ES3043897T3 - Anti-tnfalpha-antibodies and functional fragments thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas, capaces de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), a procedimientos para su producción y a sus usos terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Anticuerpos anti-TNF alfa y fragmentos funcionales de los mismos

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos y a fragmentos funcionales de los mismos, capaces de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNF*), a los procedimientos para su producción y a sus usos terapéuticos.

[0008] Antecedentes

[0010] El TNF* es una citocina proinflamatoria homotrimérica que es liberada e interactúa con las células del sistema inmunológico. También se ha demostrado que el TNF* está regulado por aumento en varias enfermedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas, tales como artritis reumatoide, Enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y esclerosis múltiple.

[0012] Se han propuesto anticuerpos contra el TNF* para la profilaxis y el tratamiento del choque endotóxico (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) y Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) analizan el potencial terapéutico de los anticuerpos anti-TNF* en el tratamiento del choque séptico. El uso de anticuerpos anti-TNF* en el tratamiento del choque séptico también se trata en Kirschenbaum et al., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). La artritis inducida por colágeno se puede tratar eficazmente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TNF* (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

[0013] El uso de anticuerpos anti-TNF* en el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn se analiza en Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) y en Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos contra Tn F* utilizados previamente en tales tratamientos son generalmente anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. n.° 5.919.452.

[0015] Se han descrito en la técnica anterior anticuerpos monoclonales contra TNF*. Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) describen anticuerpos monoclonales murinos contra TNF* recombinante. Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNF* recombinante en la definición de epítopos neutralizantes en TNF*. Además, en la solicitud de patente internacional WO 92/11383, se divulgan anticuerpos recombinantes, incluyendo anticuerpos injertados con CDR, específicos para TNF*. Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) describen el uso de tales anticuerpos injertados con CDR en el tratamiento de la artritis reumatoide. La patente estadounidense n.° 5.919.452 divulga anticuerpos quiméricos anti-TNF* y su uso en el tratamiento de patologías asociadas con la presencia de TNF*. Otros anticuerpos anti-TNF* más se divulgan en Stephens et al. (Immunology, 85, 668-674, 1995), los documentos GB-A-2 246 570, GB-A-2 297 145, US 8.673.310, los documentos US 2014/0193400, EP 2 390 267 B1, US 8.293.235, US 8.697.074, WO 2009/155723 A2 y WO 2006/131013 A2.

[0017] Las moléculas de anticuerpos anti-TNF* recombinantes de la técnica anterior generalmente tienen una afinidad reducida por el TNF* en comparación con los anticuerpos de los que derivan las regiones hipervariables o las CDR. Todos los inhibidores de TNF* comercializados actualmente se administran por vía intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o más largos como inyecciones en bolo, que dan como resultado altas concentraciones iniciales que están disminuyendo constantemente hasta la próxima inyección.

[0019] Los bioterapéuticos anti-TNF* actualmente aprobados incluyen (i) infliximab, un anticuerpo monoclonal antihumano IgG quimérico (Remicade®; Wiekowski M et al: "Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 01/01/2007, p.885-904); (ii) etanercept, una proteína de fusión dimérica TNFR2, con un Fc de IgG1 (Enbrel®); (iii) adalimumab, un anticuerpo monoclonal (mAb) totalmente humano (Humira®; Kupper H et al: "Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, W<i>LEY-VCH; Weinheim, 01/01/2007, p.697-732); (iv) certolizumab, un fragmento Fab PEGilado (Cimzia®; Melmed G Y et al: "Certolizumab pegol", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, Reino Unido, Vol. 7, n.° 8, 01/08/2008, p.641-642); (v) Golimumab, un anticuerpo monoclonal IgGIK humano (Simponi®; Mazumdar S et al: "Golimumab", mAbs, Landes Bioscience, US, Vol. 1, n.° 5, 01/09/2009, p.422-431). Sin embargo, se están desarrollando varios biosimilares y ya se ha aprobado en Europa un imitador del infliximab conocido como Remsima.

[0021] Infliximab tiene una afinidad relativamente baja por TNF* (K<d>> 0,2 nM; Weir et al., 2006, Therapy 3:535) y una potencia de neutralización limitada en un ensayo L929. Además, infliximab no muestra reactividad cruzada importante alguna con el TNF* de macacos cangrejeros o Rhesus. Para anticuerpos anti-TNF*, sin embargo, la reactividad cruzada con TNF* de monos es muy deseable, ya que esto permite pruebas en animales con primates, que reflejan la situación en seres humanos en muchos aspectos.

[0023] Etanercept, aunque una molécula bivalente, se une al TNF* en una proporción de un trímero por una molécula de etanercept, impidiendo la formación de grandes complejos antígeno-bioterapéuticos (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis, 8: 601). No inhibe la secreción de citocinas inducida por LPS en monocitos (Kirchner et al., 2004, Cytokine, 28: 67).

[0024] La potencia del adalimumab es similar a la del infliximab. Otra desventaja del adalimumab es su escasa estabilidad, por ejemplo, según se determina en una prueba de desplegamiento térmico. Se determinó que la temperatura de fusión (Tf) del adalimumab en tal prueba era de 67,5 °C. Cuanto menor sea el valor de Tf de un anticuerpo, sin embargo, menor es su estabilidad general. Una Tf más baja hace que los anticuerpos sean menos adecuados para uso farmacéutico, por ejemplo para administración oral.

[0026] La potencia del certolizumab es ligeramente mayor que la del infliximab, pero aún no satisfactoria. Certolizumab no inhibe la proliferación de linfocitos T en un MLR (Vos et al., 2011, Gastroenterology, 140: 221).

[0028] El documento EP2623515 A1 divulga anticuerpos anti-TNF* humanizados y fragmentos de unión a antígeno (Fab) de los mismos. Como se desprende de los ejemplos divulgados, la potencia de los fragmentos Fab humanizados resultantes es comparable a la del infliximab en un ensayo de neutralización de L929 (véanse las Tablas 2 y 5). El único anticuerpo IgG anti-TNF* sometido a pruebas de reactividad cruzada se une sólo débilmente al TNF-* de Rhesus (véase [0069]; Figura 3). No se comprobó la reactividad cruzada con el TNF* de macaco cangrejero. Además, existe una unión débil al TNF* humano (véase la Figura 3). Por tanto, el documento EP2623515 A1 no divulga anticuerpos anti-TNF* ni fragmentos funcionales de los mismos, que tienen una potencia de inhibición de la apoptosis inducida por TNF* en células L929 superior a la del infliximab y que tienen reactividad cruzada con el TNF* de Rhesus y el TNF* de macacos cangrejeros.

[0030] El documento WO 2012/007880 A2 desvela una molécula de unión a antígeno de dominio único modificada (SDAB) en forma de proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno únicos que se unen a una o más dianas (por ejemplo, TNF*), un enlazador y uno o más moléculas poliméricas. El único ejemplo específico dado se denomina SDAB-01 e incluye dos dominios de unión a antígeno, que se unen al TNF*, conectados con un enlazador flexible y una cisteína en el extremo C-terminal que soporta la PEGilación específica del sitio (véase la Figura 3). El documento WO 2012/007880 A2 no compara la potencia de SDAB-01 con la de anticuerpos contra TNF* conocidos, como infliximab, en un ensayo de neutralización basado en células L929, ni evalúa otros parámetros específicos de SDAB-01, como la eficacia para bloquear la interacción TNF* -TNFRI/II y la selectividad para unirse a t Nf * frente a TNF*. En un ensayo en el que se comparan el tratamiento con SDAB-01 e infliximab en un modelo de ratón transgénico para la poliartritis que sobreexpresa TNF* humano (véase la página 54, ejemplo 8), ambos parecen tener una eficacia similar en la prevención del desarrollo ulterior de la artritis (por ejemplo, Figuras 17 y 18). Sin embargo, la dosis indicada en este ejemplo es engañosa, ya que el peso molecular de SDAB-01 es inferior a la mitad del de infliximab. Por lo tanto, el documento WO 2012/007880 A2 no divulga anticuerpos anti-TNF* que tienen una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929 superior a la del infliximab.

[0032] El documento WO 2015/144852 A1 investiga las propiedades de un scFv anti-TNF* denominado "scFv1". Este scFv mostró una capacidad de neutralización de TNF* en un ensayo de células PK-15 que era comparable a la del infliximab (véase [0236]). Además, el scFv parece tener cierta reactividad cruzada con el TNF-* del macaco rhesus y del macaco cangrejero (véase el Ejemplo 8). En el documento WO 2015/144852 A1 no se facilitan datos de afinidad. Sin embargo, el fragmento de anticuerpo monocatenario DLX105 (también conocido como ESBA 105), del que se conoce que tiene sólo una afinidad moderada (K<d>=157 pM; véase Urech et al. 2010 Ann Rheum Dis 69: 443), muestra una mejor unión al TNF-* que el scFv1 (véase la Figura 1 del documento WO 2015/144852 A1). Por tanto, el documento WO 2015/144852 A1 no divulga anticuerpos anti-TNF-* que tienen alta afinidad por el t Nf* humano (K<d>< 125 pM).

[0033] El documento WO 2015/065987 A1 describe anticuerpos anti-TNF-*, anticuerpos anti-IL-6 y anticuerpos biespecíficos que se unen a ambos antígenos. Ciertos anticuerpos anti-TNF* mostraron cierta reactividad cruzada con el TNF* de macaco cangrejero (Figura 17). Los anticuerpos anti-TNF*, sin embargo, presentaron una potencia significativamente menor que infliximab en un ensayo de neutralización de L929 ([0152]; Figura 5). Por tanto, el documento WO 2015/065987 A1 no divulga anticuerpos anti-TNF* que tienen una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929 superior a la del infliximab.

[0035] Drugs in R&D, Vol. 4 N.°3, 2003, páginas 174-178 describe el anticuerpo humanizado "Humicade" (CDP 571; BAY 103356), un anticuerpo monoclonal anti-TNF* con alta afinidad. La potencia de Humicade para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929, sin embargo, parece limitada (véase, por ejemplo, el documento US 2003/0199679 A1 en [0189]). Por tanto, la referencia no divulga anticuerpos anti-TNF* que tienen una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929 superior a la del infliximab.

[0037] Saldanha J W et al: "Molecular Engineering I: Humanization", Handbook of Therapeutic Antibodies, Capítulo 6, 01-01­ 2007, WILEY-VCH, Weinheim, pág. 119-144 divulga diversas estrategias para la humanización de anticuerpos monoclonales, incluidos injerto de CDR, recubrimiento o revestimiento superficial, tecnología de transferencia de SDR y desinmunización.

[0039] Existe la necesidad de moléculas de anticuerpos mejoradas para tratar enfermedades inflamatorias crónicas tales como trastornos inflamatorios del intestino. Las moléculas de anticuerpo deben tener al menos (i) una alta afinidad por el TNF* humano (es decir, una K<d><125 pM), (ii) una alta potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929, (iii) una alta potencia para inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS, (iv) afinidad sustancial por el TNF* de Cynomolgus y Rhesus (por ejemplo, una K<d>< 1 nM) y (v) una temperatura de fusión alta del dominio variable determinada en un experimento de desplegamiento térmico (por ejemplo, una Tf > 70 °C).

[0041] Sumario de la invención

[0043] Los inventores de la presente solicitud encontraron que ciertos anticuerpos anti-TNF* y fragmentos funcionales de los mismos exhiben una combinación de propiedades favorables, incluyendo alta afinidad por el TNF* humano (K<d><125 pM), una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* en células L929 mayor que la del infliximab, una potencia para inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS mayor que la de adalimumab y una afinidad sustancial (K<d><1 nM) por el TNF* de animales, tales como el macaco cangrejero (Macaca fascicularis) y/o los macacos Rhesus (Macaca mulatta). Además, los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos eran específicos para TNF* en el sentido de que no se unían significativamente a TNF* y exhibían una estabilidad significativa, según se determina en un ensayo de desplegamiento térmico del dominio variable.

[0045] La invención proporciona moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas.

[0047] La presente invención, por tanto, se refiere a la materia objeto definida en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0049] Breve descripción de los dibujos

[0051] Figura 1: Representación esquemática del proceso de humanización.

[0053] Figura 2: Cromatogramas SE-HPLC de preparaciones de scFv humanizado purificado de un scFv. El monómero scFv eluye en tiempos de retención entre 8,5 y 9,5 minutos, mientras que los componentes del tampón eluyen a > 10 min. Todos los picos desde el volumen muerto de la columna hasta el monómero scFv respectivo se integraron como agregados/oligómeros y se usaron para el cálculo del área relativa del pico.

[0055] Figura 3: Curvas de desplegamiento térmico de las mediciones de DSF de dos construcciones de scFv. Para cada construcción se muestran medidas duplicadas. Los valores de Tm resultantes se han determinado ajustando los datos a una ecuación de Boltzmann para obtener el punto medio de la transición.

[0057] Figura 4: Transcurso del tiempo del contenido de monómero de las dos construcciones de scFv durante el almacenamiento. El contenido de monómero determinado por SE-HPLC se ha representado para las temperaturas de almacenamiento 4, -20 y <-65 °C durante 4 semanas.

[0059] Figura 5: Superposición de cromatogramas SE-HPLC para dos moléculas scFv. Para cada scFv se muestra la muestra (10 mg/ml) al d0 y después del almacenamiento durante 4 semanas a 4 °C. Además, se muestra el cromatograma de la muestra después de 5 ciclos de congelación y descongelación. El panel insertado muestra una ampliación de aproximadamente 15 veces del eje y de cada molécula para visualizar también cambios minúsculos en el contenido de oligómeros.

[0061] Figura 6: Evolución temporal del contenido de monómeros de los scFv humanizados durante el almacenamiento. El contenido de monómero determinado por SE-HPLC se ha representado gráficamente para las muestras de 10 mg/ml a una temperatura de almacenamiento de 37 °C durante 4 semanas.

[0063] Figura 7: Potencia para neutralizar el TNF* humano en el ensayo L929 de dos scFv. Se muestran las curvas de dosis-respuesta para los scFv y el anticuerpo de referencia infliximab para cada experimento. Las concentraciones más altas de scFv e infliximab, así como los controles negativos, se establecieron en 100 % y 0 % de crecimiento.

