривенного введения в количестве от 0,5 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах реализации концентрация антитела или фрагмента, подходящая для применения в композициях и способах, описанных в данном описании, включает, но не ограничивается ими, 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг или концентрацию в диапазоне между любыми из вышеуказанных значений, например, от 1 до 10 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг или от 10 до 18 мг/кг.

Эффективная доза антитела к ФНОа или функционального фрагмента может составлять от примерно 0,001 до примерно 750 мг/кг на одно (например, болюсное) введение, множество введений или непрерывное введение или количество, необходимое для достижения концентрации в сыворотке, составляющей 0,01-5000 мкг/мл за одно (например, болюсное) введение, множество введений или непрерывное введение, или любой эффективный диапазон или значение внутри него в зависимости от состояния, подлежащего лечению, пути введения и возраста, массы и состояния субъекта. В некоторых вариантах реализации каждая доза может находиться в диапазоне от примерно 0,5 мг до примерно 50 мг на килограмм массы тела или от примерно 3 мг до примерно 30 мг на килограмм массы тела. Антитело может быть приготовлено в виде водного раствора.

- 15 039760

Фармацевтические композиции в целях удобства могут быть представлены в единичных дозированных формах, содержащих заранее определенное количество антитела к ФНОа или функционального фрагмента на дозу. Такая единица может содержать, например, от 0,5 мг до 5 г, например, но без ограничения, 1 мг, 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 750 мг, 1000 мг или любой диапазон между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от 10 до 1000 мг, от 20 до 50 мг или от 30 до 300 мг. Фармацевтически приемлемые носители могут принимать самые различные формы в зависимости, например, от состояния, подлежащего лечению, или пути введения.

Определение эффективной дозы, общего количества доз и длительности лечения с применением антитела к ФНОа или его функционального фрагмента находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники и может быть выполнено с помощью стандартного исследования с повышением дозы.

Терапевтические составы антител к ФНОа и функциональных фрагментов подходящие для способов, описанных в данном описании, могут быть приготовлены для хранения в виде лиофилизированных составов или водных растворов путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами, обычно используемыми в данной области техники (все из которых упоминаются в данном описании как носители), то есть буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотонизирующими веществами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими различными добавками. См. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях.

Буферные агенты обеспечивают поддержание pH в диапазоне, приближенном к физиологическим условиям. Они могут присутствовать в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 50 мМ. Подходящие буферные агенты включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь однозамещенного цитрата натрия и двузамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты и трехзамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты и однозамещенного цитрата натрия и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и однозамещенного сукцината натрия, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и двузамещенного сукцината натрия т.д.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты и тартрата натрия, смесь винной кислоты и тартрата калия, смесь винной кислоты и гидроксида натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровой кислоты и однозамещенного фумарата натрия, смесь фумаровой кислоты и двузамещенного фумарата натрия, смесь однозамещенного фумарата натрия и двузамещенного фумарата натрия и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислоты и глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты и гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты и глюконата калия и т.д.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевой кислоты и оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты и гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты и оксалата калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты и лактата натрия, смесь молочной кислоты и гидроксида натрия, смесь молочной кислоты и лактата калия и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты и ацетата натрия, смесь уксусной кислоты и гидроксида натрия и т.д.). Дополнительно могут быть использованы фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Трис.

Консерванты могут быть добавлены для замедления роста микроорганизмов и могут быть добавлены в количествах от 0,2 до 1% (мас./об.). Подходящие консерванты включают фенол, бензиловый спирт, метакрезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензиламмония хлорид, галогениды бензалкония (например, хлорид, бромид и иодид), гексаметония хлорид и алкилпарабены, такие как метилили пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол. Изотонизирующие вещества, иногда называемые стабилизаторами, могут быть добавлены для обеспечения изотоничности жидких композиций и включают многоатомные сахарные спирты, предпочтительно трех- или более атомные или сахарные спирты, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и маннитол. Стабилизаторы относятся к широкой категории вспомогательных веществ, которые могут выполнять различные функции от наполнителя до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или обеспечивает предотвращение денатурации или прилипания к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахарные спирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоинозитол, галактитол, глицерин и тому подобное, включая циклические многоатомные спирты, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; полимеры аминокислот; серосодержащие восстановители, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, а-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (например, пептиды, состоящие из 10 остатков или менее); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, лактоза, мальтоза, сахароза, трисахариды, такие как раффиноза; и полисаха- 16 039760 риды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в диапазоне от 0,1 до 10000 массовых частей на массовую часть активного белка.

Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как смачивающие агенты) могут быть добавлены для облегчения солюбилизации терапевтического агента, а также для защиты терапевтического белка от вызванной взбалтыванием агрегации, что также позволяет составу подвергаться напряжению сдвига поверхности без денатурации белка. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), плюрониловые полиолы, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (TWEEN®-20, TWEEN®-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в диапазоне от примерно 0,05 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл или в диапазоне от примерно 0,07 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл.

Дополнительные различные вспомогательные вещества включают агенты-наполнители (например, крахмал), хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин E), ингибиторы протеаз и сорастворители.

Состав согласно данному описанию также может содержать второй терапевтический агент в дополнение к антителу к ФНОа или его функциональному фрагменту. Примеры подходящих вторых терапевтических агентов приведены ниже.

График введения может варьировать от одного раза в месяц до ежедневного введения в зависимости от ряда клинических факторов, включая тип заболевания, тяжесть заболевания и чувствительность пациента к антителу к ФНОа или функциональному фрагменту. В конкретных вариантах реализации, антитело к ФНОа или его функциональный фрагмент вводят ежедневно, два раза в неделю, три раза в неделю, через день, каждые 5 дней, каждые 10 дней, каждые две недели, каждые три недели, каждые четыре недели или один раз месяц или в любом диапазоне между любыми двумя из вышеперечисленных значений, например от одного раза в четыре дня до одного раза в месяц, от одного раза в 10 дней до одного раза в две недели или от двух до трех раз в неделю и т.д.

Доза антитела к ФНОа или функционального фрагмента, подлежащая введению, будет варьировать в зависимости от конкретного антитела, субъекта и характера и тяжести заболевания, физического состояния субъекта, схемы лечения (например, будет ли применен второй терапевтический агент) и выбранного пути введения; подходящая доза может быть легко определена специалистом в данной области техники.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что оптимальное количество и промежуток времени между отдельными введениями антитела к ФНОа или его функционального фрагмента будут определяться характером и степенью состояния, подлежащего лечению, формой, путем и местом введения, а также возрастом и состоянием конкретного субъекта, подлежащего лечению, и что в конечном итоге подходящие для применения дозы будут определены врачом. Введение может повторяться так часто, как это необходимо. При развитии побочных явлений количество и/или частота введений могут быть изменены или уменьшены в соответствии с обычной клинической практикой.

Заболевания, подлежащие лечению

Данное изобретение относится к способу лечения или предотвращения связанного с ФНОа человека заболевания у субъекта, включающему введение субъекту антитела или функционального фрагмента, как определено в данном описании. Термин связанное с ФНОа расстройство или связанное с ФНОа заболевание относится к любому расстройству, началу, прогрессированию или сохранению симптомов или патологическим состояниям, для которых требуется участие ФНОа. Иллюстративные связанные с ФНОа расстройства включают, но не ограничиваются ими, хронические и/или аутоиммунные воспалительные состояния в целом, иммуноопосредованные воспалительные расстройства в целом, воспалительное заболевание ЦНС, воспалительные заболевания, поражающие глаз, сустав, кожу, слизистые оболочки, центральную нервную систему, желудочно-кишечный тракт, мочевыводящие пути или легкое, состояния увеита в целом, ретинит, HLA-B27+увеит, болезнь Бехчета (Behcet), синдром сухого глаза, глаукому, синдром Шегрена (Sjogren), сахарный диабет (включая диабетическую нейропатию), резистентность к инсулину, состояния артрита в целом, ревматоидный артрит, остеоартрит, реактивный артрит и синдром Рейтера (Reiter), ювенильный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре (Guillain-Barre), миастению гравис, боковой амиотрофический склероз, саркоидоз, гломерулонефрит, хроническую болезнь почек, цистит, псориаз (включая псориатический артрит), гнойный гидраденит, панникулит, гангренозную пиодермию, синдром SAPHO (синовит, акне, пустулез, гиперостоз и остит), акне, синдром Свита (Sweet), пузырчатку, болезнь Крона (включая внекишечные проявления), язвенный колит, бронхиальную астму, гиперчувствительный пневмонит, общие аллергические реакции, аллергический ринит, аллергический синусит, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), фиброз легкого, гранулематоз Вегенера (Wegener), синдром Кавасаки (Kawasaki), гигантоклеточный артериит, васкулит Черджа-Стросса (Churg-Strauss), узелковый полиартериит, ожоги, болезнь трансплантат против хозяина, реакции трансплантат против хозяина, эпизоды отторжения после трансплантации органов или костного мозга, системные и локальные состояния васкулита в целом, системную и кожную красную волчанку, полимиозит и дерматомиозит, склеродермию, преэклампсию,

- 17 039760 острый и хронический панкреатит, вирусный гепатит, алкогольный гепатит, послеоперационное воспаление, такое как после офтальмологической операции (например, операции при катаракте (замена хрусталика) или глаукоме), операции на суставе (включая артроскопическую операцию), операции на связанных с суставом структурах (например, связках), челюстно-лицевой и/или стоматологической операции, минимально инвазивных сердечно-сосудистых вмешательств (например, ЧТКА, атерэктомии, установки стента), лапароскопических и/или эндоскопических интраабдоминальных и гинекологических вмешательств, эндоскопических урологических вмешательств (например, операции на предстательной железе, уретроскопии, цистоскопии, интерстициального цистита), или периоперационное воспаление (предотвращение) в целом, буллезный дерматит, нейтрофильный дерматит, токсический эпидермальный некролиз, пустулезный дерматит, церебральную малярию, гемолитический уремический синдром, отторжение аллотрансплантата, отит среднего уха, укус змеи, узловатую эритему, миелодиспластические синдромы, первичный склерозирующий холангит, серонегативную спондилоартропатию, аутоиммунную гемолитическую анемию, гранулематоз в ротолицевой области, вегетирующий гнойный стоматит, афтозный стоматит, десквамативный глоссит (geographic tongue), мигрирующий стоматит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, паралич Белла, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (Creutzfeld-Jakob) и нейродегенеративные состояния в целом.

Связанный с раком остеолиз, связанное с раком воспаление, связанная с раком боль, связанная с раком кахексия, метастазы в костях, острые и хронические формы боли, независимо от того, вызваны ли они центральными или периферическими эффектами ФНОа и классифицированы ли они как воспалительные, ноцицептивные или нейропатические формы боли, ишиаз, боль в пояснице, туннельный запястный синдром, комплексный регионарный болевой синдром (КРБС), подагра, постгерпетическая невралгия, фибромиалгия, местные болевые состояния, хронические болевые синдромы вследствие метастатической опухоли, дисменорея.

Конкретные расстройства, подлежащие лечению, включают состояния артрита в целом, ревматоидный артрит, остеоартрит, реактивный артрит, ювенильный артрит; псориаз, включая псориатический артрит; воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона, язвенный колит, включая проктит, сигмоидит, левосторонний колит, распространенный колит и панколит, неопределенный колит, микроскопический колит, включая коллагенозный и лимфоцитарный колит, колит при заболевании соединительной ткани, колит отключенной толстой кишки, колит при дивертикулярной болезни, эозинофильный колит и паучит.

Наиболее предпочтительно антитело или функциональный фрагмент согласно данному изобретению применяют для лечения воспалительного заболевания кишечника, в частности болезни Крона, язвенного колита или микроскопического колита. Болезнь Крона может представлять собой болезнь Крона с поражением подвздошной кишки, толстого кишечника, подвздошной кишки и толстого кишечника или болезнь Крона с изолированным поражением верхних отделов (желудка, двенадцатиперстной кишки и/или тощей кишки), включая нестриктурирующий/непенетрирующий, стриктурирующий, пенетрирующий и включающий перианальные поражения характер течения заболевания, с возможностью любой комбинации локализации и характера течения заболевания из указанных выше. Язвенный колит может представлять собой язвенный проктит, проктосигмоидит, левосторонний колит, язвенный панколит и паучит.

Комбинированная терапия и другие аспекты

Предпочтительно пациент, получающий лечение с применением антитела к ФНОа или его функционального фрагмента, также получает другое обычно применяемое лекарственное средство. Например, пациент, страдающий воспалительным заболеванием кишечника, особенно имеющий заболевание от умеренного до тяжелого, как правило, также получает месалазин или его производные или пролекарства, кортикостероиды, например будесонид или преднизолон (перорально или внутривенно (в/в)), иммунодепрессанты, например азатиоприн/6-меркаптопурин (6-MP) или метотрексат, циклоспорин или такролимус. Другие лекарственные средства, которые могут быть совместно введены пациенту, включают биологические препараты, такие как инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт, цертолизумаба пэгол или другие. Дополнительные лекарственные средства, которые могут быть совместно введены пациенту, включают иммунодепрессанты (например, азатиоприн/6-MP или метотрексат или пероральный циклоспорин) для поддержания стабильной или более длительной ремиссии. Еще одним аспектом данного изобретения является применение антитела к ФНОа или функционального фрагмента, как определено выше в данном описании, для снижения воспаления.

Еще одним аспектом данного изобретения является антитело к ФНОа или функциональный фрагмент, как определено выше в данном описании, для применения для снижения воспаления у пациента, страдающего от воспалительного состояния.

Другим аспектом данного изобретения является способ лечения воспалительного состояния, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела к ФНОа или функционального фрагмента, как определено выше в данном описании. Указанное воспалительное состояние предпочтительно представляет собой одно из состояний, описанных выше.

- 18 039760

Другим аспектом данного изобретения является способ предотвращения воспалительного состояния, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела к ФНОа или функционального фрагмента, как определено выше в данном описании. Воспалительное состояние предпочтительно представляет собой одно из состояний, описанных выше.