[0064] Figura 8: Potencia de dos scFv para neutralizar el TNF* de primates no humanos y humano en el ensayo L929. Se muestran las curvas dosis-respuesta para la neutralización de TNF* humano, de macaco cangrejero y de mono Rhesus. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 100% y 0% de crecimiento.

[0066] Figura 9: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNF* -TNFRI. Se muestran las curvas dosis-respuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 0 % y 100 % de unión de TNF* a TNFRI.

[0068] Figura 10: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNF*-TNFRII. Se muestran las curvas dosisrespuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 0 % y 100 % de unión de TNF* a TNFRII.

[0069] Figura 11: Especificidad diana de un scFv. El potencial para inhibir la interacción de TNF* biotinilado con scFv por TNF* y TNF* se analizó mediante ELISA de competición. Se muestran los efectos dependientes de la dosis de TNF* y TNF*.

[0071] La figura 12 representa la formación de complejos 16-22-H5-scFv:TNF* determinados mediante SE-HPLC (Ejemplo 4).

[0073] La figura 13 representa la unión simultánea de dos moléculas de TNF* a 16-22-H5-scDb determinada por SPR (Ejemplo 5).

[0075] La figura 14A representa la formación de complejos 16-22-H5-IgG:TNF* (Ejemplo 5).

[0077] La figura 14B representa la formación de complejos 16-22-H5-scDb:TNF* (Ejemplo 5).

[0079] La figura 15 representa la inhibición de la proliferación celular en un MLR después del tratamiento con anti-TNF*. *: p < 0,05; **: p <0,01 en comparación con el control de IgG (Ejemplo 6).

[0081] La figura 16 muestra la capacidad de los diferentes formatos de anticuerpos de 16-22-H5 y adalimumab para inhibir la secreción inducida por LPS de IL-1* (Figura 16A) y TNF* (Figura 16B) en monocitos de una manera dependiente de la dosis (Ejemplo 7).

[0083] Descripción detallada

[0085] La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al TNF* humano, como se define en las reivindicaciones.

[0087] En el contexto de la presente solicitud, el término "anticuerpo" se utiliza como sinónimo de "inmunoglobulina" (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas) e incluye todos los anticuerpos y fragmentos de los mismos conocidos convencionalmente. En el contexto de la presente invención, un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento de unión a antígeno u otro derivado de un anticuerpo parental que esencialmente mantiene una o más de las propiedades de dicho anticuerpo parental. Un "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión a antígeno. Una "región de unión al antígeno" de un anticuerpo se encuentra normalmente en una o más región o regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, CDR-2 y/o CDR-3. Los "fragmentos de unión a antígeno" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')<2>y un fragmento Fab. Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen, scFv, dsFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y proteínas de fusión Fc. El F(ab')<2>o Fab puede genomanipularse para minimizar o eliminar por completo las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente invención pueden ser parte de construcciones bi o multifuncionales.

[0089] Los fragmentos funcionales preferidos en la presente invención son scFv y diacuerpos.

[0091] Un scFv es un fragmento Fv monocatenario en el que los dominios ligero variable ("V<l>") y pesado variable ("V<h>") están unidos por un puente peptídico.

[0093] Un diacuerpo es un dímero que consiste en dos fragmentos, cada uno de los cuales tiene regiones variables unidas a través de un conector o similar (en lo sucesivo denominados fragmentos formadores de diacuerpos) y por lo general, contienen dos V<l>y dos<vh>. Los fragmentos formadores de diacuerpos incluyen aquellos que consisten en V<l>y V<h>, V<l>y V<l>, V<h>y V<h>, etc., preferentemente V<h>y V<l>. En fragmentos formadores de diacuerpos, el conector que une regiones variables no está específicamente limitado, pero preferentemente lo suficientemente cortos para evitar enlaces no covalentes entre regiones variables en el mismo fragmento. La longitud de dicho conector puede ser determinada según corresponda por los expertos en la materia, pero normalmente se utilizan 2-14 aminoácidos, preferentemente 3-9 aminoácidos, especialmente 4-6 aminoácidos. En este caso, la V<l>y la V<h>codificadas en el mismo fragmento se unen a través de un conector lo suficientemente corto como para evitar enlaces no covalentes entre la V<l>y V<h>en la misma cadena y para evitar la formación de fragmentos de región variable monocatenarios para que se puedan formar dímeros con otro fragmento. Los dímeros se pueden formar a través de enlaces covalentes o no covalentes o ambos entre fragmentos formadores de diacuerpos.

[0095] Además, los fragmentos formadores de diacuerpos se pueden unir a través de un conector o similar para formar diacuerpos monocatenarios (sc(Fv)<2>). Al unir fragmentos formadores de diacuerpos utilizando un conector largo de aproximadamente 15-20 aminoácidos, se pueden formar enlaces no covalentes entre fragmentos formadores de diacuerpos existentes en la misma cadena para formar dímeros. Basándose en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también se pueden preparar anticuerpos polimerizados tales como trímeros o tetrámeros uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.

[0096] Preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une específicamente a TNF*. Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo "reconoce específicamente", o "se une específicamente al" TNF* humano, cuando el anticuerpo o fragmento funcional es capaz de discriminar entre TNF* humano y una o más moléculas de referencia. Preferentemente, el valor de CI<50>para unirse a cada una de las moléculas de referencia es al menos 1.000 veces mayor que el valor de CI<50>para unirse a TNF*, particularmente como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento funcional para discriminar entre el TNF* humano y una biomolécula no relacionada, como se determina, por ejemplo, de acuerdo con un método de ensayo de especificidad conocido en la materia. Dichos procedimientos comprenden pruebas de Western blot y ELISA. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA estándar. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no solo una biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares. En una realización, la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento para discriminar entre el TNF* humano y el TNF* humano.

[0098] El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 54 y un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:13. El dominio V<l>comprende una región CDR1 (CDRL1), una región CDR2 (CDRL2), una región CDR3 (CDRL3) y regiones marco. El dominio V<h>comprende una región CDR1 (CDRH1), una región CDR2 (CDRH2), una región CDR3 (CDRH3) y regiones marco.

[0100] El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión del antígeno. Una de las definiciones más comúnmente utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicación del NIH 91-3242). Como se utiliza en el presente documento, La definición de CDR de Kabat sólo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena ligera (CDR L1), CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), así como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3 o H2, H3). CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), sin embargo, como se usa en el presente documento, se define por los siguientes restos (numeración de Kabat): Comienza en la posición 26 y termina antes de la posición 36.

[0102] La región CDR1 del dominio V<l>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 7.

[0104] La región CDR2 del dominio V<l>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8.

[0106] La región CDR3 del dominio V<l>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 9.

[0108] La región CDR1 del dominio V<h>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 10.

[0110] La región CDR2 del dominio V<h>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 11.

[0112] La región CDR3 del dominio V<h>consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 12.

[0114] El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:13. El anticuerpo o fragmento funcional comprende un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 54.

[0116] En una realización particularmente preferida, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 13 y un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:54. El dominio V<h>y el dominio V<l>se unen, preferentemente, mediante un enlazador peptídico. El enlazador peptídico (en lo sucesivo denominado "enlazador A") típicamente tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador A típicamente comprende los restos Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. En realizaciones preferidas, el enlazador comprende múltiples repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 50), por ejemplo de 2 a 6 o de 3 a 5, o 4 repeticiones consecutivas de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NO:50. Lo más preferentemente, el enlazador A consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 49. El scFv puede tener la siguiente estructura (con el extremo N-terminal a la izquierda y el C-terminal a la derecha):

[0118] V<L>-Enlazador A-V<h>; o

[0120] V<H>-Enlazador A-V<l>.

[0122] Más preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:55.

[0124] En otra realización particularmente preferida, el fragmento funcional es un diacuerpo que comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:13 y un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:54. El dominio V<h>y el dominio V<l>están unidos por un enlazador peptídico. El enlazador peptídico (en lo sucesivo denominado "enlazador B") tiene, preferentemente, una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 5 aminoácidos. El enlazador B típicamente comprende restos Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. Lo más preferentemente, el enlazador B consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 50.

[0125] El diacuerpo es, preferentemente, un diacuerpo monoespecífico, es decir, está dirigido solo a un epítopo. El diacuerpo es, preferentemente, un homodímero. El diacuerpo puede ser un dímero de dos cadenas polipeptídicas que están unidas entre sí de forma no covalente. Cada monómero puede ser una cadena polipeptídica que tiene la estructura:

[0126] V<L>-Enlazador B-V<h>; o

[0128] V<H>-Enlazador B-V<l>.

[0130] Además, los fragmentos formadores de diacuerpos se pueden unir mediante un enlazador A o similar para formar diacuerpos de cadena sencilla (sc(Fv)<2>). Al unir fragmentos formadores de diacuerpos utilizando un conector largo de aproximadamente 15-20 aminoácidos, se pueden formar enlaces no covalentes entre fragmentos formadores de diacuerpos existentes en la misma cadena para formar dímeros. Ejemplos de disposiciones de diacuerpos monocatenarios incluyen los siguientes.

[0132] V<h>- enlazador B - V<l>- enlazador A - V<h>enlazador B - V<l>

[0133] V<l>- enlazador B - V<h>- enlazador A - V<l>- enlazador B - V<h>

[0135] Preferentemente, el diacuerpo de la invención tiene la siguiente estructura:

[0136] V<l>- enlazador B - V<h>- enlazador A - V<l>- enlazador B - V<h>

[0138] Basándose en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también se pueden preparar anticuerpos polimerizados tales como trímeros o tetrámeros uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.

[0140] En otra realización particular, el anticuerpo de la invención es una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina G (IgG). La subclase de la IgG de la invención incluye IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>e IgG<4>. Preferentemente, la IgG de la invención es de subclase 1, es decir, es una molécula de IgG<1>. En una realización, cada cadena pesada de la molécula IgG de la invención tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:53. Una IgG específica de la invención consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las dos cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:53.

[0142] Afinidad

[0144] El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta afinidad por el TNF* humano. El término "K<d>", se refiere a la constante de disociación en el equilibrio de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNF* humano con una constante de disociación en el equilibrio (K<d>) de menos de aproximadamente 2x10<-10>M, preferentemente de menos de 1,5x10<-10>M, preferentemente de menos de 1,25x10<-10>M, más preferentemente de menos de 1x10<-10>M, más preferentemente de menos de 7,5x10<' 11>M o incluso de menos de 5x10<-11>M, según se determina utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE. En particular, la determinación de la K<d>se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.1.

[0146] Reactividad cruzada con TNF• de macacos cangrejeros o de macacos Rhesus

[0148] En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una afinidad sustancial por el TNF* de animales, tales como macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos Rhesus (Macaca mulatta). Esto resulta ventajoso, dado que los ensayos preclínicos de anticuerpos anti-TNF* humano, tales como estudios de toxicidad, se realizan, preferentemente, con dichos animales. Por consiguiente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene, preferentemente, reactividad cruzada con el TNF* de animales tales como macacos cangrejeros y/o macacos Rhesus. Las mediciones de afinidad se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.1.

[0149] En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene reactividad cruzada con TNF* de Macaca fascicularis. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención preferentemente tiene una afinidad por el TNF* de Macaca fascicularis que es menor que 20 veces, particularmente menos de 10 veces, incluso más particularmente menos de 5 veces diferente al del TNF* humano. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNF* de Macaca fascicularis con una constante de disociación en el equilibrio (K<d>), en donde la relación R<M.fascicularis>entre (i) la K<d>para la unión a TNF* de Macaca fascicularis y (ii) la K<d>para la unión al TNF* humano es menor que 20.

[0150]

[0153] R<M.fascicuiaris>es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10, incluso más particularmente menor que 5.

[0155] En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene reactividad cruzada con TNF* de Macaca mulatta. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene preferentemente una afinidad por TNF* de Macaca mulatta que es menor que 20 veces, más particularmente menor que 10 veces diferente a la del TNF* humano. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNF* de Macaca mulatta con una constante de disociación en el equilibrio (K<d>), en donde la relación R<m . mulatta>entre (i) la K<d>para la unión al TNF* de Macaca mulatta y (ii) la K<d>para la unión al TNF* humano es menor que 20.

[0158]

[0161] R<m . mulatta>es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10.

[0163] En otra realización más, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta reactividad cruzada con TNF* de Macaca fascicularis y con TNF* de Macaca mulatta. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención preferentemente tiene una afinidad por el TNF* de Macaca fascicularis que es menor que 20 veces, particularmente menos de 10 veces, incluso más particularmente menor que 5 veces diferente al del TNF* humano y, preferentemente, tiene una afinidad por el TNF* de Macaca mulatta que es menor que 20 veces, más particularmente menor que 10 veces diferente a la del TNF* humano. La relación R<M.fascicularis>del anticuerpo o fragmento funcional es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10, incluso más particularmente menor que 5, y la relación R<M.mulatta>del anticuerpo o fragmento funcional es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10.

[0164] Potencia para inhibir la apoptosis de células L929 inducida por TNF’

[0166] El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta potencia para inhibir la apoptosis de células L929 inducida por TNF*. En una realización particular, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* de células L929 mayor que la del anticuerpo conocido infliximab.

[0168] La potencia relativa al infliximab se puede determinar en un ensayo L929 como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.2 de la presente solicitud. La potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente superior a 2, más preferentemente superior a 3, más preferentemente superior a 5, más preferentemente mayor que 7,5, o incluso mayor que 10, en el que la potencia relativa es la relación de (i) el valor de CI<50>de infliximab en un ensayo L929 sobre (ii) el valor de CI<50>del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo L929, y en el que CI<50>indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para lograr el 50 % de la inhibición máxima de la apoptosis de células L929 inducida por TNF*.

[0170] En otra realización, la potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente superior a 2, más preferentemente superior a 3, más preferentemente superior a 5, más preferentemente mayor que 7,5, o incluso mayor que 10, en el que la potencia relativa es la relación de (i) el valor CI<90>de infliximab en un ensayo L929 sobre (ii) el valor CI<90>del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo L929, y en el que el valor CI<90>indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para lograr el 90 % de la inhibición máxima de la apoptosis de células L929 inducida por TNF*.

[0172] Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS

[0174] Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS a partir de monocitos. La secreción de citocinas inducida por LPS a partir de monocitos se puede determinar como se describe en el Ejemplo 7.

[0176] En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de interleucina-1* inducida por LPS a partir de monocitos CD14<+>. El valor de CI<50>para inhibir la secreción de interleucina-1* inducida por LPS es, preferentemente, menor que 1 nM y/o menor que 100 pg/ml. El valor de CI<50>para inhibir la secreción de interleucina-1* inducida por LPS, sobre una base molar y/o sobre una base de peso por volumen, es, preferentemente, menor que el del adalimumab.

[0178] En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción inducida por LPS de TNF* a partir de monocitos CD14<+>. El valor de CI<50>para inhibir la secreción de TNF* inducida por LPS es, preferentemente, menor que 1 nM y/o menor que 150 pg/ml. El valor de CI<50>para inhibir la secreción de TNF* inducida por LPS, sobre una base molar y/o sobre una base de peso por volumen, es, preferentemente, menor que el del adalimumab.

[0179] Ihibición de la proliferación celular

[0180] El anticuerpo o fragmento funcional de la invención es típicamente capaz de inhibir la proliferación celular de células mononucleares de sangre periférica en una reacción mixta de linfocitos. La inhibición de la proliferación celular se puede determinar como se describe en el Ejemplo 6. El índice de estimulación del anticuerpo o fragmento funcional, por ejemplo del scFv o diacuerpo de la invención, determinado según el ejemplo 6, es, preferentemente, menor que 5, más preferentemente menor que 4,5. En realizaciones particulares, el índice de estimulación del anticuerpo, por ejemplo de la IgG de la invención, es menor que 4 o incluso menor que 3.

[0181] Inhibición de la interacción entre TNF- y el receptor de TNF

[0182] Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNF* humano y el receptor I de TNF (TNFRI). La inhibición de la interacción entre el TNF* humano y el TNFRI se puede determinar en un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el Ejemplo 2, sección 2.1.3.

[0183] La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre el TNF* humano y el TNFRI, relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es, preferentemente de al menos 2, en la que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI<50>en ng/ml de infliximab y el valor de CI<50>en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.

[0184] Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNF* humano y el receptor II de TNF (TNFRII). La inhibición de la interacción entre TNF* humano y TNFRII se puede determinar en un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el Ejemplo 2, sección 2.1.3.

[0185] La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre TNF* humano y TNFRII, relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es, preferentemente de al menos 2, más preferentemente al menos 3, en la que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI<50>en ng/ml de infliximab y el valor de CI<50>en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo. Estequiometría y reticulación

[0186] El anticuerpo o fragmento funcional de la invención es típicamente capaz de unirse a TNF*<Trímero>humano en una estequiometría (anticuerpo: TNF*<Trímero>) de al menos 2. La estequiometría (anticuerpo: TNF*<Trímero>) es, preferentemente, mayor que 2 o de al menos 2,5, o al menos 3. En una realización, la estequiometría (anticuerpo: TNF*<Trímero>) es de aproximadamente 3. La estequiometría (anticuerpo: TNF*<Trímero>) se puede determinar como se describe en el Ejemplo 4 a continuación.

[0187] En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de formar un complejo con TNF* humano, en el que dicho complejo comprende al menos dos moléculas de TNF* y al menos tres moléculas de anticuerpo o fragmento funcional. El fragmento funcional de acuerdo con esta realización comprende al menos dos sitios de unión separados para TNF* , tales como, por ejemplo diacuerpos. La formación de complejos se puede determinar como se describe en el Ejemplo 5 a continuación.

[0188] En una realización, el anticuerpo es una IgG y es capaz de formar un complejo de al menos 600 kDa con TNF*. En otra realización, el fragmento funcional es un diacuerpo y es capaz de formar un complejo de al menos 300 kDa con TNF*.

[0189] Selectividad de diana

[0190] En determinadas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento funcional de la invención tiene una alta selectividad de diana, es decir, puede discriminar entre TNF* y TNF*. Preferentemente, el valor de CI<50>de TNF* es al menos 1.000 veces mayor que el valor de CI<50>de TNF*, como se determina en un ELISA de competición como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4. Más preferentemente, el valor de CI<50>del TNF* es al menos 5.000 veces, lo más preferentemente al menos 10.000 mayor que el valor CI<50>de TNF*, como se determina en un ELISA de competición como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4.

[0191] Rendimiento de expresión y rendimiento de replegamiento

[0192] En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o diacuerpo, se puede expresar de forma recombinante con alto rendimiento en microorganismos tales como bacterias o en otras células. Preferentemente, el rendimiento de expresión en E. coli, determinado como se describe en el Ejemplo 2, es de al menos 0,25 g/l. Esto se aplica particularmente a fragmentos funcionales, tales como scFv.

[0193] El rendimiento del replegamiento, determinado como se describe en el Ejemplo 2, sea de al menos 5 mg/l, más preferentemente al menos 10 mg/l, más preferentemente de al menos 15 mg/ml y lo más preferentemente de al menos 20 mg/l. Esto se aplica particularmente a fragmentos funcionales, tales como scFv.

[0194] Estabilidad

[0196] Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o diacuerpo, tiene una alta estabilidad. La estabilidad se puede evaluar mediante diferentes metodologías. La "temperatura de fusión" T<f>del dominio variable del anticuerpo o fragmento funcional de la invención, determinado por fluorimetría diferencial de barrido (DSF) como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.4, es preferentemente al menos un 65 °C, más preferentemente al menos 68 °C, lo más preferentemente al menos 70 °C. La "temperatura de fusión del dominio variable", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la temperatura de fusión de un scFv que consiste en la secuencia V<l>- Enlazador A - V<h>, en el que la secuencia de aminoácidos de Enlazador A consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:49. Por ejemplo, la temperatura de fusión del dominio variable de una IgG se define como la temperatura de fusión de su scFv correspondiente como se ha definido anteriormente.

[0197] La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95%) después de almacenamiento durante cuatro semanas a 4 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5 %, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menor que 0,5 %. La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95 %) después de almacenamiento durante cuatro semanas a -20 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5 %, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menor que 0,5 %. La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95% ) después de almacenamiento durante cuatro semanas a -65 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5 %, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menor que 0,5 %.

[0199] La pérdida de monómero después de cinco ciclos consecutivos de congelación-descongelación, determinado como se describe en el Ejemplo 2, es menos del 5 %, más preferentemente menos del 1 %, más preferentemente menos del 0,5 %, lo más preferentemente inferior al 0,2 %, por ejemplo el 0,1 % o el 0,0 %.

[0201] Anticuerpos y fragmentos funcionales

[0203] Realizaciones particulares de la invención se refieren a fragmentos funcionales de los anticuerpos descritos en el presente documento. Los fragmentos funcionales incluyen el fragmento F (ab')<2>, un fragmento Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) o un diacuerpo. Más preferentemente, las secuencias no CDR del scFv o del diacuerpo son secuencias humanas.

[0205] Preferentemente, con el fin de minimizar el potencial de inmunogenicidad en seres humanos, el armazón aceptor elegido está compuesto por regiones marco derivadas de secuencias consenso humanas o secuencias de la línea germinal humana. En particular, las regiones marco I a III del dominio ligero variable consisten en secuencias consenso de Vk1 humana de acuerdo con las SEQ ID NO: 56 a 58 y una región marco IV de una secuencia basada en la línea germinal • seleccionada de las SEQ ID NO: 59 a 62. Dado que los restos que no son consenso humano o restos de la línea germinal humana pueden causar reacciones inmunes, el número de dichos restos en cada dominio variable (VH o VL) debe ser lo más bajo posible, preferentemente inferior a 7, más preferentemente inferior a 4, lo más preferentemente 0.

[0207] Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, no está limitada a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no el método por el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluido el uso de hibridomas, tecnologías recombinantes y de presentación en fagos o una combinación de las mismas. (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

[0209] En otras realizaciones, incluyendo realizaciones relacionadas con el uso in vivo de los anticuerpos anti-TNF* en seres humanos, se pueden usar anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más preferentemente un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.

[0211] El término anticuerpo "quimérico" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tales como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, normalmente elegidas de un molde de inmunoglobulina humana. Se conocen en la técnica los métodos para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; las patentes de EE. UU. n.° 5.807.715; 4.816.567; y 4,816397.

[0212] Se encuentran disponibles diferentes metodologías recombinantes para un experto en la técnica para hacer que un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) sea más similar a uno humano mediante la generación de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')<2>u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a la diana), que contienen secuencias mínimas derivadas de dicha inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo recombinante resultante comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en la que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, particularmente una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos injertados con CDR son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) a partir de un anticuerpo generado originalmente en una especie no humana que se une al antígeno deseado y las regiones marco (FR) de una molécula de inmunoglobulina humana (documento EP239400; la publicación del PCT WO 91/09967; las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089). A menudo, en un proceso llamado "humanización", los restos marco en las regiones marco humanas se sustituirán adicionalmente con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la región marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los restos estructurales para identificar los restos estructurales importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos estructurales poco habituales en posiciones particulares. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7 y Queen et al, las patentes de Ee . UU. n.°: 5.530.101; 5.585.089: 5.693.761­ 5.693.762; y 6.180.370. Los anticuerpos se pueden hacer más humanos utilizando diversas técnicas adicionales conocidas en la materia que incluyen, por ejemplo, revestimiento o regeneración (documentos EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973 y barajado de cadenas (patente de Estados Unidos n.° 5,565,332). Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de un molde de inmunoglobulina humana elegido.

[0214] En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados se preparan como se describe en Queen et al., las patentes de EE. UU. n.°: 5.530.101; 5.585.089: 5.693.761-5.693.762; y 6.180.370.

[0216] Se divulgan, aunque no se reivindican, anticuerpos anti-TNF* que son anticuerpos humanos. Se pueden utilizar anticuerpos anti-TNF* "humanos" pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Como se utiliza en el presente documento, "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación en fagos anteriormente descritos usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse las Patentes de Estados Unidos n.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; las Patentes de EE. UU. n.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconozcan un epítopo seleccionado utilizando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).

[0218] También se divulgan, aunque no se reivindican, anticuerpos anti-TNF* que son anticuerpos primatizados. La expresión "anticuerpo primatizado" se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los métodos para producir anticuerpos primatizados son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. números 5.658.570, 5.681.722; y 5.693.780.

[0220] En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNF* son anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, los anticuerpos derivatizados que se han modificado, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína (véase más adelante una discusión de conjugados de anticuerpos), etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluida la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no convencionales.

[0222] En otros aspectos más, un anticuerpo anti-TNF* tiene uno o más aminoácidos insertados en una o más de su región hipervariable, por ejemplo, según lo descrito en el documento US 2007/0280931.

[0224] Conjugados de anticuerpos

[0226] En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNF* son conjugados de anticuerpos que se modifican, por ejemplo, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de tal manera que la unión covalente no interfiera con la unión a TNF*. Las técnicas para conjugar restos efectores con anticuerpos son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Hellstrom et al., Controlled Drag Delivery, 2.a Ed., en las pág. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

[0228] En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo se fusiona mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), en, opcionalmente, el N-terminal o el C-terminal, a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma; preferentemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento del mismo, está unido a la otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante del anticuerpo. Se pueden utilizar procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida in vivo. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina, tales como los descritos en el documento WO 2005/117984.

[0230] En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNF* se pueden unir a restos de poli(etilenglicol) (PEG). Por ejemplo, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, los restos de PEG se pueden unir a través de cualquier grupo funcional de aminoácido terminal o de cadena lateral de aminoácido disponible ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino libre, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Dichos aminoácidos pueden aparecer de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden modificarse por ingeniería genética en el fragmento utilizando procedimientos de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.219.996. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Preferentemente, los restos de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un resto de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se usa un grupo tiol como punto de unión, restos efectores apropiadamente activados, por ejemplo, derivados selectivos de tiol, tales como maleimidas y derivados de cisteína, se puede usar.

[0232] En otro ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-TNF* es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento desvelado en el documento EP0948544. Véase también Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, Nueva York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531- 545.

[0234] Composiciones y tratamientos farmacéuticos

[0236] El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes ya diagnosticados que tienen cualquier forma de la enfermedad en cualquier estadio clínico o manifestación; el retraso de la aparición o evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.

[0238] Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional del mismo puede ser un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o humano). En determinados aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.

[0240] En el presente documento se describen composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNF* y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones normalmente se suministran como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede presentarse en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado para administrarla a un paciente).

[0242] Los anticuerpos anti-TNF* y los fragmentos funcionales pueden administrarse a un paciente por diversas vías, tales como por vía oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica o localmente. La vía de administración más adecuada en cualquier caso dado dependerá del anticuerpo en particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y el estado físico del sujeto. Normalmente, un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional del mismo se administrará por vía intravenosa.

[0244] En una realización particularmente preferida, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se administra por vía oral. Si la administración es por vía oral, el fragmento funcional es, preferentemente, un anticuerpo monocatenario (scFv), diacuerpo o IgG.

[0246] En realizaciones típicas, un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional está presente en una composición farmacéutica a una concentración suficiente para permitir la administración intravenosa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo o fragmento adecuado para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluye 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, o una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de 1 mg/kg a 10 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg o de 10 mg/kg a 18 mg/kg.

[0248] La dosis eficaz de un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional puede variar de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 750 mg/kg por administración única (por ejemplo, en bolo), administraciones múltiples o administración continua, o para lograr una concentración sérica de 0,01-5000 pg/ml de concentración sérica por administración única (por ejemplo, bolo), múltiples administraciones o administración continua, o cualquier intervalo o valor efectivo en las mismas dependiendo de la afección que se esté tratando, de la vía de administración y de la edad, el peso y la afección del sujeto. En determinadas realizaciones, cada dosis puede variar de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal o de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo se puede formular como una solución acuosa.

[0250] Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-TNF* o fragmento funcional por dosis. Tal unidad puede contener de 0,5 mg a 5 g, por ejemplo, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg o cualquier intervalo entre dos cualesqueira de los valores anteriores, por ejemplo, de 10 mg a 1000 mg, de 20 mg a 50 mg o de 30 mg a 300 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo, por ejemplo, de la afección a tratar o la vía de administración.