Таблица 1. Сводные данные об аминокислотных последовательностях

SEQ ID NO:	Описание
1	Генетически детерминированный CDR L1
2	Генетически детерминированный CDR L2
3	Генетически детерминированный CDR L3
4	Генетически детерминированный CDRH1
5	Генетически детерминированный CDRH2
6	Генетически детерминированный CDR НЗ
7	CDRL1 клона 16-22-Н05
8	CDR L2 клона 16-22-Н05 и клона 16-16-НЮ
9	CDR L3 клона 16-22-Н05 и клона 16-16-НЮ
10	CDRH1 клона 16-22-Н05, клона 16-16-В08 и клона 16-16-НЮ
11	CDR Н2 клона 16-22-Н05
12	CDRH3 клона 16-22-Н05
13	Vh гуманизированного scFv клона 16-22-H05-sc02 и клона 16-22-H05-sc04
14	Vl гуманизированного scFv клона 16-22-H05-sc02
15	Гуманизированный scFv клона 16-22-H05-sc02
16	CDR L1 клона 16-12-B11
17	CDR LI клона 16-13-C08
18	CDR LI клона 16-13-E05
19	CDR LI клона 16-16-B08
20	CDR LI клона 16-16-H10
21	CDR LI клона 17-13-G07
22	CDR LI клона 17-20-E06
23	CDR L2 клона 16-12-B11, клона 16-16-B08 и клона 17-13-G07
24	CDR L2 клона 16-13-C08
25	CDR L2 клона 16-13-E05
26	CDR L2 клона 17-20-E06
27	CDR L3 клона 16-12-B11
28	CDR L3 клона 16-13-C08
29	CDR L3 клона 16-13-E05
30	CDR L3 клона 16-16-B08
31	CDR L3 клона 17-13-G07
32	CDR L3 клона 17-20-E06
33	CDR Hl клона 16-12-B11 и клона 16-13-E05
34	CDR Hl клона 16-13-C08
35	CDR Hl клона 17-13-G07
36	CDR Hl клона 17-20-E06
37	CDRH2 клона 16-12-B11 и клона 17-13-G07
38	CDRH2 клона 16-13-С08
39	CDRH2 клона 16-13-Е05
40	CDRH2 клона 16-16-В08 и клона 17-20-Е06

- 19 039760

41	CDRH2 клона 16-16-НЮ
42	CDRH3 клона 16-12-В11
43	CDRH3 клона 16-13-С08
44	CDRH3 клона 16-13-Е05
45	CDRH3 клона 16-16-В08
46	CDRH3 клона 16-16-НЮ
47	CDRH3 клона 17-13-G07
48	CDRH3 клона 17-20-Е06
49	Линкерная последовательность в scFv
50	Линкерная последовательность в диателе
51	Гуманизированное диатело клона 16-22-Н05
52	Легкая цепь гуманизированного IgG клона 16-22-Н05
53	Тяжелая цепь гуманизированного IgG клона 16-22-Н05
54	Vl гуманизированного scFv клона 16-22-H05-sc04
55	Гуманизированный scFv клона 16-22-H05-sc04
56	Консенсусная последовательность VkI каркасного участка I (положения 123 по Кабату)
57	Консенсусная последовательность VkI каркасного участка II (положения 35-49 по Кабату)
58	Консенсусная последовательность VkI каркасного участка III (положения 57-88 по Кабату)
59	последовательность основанная на последовательности V7 зародышевой линии каркасного участка IV (см. таблицу 16)
60	последовательность основанная на последовательности V7 зародышевой линии каркасного участка IV (см. таблицу 16)
61	последовательность основанная на последовательности VX зародышевой линии каркасного участка IV (см. таблицу 16)
62	последовательность основанная на последовательности V7 зародышевой линии каркасного участка IV (см. таблицу 16)

Примеры

Пример 1. Получение антител кролика, направленных на ФНОа человека.

1. Результаты

1.1. Иммунизация

Кроликов подвергали иммунизации очищенным рекомбинантным ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01A). В ходе иммунизации силу гуморального иммунного ответа на антиген качественно оценивали путем определения максимального разведения (титра) сыворотки каждого кролика, которое обеспечивало обнаруживаемое связывание поликлональных антител сыворотки с антигеном. Титры антител сыворотки к иммобилизованному рекомбинантному ФНОа человека оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА, см. 2.2.1). Для всех трех кроликов были показаны очень высокие титры, 10х 106-кратное разведение сыворотки продолжало обеспечивать положительный сигнал (по меньшей мере в 3 раза более высокий, чем сигнал, полученный для сыворотки не получавшего антиген животного, которую использовали в качестве контроля фона) в ИФА. Помимо этого, способность различных сывороток кроликов подавлять биологическую активность ФНОа оценивали с помощью анализа на основе клеток L929 мыши (см. 2.2.3). Все три сыворотки подавляли индуцированный ФНОа апоптоз фибробластов мыши L929. Для кролика №3 была показана наиболее высокая нейтрализующая активность с 50% подавлением (IC₅₀), достигаемым при разведении сыворотки 1:155000. По сравнению с кроликом №3 для кролика №2 и кролика №1 была показана примерно в 3 и 21 раз более низкая активность с достижением 50% подавления при разведении сыворотки 1:55500 и 1:7210, соответственно.

Лимфоциты, выделенные из селезенки всех трех животных, были выбраны для последующего выявления хитов (hit). Приоритет животных определяли на основании способности подавлять биологическую активность ФНОа в анализе с L929. Таким образом, наибольшее количество полученных хитов имело происхождение от кролика №3, а наименьшее количество хитов было получено от кролика №1.

1.2. Выявление хитов

1.2.1. Сортировка хитов

Была разработана методика сортировки на основе проточной цитометрии, обеспечивающая специфическое обнаружение и позволяющая выделить B-клетки, связывающие ФНОа с высокой аффинностью (см. 2.1), после чего проводили процедуру выявления хитов.

Лимфоциты общим количеством 33x106 (что соответствует 1,5% от общего количества выделенных лимфоцитов), полученные от всех трех кроликов, были охарактеризованы в двух независимых циклах сортировки. Из общего количества 33x106 проанализированных клеток было выделено 3452 В-клетки, экспрессирующие специфические антитела к ФНОа. Количества клонированных лимфоцитов были различными для трех кроликов, поскольку большее количество клеток выделяли от тех кроликов, сыворотка которых показала сильное подавление ФНОа в анализе с L929. Из числа выделенных B-клеток 792 клона

- 20 039760 были получены от кролика №1, 1144 клона - от кролика №2 и 1408 клонов - от кролика №3. Для 108 клонов происхождение от соответствующего кролика неизвестно, поскольку они получены из смеси остаточных лимфоцитов от всех 3 кроликов для обеспечения оптимального использования небольшого количества лимфоцитов из флаконов.

1.2.2. Скрининг хитов

Результаты, полученные на стадии скрининга, основаны на исследованиях, проведенных с неочищенными антителами из супернатантов культуры клеток, секретирующих антитела (ASC), поскольку масштаб высокопроизводительного культивирования не позволяет очищать отдельные антитела кроликов. Такие супернатанты использовали для ранжирования большого количества антител друг относительно друга, но не для получения абсолютных значений (например, для подавления биологической активности ФНОа), исключением являлась аффинность связывания. Супернатанты ASC подвергали скринингу в высокопроизводительном ИФА для анализа связывания с рекомбинантным ФНОа человека. Связывающиеся с ФНОа-супернатанты дополнительно характеризовали в отношении связывания с ФНОа яванского макака методом ИФА, кинетики связывания и их способности нейтрализовать биологическую активность ФНОа человека в анализе с L929. За исключением кинетики связывания, полученные при высокопроизводительном скрининге значения следует интерпретировать в качестве ответов да или нет, которые основаны на точечных измерениях (без учета зависимости доза-ответ). Аффинность к ФНОа яванского макака и мыши анализировали для всех 102 клонов, которые были выбраны для амплификации и секвенирования вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела.

1.2.2.1. Связывание с ФНОа человека

Целью первичного скрининга является выявление клонов ASC, которые продуцируют антитела, специфичные к ФНОа человека. Для этой цели супернатанты культуры клеток 3452 клонов ASC анализировали на присутствие антител к ФНОа человека методом ИФА (см. 2.2.1). Используемый метод ИФА оценивает количество антител подтипа IgG, связанных с рекомбинантным ФНОа человека, однако не дает информации об аффинности или концентрации антител. В этом анализе супернатанты из 894 клонов ASC вызывали сигнал, который был явно выше фона. Доля хитов согласно скринингу была схожей для кролика №1 и кролика №2: 153 хита из 792 (19,3%), выявленных у кролика №1 и 225 хитов из 1144, выявленных у кролика №2 (19,7%). Для кролика №3 была продемонстрирована значительно большая доля хитов - 34,4%, что обусловливало выявление 484 хитов из 1408. Для всех 894 хитов, выявленных в этом первичном скрининге, проводили определение кинетики связывания с помощью SPR (вторичный скрининг).

1.2.2.2. Кинетика связывания с ФНОа

Целью вторичного скрининга является получение количественной информации о качестве связывания с мишенью для каждого хита, выявленного при первичном скрининге, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, см. 2.2.2). В отличие от ИФА, используемого при проведении первичного скрининга, этот метод оценивает кинетику связывания с мишенью в виде функции от времени. Это позволяет определить константы скорости для ассоциации (ka) и диссоциации (kd) антитела с мишенью. Отношение kd/ka позволяет рассчитать константу равновесия диссоциации (KD), которая отражает аффинность антитела в отношении мишени. Из 894 хитов, выявленных при первичном скрининге, удалось определить аффинность связывания с ФНОа человека для 839 моноклональных антител кролика. Для остальных 55 антител аффинность не могла быть определена, поскольку концентрация антитела в супернатанте ASC была ниже предела обнаружения прибора для SPR при соответствующих настройках. 839 антител к ФНОа, для которых можно было провести определение, продемонстрировали константы диссоциации (KD) в диапазоне от 1,36x10-13 М до 1,14x10-8 М. 69% всех проанализированных антител имели KD ниже 0,5 нМ.

Медианные значения KD, составляющие 2,21x10’10 М и 2,09x10’10 М, для хитов, выявленных при скрининге от кроликов №2 и №3, были схожими, в то время как для кролика №1 были продемонстрированы примерно в 2 раза более высокие значения с медианным значением KD 4,65x10’10 М. При рассмотрении только нейтрализующих выявленных при скрининге хитов распределения аффинности были одинаковыми для всех трех животных с более низкими значениями медианной KD (медианные значения KD от 1,4x10’¹⁰ М до 1,27x10’10 М). Аффинность менее 0,041 нМ, 0,029 нМ и 0,026 нМ была определена для 5% выявленных при скрининге хитов от кроликов №1, №2 и №3, соответственно. Для 2% супернатантов аффинность находилась даже в низком пикомолярном диапазоне (менее 6,2 пМ, 7,9 пМ и 11 пМ). Высокий уровень выхода высокоаффинных антител, полученный в результате вторичного скрининга, обеспечивает широкую основу для выбора наиболее подходящих антител для гуманизации и изменения формата.

1.2.2.3. Активность

Для оценки активности был разработан анализ на основе клеток (анализ с L929) (см. 2.2.3). 506 из 894 выбранных антител (56,6%) подавляли индуцированный ФНОа апоптоз в анализе с L929 более чем на 50%. В соответствии с результатами, полученными при анализе титров, наибольшее процентное со- 21 039760 держание нейтрализующих хитов было получено у кролика №3, где доля хитов составляла 62,8%, затем следует кролик №2 с долей хитов 56,4% и кролик №1 с наименьшей долей хитов 39,9%. Аффинность этих нейтрализующих антител находилась в диапазоне от 1,36 х 10-13 до 1,19 х 10-9 М.

1.2.2.4. Видовая перекрестная реактивность (яванский макак)

Все 894 хита, выявленных при первичном скрининге, анализировали в отношении видовой перекрестной реактивности с ФНОа яванского макака с помощью ИФА (см. 2.2.1). Целью этого дополнительного скрининга являлось получение возможности отбора клонов ASC, для которых известно, что они обладают перекрестной реактивностью с ФНОа яванского макака. Используемый метод ИФА позволяет оценить количество антител подтипа IgG, связанных с рекомбинантным ФНОа яванского макака, однако, не дает информации об аффинности или концентрации антител. Супернатанты от 414 (46%) клонов ASC вызывали явный сигнал (оптическая плотность (OD) >1). Процентное содержание хитов, обладающих перекрестной реактивностью с ФНОа яванского макака, было близким для кролика №1 и кролика №3 и составляло 81 хит из 153 (52,9%), выявленный у кролика №1, и 236 хитов из 484, выявленных у кролика №3 (48,8%). Для кролика №2 было продемонстрировано несколько меньшее процентное содержание обладающих перекрестной реактивностью хитов, составляющее 37,8%, что приводило к выявлению 82 хитов из 225.

1.2.2.5. Выбор клонов для ОТ-ПЦР

В качестве предварительного условия для подтверждения получения хитов, анализа последовательности генов и последующей гуманизации антител кролика необходимо получить генетическую информацию, кодирующую вариабельный домен антитела кролика. Это было осуществлено путем обратной транскрипции (ОТ) соответствующей информационной РНК с получением комплементарной ДНК (кДНК) с последующей амплификацией двухцепочечной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор клонов ASC, подвергнутых ОТ-ПЦР, прежде всего был основан на аффинности и нейтрализующей активности. В качестве дополнительного критерия учитывали перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака. Всего для клонирования генов с помощью ОТ-ПЦР было выбрано 102 клона ASC. Сначала было выбрано 93 наиболее перспективных ASC (с точки зрения аффинности) с KD менее 80 пМ, которые подавляли биологическую активность ФНОа в анализе с L929 более чем на 50% и демонстрировали значительное связывание с ФНОа яванского макака. Помимо этого, все 9 наиболее перспективных клонов ASC с KD менее 20 пМ, которые подавляли активность ФНОа более чем на 50%, но не связывались с ФНОа яванского макака, несмотря на это также были выбраны. Всего были успешно амплифицированы и секвенированы 12, 13 и 66 клонов ASC от кроликов №1, №2 и №3, соответственно.

1.2.2.6. Выявление родственных клонов с желаемыми свойствами

Для того чтобы охарактеризовать генетическое разнообразие панели выделенных клонов ASC, последовательности определяющих комплементарность участков (CDR) подвергали экстракции и множественному выравниванию последовательностей, что обеспечивало возможность кластеризации последовательностей в филогенетическом древе.