[0252] La determinación de la dosis efectiva, el número total de dosis y la duración del tratamiento, un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional del mismo está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, y puede determinarse usando un estudio estándar de aumento de dosis.

[0254] Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TNF* y los fragmentos funcionales adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes empleados típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan en el presente documento "vehículos"), es decir, agentes tampón, agentes estabilizantes, conservantes, agentes isotónicos, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diferentes. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.

[0256] Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse a concentraciones que varían de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tampón adecuados incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico y tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico e hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gliconato sódico, mezcla de ácido glucónico e hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico y gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico y oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico e hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico y oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico y lactato sódico, mezcla de ácido láctico e hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico y lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético y acetato sódico, mezcla de ácido acético e hidróxido sódico, etc.). Además, tampones fosfato, se pueden usar tampones de histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

[0258] Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano y pueden añadirse en cantidades que varían del 0,2 %-1 % (p/v). Entre los conservantes adecuados se incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Se pueden añadir isotonificantes conocidos como "estabilizantes" para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluir alcoholes de azúcar polihídricos, preferentemente, alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes pueden referirse a una amplia categoría de excipientes que pueden tener diversas funciones, desde un agente de carga hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, • -monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 restos o menos); proteínas, tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 partes en peso de proteína activa.

[0260] Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por agitación, lo que también permite que la formulación se exponga a tensiones superficiales de cizallamiento sin provocar la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de polioxietilensorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

[0261] Otros excipientes adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), inhibidores de proteasa y codisolventes.

[0262] La formulación del presente documento también puede contener un segundo agente terapéutico además de un anticuerpo anti-TNF^ o un fragmento funcional del mismo. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

[0264] La pauta posológica puede variar de una vez al mes a diariamente, dependiendo de diversos factores clínicos, incluidos el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-TNF^ o al fragmento funcional. En realizaciones específicas, se administra diariamente un anticuerpo anti-TNF^ o un fragmento funcional del mismo, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cada dos días, cada 5 días, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos cualesquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de cada cuatro días a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.

[0266] La dosis de un anticuerpo anti-TNF^ o fragmento funcional a administrar variará según el anticuerpo particular, el sujeto y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad, la afección médica del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosis apropiada puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia.

[0268] Un experto en la materia reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un anticuerpo anti-TNF^ o fragmento funcional del mismo se determinarán mediante la naturaleza y la extensión de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el lugar de administración, así como la edad y el estado del sujeto concreto que se esté tratando, y que el médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que deben utilizarse. Esta dosificación se puede repetir con la frecuencia que sea apropiada. Si aparecen efectos secundarios, puede modificarse o reducirse la cantidad y/o la frecuencia de la dosis, de acuerdo con la práctica clínica convencional.

[0269] Trastornos a tratar

[0271] La invención se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el TNF^ humano en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o fragmento funcional como se define en el presente documento. La expresión "trastorno relacionado con TNF^" o "enfermedad relacionada con TNF^" se refiere a cualquier trastorno, la aparición, la progresión o la persistencia de los síntomas o estados patológicos de los cuales requiere la participación de TNFv Los trastornos de ejemplo relacionados con el TNF^ incluyen estados de inflamación crónicos y/o autoinmunes en general, trastornos inflamatorios inmunomediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, articulaciones, la piel, membranas mucosas, sistema nervioso central, el tubo gastrointestinal, tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveitis HLA-B27+, enfermedad de Behget, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, artrosis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, nefropatía crónica, cistitis, psoriasis (incluida artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, piodermia gangrenosa, síndrome de SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluidas manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis de pulmón, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto contra el huésped, reacciones de injerto contra hospedador, episodios de rechazo después de un trasplante de órganos o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y cutáneo, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, preeclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis vírica, hepatitis alcohólica, inflamación posquirúrgica, tal como después de una cirugía ocular (por ejemplo, cataratas (reemplazo del cristalino) o cirugía de glaucoma), cirugía de articulaciones (incluida cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía bucal y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo, ACTP, aterectomía, colocación de endoprótesis vascular), procedimientos intraabdominales y ginecológicos laparoscópicos y/o endoscópicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, dermatitis bullosa, dermatitis neutrofílica, necrólisis epidérmica tóxica, dermatitis pustulosa, malaria cerebral, síndrome urémico hemolítico, rechazo de aloinjertos, otitis media, mordedura de serpiente, eritema nudoso, síndromes mielodisplásicos, colangitis esclerosante primaria, espondiloarteropatía seronegativa, anemia hemolítica autoinmunitaria, granulomatosis orofacial, piostomatitis vegetans, estomatitis aftosa, lengua geográfica, estomatitis migratoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob y afecciones neurodegenerativas en general.

[0273] osteólisis relacionada con cáncer, inflamación relacionada con cáncer, dolor relacionado con cáncer, caquexia relacionada con cáncer, metástasis ósea, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si son causados por efectos centrales o periféricos del TNF* y si se clasifican como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia postherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debido a un tumor metastásico, dismenorrea.

[0275] Los trastornos particulares a tratar incluyen estados de artritis en general, artritis reumatoide, artrosis, artritis reactiva, artritis juvenil; psoriasis, incluida artritis psoriásica; enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, incluida proctitis, sigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis extensa y pancolitis, colitis indeterminada, colitis microscópica, incluida colitis colágena y linfocítica, colitis en la enfermedad del tejido conectivo, colitis por derivación, colitis en la enfermedad diverticular, colitis eosinofílica y pouchitis.

[0277] Lo más preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se usa para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal, en particular, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o colitis microscópica. La enfermedad de Crohn puede ser enfermedad de Crohn ileal, colónica, ileocolónica o superior aislada (gástrica, duodenal y/o yeyunal) incluyendo comportamiento de enfermedad no estenosante/no penetrante, estenosante, penetrante y perianal, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de enfermedad de cualquiera de los mencionados anteriormente. La colitis ulcerosa puede ser proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis pan-ulcerosa y pouchitis.

[0279] Terapia combinada y otros aspectos

[0281] Preferentemente, el paciente que está siendo tratado con un anticuerpo anti- TNF* o un fragmento funcional del mismo también se trata con otro medicamento convencional. Por ejemplo, un paciente que sufre enfermedad inflamatoria intestinal, especialmente si sufre enfermedad de moderada a grave también se trata típicamente con mesalazina o derivados o profármacos de la misma, corticoesteroides, por ejemplo, desonida o prednisolona (oral o i.v.), inmunodepresores, por ejemplo, azatioprina/6-mercaptopurina (6-MP) o metotrexato, ciclosporina o tacrolimus. Otros medicamentos que se pueden coadministrar al paciente incluyen productos biológicos, tales como infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol u otros. Otros medicamentos que pueden coadministrarse al paciente incluyen inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina/6-MP o metotrexato o ciclosporina oral) para mantener una remisión estable y más prolongada. Otro aspecto más de la invención es el uso de un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional como se ha definido en el presente documento anteriormente para reducir la inflamación.

[0283] Otro aspecto más de la invención es un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional como se ha definido anteriormente para su uso en la reducción de la inflamación en un paciente que padece una afección inflamatoria.

[0284] Otro aspecto descrito en el presente documento, pero no reivindicado, es un método para tratar una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional como se ha definido en el presente documento anteriormente. La afección inflamatoria es, preferentemente, una de las afecciones descritas anteriormente.

[0286] Otro aspecto descrito en el presente documento, pero no reivindicado, es un método para prevenir una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNF* o un fragmento funcional como se ha definido en el presente documento anteriormente. La afección inflamatoria es, preferentemente, una de las afecciones descritas anteriormente.

[0288] Tabla 1. Resumen de las secuencias de aminoácidos

[0291]

[0292] (continuación)

[0293]

[0294] (continuación)

[0297]

[0299] Ejemplos

[0300] Ejemplo 1: Generación de anticuerpos de conejo d irigidos contra TNF* humano

[0301] 1. Resultados

[0302] 1.1 Inmunización

[0303] Se han inmunizado conejos con TNF* humano recombinante purificado (Peprotech, N.° cat. 300-01 A). Durante el curso de la inmunización, la fuerza de la respuesta inmune humoral contra el antígeno se evaluó cualitativamente determinando la dilución máxima (título) para el suero de cada conejo que todavía producía una unión detectable de los anticuerpos policlonales séricos frente al antígeno. Se evaluaron los títulos de anticuerpos en suero contra el TNF* humano recombinante inmovilizado usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, véase 2.2.1). Los tres conejos mostraron títulos muy altos con una dilución de 10 x 10<6>veces del suero que aún da como resultado una señal positiva (al menos 3 veces más alta que la señal obtenida con suero de un animal no emparentado sin experiencia que se usó como control de fondo) en el ELISA. Además, se evaluó la capacidad de diferentes sueros de conejo para inhibir la actividad biológica de TNF* utilizando un ensayo basado en células L929 de ratón (véase 2.2.3). Los tres sueros inhibieron la apoptosis inducida por TNF* de fibroblastos de ratón L929. El conejo n.° 3 mostró la actividad neutralizante más fuerte con una inhibición del 50 % (CI<50>) alcanzada a una dilución de suero de 1:155.000.

[0304] Comparado con el conejo n.° 3, el conejo n.° 2 y el conejo n.° 1 mostraron aproximadamente 3 y 21 veces menos actividad, alcanzando un 50 % de inhibición a una dilución de suero de 1:55.500 y 1:7.210, respectivamente.

[0306] Se eligieron linfocitos aislados de bazos de los tres animales para los siguientes procedimientos de identificación de coincidencias. Los animales se priorizaron en función de la potencia para inhibir la actividad biológica de TNF* en el ensayo L929. Por tanto, el mayor número de coincidencias que se cultivaron se originó en el conejo n.° 3 y el menor número de coincidencias se derivó del conejo n.° 1.

[0308] 1.2 Identificación de coincidencias

[0310] 1.2.1 Clasificación de coincidencias

[0312] Antes del procedimiento de identificación de coincidencias, se desarrolló un procedimiento de clasificación basado en citometría de flujo que detecta específicamente y permite el aislamiento de linfocitos B que se unen a TNF* de alta afinidad (ver 2.1).

[0314] Un total de 33 x 106 linfocitos (correspondientes al 1,5 % del total de linfocitos aislados) derivados de los tres conejos se caracterizaron en dos campañas de clasificación independientes. De las 33 x 106 células analizadas en total, se aislaron 3452 linfocitos B que expresaban anticuerpos específicos de TNF* (IgG). El número de linfocitos clonados fue diferente para los tres conejos, ya que se aislaron más células de aquellos conejos cuyos sueros mostraron una fuerte inhibición de TNF* en el ensayo L929. De los linfocitos B aislados, se obtuvieron 792 clones de conejo n.° 1, 1144 clones de conejo n.° 2 y 1408 clones de conejo n.° 3. Para 108 clones se desconoce el origen de conejo respectivo, porque se derivan de una mezcla de linfocitos residuales de los 3 conejos para permitir la recuperación óptima de una pequeña cantidad de linfocitos de los viales.

[0316] 1.2.2 Detección de coincidencias

[0318] Los resultados obtenidos durante la fase de detección se basan en ensayos realizados con anticuerpos no purificados de sobrenadantes de cultivos de células secretoras de anticuerpos (ASC), ya que la escala del cultivo de alto rendimiento no permite la purificación de los anticuerpos de conejo individuales. Dichos sobrenadantes se utilizaron para clasificar un gran número de anticuerpos entre sí, sin embargo, no proporcionan valores absolutos (por ejemplo, para la inhibición de la actividad biológica de TNF*), excepto por la afinidad de unión. Los sobrenadantes de ASC se cribaron en un ELISA de alto rendimiento para determinar la unión al TNF* humano recombinante. Los sobrenadantes que se unen al TNF* se caracterizaron adicionalmente por su unión al TNF* de macaco cangrejero mediante ELISA, cinética de unión y por su potencial para neutralizar la actividad biológica del TNF* humano en el ensayo L929. Con la excepción de la cinética de unión, los valores de los informes de las pruebas de detección de alto rendimiento deben interpretarse como respuestas "sí" o "no", que se basan en mediciones de un solo punto (sin dosis-respuesta). Se analizó la afinidad con el TNF* de macaco cangrejero y ratón para todos los 102 clones que se seleccionaron para la amplificación y secuenciación de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo.

[0320] 1.2.2.1 Unión al TNF* humano

[0322] El objetivo de la detección primaria es identificar clones de ASC que producen anticuerpos específicos para TNF* humano. Para este fin, los sobrenadantes de cultivos celulares de 3452 clones de ASC se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos contra TNF* humano mediante ELISA (véase 2.2.1). El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNF* humano recombinante, sin embargo, no proporciona información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. En este ensayo, los sobrenadantes de 894 clones de ASC produjeron una señal que estaba claramente por encima del fondo. La tasa de coincidencias en la detección fue similar para el conejo n.° 1 y el conejo n.° 2 con 153 coincidencias de 792 (19,3 %) identificados del conejo n.° 1 y 225 coincidencias de 1144 identificados del conejo n.° 2 (19,7 %). El conejo n.° 3 mostró una tasa de coincidencias significativamente mayor del 34,4 %, lo que resultó en la identificación de 484 coincidencias de 1408. Las 894 coincidencias identificadas en esta detección primaria, se sometieron a la medición de la cinética de unión mediante SPR (detección secundaria).

[0324] 1.2.2.2 Cinética de unión al TNF*

[0326] El objetivo de la detección secundaria es obtener información cuantitativa sobre la calidad de la unión a la diana para cada impacto a partir de la detección primaria por resonancia de plasmón superficial (SPR, véase 2.2.2). A diferencia del ELISA utilizado durante la detección primaria, este procedimiento evalúa la cinética de la unión a la diana en función del tiempo. Esto permite la determinación de las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) del anticuerpo de su diana. La relación k<d>/k<a>proporciona la constante de disociación en el equilibrio (K<d>), que refleja la afinidad de un anticuerpo por su diana. De las 894 coincidencias identificadas en la detección primaria, se pudieron determinar las afinidades de unión al TNF* humano para los anticuerpos monoclonales 839 de conejo. Para los 55 anticuerpos restantes no se pudo medir la afinidad porque la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de ASC estaba por debajo del límite de detección del instrumento SPR en la configuración respectiva. Los 839 anticuerpos anti-TNF* que se pudieron medir mostraron constantes de disociación (K<d>) que variaban desde menos de 1,36 x 10-13 M hasta 1,14 x 10-8 M. El 69 % de todos los anticuerpos analizados tenían una K<d>por debajo de 0,5 nM.

[0328] La mediana de K<d>de 2,21 x 10-10 M y 2,09 x 10-10 M para la detección de coincidencias identificadas de los conejos n.° 2 y n.° 3 fueron similares, mientras que el conejo n.° 1 mostró valores aproximadamente 2 veces más altos con una mediana de K<d>de 4,65 x 10-10 M. Al considerar solo las coincidencias de detección neutralizantes, las distribuciones de la afinidad fueron similares para los tres animales con valores más bajos para la mediana de K<d>(mediana de K<d>entre 1,4 x 10"10 M y 1,27 x 10"10 M). Las afinidades por debajo de 0,041 nM, 0,029 nM y 0,026 nM se midieron para el 5 % de las coincidencias de detección para los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente. Para el 2 % de los sobrenadantes, las afinidades estaban incluso en el intervalo picomolar bajo (por debajo de 6,2 pM, 7,9 pM y 11 pM). El excelente rendimiento de anticuerpos de alta afinidad resultantes de la detección secundaria proporciona una base amplia para la selección de los anticuerpos más apropiados para la humanización y el reformateo.

[0330] 1.2.2.3 Potencia

[0332] Para la evaluación de la potencia, se ha desarrollado un ensayo basado en células (ensayo L929) (véase 2.2.3). 506 de los 894 anticuerpos seleccionados (56,6 %), inhibieron la apoptosis inducida por TNF* en el ensayo L929 en más del 50 %. De acuerdo con los resultados obtenidos durante el análisis de títulos, el mayor porcentaje de coincidencias neutralizantes se obtuvo del conejo n.° 3 con una tasa de coincidencias del 62,8 %, seguido por el conejo n.° 2 con una tasa de coincidencias del 56,4 % y el conejo n.° 1 con la tasa de coincidencias más baja del 39,9 %. Las afinidades de estos anticuerpos neutralizantes oscilaron entre 1,36 x 10-13 y 1,19 x 10-9 M.

[0334] 1.2.2.4 Reactividad cruzada de especies (macaco cangrejero)

[0336] Las 894 coincidencias identificadas en la detección primaria, se analizaron para determinar la reactividad cruzada de especies con TNF* de macaco cangrejero mediante ELISA (véase 2.2.1). El objetivo de esta detección adicional era permitir la selección de clones de ASC que se sabe que reaccionan de forma cruzada con TNF* de macaco cangrejero. El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNF* recombinante de macaco cangrejero, sin embargo, no proporciona información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. Los sobrenadantes de 414 (46 %) clones de ASC produjeron una señal clara (densidad óptica (DO) • 1). El porcentaje de coincidencias con reactividad cruzada con el t Nf * de macaco cangrejero fue similar para el conejo n.° 1 y el conejo n.° 3 con 81 coincidencias de 153 (52,9 %) identificadas del conejo n.° 1 y 236 coincidencias de 484 identificadas del conejo n.° 3 (48,8 %). Con un 37,8 %, el conejo n.° 2 mostró un porcentaje ligeramente menor de coincidencias con reactividad cruzada, lo que resultó en la identificación de 82 coincidencias de 225.

[0338] 1.2.2.5 Selección de clones para RT-PCR

[0340] Como requisito previo para la confirmación de coincidencias, el análisis de la secuencia genética y posterior humanización de los anticuerpos de conejo, es necesario recuperar la información genética que codifica el dominio variable del anticuerpo de conejo. Esto se hizo mediante transcripción inversa (RT) del respectivo ARN mensajero en el ADN complementario (ADNc), seguido de la amplificación del ADN bicatenario mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La selección de clones de a Sc sometidos a RT-PCR se basó principalmente en la afinidad y la actividad neutralizante. Como criterio adicional, se consideró la reactividad cruzada con TNF* de macaco cangrejero. En total, se seleccionaron 102 clones de ASC para la clonación de genes mediante RT-PCR. En primer lugar, las 93 ASC mejor clasificadas (en términos de afinidad) con una K<d>por debajo de 80 pM, que inhibían la actividad biológica del TNF* en el ensayo L929 en más del 50 % y que mostraban una unión significativa al TNF* del macaco cangrejero. Además, también se eligieron los 9 clones de ASC de mejor clasificación con K<d>por debajo de 20 pM que neutralizaban la actividad de TNF* en más del 50 % pero no se unían al TNF* de macaco cangrejero. En total, 12, 13 y 66 clones de ASC se amplificaron y secuenciaron con éxito a partir de los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente.

[0342] 1.2.2.6 Identificación de clones relacionados con propiedades deseadas

[0344] Con el fin de caracterizar la diversidad genética del panel de clones de ASC aislados, se extrajeron las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y se sometieron a un alineamiento de secuencias múltiples, lo que permitió la agrupación de secuencias en un árbol filogenético.

[0346] Si bien este análisis, por un lado, permite que la selección de un conjunto diverso de secuencias clonales se lleve a cabo en experimentos de humanización y reformateo, también identifica grupos de homólogos de secuencias clonales que parecían compartir un clon de linfocitos B parentales común en el conejo. El sello distintivo de estos grupos de secuencias es una alta homología de secuencia en las CDR y un patrón consistente de propiedades farmacodinámicas. Ambas características se resumen para un grupo de ocho clones en las Tablas 2 y 3. A pesar de la conservación funcional de este grupo de secuencias, la secuencia consenso de la Tabla 3 revela que se tolera una cierta variabilidad de las CDR, sin dejar de dar como resultado el perfil farmacodinámico deseado.

[0347] Tabla 2: Propiedades farmacodinámicas de los anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de ASC. SN de ASC Afinidad por el TNF* humano Afinidad con TNF* de Cynomolgus

[0348] Ensayo L929 % inh. ID. del clon<M>M<- V 1>) M s<-1>) K<d>(M) k<a>(M<-1>s<-1>) K<d>(s<-1>) K<d>(M)

[0349] 16-12-B11 3,22E+06 1,87E-04 5,82E-11 2,15E+06 1,37E-03 6,34E-10 71

[0350] 16-13-C08 1,77E+06 9,41E-05 5,33E-11 1,80E+06 1,77E-04 9,82E-11 93

[0351] 16-13-E05 2,78E+06 8,27E-05 2,97E-11 2,53E+06 2,99E-04 1, 18E-10 94

[0352] 16-16-B08 2,27E+06 4,53E-05 1,99E-11 2,35E+06 1,52E-04 6,45E-11 73

[0353] 16-16-H10 2,03E+06 1,59E-04 7,85E-11 2,20E+06 4,61E-04 2,10E-10 70

[0354] 16-22-H05 1,90E+06 7,26E-05 3,82E-11 2,17E+06 6,97E-05 3,21E-11 67

[0355] 17-13-G07 7,87E+05 1,37E-06 1,73E-12 7,80E+05 7,34E-05 9,41E-11 109

[0356] 17-20-E06 1,19E+06 3,59E-06 3,03E-12 1,45E+06 3,27E-05 2,26E-11 101

[0357] T l i r n l i i n n i n r l DR r l l n n ri r

[0359]

[0360] continuación

[0362]

[0365] 1.2.2.7 Reactividad cruzada con TNF* de macaco cangrejero (por SPR)

[0367] Debido a la gran cantidad de coincidencias de alta afinidad que neutralizan potencialmente al TNF*, se evaluó la reactividad cruzada de especies para todos los anticuerpos monoclonales de conejo que se sometieron a RT-PCR con el fin de facilitar la selección de clones de ASC para la confirmación de coincidencias. Las afinidades por el TNF* de macaco cangrejero se determinaron mediante mediciones de SPR de manera similar a como se ha descrito anteriormente (véase también 2.2.2). Las afinidades de los 93 anticuerpos analizados para el TNF* de macaco cangrejero oscilaron entre 9,6 x 10-12 y 2,1 x 10-9 M. 38 de los 93 anticuerpos de reacción cruzada se unieron al TNF* humano y de macaco cangrejero con una afinidad similar (menos del doble de diferencia en la K<d>). Además, la diferencia en la afinidad entre seres humanos y macacos cangrejeros fue menos de 20 veces para 79 de los 93 anticuerpos con reactividad cruzada y menos de 10 veces para 62 de ellos, lo que los hace aceptables para el desarrollo preclínico en el macaco cangrejero.2

[0369] 2. Métodos

[0370] 2.1 Ensayo de clasificación

[0372] El procedimiento de clasificación basado en citometría de flujo para el aislamiento de linfocitos B específicos de antígeno a partir de tejido linfático de conejo se realizó como lo describen Lalor et al. (Eur J Immunol. 1992; 22.3001­ 2011)

[0374] 2.2 Ensayos de detección

[0376] 2.2.1 ELISA de unión a TNF- (TNF- humano y de macaco cangrejero)

[0378] TNF* humano recombinante (Peprotech, N.° cat. 300-01) en una placa ELISA de microtitulación de 96 pocillos. La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNF* inmovilizado se detectó mediante una IgG secundaria anti-conejo marcada con HRP (Jacksonlmmuno Research, n.° cat. 111 -035-046). Se añadió sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, KPL, n.° cat. 53-00-00) y la reacción de color se detuvo mediante la adición de H<2>SO<4>. Las placas se leyeron usando un lector de placas de microvaloración (Infinity reader M200 Pro, Tecan) a una longitud de onda de 450 nm.

[0380] El rendimiento del ensayo durante las campañas de detección se controló mediante un anticuerpo policlonal de conejo anti-TNF* control positivo disponible comercialmente (AbD Serotec, n.° cat. 9295-0174). Con este fin, el anticuerpo de control positivo se probó a 100 y 250 ng/ml por duplicado en cada placa de detección. Se controló la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo para cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la relación señalfondo fue de entre 30 y 40 para el control positivo a 250 ng/ml y el coeficiente de variación (CV) del control positivo estuvo por debajo del 10 %. Una señal con una densidad óptica de • 100 % en relación con el control positivo de 250 ng/ml se consideró como una coincidencia de detección primaria.

[0382] Para las determinaciones de títulos séricos, se utilizó la misma configuración de ELISA que se ha descrito anteriormente. Una dilución de suero se consideró positiva cuando la señal de unión del suero inmune era al menos 3 veces mayor en comparación con la señal de un animal no emparentado intacto.

[0384] La reactividad cruzada de especies con el macaco cangrejero se determinó usando un ELISA similar al descrito anteriormente. Placas de ELISA de microvaloración de 96 pocillos se recubrieron con TNF* recombinante de macaco cangrejero (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE). La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNF* de macaco cangrejero inmovilizado se detectó mediante el anticuerpo secundario marcado con HRP como se ha especificado anteriormente. Se usó suero inmune de conejo n.° 2 como control positivo a una dilución de 1:80.000 y 1:320.000. Se controló la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo para cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la relación señal-fondo fue de entre 20 y 30 para el control positivo a una dilución de 1:80.000 y los CV del control positivo fueron inferiores al 10 %.

[0386] 2.2.2 Cinética de unión a TNF• por SPR (humano y macaco cangrejero)

[0388] Las afinidades de unión de los anticuerpos por el TNF* humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento MASS-1 SPR (Sierra Sensors). El rendimiento del instrumento se calificó mediante soluciones de referencia patrón, así como mediante el análisis de una interacción anticuerpo-antígeno de referencia, tal como la interacción infliximab-TNF*.

[0390] Para la detección de afinidad, un anticuerpo específico para la región Fc de las IgG de conejo (Bethyl Laboratories, n.° cat. A120-111A) se inmovilizó en un chip sensor (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) utilizando un procedimiento estándar de acoplamiento de aminas. Los anticuerpos monoclonales de conejo en los sobrenadantes de ASC fueron capturados por el anticuerpo IgG anti-conejo inmovilizado. Después de capturar los anticuerpos monoclonales, se inyectó TNF* humano (Peprotech, n.° cat 300-01) en las células de flujo durante 3 minutos a una concentración de 90 nM y se dejó que la disociación de la proteína de la IgG capturada en el chip sensor prosiguiera durante 5 minutos. Después de cada ciclo de inyección, las superficies se regeneraron con dos inyecciones de glicina-HCl 10 mM. Las constantes de velocidad de disociación aparente (k<d>) y asociación (k<a>) y la constante de disociación en el equilibrio aparente (K<d>) se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno y la calidad de los ajustes se controló en función de la Chi<2>relativa (Chi<2>normalizada a nivel de la unión máxima extrapolada del analito), que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Para la mayoría de las coincidencias, el valor relativo de Chi<2>fue inferior al 15 %. Los resultados se consideraron válidos si las unidades de respuesta (UR) para la unión del ligando eran al menos el 2 % de las UR para la captura de anticuerpos. Se consideró que las muestras con UR para la unión del ligando con menos del 2 % de las UR para la captura de anticuerpos no mostraban unión específica de TNF* al anticuerpo capturado.

[0392] La reactividad cruzada de especies con TNF* de macaco cangrejero (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) se midió usando la misma configuración de ensayo y concentraciones de TNF* y aplicando las mismas medidas de calidad. La Chi<2>relativa estaba por debajo del 15 % para la mayoría de los sobrenadantes de ASC analizados.