В то время как этот анализ, с одной стороны, позволяет выбрать генетически разнообразный набор последовательностей клонов для последующих экспериментов по гуманизации и изменению формата, он также позволяет выявить гомологичные кластеры последовательностей клонов, которые, по-видимому, имеют общий исходный клон B-клеток у кролика. Отличительными признаками этих кластеров последовательностей являются высокая гомология последовательностей в CDR и единая закономерность фармакодинамических свойств. Оба этих свойства обобщены для кластера из восьми клонов в табл. 2 и 3. Несмотря на сохранение функций в этом кластере последовательностей, консенсусная последовательность в табл. 3 демонстрирует, что определенная вариабельность CDR допустима при сохранении желаемого фармакодинамического профиля.

Таблица 2. Фармакодинамические свойства моноклональных антител в супернатантах ASC

С/н ASC	Аффинность к ФНОа человека	Аффинность к ФНОа яванского макака	анализ с L929
ID клона	ка (МА’1)	Kd (s'1)	KD (М)	ka (МА’1)	Kd (s'1)	KD (М)	% подавления
16-12-В11	3,22Е+06	1,87Е-04	5,82Е-11	2Д5Е+06	1Д7Е-03	6,34Е-10	71
16-13-С08	1,77Е+06	9Д1Е-05	5,ЗЗЕ-11	1,80Е+06	1,77Е-04	9,82Е-11	93
16-13-Е05	2,78Е+06	8,27Е-05	2,97Е-11	2,53Е+06	2,99Е-04	1Д8Е-10	94
16-16-В08	2,27Е+06	4,53Е-05	1,99Е-11	2,35Е+06	1,52Е-04	6Д5Е-11	73
16-16-Н10	2,03Е+06	1,59Е-04	7,85Е-11	2,20Е+06	4,61Е-04	2Д0Е-10	70
16-22-Н05	1,90Е+06	7,26Е-05	3,82Е-11	2Д7Е+06	6,97Е-05	ЗД1Е-11	67
17-13-G07	7,87Е+05	1,37Е-06	1,73Е-12	7,80Е+05	7,34Е-05	9Д1Е-11	109
17-20-Е06	1Д9Е+06	3,59Е-06	3,ОЗЕ-12	1Д5Е+06	3,27Е-05	2Д6Е-11	101

- 22 039760

Таблица 3. Для указанных выше клонов были получены следующие данные о последовательностях, относящихся к CDR:

CDR	Клон	Последовательность *	SEQ ID NO:
CDRL1	16-22-Н05 16-12-В11 16-13-С08 16-13-Е05 16-16-В08 16-16-Н10 17-13-G07 17-20-Е06	QASQSIFSGLA QASQSISNYLA QASQSISTALA QASQSIGRNLA QASQSISNSLA QASQSIYSGLA QASQSIGSNLA QASQSISSSLA QASQSIXXXLA	7 16 17 18 19 20 21 22 1
	16-22-Н05 16-12-В11 16-13-С08 16-13-Е05 16-16-В08 16-16-Н10 17-13-G07 17-20-Е06	GASKLAS	8
	RASTLAS	23
	RASTLES	24
CDR L2	QASKLAS RASTLAS	25 23
	GASKLAS	8
	RASTLAS	23
	RASKLAS	26
	XASXLXS	2
	16-22-Н05	QSYYYSSSSSDGSYA	9
	16-12-В11	QSYYYSSSSSDGFFA	27
CDR L3	16-13-С08	QSYYYSSSSSDGSFA	28
16-13-Е05	QSYYYSSSNSDGSLA	29
	16-16-В08	QSYYYSSISSDGSYA	30
	16-16-Н10	QSYYYSSSSSDGSYA	9
	17-13-G07	QSYYYSSSSSDGSVA	31
	17-20-Е06	QSYYYTSSTSDGSYA	32
		QSYYYXSXXSDGXXA	3
	16-22-Н05 16-12-В11 16-13-С08 16-13-Е05 16-16-В08 16-16-Н10 17-13-G07 17-20-Е06	GIDFNNYGIG	10
	GIDFSNYGIC	33
	GIDFSNYGIS	34
	GIDFSNYGIC	33
CDRH1	GIDFNNYGIG	10
	GIDFNNYGIG	10
	GIDFSTYGIS	35
	GIDFSNYGIG	36
	GIDFXXYGIX	4
	16-22-Н05 16-12-В11 16-13-С08 16-13-Е05 16-16-В08 16-16-Н10 17-13-G07 17-20-Е06	YIYPGF AITNFANSVKG	11
	YIYPGFGITNYANSVKG YIYPGFGIRNYAHSVKG	37 38
	YIYPGFGIRNYANSLKG	39
CDRH2	YIYPGF AIRNYANS VKG	40
	YIYPGFGITNFANSVKG	41
	YIYPGFGITNYANSVKG	37
	YIYPGF AIRNYANSVKG	40
	YIYPGFXIXNXAXSXKG	5
	16-22-Н05 16-12-В11 16-13-С08 16-13-Е05 16-16-В08 16-16-Н10 17-13-G07 17-20-Е06	DPVYATSSGYFDL DPIYASSSGYLDL	12 42
	DPVYSSDWGYFNL	43
	DPVYASSSGYLDL	44
CDR НЗ	DPLYATSSGYFDL	45
	DPVYASSSGYFDL	46
	DPVYASSSAYYNL	47
	DPLYSTSSGYFNL	48
	DPXYXXXXXYXXL	6

*Аминокислоты, обозначенные как X, имеют значение, определенное в прилагаемом перечне последовательностей.

1.2.2.7. Перекрестная реактивность с ФНОа яванского макака (определенная методом SPR)

Вследствие большого количества хитов с высокой аффинностью, которые эффективно нейтрализуют ФНОа, видовую перекрестную реактивность оценивали для всех моноклональных антител кролика, которые подвергали ОТ-ПЦР, для облегчения выбора клонов ASC для подтверждения получения хитов. Аффинность к ФНОа яванского макака определяли методом SPR аналогично описанному выше (см. также 2.2.2). Аффинность 93 исследованных антител к ФНОа яванского макака находилась в диапазоне от 9,6х10^-12 до 2,1 х10^-9 М. 38 из 93 обладающих перекрестной реактивностью антител связывались с

- 23 039760

ФНОа человека и яванского макака с аналогичной аффинностью (KD отличались менее чем в два раза).

Кроме того, аффинность к ФНОа человека и яванского макака отличалась менее чем в 20 раз для 79 из обладающих перекрестной реактивностью антител и менее чем в 10 раз для 62 из них, что делает их приемлемыми для доклинических исследований с использованием яванских макаков.

2. Способы

2.1. Сортировочный анализ

Процедуру сортировки на основе проточной цитометрии для выделения антигенспецифичных Вклеток из лимфатической ткани кролика выполняли, как описано в источнике Lalor et al (Eur J Immunol. 1992;22.3001-2011).

2.2. Скрининговое исследование

2.2.1. Определение связывания с ФНОа методом ИФА (ФНОа человека и яванского макака)

Рекомбинантный ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01) наносили на 96-луночный планшет для микротитрования для ИФА. Связывание антител кролика в супернатантах культуры ASC с иммобилизованным ФНОа обнаруживали с применением вторичного меченного HRP IgG к иммуноглобулинам кролика (Jackson ImmunoResearch, номер по каталогу. 111-035-046). Добавляли субстрат ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, KPL, номер по каталогу 53-00-00) и останавливали реакцию с развитием окрашивания путем добавления H₂SO₄ Планшеты считывали с использованием устройства для считывания планшетов для микротитрования (Infinity reader M200 Pro, Tecan) при длине волны 450 нм.

Эффективность анализа во время циклов скрининга контролировали с помощью коммерчески доступного поликлонального антитела кролика к ФНОа в качестве положительного контроля (AbD Serotec, номер по каталогу 9295-0174). Для этой цели являющееся положительным контролем антитело исследовали в концентрации 100 и 250 нг/мл в двух повторностях в каждом планшете для скрининга. Устойчивость и точность ответа положительного контроля контролировали для каждого планшета. При конечных условиях анализа отношение сигнал-фон составляло от 30 до 40 для положительного контроля в концентрации 250 нг/мл, а коэффициент вариации (КВ) положительного контроля составлял менее 10%. Сигнал с оптической плотностью >100% относительно положительного контроля в концентрации 250 нг/мл рассматривали как хит первичного скрининга.

Для определения титра сыворотки использовали те же условия ИФА, как описано выше. Разведение сыворотки считали положительным, когда сигнал связывания иммунной сыворотки был по меньшей мере в 3 раза более высоким по сравнению с сигналом сыворотки не получавшего антигена животного.

Видовую перекрестную реактивность с яванским макаком определяли с использованием аналогичного ИФА, как описано выше. Рекомбинантный ФНОа яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 90018-CNAE) наносили на 96-луночный планшет для микротитрования для ИФА. Связывание антител кролика в супернатантах культуры ASC с иммобилизованным ФНОа яванского макака обнаруживали с применением вторичного меченного HRP антитела, как указано выше. Иммунную сыворотку от кролика №2 использовали в качестве положительного контроля при разведении 1:80000 и 1:320000. Устойчивость и точность ответа положительного контроля контролировали для каждого планшета. При конечных условиях анализа отношение сигнал-фон составляло от 20 до 30 для положительного контроля при разведении 1:80000, a КВ положительного контроля составляли менее 10%.

2.2.2. Кинетика связывания с ФНОа (человека и яванского макака), определенная методом SPR

Аффинность связывания антител с ФНОа человека определяли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора для SPR MASS-1 (Sierra Sensors). Производительность прибора определяли с помощью стандартных эталонных растворов, а также анализа взаимодействия эталонного антитела с антигеном, такого как взаимодействие инфликсимаба с ФНОа.

Для скрининга аффинности антитело, специфичное к Fc-участку IgG кролика (Bethyl Laboratories, номер по каталогу A120-111A), иммобилизовали на сенсорном чипе (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) с использованием стандартной методики конъюгации аминов. Моноклональные антитела кролика в супернатантах ASC захватывались иммобилизованным антителом к IgG кролика. После захвата моноклональных антител выполняли инъекцию ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01) в проточные ячейки в течение 3 мин в концентрации 90 нМ и оставляли на 5 мин для протекания диссоциации белка от IgG, захваченного на сенсорном чипе. После каждого цикла инъекций поверхность подвергали регенерации с помощью двух инъекций 10 мМ глицин-HCl. Кажущиеся константы скорости диссоциации (kd) и ассоциации (k_a) и кажущуюся константу равновесия диссоциации (K_D) рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) с применением модели связывания Лэнгмюра один к одному, а качество аппроксимации контролировали на основании критерия Chi² (Chi2, нормированного на экстраполированный максимальный уровень связывания аналита), который является мерой качества подбора кривой. Для большинства хитов относительное значение Chi2 составляло менее 15%. Результаты признавали значимыми, если значения единиц ответа (RU) для связывания лиганда составляли по меньшей мере 2% от значений RU для захвата антитела. Образцы со значениями RU для связывания лиганда, составлявшими менее чем 2% от значений RU для захвата антитела, рассматривали как не демонстрирующие специфического связывания ФНОа с захва- 24 039760 ченным антителом.

Видовую перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу

90018-CNAE) определяли с использованием тех же условий анализа и концентраций ФНОа и применением тех же мер качества. Относительный Chi2 составлял менее 15% для большинства проанализированных супернатантов ASC.

2.2.3. Индуцированный ФНОа апоптоз фибробластов L929

Способность IgG кролика из супернатантов культуры ASC нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного ФНОа человека оценивали с использованием фибробластов мыши L929 (ATCC/LGC Standards, номер по каталогу CCL-1). Клетки L929 сенсибилизировали к индуцированному ФНОа апоптозу путем добавления 1 мкг/мл актиномицина D. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах для микротитрования с плоским дном в присутствии 50% супернатанта культуры ASC и 100 пМ (5,2 нг/мл) ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01) в течение 24 ч. По сравнению с очищенными антителами, в присутствии супернатантов ASC необходимо было использовать более высокие концентрации ФНОа для скрининга хитов. Выживаемость клеток определяли с помощью колориметрического анализа с применением реагента для детекции пролиферации клеток WST-8 (2-(2метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий, мононатриевая соль) (Sigma Aldrich, номер по каталогу 96992). WST-8 восстанавливается под действием дегидрогеназ клетки с образованием оранжевого продукта формазана. Количество образующегося формазана прямо пропорционально количеству живых клеток. Данные анализировали с применением четырехпараметрической логистической модели для подбора кривой, используя программное обеспечение для анализа данных Softmax (Molecular Devices), и рассчитывали концентрацию инфликсимаба, необходимую для нейтрализации индуцированного ФНОа апоптоза 50% (IC50) при концентрации 36,2 нг/мл. Таким образом, рассчитанный нижний предел обнаружения для этого анализа составляет от 30 до 40 нг/мл. Это значение является лишь приблизительной оценкой предела обнаружения, поскольку способность блокировать ФНОа зависит не только от концентрации моноклонального антитела, но также от аффинности антитела к мишени. Однако чувствительность анализа достаточна для скрининга супернатантов, поскольку концентрации IgG в большинстве супернатантов ASC превышают концентрацию 40 нг/мл. Супернатанты, приводящие к 50% нейтрализации индуцированного ФНОа апоптоза, считали положительными.

Для обеспечения устойчивой эффективности анализа при проведении циклов скрининга используемое в качестве положительного контроля антитело инфликсимаб анализировали в концентрациях 115 нг/мл (0,8 нМ) и 58 нг/мл (0,4 нМ) в двух повторностях в каждом планшете для скрининга. Процент подавления и точность ответа на положительный контроль контролировали для каждого используемого для скрининга планшета. Критерии приемлемости для каждого планшета устанавливали следующим образом: по меньшей мере 60% подавления используемого в качестве положительного контроля антитела в концентрации 115 нг/мл с коэффициентом вариации (КВ) менее 20%.

Пример 2. Гуманизация и получение scFv.