[0394] 2.2.3 Apoptosis inducida por TNF• en fibroblastos L929

[0395] La capacidad de las IgG de conejo de los sobrenadantes de cultivos de ASC para neutralizar la actividad biológica del TNF* humano recombinante se evaluó utilizando fibroblastos L929 de ratón (patrones ATCC/LGC, n.° cat. CCL-1). Las células L929 se sensibilizaron a la apoptosis inducida por TNF* mediante la adición de 1 pg/ml de actinomicina D. Las células se cultivaron en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos en presencia de sobrenadante de cultivo ASC al 50% y TNF* humano 100 pM (5,2 ng/ml) (Peprotech, n.° cat. 300-01) durante 24 horas. En comparación con los anticuerpos purificados, deben usarse concentraciones más altas de TNF* en presencia de sobrenadantes de ASC para la detección de coincidencias. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Sigma Aldrich, n.° cat. 96992). WST-8 se reduce mediante deshidrogenasas celulares a un producto de formazán naranja. La cantidad de formazano producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de infliximab necesaria para neutralizar la apoptosis inducida por TNF* en un 50 % (CI<50>) a una concentración de 36,2 ng/ml. Por tanto, el límite inferior estimado de detección para este ensayo está entre 30 y 40 ng/ml. Este valor es solo una estimación aproximada del límite de detección, ya que el potencial para bloquear TNF* no solo depende de la concentración del anticuerpo monoclonal sino también de la afinidad del anticuerpo por la diana. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo es suficiente para la detección de sobrenadantes de ASC ya que las concentraciones de IgG en la mayoría de los sobrenadantes de ASC están por encima de una concentración de 40 ng/ml. Los sobrenadantes que dieron como resultado una neutralización del 50 % de la apoptosis inducida por TNF* se consideraron positivos.

[0396] Para asegurar un rendimiento robusto del ensayo durante las campañas de detección, el anticuerpo de control positivo infliximab se probó a 115 ng/ml (0,8 nM) y a 58 ng/ml (0,4 nM) por duplicado en cada placa de detección. Se controló el porcentaje de inhibición y la precisión de la respuesta para el control positivo para cada placa de detección. Los criterios de aceptación para cada placa se establecieron de la siguiente manera: inhibición de al menos un 60 % con el anticuerpo de control positivo a una concentración de 115 ng/ml con un coeficiente de variación (CV) inferior al 20 %.

[0398] Ejemplo 2: Humanización y generación de scFv

[0400] 1. Resultados

[0402] 1.1 Confirmación de coincidencias y selección de coincidencias para humanización

[0404] Se recuperaron 73 conjuntos únicos de dominios variables parentales de cadena ligera y pesada de conejo durante la detección de coincidencias y se analizaron mediante alineación de secuencia. Basado en los resultados del ensayo de detección y la homología de secuencia de los clones individuales de IgG de conejo, se seleccionaron 30 candidatos para la confirmación de coincidencias. Se fabricaron 29 anticuerpos monoclonales y se seleccionaron los clones de mejor rendimiento en términos de afinidad y potencia para la humanización y la generación de candidatos principales. Los criterios para la selección de clones fueron i) neutralización de TNF* humano en el ensayo L929, ii) alta afinidad por TNF* humano, iii) reactividad cruzada con TNF* de macaco cangrejero y Rhesus, y iv) diversidad de secuencia. Se ha seleccionado un clon (16-22-H05) para humanización, una de las IgG de mejor clasificación en términos de potencia para neutralizar el TNF* humano en el ensayo L929. Con respecto a la fuerza de unión, se desea la mejor afinidad posible ya que se necesita anticipar una cierta pérdida de afinidad como resultado de la humanización y el reformateo en el formato scFv.

[0406] Los datos del clon de IgG n.° 16-22-H05 se resumen en la Tabla 4.

[0407]

[0408]

[0409] 1.2 Generación y selección de fragmentos de scFv humanizados

[0411] Las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se transfirieron in silico mediante injerto de bucle de CDR en una secuencia de armazón de dominio variable humano como se describe en el documento WO 2014/206561. Además, se generó una segunda construcción por clon de conejo, que transfirió aminoácidos adicionales desde la secuencia donante en posiciones con relevancia estructural para los dominios de inmunoglobulina y posicionamiento de CDR. Se sintetizó un gen artificial (con un uso de codón optimizado para la expresión bacteriana) que codifica el respectivo Fv de anticuerpo monocatenario humanizado (scFv) (a partir de las correspondientes cadenas ligeras y pesadas variables). A continuación, se produjo el polipéptido y posteriormente se caracterizó utilizando ensayos similares a los descritos durante la confirmación de la coincidencia.

[0413] 1.2.1 Humanización y fabricación de scFv humanizados (API)

[0415] La humanización del clon seleccionado comprendió la transferencia de las CDR de conejo a un marco aceptor scFv del tipo V*1/VH3 como se describe en el documento WO 2014/206561. En este proceso, que se muestra esquemáticamente en la figura 1, la secuencia de aminoácidos de las seis regiones CDR se identificó en la secuencia donante (mAb de conejo) y se injertó en la secuencia del armazón aceptor, dando como resultado las construcciones denominadas "injerto de CDR".

[0417] Además, se diseñó un segundo injerto, que incluyó modificaciones de aminoácidos adicionales del donante de conejo en la posición L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 y H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (numeración AHo), que se ha descrito que influyen potencialmente en la posición de las CDR y, por tanto, la unión al antígeno (Borras et al., JBC. 2010; 285:9054-9066). Esta construcción humanizada se denomina "injerto estructural (STR)". En caso de que la comparación de los datos de caracterización para estas dos construcciones iniciales revelara una ventaja significativa de la construcción STR, se diseñaron variantes adicionales que combinaban la VL injertada con CDR con VH injertada con STR. Se ha demostrado que esta combinación a menudo es suficiente para retener la actividad del injerto STR (Borras et al., 2010, JBC, 285: 9054-9066) y, en general, se preferiría ya que menos alteraciones no humanas en el armazón del aceptor humano reducen el riesgo de alteración de la estabilidad y también el potencial de inmunogenicidad.

[0419] Una vez que se completó el diseño de la construcción in silico descrito en la sección anterior, se sintetizaron los genes correspondientes y se construyeron los vectores de expresión bacteriana. La secuencia de las construcciones de expresión se confirmó a nivel de ADN y las construcciones se fabricaron de acuerdo con protocolos genéricos de expresión y purificación.

[0421] La expresión heteróloga de las proteínas se realizó en E. coli como cuerpos de inclusión insolubles. El cultivo de expresión se inoculó con un cultivo de partida de crecimiento exponencial. El cultivo se realizó en matraces de agitación en un agitador orbital usando medios ricos disponibles comercialmente. Las células se cultivaron hasta una DO600 definida de 2 y se indujeron mediante expresión durante la noche con isopropil • -D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Al final de la fermentación, las células se recogieron por centrifugación y se homogeneizaron por sonicación. En este punto, el nivel de expresión de las diferentes construcciones se determinó mediante análisis SDS-PAGE del lisado celular. Los cuerpos de inclusión se aislaron del sedimento celular homogeneizado mediante un protocolo de centrifugación que incluyó varias etapas de lavado para eliminar los restos celulares y otras impurezas de la célula hospedadora. Los cuerpos de inclusión purificados se solubilizaron en un tampón desnaturalizante (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, Gdn-HCl 6 M, EDTA 2 mM) y los scFv se volvieron a plegar mediante un protocolo de replegamiento escalable que generó cantidades de miligramos de plegado de forma nativa, scFv monomérico. Se empleó un protocolo estandarizado para purificar los scFv, que incluyó las siguientes etapas. El producto después del replegamiento se capturó mediante una cromatografía de afinidad empleando agarosa Capto L (GE Healthcare) para producir los scFv purificados. Los candidatos principales que cumplieron con los criterios de afinidad y potencia en las pruebas iniciales se purificaron aún más mediante una cromatografía de exclusión por tamaño de pulido usando una columna HiLoad Superdex75 (GE Healthcare). Posteriormente al protocolo de purificación, las proteínas se formularon en una solución salina tamponada y se caracterizaron mediante los diversos procedimientos biofísicos, de interacción de proteínas y biológicos, como se describe a continuación. Se comparó la capacidad de producción de las diferentes construcciones determinando el rendimiento final de proteína purificada para el lote y normalizando este valor a 1 l de volumen de replegamiento.

[0423] 1.2.2 Caracterización biofísica de scFv humanizado

[0425] La caracterización biofísica del scFv con respecto a la estabilidad y la producibilidad se compiló en la Tabla 5. La producibilidad y la estabilidad de la construcción scFv se caracterizaron por los diferentes puntos de notificación, como se analiza en las secciones siguientes.

[0427] El scFv se investigó según ciertos criterios, como se explica a continuación.

[0429] El criterio de producibilidad garantizará que la entidad scFv seleccionada pueda expresarse, replegarse y purificarse en cantidades suficientes para apoyar el desarrollo posterior de la molécula principal. Los criterios definidos fueron el rendimiento de expresión de scFv por litro de caldo de fermentación, según lo evaluado mediante SDS-PAGE y el rendimiento de purificación logrado en el proceso genérico a escala de laboratorio, según lo evaluado midiendo la cantidad de proteína purificada por espectrometría UV, calculado de nuevo a 1 litro de solución de replegamiento.

[0430] Los criterios de estabilidad estaban destinados a evaluar la propensión a la agregación durante el proceso de fabricación de las moléculas y su integridad estructural durante el almacenamiento y manipulación posterior. El contenido de monómeros determinado por SE-HPLC permite evaluar la estabilidad coloidal de las moléculas durante el proceso de purificación (2.2.3). En un estudio de estabilidad posterior, se probó el contenido de monómero durante 4 semanas a 1 y 10 mg/ml y almacenamiento a 4, -20 y <-65 °C. Adicionalmente, la estabilidad coloidal de las proteínas se probó después de 5 ciclos de congelación y descongelación. Como parámetro adicional indicador de estabilidad, el punto medio del desplegamiento térmico se determinó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF) (2.2.4) para proporcionar una lectura de la estabilidad conformacional de los candidatos principales.

[0432] Tabla 5: Resumen de los datos de caracterización biofísica de los scFv humanizados.

[0433] ID. del Construcción Estabilidad Capacidad de producción clon

[0434] Tf [°C] Almacenamiento Liberar/Descongelar Pureza Expresión Rendimiento de [•% ] [•% ] [%] [g/l] purificación [mg/l]

[0435] -65 °C -25 °C 4 °C

[0436] 16-22- CDR 74,2 nd nd nd nd 98,0 nd 19,1 H05-sc01

[0437] 16-22- 16-22- ESTR 71,3 0,0 0,0 0,2 0,0 99,9 0,27 29,8 H05- H05-sc05

[0438] sc02

[0439] 16-22- CDR/STR 72,6 0,2 0,1 0,4 0,0 100,0 0,26 24,1 H05-sc04

[0441] 1.2.2.1 Evaluación de la producibilidad

[0443] Las moléculas scFv candidatas principales se expresaron mediante fermentación en matraz de agitación en modo discontinuo y se purificaron mediante un proceso genérico a escala de laboratorio para producir las muestras de proteínas para su posterior caracterización. Durante este proceso, se controlaron algunos parámetros clave de rendimiento para comparar las moléculas candidatas e identificar construcciones potencialmente difíciles de desarrollar.

[0445] El título de expresión se determinó sobre el nivel del lisado de E. coli en bruto después de la recolección de las células mediante centrifugación. Durante la cosecha se prevé una pequeña pérdida de células, sin embargo, este factor se eligió para su omisión para el cálculo del rendimiento de expresión a favor de una estimación más conservadora de la productividad. Para la cuantificación del producto scFv en el lisado teñido con coomassie se eligió SDS-PAGE reductora (2.2.1) debido a la alta especificidad del procedimiento que permite discriminar el producto de las proteínas de la célula hospedadora en la muestra.

[0447] Un segundo criterio para evaluar la producibilidad es el rendimiento de purificación de scFv calculado por litro de solución de replegamiento. Este parámetro aborda el posible cuello de botella en el proceso de fabricación anticipado que incluye una etapa de replegamiento de proteínas. Dado que la eficacia del procedimiento de replegamiento ha demostrado ser limitante en procesos de fabricación comparables, se ha decidido comparar el rendimiento de las diferentes construcciones con respecto a la producibilidad normalizada a un volumen de replegamiento definido. Para el cálculo del rendimiento, la muestra de proteína final de cada lote se cuantificó mediante absorbancia UV (2.2.2) y se dividió por el volumen de replegamiento real de la purificación respectiva (Tabla 6).

[0449] Tabla 6: Resumen de los datos de producibilidad para dos scFv humanizados. El título de expresión se determinó mediante SDS-PAGE cuantitativa en lisados de células al final de la producción. El rendimiento del lote se determinó mediante la medición de la absorbancia UV del conjunto de purificación final. El rendimiento de la purificación se _____________________calcula como scFv purificado por litro de volumen de replegamiento._____________________

[0450] Producibilidad

[0451] ID de la Título de expresión Rendimiento del Volumen de Rendimiento de construcción [g/l] lote [mg] replegamiento [l]

purificación [mg/l] 16-22-H05-sc02 0,27 14,3 0,48 29,8

[0453] 16-22-H05-sc04 0,26 11,9 0,49 24,1

[0454] 1.2.2.2 Evaluación de la estabilidad

[0456] La evaluación de la estabilidad conformacional, la monodispersidad y la integridad estructural de las construcciones de scFv es un componente integral para la clasificación de las diferentes moléculas con respecto a la capacidad de desarrollo. Un requisito previo para la comparación significativa de las diferentes construcciones es la preparación de moléculas purificadas de calidad similar. El criterio de "pureza del monómero" determinado por SE-HPLC tiene por objeto garantizar la calidad compatible de las diferentes sustancias de ensayo. Además del análisis SE-HPLC, se realizó SDS-PAGE para la determinación de la pureza e identidad de las proteínas para confirmar la calidad comparable de las preparaciones ensayadas.

[0458] Los resultados de SE-HPLC de los dos scFv revelan que todas las preparaciones pueden purificarse hasta un contenido de monómero • 99 % (Figura 2).

[0460] El comportamiento de desplegamiento térmico de los candidatos principales se probó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF) para permitir la clasificación de las moléculas con respecto a su estabilidad conformacional esperada. En la figura 3 se muestra un gráfico normalizado de los datos brutos de fluorescencia, que representa medidas duplicadas de cada muestra. Se observó un comportamiento de desplegamiento cooperativo. Las dos moléculas 16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04 mostraron una Tf de 71,3 y 72,6 °C, respectivamente.