1. Результаты

1.1. Подтверждение получения хитов и выбор хитов для гуманизации уникальных набора исходных вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител кролика были получены во время скрининга хитов и проанализированы путем выравнивания последовательностей. На основании результатов скринингового анализа и гомологии последовательностей отдельных клонов IgG кролика были выбраны 30 кандидатов для подтверждения получения хитов. Было получено 29 моноклональных антител, и наиболее эффективные клоны с точки зрения аффинности и активности были выбраны для гуманизации и получения кандидата-лидера (lead candidate). Критериями выбора клонов являлись i) нейтрализация ФНОа человека в анализе с L929, ii) высокая аффинность к ФНОа человека, iii) перекрестная реактивность с ФНОа яванского макака и макака-резуса и iv) разнообразие последовательностей. Для гуманизации был выбран один клон (16-22-H05) как один из наиболее перспективных IgG с точки зрения способности к нейтрализации ФНОа человека в анализе с L929. В отношении силы связывания предпочтительна наибольшая возможная аффинность, поскольку необходимо предвидеть некоторую потерю аффинности в результате гуманизации и изменения формата на формат scFv.

Данные для клона IgG № 16-22-H05 приведены в табл. 4.

Таблица 4. Характеристики связывания и активности in vitro очищенного моноклонального антитела (16-22-H05)

			Нейтрализация ФНО в анализе с L929	Блокирование взаимодействия ФНО с TNFR1	Блокирование взаимодействия ФНО с TNFR2
Аффинность к ФНО человека	Аффинность к ФНО яванского макака	Аффинность к ФНО макака-резуса
ка (МА'1)	Kd (S-1)	KD (М)	ка (МА'1)	Kd (S-1)	KD (М)	ка (МА'1)	Ка (S'1)	KD (М)	отн. IC50	отн. IC50	отн. IC50
4,04Е+06	1,31Е-04	3,25Е-11	3,50Е+06	4,89Е-06	1,40Е-12	2,01Е+06	5,31Е-04	2,65Е-10	9,95	1,02	0,88

*: IC₅₀, инфликсимаб/IC₅₀, исследуемый образец

- 25 039760

1.2. Получение и отбор гуманизированных фрагментов scFv

Последовательности, кодирующие определяющие комплементарность участки (CDR), переносили in silico путем прививки петлей CDR на каркасную последовательность вариабельного домена антитела человека, как описано в WO 2014/206561. Помимо этого, была получена вторая конструкция для каждого клона кролика, которая переносила дополнительные аминокислоты из донорной последовательности в положения, имеющие структурную значимость для позиционирования доменов иммуноглобулина и CDR. Был синтезирован (из соответствующих вариабельных легких и тяжелых цепей) искусственный ген (с оптимизированным использованием кодонов для бактериаьной экспрессии), кодирующий соответствующее гуманизированное одноцепочечное антитело Fv (scFv). Затем был получен полипептид и впоследствии охарактеризован с использованием аналогичных исследований, как описано для процесса подтверждения получения хитов.

1.2.1. Гуманизация и получение гуманизированных scFv (активных фармакологических ингредиентов (API))

Гуманизация выбранного клона включала перенос CDR антитела кролика на акцепторный каркас scFv типа Vk1/VH3, как описано в WO 2014/206561. В этом способе, который схематически представлен на фиг. 1, аминокислотная последовательность шести участков CDR была идентифицирована в донорной последовательности (мАТ кролика) и привита на каркасную последовательность акцептора с получением конструкции, названной трансплантат CDR.

Помимо этого, был разработан второй трансплантат, который включал дополнительные модификации аминокислот донорного антитела кролика в положениях L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 и H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (нумерация AHo), которые, как было описано, потенциально влияют на позиционирование CDR и, следовательно, связывание антигена (Borras et al. JBC. 2010; 285:9054-9066). Эта гуманизированная конструкция названа структурный (STR) трансплантат. В случае, когда сравнение данных характеристик для этих двух исходных конструкций показало значительное преимущество конструкции STR, были разработаны дополнительные варианты, которые объединяли CDR-привитые VL с STR-привитыми VH. Было доказано, что эта комбинация часто является достаточной для сохранения активности трансплантата STR (Borras et al., 2010, JBC, 285:9054-9066) и в целом является более предпочтительной, поскольку меньшее количество изменений, не связанных с антителом человека, в акцепторном каркасе антитела человека снижают риск ухудшения стабильности, а также потенциал иммуногенности.

После завершения разработки конструкции in silico, описанной в предыдущем разделе, синтезировали соответствующие гены и конструировали векторы бактериальной экспрессии. Последовательность экспрессионных конструкций была подтверждена на уровне ДНК, и конструкции получали в соответствии с общими протоколами экспрессии и очистки.

Гетерологичную экспрессию белков проводили в E.coli в виде нерастворимых телец включения. Культуру экспрессии инокулировали экспоненциально растущей исходной культурой. Культивирование проводили во встряхиваемых колбах в орбитальном шейкере с использованием коммерчески доступных обогащенных сред. Клетки выращивали до установленной OD₆₀₀, равной 2, и индуцировали путем ночной экспрессии с добавлением 1 мМ изопропил-в-О-1-тиогалактопиранозида (IPTG). По окончании культивирования клетки собирали центрифугированием и гомогенизировали с помощью обработки ультразвуком. На этой стадии уровень экспрессии различных конструкций определяли с помощью электрофореза лизата клеток в ПААГ с добавлением ДНС. Тельца включения выделяли из гомогенизированного остатка клеток с использованием протокола центрифугирования, который включал несколько стадий промывки для удаления остатков клеток и других примесей клеток-хозяев. Очищенные тельца включения солюбилизировали в денатурирующем буфере (100 мМ Трис/HCl, pH 8,0, 6 М гуанидин-HCl, 2 мМ ЭДТА) и подвергали scFv рефолдингу с помощью масштабируемого протокола рефолдинга, который обеспечивал получение миллиграммовых количеств мономерного scFv с нативной структурой. Для очистки scFv использовали стандартизованный протокол, который включал следующие стадии. Продукт после рефолдинга захватывали с помощью аффинной хроматографии с использованием агарозы Capto L (GE Healthcare) с получением очищенных scFv. Кандидаты-лидеры, которые соответствовали критериям аффинности и активности при начальной проверке, дополнительно очищали, подвергая заключительной эксклюзионной хроматографии с использованием колонки HiLoad Superdex75 (GE Healthcare). После выполнения протокола очистки белки были приготовлены в буферном солевом растворе и охарактеризованы с помощью различных биофизических методов, методов анализа белковых взаимодействий и биологических методов, как описано ниже. Производительность различных конструкций сравнивали путем определения конечного выхода очищенного белка на партию и нормализации этого значения на 1 л объема рефолдинга.

1.2.2. Определение биофизических характеристик гуманизированного scFv

Биофизические характеристики scFv в отношении стабильности и производительности представлены в табл. 5. Производительность и стабильность конструкции scFv была охарактеризована различными контрольными точками, как описано в последующих разделах.

- 26 039760 scFv исследовали в соответствии с определенными критериями, как пояснено ниже.

Критерий производительности должен гарантировать, что выбранная структура scFv может быть экспрессирована, подвергнута рефолдингу и очищена в достаточных количествах для обеспечения дальнейшей разработки молекулы-лидера (lead molecule). Определенными критериями были выход продукта экспрессии scFv на литр культуральной жидкости при оценке методом электрофореза в ПААГ с добавлением ДНС и выход продукта очистки, достигаемый в общем лабораторном способе, при оценке путем определения количества очищенного белка с помощью УФ-спектрометрии в пересчете на 1 л раствора для рефолдинга.

Критерии стабильности были предназначены для оценки склонности к агрегации в процессе получения молекул и их структурной целостности при хранении и дальнейшей обработке. Содержание мономера, определенное с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, позволяет оценить стабильность коллоидного раствора молекул в процессе очистки (2.2.3). В последующем исследовании стабильности содержание мономера определяли в течение 4 недель при концентрации 1 и 10 мг/мл и хранении при 4, -20 и <-65°C. Помимо этого, стабильность коллоидного раствора белков определяли после 5 циклов замораживания и оттаивания. В качестве дополнительного показателя стабильности определяли среднюю точку тепловой денатурации методом дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF) (2.2.4), получая данные по конформационной стабильности кандидатов-лидеров.

Таблица 5. Сводные данные биофизических характеристик гуманизированных scFv

	ID клона	Конструкция	Стабильность	Производительность
Тпл [°C]	Хранение [Δ%]	Замораживание/от- таивание [Δ%]	Чистота [%]	Экспрессия [г/л]	Выход Очистки [мг/л]
-6 5 °C	-25 °C	4°С
16-22-H05-SC01		CDR	74,2	н/о	н/о	н/о	н/о	98,0	н/о	19,1
16-22-H05-SC02	16-22-05	STR	71,3	0,0	0,0	0,2	0,0	99,9	0,27	29,8
16-22-H05-SC04		CDR/STR	72,6	0,2	0,1	0,4	0,0	100,0	0,26	24,1

1.2.2.1. Оценка производительности

Молекулы scFv, являющиеся кандидатами-лидерами, экспрессировали путем культивирования во встряхиваемых колбах в периодическом режиме и очищали с помощью общего лабораторного способа с получением образцов белка для дальнейшего определения характеристик. В ходе этого процесса контролировали некоторые ключевые параметры производительности для сравнения молекул-кандидатов и выявления потенциально сложных для разработки конструкций.

Титр экспрессии определяли на уровне неочищенного лизата E.coli после сбора клеток центрифугированием. Во время сбора ожидается небольшая потеря клеток, однако этот фактор было решено не учитывать при расчете выхода продукта экспрессии, предпочитая более консервативную оценку производительности. Для количественного определения продукта scFv в лизате был выбран восстанавливающий электрофорез в ПААГ с добавлением ДНС с окрашиванием Кумасси (2.2.1) вследствие высокой специфичности этого метода, которая позволяет отличать продукт от белков клетки-хозяина в образце.

Вторым критерием оценки продуктивности является выход продукта очистки scFv в расчете на литр раствора для рефолдинга. Этот параметр указывает на потенциальный лимитирующий фактор в ожидаемом способе получения, который включает стадию рефолдинга белка. Поскольку доказано, что эффективность процедуры рефолдинга является лимитирующей в сопоставимых способах получения, было решено сравнивать производительность различных конструкций, принимая во внимание производительность, нормированную на определенный объем рефолдинга. Для расчета выхода образец конечного белка из каждой партии подвергали количественной оценке по поглощению УФ (2.2.2) и делили на фактический объем рефолдинга соответствующей очистки (табл. 6).

Таблица 6. Сводные данные о производительности для двух гуманизированных scFv. Титр экспрессии определяли с помощью количественного электрофореза лизатов клеток на конечном этапе производственного цикла в ПААГ с добавлением ДНС. Выход партии определяли с помощью измерения поглощения УФ-пула после конечной очистки. Выход продукта очистки рассчитывали как количество очищенного scFv на литр объема рефолдинга.__________________________________________________

ID конструкции	Титр экспрессии [г/л]	Производительность
Выход партии [мг]	Объем рефолдинга [л]	Выход очистки [мг/л]
16-22-H05-SC02	0,27	14,3	0,48	29,8
16-22-H05-SC04	0,26	11,9	0,49	24,1

1.2.2.2. Оценка стабильности

Оценка конформационной стабильности, монодисперсности и структурной целостности конструкций scFv является неотъемлемым компонентом ранжирования различных молекул в отношении возможности их разработки. Предварительным этапом для корректного сравнения различных конструкций является получение очищенных молекул схожего качества. Критерий чистота мономера, определенный методом эксклюзионной ВЭЖХ, предназначен для обеспечения сопоставимого качества различных исследуемых веществ. Помимо анализа методом эксклюзионной ВЭЖХ для определения чистоты и под- 27 039760 линности белка проводили электрофорез в ПААГ с добавлением ДНС для подтверждения сопоставимого качества исследуемых препаратов.

Результаты эксклюзионной ВЭЖХ двух scFv показывают, что все препараты могут быть очищены до достижения содержания мономера >99% (фиг. 2).

Характер тепловой денатурации кандидатов-лидеров исследовали методом дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF) для обеспечения ранжирования молекул в отношении их ожидаемой конформационной стабильности. Нормализованный график исходных данных флуоресценции представлен на фиг. 3, где представлены результаты измерений для каждого образца в двух повторностях. Наблюдали кооперативный характер денатурации. Две молекулы 16-22-H05-sc02 и 16-22-H05-sc04 продемонстрировали Т_пл 71,3 и 71,6°C, соответственно.

Во втором аспекте оценки стабильности монодисперсность молекул контролировали в течение 4 недель при различных температурах. Результаты исследования стабильности и полученные содержания мономера представлены на фиг. 4. Обе молекулы (16-22-H05-sc02 и 16-22-H05-sc04) изначально имеют содержание мономера, превышающее минимум 95% мономера, и теряют менее 5% мономера относительно соответствующего исходного значения в концентрации 10 мг/мл. В замороженном состоянии при -20°C и <-65°C для образцов показаны лишь минимальные различия во времени. В наиболее жестких условиях (4°C) молекула 16-22-H05-sc02 потеряла всего 0,2% мономера в течение 4 недель. Помимо этого исследование устойчивости к внешним воздействиям проводили при температуре 37°C и концентрации scFv 10 мг/мл в срок до 4 недель. При этих условиях ожидается более сильное проявление различий в склонности к агрегации различных конструкций. Полученные данные, приведеннные на фиг. 6, свидетельствуют о потере 15% мономера через 28 дней. Оба scFv продемонстрировали хорошую стабильность мономера в условиях нагрузки. Хроматограммы исследования стабильности при 4°C приведены на фиг. 5, где показан образец в 0 день и через 28 дней при 4°C. В виде наложенного изображения на этой хроматограмме также показаны результаты стабильности при замораживании/оттаивании. Для этой части исследования образцы неоднократно замораживали и оттаивали, всего проводили 5 циклов. Полученная количественная оценка содержания мономера с помощью аналитической эксклюзионной ВЭЖХ не выявила каких-либо изменений в двух указанных образцах (табл. 5).

Для двух scFv был проведен анализ методом электрофореза в ПААГ с добавлением ДНС для получения вспомогательных данных для количественной оценки с помощью поглощения УФ, подтверждающих чистоту исследуемого препарата и таким образом обеспечивающих специфичность количественного определения содержания. В другом аспекте этого анализа результаты электрофореза в ПААГ с добавлением ДНС выявили отсутствие деградации белка во время исследования стабильности (28 дней при 4°C и концентрации 10 мг/мл по сравнению с образцом в день 0, хранящимся при <-65°C), что является важной характеристикой с точки зрения возможности разработки.

Важно отметить, что различные исследования, проведенные в рамках этой оценки, касаются различных аспектов механизма устойчивости белка. Определение температуры тепловой денатурации белка позволит получить дополнительные данные для определения монодисперсности методом эксклюзионной ВЭЖХ при хранении при повышенной температуре. Хотя оба метода предназначены для получения оценки потенциального срока хранения и стабильности продукта, рассматриваемые механизмы глубоко различны. Средняя точка перехода (Т_пл), определенная с помощью тепловой денатурации, является качественной мерой стабильности домена белка (не позволяет термодинамически определить AG). Высокостабильные домены белка (с высокой Т_пл) с меньшей вероятностью подвергаются спонтанной денатурации при температуре окружающей среды и, следовательно, менее подвержены необратимой агрегации/преципитации, обусловленной взаимодействиями денатурированных доменов. Высокая стабильность домена указывает на плотную упаковку аминокислотных остатков, которая также коррелирует с устойчивостью к расщеплению протеазами. С другой стороны, оценка методом эксклюзионной ВЭЖХ обеспечивает количественное определение содержания мономерной фракции, а также растворимых олигомеров/агрегатов. Такие растворимые олигомеры часто представляют собой обратимые и относительно слабые ассоциаты, обусловленные электростатическими или гидрофобными взаимодействиями между правильно уложенными белками. Существует некоторая корреляция между Т_пл, определенной с помощью тепловой денатурации, и склонностью к образованию олигомеров/агрегатов, определенной методом эксклюзионной ВЭЖХ, в частности для белков с пограничной стабильностью. До достижения определенного порога Т_пл, составляющего примерно 60°C, вариабельные домены антител, как правило, достаточно стабильны, чтобы быть устойчивыми к агрегации/преципитации и протеолитической деградации вследствие частичной денатурации домена при температуре окружающей среды. Однако олигомеризация, обусловленная гидрофобными и/или электростатическими взаимодействиями поверхностных остатков, все же происходит. Важно отметить, что при ускоренном (нагрузочном) исследовании стабильности при повышенной температуре (например, 37°C) различные механизмы образования олигомеров и преципитации могут действовать одновременно.

1.2.3. Определение характеристик связывания и активности гуманизированных scFv in vitro

В дальнейшем гуманизированные scFv были охарактеризованы in vitro в отношении их свойств свя- 28 039760 зывания с мишенью и активности. Анализировали кинетику связывания (ka, kd и KD) с ФНОа человека и способность к нейтрализации индуцированного ФНОа апоптоза фибробластов L929. Дополнительно определяли способность подавлять индуцированный ФНОа яванского макака (Macaca fascicularis) и макака-резуса (Macaca mulatta) апоптоз, а также способность подавлять взаимодействие ФНОа человека с TNFRI/TNFRII методом ИФА и селективность в отношении мишени для связывания ФНОа по сравнению с ФНОв.

Для понимания приведенных ниже результатов важно отметить, что как перенос CDR антитела кролика на каркас вариабельного домена антитела человека, так и изменение формата от полноразмерного IgG до фрагмента scFv может влиять на фармакологические свойства. Например, определенная потеря аффинности обычно связана с гуманизацией. Кроме того, вследствие меньшего размера scFv по сравнению с IgG способность scFv препятствовать взаимодействию партнеров посредством стерического затруднения в значительной степени снижается. Последнее, но не менее важное, что следует отметить вследствие бивалентного способа связывания с гомотримерным ФНОа аффинность исходного IgG может быть завышена (артефакт SPR). Следовательно, при сравнении аффинности исходного бивалентного IgG кролика и гуманизированного моновалентного scFv указанная потеря аффинности может быть переоценена.

1.2.3.1. Аффинность

Аффинность гуманизированных scFv к ФНОа человека определяли с помощью SPR (см. также 2.1.1). Аффинность определяли с использованием 2-кратных серийных разведений соответствующих scFv. scFv были получены из моноклонального антитела кролика. Были получены два варианта scFv, названные CDR (CDR) и структурный трансплантат (STR). Чтобы оценить относительный вклад замен в каркасах легкой и тяжелой цепи и по возможности уменьшить количество аминокислотных остатков кролика, введенных в каркас антитела человека, проводили эксперименты по перестановке доменов. Таким образом, для kлона16-22-H05 были получены конструкции scFv, содержащие CDR-привитую легкую цепь и структурно-привитую тяжелую цепь (CDR/STR).

Наиболее перспективные scFv 16-22-H05-sc02 (STR) и 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) связывались с аффинностью 4,5x10’11 и 1,1x10’1° М, соответственно. 16-22-H05-sc04 показал лишь небольшое уменьшение аффинности по сравнению с его вариантом -структурным трансплантатом (16-22-H°4-sc°2) (см. табл. 7). Эти результаты свидетельствуют, что аффинность гуманизированных scFv в основном зависит от нескольких аминокислот кролика, введенных в каркас тяжелой цепи антитела человека.

1.2.3.2. Активность

Способность гуманизированных scFv нейтрализовать ФНОа человека анализировали с использованием анализа с L929 (см. также 2.1.2). Способность (IC₅° и IC₉°) к нейтрализации индуцированного ФНОа апоптоза анализировали для scFv, полученных из 16-22-H5, и сравнивали со способностью эталонного антитела - инфликсимаба, чтобы обеспечить прямое сравнение значений IC₅° и IC₉° в разных планшетах для анализа. Относительные значения IC₅° и IC₉° рассчитывали в единицах массы (нг/мл) инфликсимаба и scFv. Анализ активности выполняли несколько раз в разные дни с различными партиями фрагментов антител. На фиг. 7 показаны типичные кривые зависимости ответа от дозы из одного эксперимента для каждого из двух scFv. Средние значения параллельных определений представлены в табл. 7 (стандартные отклонения приведены в легенде таблицы).

Гуманизированные scFv подавляли индуцированный ФНОа апоптоз с более низкими значениями IC₅° и IC₉°, чем инфликсимаб (см. табл. 7). В соответствии с результатами SPR вариант с переставленными доменами 16-22-H°5-sc°4 (CDR/STR) демонстрировал равную активность по сравнению со структурным трансплантатом 16-22-H°5-sc°2 (STR). scFv 16-22-H°5-sc°4 и 16-22-H°5-sc°2 продемонстрировали превосходную активность нейтрализации ФНОа со значениями IC₅°, в 14,6 и 13,1 раз лучшими, чем для инфликсимаба, соответственно. Значения IC₉° 16-22-H°5-sc°4 и 16-22-H°5-sc°2 были в 13,1 и 12,6 раз лучше, чем для инфликсимаба, соответственно. Как и в случае исходных моноклональных антител кролика, не наблюдалось четкой корреляции между аффинностью и активностью антител (корреляция не приведена). Тем не менее, scFv, полученные из 16-22-H°5, проявляющие наиболее высокую аффинность (16-22-H°5-sc°2 (STR) и 16-22-H°5-sc°4 (CDR/STR)), также продемонстрировали наибольшую активность. Кроме того, результаты анализа нейтрализации свидетельствуют, что для эффективного подавления передачи сигналов ФНОа необходимо достижение определенной пороговой аффинности. Например, scFv 16-14-D°8-sc°1 (CDR), 16-15-C°9-sc°1 (CDR), 16-24-H°7-sc°1 (CDR) и 17-2°-G°1-sc°1 (CDR), все из которых связываются с ФНОа с аффинностью выше 1 нМ, демонстрируют слабую способность к нейтрализации ФНОа (данные не приведены).

1.2.3.3. Видовая перекрестная реактивность (ФНОа яванского макака и макака-резуса)

Видовую перекрестную реактивность для наиболее перспективных scFv определяли двумя способами: 1) определением способности к нейтрализации ФНОа яванского макака и макака-резуса в анализе с L929 и 2) определением аффинности к ФНОа яванского макака и макака-резуса методом SPR. Способность к нейтрализации ФНОа от различных видов определяли с помощью анализа с L929, подобно тому,

- 29 039760 как описано выше для ФНОа человека, с использованием ФНОа яванского макака и макака-резуса, соответственно (см. также 2.1.2). ФНОа от обоих видов показали очень схожую способность индуцировать апоптоз L929 (данные не приведены). Таким образом, для исследования видовой перекрестной реактивности использовали одинаковые концентрации ФНОа человека и обезьян. Кроме того, определяли кинетику связывания (методом SPR) с ФНОа яванского макака и макака-резуса с использованием аналогичного анализа, как и для ФНОа человека (см. также 2.1.1).

Все scFv, полученные из клона 16-22-H05, демонстрировали перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака и макака-резуса (см. табл. 7). Аффинность была схожей, а именно 2,0x10’1° и 2,3x10’1° М для яванского макака и макака-резуса, соответственно. Аффинность к ФНОа человека и обезьян отличалась примерно в 5 раз. Способность нейтрализовать ФНОа яванского макака, макака-резуса и человека хорошо коррелировала с аффинностью к соответствующим ФНОа. Следовательно, два клона, полученных из 16-22-H05, показали в 5-7 раз более низкую активность в отношении ФНОа обезьян по сравнению с ФНОа человека (см. табл. 7 и фиг. 8). В целом, два scFv продемонстрировали видовую перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака и макака-резуса.

1.2.3.4. Блокирование взаимодействия ФНОа cTNFRI/II человека

Помимо анализа с L929, способность каждого гуманизированного scFv подавлять взаимодействие ФНОа человека с TNFRI/II оценивали с помощью ИФА (см. раздел 2.1.3). Аналогично анализу с L929, отдельные значения IC₅₀ в каждом планшете калибровали относительно IC₅₀ молекулы сравнения инфликсимаба, который также вносили в каждый планшет, и относительные значения IC₅₀ и IC₉₀ рассчитывали в единицах массы (нг/мл) инфликсимаба и scFv.

Анализ нейтрализации позволяет обнаружить отличия в активности целевых блокирующих антител только в том случае, если они связываются со своей мишенью с константой равновесия связывания (KD), которая превышает целевую концентрацию, используемую в анализе активности (KD > целевой концентрации). Для анализа с L929 использовали концентрацию ФНОа, составляющую 5 пМ, в то время как в ингибиторном ИФА с TNFRI/II использовали концентрацию ФНОа, составляющую 960 пМ. Таким образом, теоретически анализ с L929 позволяет различить активности scFv с KD>5 пМ, тогда как ингибиторный ИФА позволяет различить лишь активности scFv с KD>960 пМ. Поскольку для всех проанализированных scFv показаны KD ниже 960 пМ, активности scFv с различной аффинностью (но похожим механизмом действия) можно различить только в анализе с L929.

16-22-H5-sc02 и 16-22-05-sc04 продемонстрировали способность блокировать взаимодействие ФНОа с TNFRI, в 2,8-3,5 раза большую по сравнению с инфликсимабом, тогда как способность по сравнению с инфликсимабом в анализе с L929 была значительно выше (в 13,1 и 14,6 раза). При сравнении относительных значений IC₅₀ для исходного IgG кролика (см. табл. 2) с относительными значениями IC₅₀ для гуманизированных scFv (табл. 7) активности scFv в целом были несколько выше по сравнению с исходным IgG, хотя аффинность в целом находилась в том же диапазоне, что и для исходного IgG кролика. Поскольку активности антител и scFv сравнивали в единицах массы, количество валентностей (сайтов связывания ФНОа) для каждой концентрации было примерно в 2,9 раза выше для моновалентных scFv по сравнению с имеющим более чем в пять раз большую молекулярную массу, но бивалентным IgG. В случае scFv, связывающихся с очень высокой аффинностью, это приводит к более эффективному блокированию взаимодействия ФНОа и TNFRI/II, поскольку отсутствие авидности более не является определяющим для активности. Напротив, для низкоаффинных одновалентных доменов были опубликованы противоположные данные (Coppieters et al., Arthritis & Rheumatism, 2006; 54:1856-1866). По указанным выше причинам результаты ингибиторного ИФА не использовали для ранжирования активностей различных антител, но первоначально применяли для сравнения способности антител блокировать взаимодействие с TNFRI по сравнению с TNFRII. Исследованные scFv блокировали взаимодействие с обоими рецепторами ФНОа с сопоставимыми активностями (табл. 9, фиг. 9 и фиг. 10).

1.2.3.5. Специфичность в отношении мишени (селективность связывания с ФНОа по сравнению с ФНОв)

Специфичность двух scFv (16-22-H05-sc02 и 16-22-H05-sc04) к ФНОа по сравнению с ФНОв подтверждали путем оценки относительной способности ФНОв по сравнению с ФНОа обеспечивать половину максимального подавления связывания ФНОа с каждым scFv и определяли с помощью конкурентного ИФА (см. также раздел 2.1.4). Качество рекомбинантного ФНОв человека было оценено производителем белка 1) в отношении чистоты посредством электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН и анализа методом ВЭЖХ и 2) в отношении биологической активности в анализе цитотоксичности на клетках L929 мыши. Как показано на фиг. 11, взаимодействие каждого из scFv с биотинилированным ФНОа блокировалось немеченым ФНОа со значениями IC₅₀, находящимися в диапазоне от 60 до 260 нг/мл, тогда как ФНОв не показал какого-либо значимого эффекта даже в самой высокой исследованной концентрации ФНОв (1250 мкг/мл). Следовательно, все проанализированные scFv специфически связываются с ФНОа, но не с его ближайшим гомологом,ФНОв. ФНОв не показал какого-либо значимого подавления связы- 30 039760 вания ФНОа с scFv в исследованных концентрациях. Таким образом, концентрация ΦΗΟβ, необходимая для обеспечения половины максимального подавления связывания ФНОа, должна быть значительно выше, чем наибольшая концентрация ΦΗΟβ, использованная в анализе (1250 мкг/мл). При сравнении концентраций ФНОа и ΦΗΟβ, необходимых для обеспечения половины максимального подавления связывания ФНОа с scFv, селективность связывания с ФНОа по сравнению с ΦΗΟβ была значительно выше, чем приблизительно в 5000-20000 раз, для всех исследованных фрагментов (см. также табл. 7). Поэтому, связывание любого из scFv вне мишени представляется весьма маловероятным.