[0462] En un segundo brazo de la evaluación de la estabilidad, se controló la monodispersidad de las moléculas durante 4 semanas a diferentes temperaturas. Los resultados del estudio de estabilidad y el contenido de monómero resultante se muestran en la figura 4. Ambas moléculas (16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04) comienzan con un contenido de monómero superior al mínimo del 95 % de monómero y pierden menos del 5 % de monómero con respecto al valor inicial respectivo a una concentración de 10 mg/ml. En estado congelado a -20 °C y <- 65 °C, las muestras solo mostraron diferencias mínimas a lo largo del tiempo. En las condiciones más estrictas (4 °C), la molécula 16-22-H05-sc02 perdió tan poco como un 0,2 % de monómero durante las 4 semanas. Además, se realizó un estudio de estabilidad frente al estrés a una temperatura de 37 °C y una concentración de scFv de 10 mg/ml durante un máximo de 4 semanas. En esta condición, se espera una discriminación más estricta de la propensión a la agregación de las diferentes construcciones. Los datos resultantes resumidos en la figura 6 revelaron una pérdida de monómero del 15 % después de 28 días. Ambos scFv demostraron una buena estabilidad de los monómeros en condiciones de estrés. Los cromatogramas del estudio de estabilidad a 4 °C se proporcionan en la figura 5, donde se muestra la muestra el día 0 y después de 28 días a 4 °C. En esta superposición de cromatograma también se muestran los resultados de la estabilidad de congelación/descongelación. Para esta parte del estudio, las muestras se congelaron y descongelaron repetidamente durante un total de 5 ciclos. La cuantificación resultante del contenido de monómero por SE-HPLC analítica no reveló ningún cambio en las dos muestras (Tabla 5).

[0464] Se realizó un análisis SDS-PAGE para los dos scFv para generar datos de apoyo para la cuantificación por absorbancia UV, confirmando la pureza de la preparación de la muestra y confiriendo así especificidad para la cuantificación del contenido. En otro aspecto de este análisis, los resultados de SDS-PAGE revelaron la ausencia de degradación de proteínas durante el estudio de estabilidad (28 días a 4 °C y una concentración de 10 mg/ml en comparación con la muestra del día 0 almacenada a <-65 °C), que es una característica importante desde una perspectiva de desarrollo.

[0466] Es importante señalar que los diferentes estudios realizados dentro del ámbito de esta evaluación abordan distintos aspectos mecánicos de la estabilidad de las proteínas. La determinación de la temperatura de desplegamiento térmico de una proteína dará resultados complementarios a la medición de la monodispersidad por SE-HPLC tras el almacenamiento a temperatura elevada. Si bien ambos procedimientos están diseñados para dar una estimación de la vida útil y la estabilidad potenciales del producto, los mecanismos abordados son profundamente diferentes. El punto medio de transición (Tm) evaluado mediante desplegamiento térmico es una medida cualitativa de la estabilidad del dominio de la proteína (no permite la determinación termodinámica de *G). Es menos probable que los dominios de proteínas altamente estables (Tm alta) se desplieguen de forma espontánea a temperatura ambiente y, por lo tanto, son menos propensos a la agregación/precipitación irreversible impulsada por interacciones de dominios no plegados. La alta estabilidad del dominio indica un empaquetamiento denso de restos de aminoácidos, que también se correlaciona con la resistencia a la escisión por proteasa. La evaluación de SE-HPLC, por otro lado, determina cuantitativamente el contenido de la fracción monomérica, así como de oligómeros/agregados solubles. Dichos oligómeros solubles son a menudo asociaciones reversibles y relativamente sueltas impulsadas por interacciones electrostáticas o hidrofóbicas entre proteínas plegadas correctamente. Existe cierta correlación entre el Tm evaluado por el desplegamiento térmico y la propensión a la formación de oligómeros/agregados evaluada por SE-HPLC, en particular para proteínas con estabilidad en el "límite". Más allá de un cierto umbral Tm de aproximadamente 60 °C, los dominios variables del anticuerpo son generalmente suficientemente estables para ser resistentes a la agregación/precipitación y la degradación proteolítica debido al desplegamiento parcial del dominio a temperatura ambiente. La oligomerización impulsada por interacciones hidrófobas y/o electrostáticas de restos superficiales puede, sin embargo, seguir produciéndose. De manera destacada, en un estudio de estabilidad acelerada (estrés) a temperatura elevada (por ejemplo, 37 °C), los diversos mecanismos de formación de oligómeros y precipitación pueden ocurrir simultáneamente.

[0468] 1.2.3 Caracterización de la unión y actividad in vitro de scFv humanizados

[0470] A continuación, los scFv humanizados se caracterizaron in vitro por sus propiedades y potencias de unión a la diana. Se analizó la cinética de unión (ka, kd y KD) al TNF* humano y la potencia para neutralizar la apoptosis inducida por TNF* de los fibroblastos L929. Además, se determinó la potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNF* de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) y mono Rhesus (Macaca mulatta), así como la potencia para inhibir la interacción entre TNF* humano y TNFRI/TNFRII mediante ELISA y la selectividad de la diana para la unión a TNF* sobre TNF*.

[0472] Para la comprensión de los resultados siguientes, es importante destacar que,ambos, la transferencia de las CDR de conejo sobre un armazón de dominio variable humano y el cambio en el formato desde IgG de tamaño completo al fragmento scFv pueden afectar a las propiedades farmacológicas. Por ejemplo, una cierta pérdida de afinidad normalmente se asocia con humanización. Además, debido al menor tamaño de los scFV en comparación con la IgG, la capacidad de un scFv para interferir con las parejas de interacción mediante hidrancia estérica se reduce considerablemente. Por último, aunque no menos importante, cabe destacar que debido a su modo bivalente de unión al TNF* homotrimérico, la afinidad de la IgG parental puede haberse indicado como demasiado alta (artefacto SPR). Por consiguiente, cuando se comparan afinidades entre la IgG de conejo bivalente parental y el scFv monovalente humanizado, la "pérdida en afinidad" notificada puede sobreestimarse.

[0474] 1.2.3.1 Afinidad

[0476] La afinidad de los scFv humanizados por el TNF* humano se determinó mediante mediciones de SPR (véase también 2.1.1). La afinidad se determinó usando diluciones en serie por dos de los respectivos scFv. Los scFv procedieron de un anticuerpo monoclonal de conejo. Se generaron dos variantes de scFv, denominados "CDR" (CDR) e "injerto estructural" (STR). Para evaluar la contribución relativa de las sustituciones de marco en las cadenas ligera y pesada y reducir, posiblemente, el número de restos de aminoácidos de conejo introducidos en el marco humano, se realizaron experimentos de barajado de dominios. Por tanto, se generaron construcciones de scFv que contenían una cadena ligera injertada con c Dr y una cadena pesada injertada estructural (CDR/STR) para el clon 16-22-H05.

[0478] Los scFv mejor clasificados 16-22-H05-sc02 (STR) y 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) se unieron con afinidades de 4,5 x 10<-11>y 1,1 x 10<' 10>M, respectivamente. 16-22-H05-sc04 mostró sólo una ligera reducción de la afinidad en comparación con su variante de "injerto estructural" (16-22-H04-sc02) (véase la Tabla 7). Estos resultados sugieren que la afinidad de los scFv humanizados depende principalmente de los pocos aminoácidos de conejo introducidos en el armazón de la cadena pesada humana.

[0480] 1.2.3.2 Potencia

[0482] La capacidad de los scFv humanizados para neutralizar el TNF* humano se analizó usando el ensayo L929 (véase también 2.1.2). Se analizó la potencia (CI<50>e CI<90>) para neutralizar la apoptosis inducida por TNF* para scFv derivados de 16-22-H5 y se comparó con la potencia del anticuerpo de referencia infliximab para permitir la comparación directa de los valores de CI<50>e CI<90>de diferentes placas de ensayo. Los valores relativos de CI<50>e CI<90>se calcularon en unidades de masa (ng/ml) de infliximab y scFv. El análisis de potencia se realizó varias veces en diferentes días con diferentes lotes de fragmentos de anticuerpos. La Figura 7 muestra curvas de dosis-respuesta representativas de un experimento para cada uno de los dos scFv. Los valores medios de las mediciones repetidas se muestran en la Tabla 7 (las desviaciones estándar se resumen en la leyenda de la tabla).

[0484] Los scFv humanizados inhibieron la apoptosis inducida por TNF* con valores de CI<50>e CI<90>más bajos que infliximab (véase la Tabla 7). De acuerdo con los resultados de SPR, la variante de dominio barajado 16-22-H05-sc04 (CDR/STR) exhibió la misma potencia en comparación con el injerto estructural 16-22-H05-sc02 (STR). Los scFv 16-22-H05-sc04 y 16-22-H05-sc02 mostraron excelentes actividades neutralizantes de TNF*, con valores de CI<50>de 14,6 y 13,1 veces mejores que infliximab, respectivamente. Los valores de CI<90>de 16-22-H05-sc04 y 16-22-H05-sc02 fueron 13,1 y 12,6 veces mejores que para infliximab, respectivamente. Como se observó para los anticuerpos monoclonales de conejo parentales, no hubo una correlación clara entre la afinidad y la potencia de los anticuerpos (correlación no mostrada). No obstante, el scFv derivado de 16-22-H05 que muestra las afinidades más altas (16-22-H05-sc02 (STR) y 16-22-H05-sc04 (CDR/STR)) también mostró la potencia más alta. Además, los resultados de los ensayos de neutralización sugieren que es necesario lograr un cierto umbral de afinidad para una inhibición eficaz de la señalización de TNF*. Por ejemplo, los scFv 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) y 17-20-G01-sc01 (CDR), todos unidos a TNF* con afinidades superiores a 1 nM, muestran poco potencial para neutralizar el TNF* (no mostrado).

[0486] 1.2.3.3 Reactividad cruzada de especie (TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus)

[0488] La reactividad cruzada de especie para los scFv mejor clasificados se determinó mediante dos procedimientos: 1) potencia para neutralizar TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus en el ensayo L929 y 2) afinidad por TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus por SPR. La potencia para neutralizar el t Nf * de las diferentes especies se determinó mediante el ensayo L929 de manera similar a como se ha descrito anteriormente para TNF* humano usando TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus, respectivamente (véase también 2.1.2). El TNF* de ambas especies mostró una potencia muy similar para inducir la apoptosis de L929 (datos no mostrados). Por tanto, se utilizaron las mismas concentraciones de TNF* humano y de mono para las pruebas de reactividad cruzada de especie. Además, se determinó la cinética de unión (por SPR) al TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus usando un ensayo similar a la del TNF* humano (véase también 2.1.1).

[0490] Todos los scFv derivados del clon 16-22-H05 mostraron reactividad cruzada con TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus (véase la Tabla 7). Las afinidades eran similares, a saber, 2,0 x 10<-10>y 2,3 x 10<-10>M para el macaco cangrejero y el mono Rhesus, respectivamente. La diferencia de afinidad entre el TNF* humano y de mono fue de aproximadamente 5 veces. Las potencias para neutralizar el TNF* de mono cangrejero, mono Rhesus y ser humano se correlacionaron bien con las afinidades por los respectivos TNF*. En consecuencia, los dos clones derivados de 16-22-H05 mostraron potencias entre 5 y 7 veces menores hacia el TNF* de mono en comparación con el TNF* humano (véanse la Tabla 7 y la Figura 8). En resumen, los dos scFv mostraron reactividad cruzada de especie con TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus.

[0492] 1.2.3.4 Bloqueo de la interacción TNF* humano-TNFRI/II

[0494] Además del ensayo L929, la potencia de cada scFv humanizado para inhibir la interacción entre TNF* humano y TNFRI/II se evaluó mediante ELISA (véase 2.1.3). De manera similar al ensayo L929, los valores de CI<50>individuales en cada placa se calibraron frente a la CI<50>de la molécula de referencia infliximab que se tomó en cada placa y los valores relativos de CI<50>e CI<90>se calcularon en unidades de masa (ng/ml) de infliximab y los scFv.

[0496] Los ensayos de neutralización pueden distinguir las potencias de los anticuerpos bloqueantes de la diana solo si se unen a su diana con una constante de unión en el equilibrio (KD) que es mayor que la concentración de la diana utilizada en el ensayo de potencia (KD > concentración de la diana). Para el ensayo L929 se usó una concentración de TNF* de 5 pM mientras que en los ELISA de inhibición de TNFRI/II se usó una concentración de TNF* de 960 pM. Por tanto, teóricamente, el ensayo L929 puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 5 pM, mientras que el ELISA de inhibición solo puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 960 pM. Dado que todos los scFv analizados mostraron KD por debajo de 960 pM, las potencias entre scFv con diferentes afinidades (pero un mecanismo de acción similar) se pueden diferenciar sólo en el ensayo L929.

[0498] 16-22-H5-sc02 y 16-22-05-sc04 mostraron potencias de bloqueo de la interacción TNF* -TNFRI entre 2,8 y 3,5 veces mayor en comparación con infliximab, mientras que la potencia en comparación con infliximab en el ensayo L929 fue significativamente mayor (13,1 y 14,6 veces). Cuando se comparan los valores relativos de CI<50>para la IgG parental de conejo (véase la Tabla 2) con los valores relativos de CI<50>para los scFv humanizados (Tabla 7), las potencias de los scFv son en general ligeramente superiores en comparación con las IgG parentales, aunque las afinidades en general están en mismo intervalo para la IgG parental de conejo. Dado que las potencias de los anticuerpos y scFv se compararon en unidades de masa, el número de valencias (sitios de unión de TNF*) en cada concentración es aproximadamente 2,9 veces mayor para los scFv monovalentes en comparación con la IgG más de cinco veces más pesada pero bivalente. Con scFv de unión de muy alta afinidad, esto da como resultado un bloqueo más potente de la interacción TNF* y TNFRI/II porque la falta de avidez ya no es crítica para la actividad. Por el contrario, con dominios monovalentes de baja afinidad se ha publicado lo contrario (Coppieters et al., Arthritis & Rheumatism, 2006; 54:1856-1866). Por los motivos mencionados anteriormente, los resultados del ELISA de inhibición no se utilizaron para clasificar las potencias entre los diferentes anticuerpos, sino principalmente para comparar el potencial de los anticuerpos para bloquear la interacción con TNFRI frente a TNFRII. Los scFv investigados bloquearon la interacción entre ambos receptores de TNF* con potencias comparables (Tabla 9, Figura 9 y Figura 10).