Результаты описанных выше экспериментов приведены в табл. 7-9.

Таблица 7. Способность связывания и активность гуманизированных scFv in vivo. CDR: трансплантат CDR. STR: структурный трансплантат. Анализ активности выполняли несколько раз в разные дни с различными партиями фрагментов антитела со следующими стандартными отклонениями: 16-22H05-sc02 (п-3): отн. 1С₅₀=13,1±1,8 и отн. IC₉₀-12,6±3,5: 16-22-H05-sc04 (п-2): отн. 1С₅₀=14,6±0,6 и отн. 1С₉₀=13,1±2,4._________________________________________________________________________________________

scF\

Дизайн

Аффинность к ФНОа человека

Аффинность к ФНОа яванского макака

Аффинность к ФНОа макака-резуса

Активность

Вид оспе цпфпчность 1С50 [нг мл]

Специфичность к мишени отн 1С;0 для ΦΗΟβ по сравнению с ФНОа

ka АГ1 s'1)

kd (s’1)

KD (M)

ka (MVl

kdA1)

ECD ГМ)

ка (MVi

ка^1)

KD (Μ)

ОТН IC50

ОТН КАо&

человек

яванский макак

макакрезус

16-22-НО5sc02

STR

9.6Е+05

4.3E-05

4.5E-11

4.9Е+О5

9.6Е-05

2.OE-1O

6.7Е+05

1.5Е-04

2.3Е-Ю

13,1

12,6

0,6

2,9

3,0

1(И и К)

16-22-НО5scO4

CDR ST R

6,SE+( )5

7ЛЕ-О5

1.1E-10

но

НО

14,6

13,1

0,5

3,5

2,9

1(м и Н)

• 1С50 _ИНф_{ликсима}б (Hr/Mn)/IC₅₀,_scFv (нг/мл) • 1С₉о„_инф_{ликсима}б (нг/мл)/1С₉₀,_8сРу (нг/мл)

Таблица 8. Описания гуманизированных scFv согласно данному изобретению

	Экспрессия	Производительность	Стабильность
	Выход продукта экспрессии	Выход продук1а рефолдипга	Тепловая денатурация	Потеря мономера при концентрации 10 г/л через 4 исд. при 4°С (-65. -20)	Поюря мономера после 5 циклов замораживапия/оттаивапия
	[г/л]	[мг/л]	l°cj	[Δ%]	LA%]
16-22-1105-sc02	0,26	29.8	71,3	0.2 (0.0, 0,0)	0.0
16-22-H05-sc04	0,26	24,1	72,6	0,4(0,2, 0,1)	0

Таблица 9. Способность scFv блокировать взаимодействие ФНОа с TNFR1 и ФНОа с TNFR2

	Блокирование взаимодействия ФНОасТХТЕ!	Блокирование взаимодейс1вия ФНОа с TNFRT1
scFv	отн. Ю50	ОТН. 1С90*	[НГ'МЛ]	ICW [нг/мл]	отн . ТС5()	отн. 1С90 йг	тс,,. [нг/мл]	тс9() [нг/мл]
16-22-H05-sc02	3,5	2.4	13.9	39.8	5,7		20.0	56.9
16-22-lI05-sc04	2,8	2.1	17,7	45.3	3,5	1.5	32,6	127

• 1С5о _инф_{ликсима}б (нг/мл)/IC5Q _SC|\ (нг/мл) • 1С₉0„_инф_{ликсима}б (нг/мл)/1С₉0 _8Ср_у (нг/мл)

2. Способы

2.1. Анализ характеристик лидера

2.1.1. Определение кинетики связывания и видовой перекрестной реактивности методом SPR

Аффинность связывания scFv с ФНОа человека определяли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора для SPR MASS-1 (Sierra Sensors). Эффективность исследования методом SPR была подтверждена с помощью анализа взаимодействия эталонного антитела с антигеном, такого как взаимодействие цертолизумаба с ФНОа. Пегилированный Fab-фрагмент цертолизумаб был выбран в качестве эталона вследствие его моновалентного способа связывания, аналогичного способу связывания scFv. При использовании тех же условий проведения анализа, что и для определения аффинности scFv, было определено значение аффинности цертолизумаба к ФНОа, составляющее 9,94x10'¹¹ М. Это значение хорошо согласуется с опубликованными значениями KD, составляющими 9,02±1,43х10'^п М (заявка на лицензирование биопрепарата (BLA) цертолизумаба; номер BLA: 125160; дата подачи: 30 апреля 2007 г.).

Для определения аффинности scFv ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01) иммобилизовали на сенсорном чипе (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors) путем конъюгации аминов до достижения уровня иммобилизации от 50 до 100 резонансных единиц (RU) (уровни иммобилизации, достигнутые в процессе проведения анализа SPR, составляли от 40 до 120 RU). На первой стадии проводили скрининг аффинности scFv с применением только одной концентрации scFv (90 нМ). На второй стадии, для наилучшей характеристики свойств scFv, определяли кинетические характеристики в цикле с однократной инъекцией (single injection cycle kinetics; SiCK), используя цикл с однократной инъекцией путем одновременного введения шести анализируемых образцов в различных концентрациях в каждый из восьми параллельных каналов системы MASS-1. Для скрининга аффинности гуманизированные scFv вводили в проточные ячейки в концентрации 90 нМ в течение 3 мин и контролировали процесс диссоциации в течение 12 мин. Для последующих более точных определений аффинности в проточные ячейки в течение 3 мин вводили двукратные серийные разведения scFv в диапазоне от 45 до 1,4 нМ и оставляли

-31 039760 на 12 мин для протекания диссоциации белка из комплекса с ФНОа, иммобилизованного на сенсорном чипе. Кажущиеся константы скорости диссоциации (kd) и ассоциации (k_a) и кажущуюся константу равновесия диссоциации (K_D) рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) с применением модели связывания Лэнгмюра один к одному, а качество аппроксимации контролировали на основании критерия Chi², который является мерой качества подбора кривой. Чем меньше значение Chi², тем более точной является аппроксимация к модели связывания Лэнгмюра один к одному. Для скрининга аффинности результаты признавали значимыми, если Chi² составлял менее 10 для анализируемой концентрации. В тех случаях, когда анализировали несколько концентраций scFv, результаты признавали значимыми, если среднее значение Chi² по всем исследованным концентрациям составляло менее 10. Критерии приемлемости были соблюдены для всех исследованных scFv.

Видовую перекрестную реактивность с ФНОа (Peprotech, номер по каталогу 315-01A) яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 90018-CNAE) и макака-резуса (R&D Systems, номер по каталогу 1070-RM-025/CF) определяли с применением тех же условий проведения анализа и тех же показателей качества, которые описаны выше для ФНОа человека. Для ФНОа яванского макака и макака-резуса были достигнуты уровни иммобилизации, находящиеся в диапазоне от 50 до 180 RU и от 90 до 250 RU, соответственно. ScFv анализировали с применением двукратных серийных разведений с концентрациями, составляющими от 45 до 1,4 нМ. Средние значения Chi² составляли менее 10 для всех исследованных scFv.

2.1.2. Индуцированный ФНОа апоптоз в фибробластах L929 (нейтрализация ФНОа человека и ФНОа приматов, не являющихся человеком, под действием scFv)

Способность scFv нейтрализовать биологическую активность рекомбинантного ФНОа человека оценивали с использованием фибробластов мыши L929 (ATCC/LGC Standards, номер по каталогу CCL-1). Клетки L929 сенсибилизировали к индуцированному ФНОа апоптозу путем добавления 1 мкг/мл актиномицина D. Трехкратные серийные разведения эталонного антитела к ФНОа или scFv (3000-0,05 нг/мл) и 5 пМ рекомбинантного ФНОа человека (Peprotech, номер по каталогу 300-01) предварительно инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Используемая концентрация ФНОа (5 пМ) индуцировала субмаксимальный апоптоз (EC₉₀) клеток L929. После добавления смесей агонистов/ингибиторов клетки инкубировали в течение 24 ч. Выживаемость клеток определяли посредством колориметрического анализа с применением реагента для детекции пролиферации клеток WST-8 (2-(2-метокси-4нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий, мононатриевая соль) (Sigma Aldrich, номер по каталогу 96992). WST-8 восстанавливается под действием дегидрогеназ клетки с образованием оранжевого продукта формазана. Количество образующегося формазана прямо пропорционально количеству живых клеток. Данные анализировали с применением четырехпараметрической логистической модели для подбора кривой, используя программное обеспечение для анализа данных Softmax (Molecular Devices), и рассчитывали концентрацию эталонного антитела или scFv, необходимую для нейтрализации индуцированного ФНОа апоптоза на 50 и 90% (IC₅₀ и IC₉₀) (см. также фиг. 7). Для обеспечения возможности непосредственного сравнения значений IC₅₀ и IC₉₀ между экспериментами, которые были проведены в разные дни или в разных планшетах для анализа, значения IC₅₀ и IC₉₀ калибровали относительно эталонного антитела, представляющего собой инфликсимаб. Для контроля точности ответа кривые зависимости ответа от дозы анализировали в двух повторностях. Стандартные отклонения и коэффициенты вариации (КВ) рассчитывали для каждой экспериментальной точки (КВ<20%).

Видовую перекрестную реактивность с ФНОа яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 90018-CNAE) и макака-резуса (R&D Systems, номер по каталогу 1070-RM-025/CF) определяли с применением тех же условий проведения анализа и тех же показателей качества, которые описаны выше для ФНОа человека. Как и в случае аналога из организма человека, для исследования видовой перекрестной реактивности использовали концентрации ФНОа, которые индуцировали субмаксимальный апоптоз (EC90) в клетках L929. ФНОа обоих видов демонстрировал способность индуцировать апоптоз в фибробластах мыши L929, очень сходную с аналогичной способностью ФНОа человека. Следовательно, для обоих исследуемых видов использовали ту же концентрацию ФНОа (5 пМ). При проведении анализа видовой перекрестной реактивности значения КВ для большинства повторных экспериментальных точек составляли менее 10%.

2.1.3. Ингибиторный ИФА ФНОа

Ингибирующее действие scFv на связывание с лигандами оценивали с применением ИФА, биохимического метода, воспроизводящего исключительно взаимодействие ФНОа с TNFRI и TNFRII.

В случае первого ингибиторного ИФА внеклеточный домен TNFRI, слитый с Fc-фрагментом IgG человека (R&D Systems, номер по каталогу 372-RI), наносили на 96-луночный планшет для ИФА Maxisorp в концентрации 0,5 мкг/мл. В случае второго ингибиторного ИФА внеклеточный домен TNFRII, слитый с Fc-фрагментом IgG человека (R&D Systems, номер по каталогу 726-R2), наносили в концентрации 2 мкг/мл. Все последующие этапы были идентичными для обоих анализов. Для детекции связывания

- 32 039760

ФНОа с TNFRI и TNFRII ФНОа биотинилировали перед применением. Биотинилированный ФНОа человека (960 пМ, 50 нг/мл) сначала инкубировали со взятыми в трехкратных серийных разведениях гуманизированными scFv к ФНОа и инфликсимабом (10000 нг/мл-0,2 нг/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Смеси ФНОа/фрагмент антитела переносили в планшеты, содержащие иммобилизованный рецептор ФНО, и детектировали связывание незаблокированного ФНОа с иммобилизованным рецептором ФНОа после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре с помощью биотинсвязывающего конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (стрептавидин-HRP) (SDT Reagents, номер по каталогу SP4OC). Добавление субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) приводило к получению считываемых колориметрически показаний, пропорциональных связыванию ФНОа с TNFRI и TNFRII. Перед применением в конкурентном ИФА биологическую активность биотинилированного ФНОа подтверждали в анализе с L929. EC₅₀ биотинилированного ФНОа была аналогична EC₅₀ немеченого ФНОа (данные не приведены). Аналогично описанному выше анализу L929 данные анализировали с применением четырехпараметрической логистической модели для подбора кривой, используя программное обеспечение для анализа данных Softmax (Molecular Devices), и рассчитывали концентрации scFv, необходимые для подавления взаимодействия ФНОа с TNFR на 50 и 90% (IC₅₀ и IC₉₀). Для обеспечения возможности непосредственного сравнения значений IC₅₀ и IC₉₀ между экспериментами, которые были проведены в разные дни или в разных планшетах для анализа, значения IC₅₀ и IC₉₀ калибровали относительно эталонного антитела, представляющего собой инфликсимаб.

Для контроля точности ответа кривые зависимости ответа от дозы анализировали в двух повторностях. Стандартные отклонения и КВ рассчитывали для каждой экспериментальной точки (КВ<25%).

2.1.4. Специфичность в отношении мишени

Для подтверждения специфичности scFv к ФНОа оценивали связывание с наиболее гомологичным членом семейства ФНОв. Способность немеченых ФНОв (Peprotech, номер по каталогу 300-01B) и ФНОа (Peprotech, номер по каталогу 300-01) подавлять взаимодействие биотинилированного ФНОа с scFv анализировали с помощью конкурентного ИФА. С этой целью scFv наносили на 96-луночный планшет для проведения ИФА Maxisorp в концентрации 1 мкг/мл. Связывание биотинилированного ФНОа (75 нг/мл) с нанесенными на планшет scFv в присутствии взятых в пятикратных серийных разведениях немеченого ФНОа (50 мкг/мл-0,00013 мкг/мл) или ФНОв (1250 мкг/мл-0,00013 мкг/мл) детектировали с применением биотинсвязывающего конъюгата стрептавидин-HRP (SDT Reagents, номер по каталогу SP40C), как описано выше. При построении кривой зависимости ответа от дозы для ФНОа данные анализировали с применением четырехпараметрической логистической модели для подбора кривой, используя программное обеспечение для анализа данных Softmax (Molecular Devices), и рассчитывали концентрацию немеченого ФНОа, необходимую для блокирования взаимодействия биотинилированного ФНОа с нанесенными на планшет scFv на 50% (IC₅₀). ФНОв не показал какого-либо значимого подавления взаимодействия биотинилированного ФНОа с scFv (см. также фиг. 11). Для количественного определения относительной способности ФНОв по сравнению с ФНОа подавлять связывание ФНОа с каждым scFv рассчитывали IC₅₀, характеризующую подавление взаимодействия под действием ФНОв относительно ФНОа. Поскольку при использовании ФНОв в концентрациях, приблизительно в 5000-20000 раз превышающих IC₅₀ для ФНОа, не наблюдали какого-либо значимого ингибирования, было определено, что селективность связывания с ФНОа превышает селективность связывания с ФНОв более чем в 5000-20000 раз. Для контроля точности ответа кривые зависимости ответа от дозы анализировали в двух повторностях. Стандартные отклонения и КВ рассчитывали для каждой экспериментальной точки (КВ<25% для всех, кроме одной из исследованных концентраций ФНОа/в). Все scFv удовлетворяли этому критерию.

2.2. Обработка и анализ данных по химические свойствам, процессу производства и контролю качества (chemistry, manufacturing and controls; CMC)

2.2.1. Восстанавливающий электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН) представляет собой метод анализа, применяемый для качественной характеристики и контроля чистоты белков. Согласно Фармакопее США (United States Pharmacopeia; USP) (Глава 1056 Фармакопеи США) аналитический гель-электрофорез является подходящим и рутинным способом идентификации и оценки гомогенности белков в лекарственных веществах.

Данный метод применяют для определения количества продукта scFv в лизатах E. coli для установления выхода продукта экспрессии после ферментации. Другим применением этого метода является проверка подлинности исследуемых веществ, основанная на определении их молекулярной массы относительно теоретических значений. Во вспомогательных целях этот метод применяют для количественной оценки чистоты исследуемых образцов с точки зрения наличия примесей, связанных с процессом получения (белков клетки-хозяина), и примесей, связанных с продуктом (продукты разложения или аддукты).

Исследования методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН проводили с помощью коммерчески доступной сборной системы для приготовления гелей Mini Protean, приобретенной у компании

- 33 039760

Bio-Rad Laboratories Inc. Гуманизированные scFv анализировали на разделяющих гелях типа Any kD (номер по каталогу 456-9036). В обоих случаях использовали буферную систему трис/глицин, рекомендованную производителем. Для детекции белковых зон применяли либо окрашивание Кумасси с применением раствора для окрашивания SimplyBlueTM (Life Technologies Corp., номер по каталогу LC6060), либо окрашивание серебром с применением набора Pierce Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., номер по каталогу 24612). При проведении процедур окрашивания следовали протоколам соответствующей компании-поставщика.

Документирование и анализ окрашенных белковых гелей проводили с применением системы для документирования ChemiDoc XRS System (Bio-Rad Laboratories Inc., номер по каталогу 170-8265) и программного обеспечения Image Lab, версия 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., номер по каталогу 170-9690).

Определение титра в образцах лизатов

Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН обеспечивает специфическую детекцию целевого белка в смеси белков клетки-хозяина. На каждый гель наносили серийные разведения стандартного образца в линейном диапазоне метода (который был определен заранее). Для расчета стандартной кривой, которую, в свою очередь, использовали для экстраполяции содержания scFv в образце, применяли линейную регрессию интенсивностей зон (измеренных посредством денситометрии) в зависимости от номинальных концентраций стандартного образца.

Образцы лизатов с неизвестными концентрациями продукта наносили в различных разведениях (по меньшей мере 1:10 в буфере для разведения) таким образом, чтобы по меньшей мере одна концентрация scFv находилась в линейном диапазоне метода. Количество продукта рассчитывали на основе измеренных интенсивностей зон scFv, и концентрацию определяли с использованием кратностей разведения препарата образца. Значения усредняли для всех образцов, которые находились в пределах линейного диапазона стандартной кривой.

В качестве дополнительной проверки пригодности данного метода для количественного определения в образцах лизатов проводили анализ подавления/усиления сигнала путем добавления в образец лизата известного количества стандартного образца. Расчет степени извлечения при разведении образца 1:10 в буфере для разведения приводил к значению 95,4%, которое находится на том же уровне точности, что и наблюдаемое значение для стандартного образца в буфере для разведения. Таким образом, не наблюдали какой-либо существенной интерференции с матриксом в клеточных лизатах и этот метод считали подходящим для количественного определения содержания scFv в клеточных лизатах.

Содержание и чистота белков

Для того чтобы показать пригодность метода для определения содержания и, следовательно, также чистоты исследуемых образцов, нижний предел обнаружения (НПО) для эталонного scFv определяли визуально (путем идентификации белковой зоны) при номинальной нагрузке 0,02 мкг, при этом оценка гистограммы интенсивности для соответствующей дорожки показывала, что отношение сигнал/шум при этой нагрузке составляло приблизительно 2. Кроме того, линейный диапазон для количественной оценки определяли путем денситометрического анализа основных зон.

Аппроксимация данных методом линейной регрессии приводила к коэффициенту смешанной корреляции (R²), составляющему 0,9998, что указывало на хорошее качество аппроксимации. В дополнение к общему качеству аппроксимации определяли относительную ошибку для каждой отдельной экспериментальной точки с целью подтверждения пригодности способа в выбранном диапазоне. Относительные ошибки составляли менее 10% для всех экспериментальных точек, что указывало на хорошую точность этого способа.

2.2.2. Поглощение УФ излучения при 280 нм

Метод измерения поглощения УФ излучения при 280 нм представляет собой анализ содержания общего белка, как описано в Главе 1057 Фармакопеи США. Растворы белков поглощают УФ излучение с длиной волны 280 нм благодаря наличию ароматических аминокислот. Поглощение УФ излучения зависит от содержания остатков тирозина и триптофана в белке и пропорционально концентрации белка. Поглощение раствора с неизвестным содержанием белка может быть определено, в соответствии с Главой 851 Фармакопеи США, посвященной спектроскопии, путем применения закона Бера: A = ε*l*c, где поглощение (A) равно произведению молярного коэффициента поглощения (ε), длины оптического пути и концентрации вещества. Молярный коэффициент поглощения для scFv рассчитывали с помощью программного обеспечения Vector NTI® (Life Technologies Corporation).

Измерение поглощения УФ излучения проводили с применением ридера Infinity M200 Pro, оснащенного планшетом Nanoquant (Tecan Group Ltd.). Поглощение образцов белка измеряли при 280 нм и 310 нм, при этом последняя длина волны служила базовым сигналом, который вычитали из сигнала на 280 нм. Для учета возможной интерференции с матриксом образцов для каждого измерения выполняли вычитание сигнала контрольной пробы. Полученный итоговый сигнал поглощения образца белка использовали для расчета концентрации белка с применением закона Ламберта-Бера.

Все измерения проводили в пределах диапазона, указанного в спецификациях к приборам, в диапазоне измерения 0-4 единицы ОП, для которого производитель указывает воспроизводимость <1% и еди- 34 039760 нообразие измерений <3%.

2.2.3. Эксклюзионная ВЭЖХ (эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография)

Эксклюзионная ВЭЖХ представляет собой метод разделения, основанный на применении твердой неподвижной фазы и жидкой подвижной фазы, как указано в главе 621 Фармакопеи США. Этот метод обеспечивает разделение молекул на основе их размера и формы за счет применения гидрофобной неподвижной фазы и водной подвижной фазы. Разделение молекул происходит между мертвым объемом (V₀) и полным объемом растворителя (V_T) конкретной колонки. Определение посредством эксклюзионной ВЭЖХ проводили в системе для ВЭЖХ Chromaster (Hitachi High-Technologies Corporation), оснащенной устройством для автоматического ввода образцов и УФ-детектором, настроенным на длину волны детектирования 280 нм. Управление оборудованием осуществляли с помощью программного обеспечения EZChrom Elite (Agilent Technologies, версия 3.3.2 SP2), которое также поддерживает функцию анализа полученных хроматограмм. Образцы белка доводили до прозрачного состояния путем центрифугирования и хранили при температуре 6°C в автодозаторе до введения. Для анализа образцов ScFv использовали колонку Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc, номер по каталогу F6989201) со стандартным солевым буфером в качестве подвижной фазы (50 мМ ацетат натрия pH 6,0, 250 мМ хлорид натрия) при рекомендуемой скорости потока 0,35 мл/мин. Количество целевого образца на каждое введение пробы составляло 5 мкг. Детекцию образцов осуществляли с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм и данные регистрировали с применением подходящего пакета программного обеспечения. Полученные хроматограммы анализировали в диапазоне от V₀ до V_T, исключая таким образом пики, связанные с матриксом, со значением времени элюирования >10 мин.

С целью обеспечения внутрилабораторной воспроизводимости метода регулярно проводили измерения для стандартного образца в начале и в конце каждого процесса ВЭЖХ. Стандартный образец, используемый для проверки пригодности этой системы, представлял собой ScFv, который был получен в виде одной порции и разделен на аликвоты, используемые для измерения в каждой временной точке.

2.2.4. ДСФ (дифференциальная сканирующая флуориметрия)

Метод ДСФ представляет собой нефармакопейный способ измерения зависимой от температуры денатурации белка. Измерение температуры тепловой денатурации методом ДСФ проводили с помощью аппарата для количественной ПЦР MX3005P (Agilent Technologies), управляемого пакетом программного обеспечения MX Pro (Agilent Technologies) и оснащенного фильтром возбуждения/эмиссии, установленным на 492/610 нм. Реакции проводили в белых планшетах для ПЦР Thermo fast 96 (Abgene, номер по каталогу AB-0600/W). Для детекции денатурации белка использовали коммерчески доступный стоковый раствор красителя SYPRO orange (Molecular Probes; номер по каталогу S6650) в конечном разведении 1:1000. Образцы белка разводили для измерений денатурации до конечной концентрации 50 мкг/мл в стандартном буферном солевом растворе. Тепловую денатурацию осуществляли с помощью запрограммированного изменения температуры, начинающегося с 25°C и доводимого до 96°C с шагом 1°C с продолжительностью 30 с. В процессе запрограммированного изменения температуры регистрировали эмиссию флуоресценции каждого образца. Зарегистрированные необработанные данные обрабатывали и оценивали с применением пакета шаблонов Microsoft Excel (Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2 No.9), и данные по флуоресценции аппроксимировали с помощью уравнения Больцмана с применением программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) для получения средней точки температурного перехода (Tm).

Для обеспечения надежных и устойчивых к ошибкам измерений средней точки денатурации измерения выполняли по меньшей мере в двух повторностях. Что касается качества данных, то учитывали лишь измерения с качеством аппроксимации (R²)>0,9900 и 95% доверительным интервалом для T_m менее 0,5%.

Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости в каждое измерение включали стандартный образец (известный охарактеризованный scFv), что обеспечивало возможность сравнения результатов выполнения анализа в разные дни.

2.2.5. Исследование стабильности

Для оценки стабильности различных конструкций scFv в качестве регистрируемого показателя пригодности этих молекул для дальнейших разработок был создан протокол краткосрочного исследования стабильности. Конструкции белков концентрировали в простом буферном солевом составе (см. выше) до целевых концентраций, составляющих 1 и 10 мг/мл. Содержание мономера определяли посредством эксклюзионной ВЭЖХ для подтверждения того, что чистота превышает требуемый критерий, составляющий >95%. Далее образцы белка хранили при температуре <-65, -20,4 и 37°C в течение 4 недель и аликвоты анализировали в различные моменты времени. Первичный регистрируемый показатель представлял собой анализ методом эксклюзионной ВЭЖХ, который обеспечивал количественное определение растворимых олигомеров и агрегатов с более высокой молекулярной массой. В качестве вспомогательных измерений определяли содержание белка по поглощению УФ-излучения при 280 нм, которое позволяло судить о том, происходила ли в течение периода хранения потеря существенных количеств белка за счет осаждения. Для хранения использовали пробирки с завинчивающейся крышкой (Sarstedt, номер по каталогу 72.692.005), которые заполняли количествами 30-1500 мкг на каждую аликвоту. Кроме того, опре- 35 039760 деляли чистоту посредством электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН, который свидетельствовал о стабильности конструкции в отношении деградации или ковалентной мультимеризации.

Пример 3. Получение гуманизированного диатела и IgG

Конструкция одноцепочечного диатела была разработана путем расположения вариабельных доменов в конфигурации VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA. В этих конструкциях домены VLA и VHA и VLB и VHB совместно образуют сайт связывания для ФНОа. Пептидные линкеры L1-L3, соединяющие вариабельные домены, были сконструированы из повторов глицин/серин. Два коротких линкера L1 и L3 состоят из единственного повтора G4S, тогда как длинный линкер L2 состоит из последовательности (G₄S)₄- Нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированные вариабельные домены (пример 2; раздел 1.2.1.), были синтезированы de novo и клонированы в адаптированный вектор для экспрессии в E. coli, полученный на основе последовательности плазмиды pET26b(+) (Novagen). Экспрессию и очистку осуществляли, как описано для scFv в примере 2; разделе 1.2.1.

Гуманизированный IgG был сконструирован путем клонирования вариабельных доменов в подходящий вектор для экспрессии в клетках млекопитающих для транзиторной гетерологичной экспрессии, содержащий лидерную последовательность и соответствующие константные домены, например векторы pFUSE-rIgG (Invivogen). Транзиторную экспрессию функционального IgG осуществляли путем совместной трансфекции векторов, кодирующих тяжелую и легкую цепи, в клетки CHO S с применением системы FreeStyle™ MAX. После культивирования в течение нескольких дней собирали для очистки супернатант от клеток, секретирующих антитела. Далее секретированные IgG подвергали аффинной очистке на сорбенте белок A-сефароза (GE Healthcare). Элюированные фракции анализировали посредством электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН, измерения поглощения УФ-излучения при 280 нм и эксклюзионной вэжх.

Аффинности молекул антитела определяли с использованием прибора Biacore, как описано в примере 2 в разделе 2.1.1).

Таблица 10

	MM-V)	kd (с-1)	KD(M)
IgG	1,90 x 10б	7,92 x ΙΟ’5	4,17 χ 1011
scDb	9,40 x 105	2,02 χ ΙΟ’5	2,15 χ 10’11
scFv	8,93 x 105	3,38 χ ΙΟ’5	3,79 χ 10’11

Активности молекул антител определяли в анализе L929 (способ описан в примере 2 в разделе 2.1.2).

Таблица 11

	Активность IC50 (нМ)
IgG	0,02
scDb	0,01
scFv	0,03

Пример 4. Определение стехиометрии связывания ФНОа.

Стехиометрию связывания 16-22-H5 с ФНОа определяли с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. 16-22H5-scFv и ФНОа инкубировали в двух разных молярных отношениях, а именно в молярном отношении 1:1 и 4,5:1. Поскольку ФНОа существует в растворе в виде тримера, указанные молярные отношения относятся к ФНОа_тример. Таким образом, в отношении 4,5:1 16-22-H5-scFv находится в избытке и должен занимать все точки связывания ФНОатример, в результате чего образуются комплексы 1 ФНОа_тример с 3 scFv. Однако в условиях эквимолярного отношения имеющегося scFv не достаточно для насыщения всех трех теоретических сайтов связывания ФНОа. Поэтому также были ожидаемыми варианты комплекса с менее чем 3 связанными scFv. ФНОа и 16-22-H5-scFv инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре для обеспечения образования комплекса. Затем образцы центрифугировали при 4°C в течение 10 мин. 10 мкл каждого образца анализировали посредством эксклюзионной ВЭЖХ. Анализ с помощью эксклюзионной ВЭЖХ проводили с 50 мМ фосфатным буфером pH 6,5, 300 мМ NaCl в качестве элюента при скорости потока 0,35 мл/мин. Элюированные пики белка детектировали на длине волны 280 нм. Колонку заранее калибровали с применением калибровочного набора для гель-фильтрации от компании GE Healthcare (низкомолекулярные стандарты, высокомолекулярные стандарты) для определения кажущихся молекулярных масс.

На нижней панели фиг. 12 показан профиль элюции для эквимолярных количеств scFv и ФНОа, который перекрывался с профилями ФНОатример и scFv, взятых по отдельности. Вследствие тримеризации ФНОа в растворе теоретически существует до трех эквивалентных сайтов связывания для scFv, присутствующих в каждом тримере, и, следовательно, молекулы scFv являются лимитирующими. В этих условиях были идентифицированы все три вида комплекса (3:1, 2:1, 1:1). На верхней панели фиг. 12 показан профиль элюции комплекса с избыточными количествами scFv. Избыток несвязанного scFv элюировался с ожидаемым значением времени удерживания. Пик ФНОа количественно расходовался на образование комплексов и полностью исчезал. Пик этого комплекса смещался в сторону более низких значений времени удерживания и хорошо коррелировал со временем удерживания пика с наибольшей молекулярной

- 36 039760 массой, полученного в условиях эквимолярного отношения. По этой причине было сделано заключение, что все доступные сайты связывания на молекуле ФНОа были заняты scFv, и, следовательно, стехиометрия связывания составляет 3:1 (scFv:ФНОα), если scFv доступен в избытке.

В дополнение к этим качественным наблюдениям кажущуюся стехиометрию связывания также рассчитывали на основе кажущейся молекулярной массы комплекса 16-22-H5-scFv:ФНОα, определенной посредством эксклюзионной ВЭЖХ. На основании времени удерживания было рассчитано, что кажущаяся молекулярная масса составляла 139,7 кДа. Согласно приведенному ниже уравнению (1) было рассчитано, что кажущаяся стехиометрия связывания составляла 3,3. Это хорошо коррелирует с теоретическим числом трех эквивалентных сайтов связывания, доступных для scFv на молекуле ФНОатр_имер, и приведенными выше наблюдениями, согласно которым была определена стехиометрия связывания 3:1.

Уравнение (1):

стехиометрия связывания (scFv:ФНОα) = (молекулярная масса (комплекс, каж.)-молекулярная масса (ФНОа, теор.))/молекулярная масса (scFv, теор.) молекулярная масса (комплекс, каж.): 139,7 кДа молекулярная масса (ФНОа, теор.): 52,2 кДа молекулярная масса (scFv, теор.): 26,5 кДа.

Пример 5. Образование комплексов ФНОа:антитело (перекрестное связывание ФНОа).

Способность 16-22-H5-scDb связываться одновременно с двумя молекулами ФНОа исследовали на приборе Biacore T200 в буфере HEPES, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl и 0,05% Твин. Биотинилированный ФНОа (Acro Biosystems) захватывали с помощью биотинилированного олигонуклеотида на основе одноцепочечной ДНК с применением набора Biotin CAPture (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. 0,25 мкг/мл биотинилированного ФНОа вводили со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 3 мин для достижения уровня захвата, составляющего приблизительно от 200 до 300 RU (резонансных единиц). Антитела 16-22-H5-scDb и 16-22-H5-scFv в качестве контроля вводили сверху поверхности, содержащей иммобилизованный ФНОа, в течение 2 мин при скорости потока 30 мкл/мин в концентрации 90 нМ. После ассоциации фрагментов антитела вводили ФНОа (Peprotech) в течение 5 мин при скорости потока 30 мкл/мин в концентрации 90 нМ. Концентрации антител и ФНОа были выбраны близко к насыщению связывания. Измерение проводили при 25°C. На фиг. 13 показано, что двухвалентный 16-22-H5-scDb был способен связывать две молекулы ФНОа одновременно, тогда как моновалентный 16-22-H5-scFv, как и ожидалось, связывался только с одной молекулой ФНОа.

Дополнительно образование комплексов ФНОа-антитела оценивали при различных отношениях ФНОа и форм антител 16-22-H5 с применением эксклюзионной ВЭЖХ. 16-22-H5-IgG (150 кДа) и 16-22H5-scDb (52 кДа) инкубировали с ФНОа (52 кДа) в разных молярных отношениях (1:3, 1:1, 3:1) относительно количества сайтов связывания. Таким образом, IgG и scDb содержат 2, а ФНОа содержит 3 сайта связывания. Смеси антитело-ФНОа инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при 37°C, охлаждали в течение 10 мин при комнатной температуре и хранили в течение ночи при 2-8°C. От 5 до 10 мкл смеси белков с концентрацией приблизительно 1 мг/мл вводили в колонку TOSHO TSKgel UP-SW3000. Анализ проводили с 150 мМ фосфатным буфером pH 6,8, 100 мМ NaCl в качестве элюента при скорости потока 0,3 мл/мин. Элюированные пики белков детектировали на длине волны 214 нм. Колонку заранее калибровали с использованием стандартной смеси белков BEH450 SEC (Waters) для определения приблизительной молекулярной массы комплексов. На фиг. 14A показано образование комплексов 16-22H5-IgG: ФНОа. Комплексы с молекулярной массой >600 кДа указывают на образование комплексов, состоящих из >2 молекул ФНОа и >3 молекул IgG. Ha фиг. 14B показано образование комплексов 16-22H5-scDb:ФНОα. Комплексы с молекулярной массой >300 кДа указывают на образование комплексов, состоящих из >2 молекул ФНОа и >3 молекул scDb.

Пример 6. Ингибирование пролиферации клеток.

Способность различных форм антител 16-22-H5 и адалимумаба ингибировать пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) исследовали в реакции смешанных лимфоцитов (РСЛ). МКПК от 2 здоровых доноров культивировали (RPMI1640) в отношении 1:1 в 96-луночных планшетах в течение 48 ч при 37°C/5% CO₂. После активации клетки обрабатывали антителами к ФНОа или контрольным антителом IgG (все в конечной концентрации 10 мкг/мл) в шести повторностях в течение еще 5 дней при 37°C/5% CO₂. За 24 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли бромдезоксиуридин (BrdU) (20 мкл/лунка) и определяли пролиферацию путем определения включения BrdU с применением коммерчески доступного ИФА для детекции пролиферации клеток (Roche Diagnostics). Индекс стимуляции определяли путем расчета отношения включения BrdU между клетками, обработанными антителами, и клетками, обработанными митомицином C (25 нг/мл). Табл. 12 и фиг. 15 иллюстрируют, что все исследованные формы антител 16-22-H5 значительно ингибировали пролиферацию T-клеток в степени, сравнимой с адалимумабом.

- 37 039760

Таблица 12

	концентрация	Индекс стимуляции
	(мкг/мл)	среднее	СО
Контрольный IgG	10	5,2	0,5
Адалимумаб	10	2,6**	0,6
16-22-H5-IgG	10	2,5**	0,6
16-22-H5-scDb	10	4,1*	0,7
16-22-H5-scFv	10	4,0**	0,6

*p<0,05; **p < 0,01

Пример 7. Ингибирование индуцированной ЛПС секреции цитокинов.

Моноциты CD14+ в RPMI1640 высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 16 ч при 37°C/5% CO₂ в инкубаторе с увлажнением. Затем клетки обрабатывали антителами к ФНОа или контрольным антителом IgG в двух повторностях в течение 1 ч с применением конечных концентраций антител, находящихся в диапазоне от 2 до 2000 нг/мл. Моноциты промывали три раза средой для культивирования клеток и затем инкубировали с ЛПС (100 нг/мл) в течение 4 ч при 37°C/5% CO₂. Концентрации ИЛ-1в и ФНОа в супернатантах культуры клеток определяли с применением коммерчески доступных наборов для ИФА (R&D Systems). Результаты представлены в табл. 13 и 14 и на фиг. 16A и B. IC₅₀ определяли с использованием четырехпараметрической логистической модели для подбора кривой. Что касается секреции ΗΠ-1β, значения IC₅₀ для 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv и адалимумаба приведены в табл. 13 ниже.

Таблица 13. Секреция ИЛ-1в

	ICso (пг/мл)	ICso (нМ )
Адалимумаб	121,3	0,81
16-22-H5-IgG	81,55	0,54
16-22-H5-scDb	30,51	0,59
16-22-H5-scFv	16,98	0,65

Что касается секреции ФНОа, значения IC₅₀, определенные для 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 1622-H5-scFv, приведены в табл. 14.

Таблица 14. Секреция ФНОа

	ICso (пг/мл)	ICso (нМ )
Адалимумаб	174,0	1,16
16-22-H5-IgG	120,5	0,80
16-22-H5-scDb	17,18	0,33
16-22-H5-scFv	13,48	0,52

Таблица 15. Консенсусные последовательности VkI (перестроенные)

	Положения по Кабату:	SEQ ID №:	Последовательность
Каркасный участок I	1-23	56	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Каркасный участок II	35-49	57	WYQQKPGKAPKLLIY
Каркасный участок III	57-88	58	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

Таблица 16. Последовательности, основанные на последовательностях Vλ, зародышевой линии каркасного участка IV

SEQ ID №:	Последовательность
59	FGTGTKVTVL
60	FGGGTKLTVL
61	FGGGTQLIIL
62	FGSGTKVTVL

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело или его функциональный фрагмент, способные связываться с фактором некроза опухоли альфа (ФНОа) человека, причем указанное антитело или функциональный фрагмент содержит (i) домен VL, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, и (ii) домен V_H, содержащий участок CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, участок CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представ-

   - 38 039760 ленную в SEQ ID NO: 11, и участок CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.
2. 2. Антитело или его функциональный фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или функциональный фрагмент (i) связывается с ФНОа человека с константой диссоциации (K_D) менее 125 пМ;

   (ii) обладает перекрестной реактивностью с ФНОа Macaca mulatta (макака-резуса) и ФНОа Macaca fascicularis (яванского макака);

   (iii) обладает более высокой способностью подавлять индуцированный ФНОа апоптоз по сравнению с инфликсимабом при определении с помощью анализа с L929;

   (iv) содержит вариабельный домен, имеющий температуру плавления, определенную с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии, составляющую по меньшей мере 70°C, и/или (v) способно(ен) связываться с ФНОатр_имер человека в стехиометрическом отношении (антитело : ФНОатммер), составляющем по меньшей мере 2.
3. 3. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что связываются с ФНОа человека с K_D менее 50 пМ.
4. 4. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что указанное антитело или функциональный фрагмент содержит домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.
5. 5. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что указанное антитело или функциональный фрагмент содержит домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 54.
6. 6. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что функциональный фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
7. 7. Антитело или его функциональный фрагмент по п.6, отличающиеся тем, что указанный scFv имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 55.
8. 8. Антитело его функциональный фрагмент по любому из пп.1-5, отличающиеся тем, что представляют собой иммуноглобулин G (IgG).
9. 9. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что сумма (i) количества аминокислот в каркасных участках I-III вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента, которые отличаются от соответствующих консенсусных последовательностей Vk1 человека с SEQ ID NOs: 56-58, и (ii) количества аминокислот в каркасном участке IV вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента, которые отличаются от наиболее схожей последовательности, основанной на последовательности λ зародышевой линии человека, выбранной из SEQ ID NOs: 59-62, составляет менее 7, предпочтительно менее 4.
10. 10. Антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что указанные каркасные участки I-III вариабельного домена легкой цепи указанного антитела или функционального фрагмента состоят из консенсусных последовательностей Vk1 человека с SEQ ID NOs: 56-58, соответственно, а каркасный участок IV состоит из последовательности, основанной на последовательности λ зародышевой линии человека, выбранной из SEQ ID NOs: 59-62.
11. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его функциональный фрагмент по любому из предшествующих пунктов.
12. 12. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.11.
13. 13. Экспрессирующий вектор по п.12, где эккспрессирующий вектор является плазмидой.
14. 14. Клетка для получения антитела или его функциональнного фрагмента, определенных в любом из пп.1-10, где клетка содержит нуклеиновую кислоту по п.11 или экспрессирующий вектор по пп.12-13.
15. 15. Способ получения антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-10, включающий культивирование клетки по п.14 в среде при условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело или функциональный фрагмент, и выделения антитела или функционального фрагмента из указанных клеток или среды.
16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его функциональный фрагмент по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.
17. 17. Применение антитела или его функционального фрагмента по любому из пп.1-10 для лечения воспалительного расстройства или связанного с ФНОа расстройства.
18. 18. Применение по п.17, причем указанное воспалительное расстройство представляет собой воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта.
19. 19. Применение по п.18, причем указанное воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой воспалительное заболевание кишечника.
20. 20. Применение по п.18 или 19, причем указанное воспалительное расстройство желудочнокишечного тракта представляет собой болезнь Крона или язвенный колит.