[0500] 1.2.3.5 Especificidad de la diana (Selectividad de unión a TNF* frente a TNF*)

[0502] La especificidad de los dos scFv (16-22-H05-sc02 y 16-22-H05-sc04) para TNF* sobre TNF* se confirmó mediante la evaluación del potencial relativo de TNF* en comparación con TNF* para inhibir de forma semimáxima la unión de TNF* a cada scFv y se midió en un ELISA de competición (véase también 2.1.4). Se ha analizado la calidad del TNF* humano recombinante 1) para determinar su pureza mediante análisis SDS-PAGE y HPLC, y 2) para determinar la actividad biológica en el ensayo de citotoxicidad de L929 de ratón, por el fabricante de la proteína. Como se muestra en la Figura 11, la interacción entre cada uno de los scFv con TNF* biotinilado fue bloqueada por TNF* no marcado con valores de CI<50>que varían de 60 a 260 ng/ml, mientras que el TNF* no mostró ningún efecto significativo incluso a la concentración más alta de TNF* probada (1250 pg/ml). En consecuencia, todos los scFv analizados se unen específicamente a TNF* pero no a su homólogo más cercano, TNF*. El TNF* no mostró ninguna inhibición significativa de la unión de TNF* a scFv a las concentraciones ensayadas. Por tanto, la concentración de TNF* requerida para inhibir de forma semimáxima la unión de TNF* tiene que ser significativamente más alta que la concentración más alta de TNF* usada en el ensayo (1250 pg/ml). Cuando se comparan las concentraciones de TNF* y TNF* necesarias para inhibir de forma semimáxima la unión de TNF* a los scFv, la selectividad para la unión a TNF* sobre TNF* es significativamente mayor que aproximadamente 5.000 a 20.000 veces para todos los fragmentos analizados (véase también la Tabla 7). Por tanto, la unión fuera de la diana de cualquiera de los scFv parece muy poco probable.

[0504] Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se resumen en las tablas 7 a 9.

[0505]

[0507] 30 Tabla 8. Especificaciones de scFv humanizados de la presente invención.

[0508] Expresión Producibilidad Estabilidad

[0509] Rendimiento Rendimiento<Desplegamiento>Pérdida de monómero Pérdida de monómero de de después de 4 w a 10 después de 5 ciclos de expresión replegamiento térmico g/l a 4 °C (-65, -20) congelación/descongelación [g/l] [mg/l] [°C] [•% ] [•% ] 16-22-H05- 0,26 29,8 71,3 0,2 (0,0, 0,0) 0,0

[0510] sc02

[0511] 16-22-H05- 0,26 24,1 72,6 0,4 (0,2, 0,1) 0

[0512] sc04

[0514] Tabla 9. Potencia de los scFv para bloquear la interacción TNF* -TNFR1 y TNF* -TNFR2. Bloqueo de la interacción TNF* -TNFRI Bloqueo de la interacción TNF* -TNFRII

[0516]

[0519] 2. Métodos

[0521] 2.1 Ensayos de caracterización principales

[0523] 2.1.1 Cinética de unión y reactividad cruzada de especies por SPR

[0525] Las afinidades de unión de los scFv por el TNF* humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento MASS-1 SPR (Sierra Sensors). El rendimiento del ensayo SPR se calificó mediante el análisis de una interacción de antígeno de anticuerpo de referencia, tal como la interacción certolizumab-TNF*. El certolizumab-fragmento Fab pegilado se seleccionó como referencia debido a su modo de unión monovalente similar al de los scFv. Usando la misma configuración de ensayo que para las mediciones de afinidad de los scFv, se determinó un valor de 9,94 x 10<' 11>M para la afinidad de certolizumab por TNF*. Este valor concuerda bien con los valores de K<d>publicados de 9,02 ± 1,43 x 10<' 11>M (certolizumab BLA; número BLA: 125160; día de presentación: 30 de abril de 2007).

[0527] Para las medidas de afinidad de scFv TNF* humano (Peprotech, n.° cat. 300-01) se inmovilizó en un chip sensor (sensor de afinidad SPR-2, Amina, Sierra Sensors) mediante acoplamiento de amina para alcanzar un nivel de inmovilización de 50 a 100 UR (los niveles de inmovilización alcanzados durante el análisis de SPR estuvieron entre 40 y 120 UR). En una primera etapa, la detección de afinidad de scFv se realizó usando sólo una concentración de scFv (90 nM). En una segunda etapa, para los scFv de mejor rendimiento, la cinética del ciclo de inyección única (SiCK) se midió a partir de un ciclo de inyección único inyectando simultáneamente seis muestras de analito a diferentes concentraciones en cada uno de los ocho canales paralelos en el sistema MASS-1. Para las detecciones de afinidad, se inyectaron scFv humanizados en las células de flujo a una concentración de 90 nM durante tres minutos y se controló la disociación durante 12 minutos. Para las posteriores determinaciones de afinidad más precisas, se inyectaron diluciones en serie por dos de scFv en el intervalo de 45 a 1,4 nM en las células de flujo durante tres minutos y se dejó que la disociación de la proteína de TNF* inmovilizado en el chip sensor prosiguiera durante 12 minutos. Las constantes de la velocidad de disociación aparente (k<d>) y de asociación (k<a>) y la constante de disociación en el equilibrio aparente (K<d>) se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno y la calidad de los ajustes se monitorizaron conforme a Chi<2>, que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Cuanto menor sea el valor de Chi<2>, más preciso será el ajuste al modelo de unión de Langmuir uno a uno. Para las detecciones de afinidad, los resultados se consideraron válidos si el Chi<2>era inferior a 10 para la concentración analizada. En los casos en que se analizaron varias concentraciones de scFv, los resultados se consideraron válidos si el Chi<2>promedio de todas las concentraciones analizadas era inferior a 10. Se cumplieron los criterios de aceptación para todos los scFv analizado.

[0529] La reactividad cruzada de especies con TNF* de macaco cangrejero (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) y de mono Rhesus (R&D Systems, n.° cat. 1070-RM-025/CF) (Peprotech, n.° cat. 315-01 A) se midió usando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNF* humano. Para el TNF* de macaco cangrejero y mono Rhesus se lograron niveles de inmovilización que oscilan entre 50 y 180 UR y entre 90 y 250 UR, respectivamente. Los scFv se analizaron usando diluciones en serie por dos con concentraciones en el intervalo de 45 a 1,4 nM. Los valores promedio de Chi<2>fueron inferiores a 10 para todos los scFv analizados.

[0531] 2.1.2 Apoptosis inducida por TNF- en fibroblastos L929 (neutralización de TNF- humanos, de primates no humanos por scFv)

[0533] La capacidad de los scFv para neutralizar la actividad biológica del TNF* humano recombinante se evaluó utilizando fibroblastos L929 de ratón (patrones ATCC/KGC, N.° de Cat. N.°CCL-1). Las células L929 se sensibilizaron a la apoptosis inducida por TNF* mediante la adición de 1 pg/ml de actinomicina D. Diluciones en serie por tres del anticuerpo de referencia anti-TNF* o scFv (3.000-0,05 ng/ml) y TNF* 5 pM de humano recombinante (Peprotech, n.° de cat. No. 300-01) se preincubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La concentración de TNF* usada (5 pM) induce apoptosis submáxima de L929 (CE<90>). Después de la adición de las mezclas de agonista/inhibidor, las células se incubaron durante 24 horas. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) reactivo de proliferación celular (Sigma Aldrich, n.° cat. 96992). WST-8 se reduce mediante deshidrogenasas celulares a un producto formazán naranja. La cantidad de formazano producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración del anticuerpo de referencia o los scFv necesarios para neutralizar la apoptosis inducida por TNF* en un 50 % y un 90 % (CI<50>y CI<90>) (véase también la Figura 7). Con el fin de hacer que los valores de CI<50>e CI<90>sean directamente comparables entre los experimentos que se realizaron en diferentes días o en diferentes placas de ensayo, Los valores de CI<50>y CI<90>se calibraron frente al anticuerpo de referencia infliximab. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV <20 %).

[0535] La reactividad cruzada de especies con TNF* de macaco cangrejero (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) y de mono Rhesus (R&D Systems, n.° cat. 1070-RM-025/CF) se midió usando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNF* humano. De manera similar al homólogo humano, las concentraciones de TNF* que inducen la apoptosis submáxima de L929 (CE<90>) se utilizaron para las pruebas de reactividad cruzada de especies. El TNF* de ambas especies mostró una potencia muy similar al TNF* humano para inducir apoptosis de fibroblastos de ratón L929. En consecuencia, se utilizó la misma concentración de TNF* (5 pM) para otras especies analizadas. Durante las pruebas de reactividad cruzada de especies, los CV de la mayoría de los puntos de medición por duplicado estuvieron por debajo del 10 %.

[0537] 2.1.3 ELISA de inhibición de TNF•

[0539] El efecto inhibidor de scFv sobre la unión del ligando se evaluó usando un ELISA, un procedimiento bioquímico que reproduce únicamente la interacción entre TNF* y TNFRI y TNFRII.

[0541] Para el primer ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRI fusionado a la región Fc de la IgG humana (R&D Systems, N.° de Cat. n.° cat. 372-RI) se revistió sobre un ELISA Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 0,5 pg/ml. Para el segundo ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRII fusionado a la región Fc de la IgG humana (R&D Systems, N.° de Cat. 726-R2) se revistió a una concentración de 2 pg/ml. Todas las etapas posteriores fueron idénticas para ambos ensayos. Para detectar la unión de TNF* a TNFRI y TNFRII, el TNF* se biotiniló antes de su uso. Primero se incubó TNF* humano biotinilado (960 pM, 50 ng/ml) con scFv anti-TNF* humanizado diluido en serie 3 veces e infliximab (10.000 ng/ml-0,2 ng/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de TNF*/fragmento de anticuerpo se transfirieron a las placas con el receptor de TNF inmovilizado y se detectó la unión de TNF* no bloqueado al receptor de TNF* inmovilizado después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos con estreptavidina HRP de unión a biotina (SDT Reagents, n.° cat. SP40C). La adición de sustrato de 3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) dio como resultado una lectura colorimétrica que era proporcional a la unión de TNF* a TNFRI y TNFRII. Antes de su uso en el ELISA de competición, la actividad biológica del TNF* biotinilado se confirmó en el ensayo L929. La CE<50>del TNF* biotinilado fue similar a la CE<50>del TNF* sin marcar (datos no mostrados). Similar al ensayo L929 descrito anteriormente, los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de scFv necesarios para inhibir la interacción de TNF* y TNFR en un 50 % y un 90 % (CI<50>y CI<90>). Con el fin de hacer que los valores de CI<50>e CI<90>sean directamente comparables entre los experimentos que se realizaron en diferentes días o en diferentes placas de ensayo, Los valores de CI<50>y CI<90>se calibraron frente al anticuerpo de referencia infliximab.

[0543] Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV <25 %).

[0545] 2.1.4 Especificidad de la diana

[0547] Para confirmar la especificidad de los scFv anti-TNF*, se evaluó la unión al miembro de la familia más homólogo TNF*. El potencial para inhibir la interacción de TNF* biotinilado con scFv por TNF* no marcado (Peprotech, n.° cat.

[0548] 300-01B) y TNF* (Peprotech, n.° cat. 300-01) se analizó mediante ELISA de competición. Para este fin, se revistió una placa ELISA Maxisorp de 96 pocillos con scFv a una concentración de 1 pg/ml. Se detectó la unión de TNF* biotinilado (75 ng/ml) a los scFv del revestimiento en presencia de TNF* no marcado diluido en serie 5 veces (50 pg/ml - 0,00013 pg/ml) o TNF* (1250 pg/ml - 0,00013 pg/ml) utilizando estreptavidina-HRP de unión a biotina SDT Reagents, n.° cat. SP40C) como se ha descrito anteriormente. Para la curva de dosis-respuesta con TNF*, los datos se analizaron usando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de TNF* sin marcar requerida para bloquear la interacción de TNF* biotinilado con el scFv de revestimiento en un 50 % (CI<50>). El TNF* no mostró ninguna inhibición significativa de la interacción entre el TNF* biotinilado y los scFv (véase también la Figura 11). Para cuantificar el potencial relativo de TNF* en comparación con TNF* para inhibir la unión de TNF* a cada scFv se calculó la CI<50>para inhibir la interacción por TNF* con respecto a TNF*. Dado que no se observó una inhibición significativa cuando se usó TNF* a una concentración de aproximadamente 5.000 a 20.000 veces mayor que la CI<50>de TNF*, se determinó que la selectividad para la unión a TNF* sobre TNF* era significativamente mayor que 5.000 a 20.000 veces. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV < 25 % para todas menos una de las concentraciones de TNF*/* analizadas). Todos los scFv cumplieron este criterio.

[0550] 2.1 Análisis de CMC

[0552] 2.2.1 Reducción de SDS-PAGE

[0554] La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es una técnica de análisis utilizada para la caracterización cualitativa y para controlar la pureza de las proteínas. De acuerdo con la Farmacopea de Estados Unidos (USP) (USP, Capítulo 1056), la electroforesis analítica en gel es un procedimiento apropiado y de rutina para identificar y evaluar la homogeneidad de proteínas en sustancias farmacológicas.

[0556] El procedimiento se utiliza para cuantificar la cantidad de producto scFv de lisados de E. coli para obtener el rendimiento de expresión después de la fermentación. Otra aplicación del procedimiento es verificar la identidad de las sustancias de ensayo en función de su peso molecular con respecto a los valores teóricos. Con fines de apoyo, este procedimiento se utiliza para cuantificar la pureza de las muestras de prueba con respecto a las impurezas relacionadas con el proceso (proteínas de la célula huésped) y las impurezas relacionadas con el producto (productos de degradación o aductos).

[0558] Los análisis de SDS-PAGE se realizaron con un sistema de gel prefabricado comercialmente disponible "Mini Protean" obtenido de Bio-Rad Laboratories Inc. Se analizaron scFv humanizados en geles de resolución "Cualquier kD" (n.° 456-9036). En ambos casos se utilizó el sistema tampón Tris/Glicina recomendado por el fabricante. Para la detección de bandas de proteínas se empleó tinción de Coomassie con la solución de tinción SimplyBlueTM (Life Technologies Corp., N.° LC6060) o la tinción con plata con el kit Pierce Silver Stain (Thermo Fisher Scientific Inc., N.° 24612). Para los procedimientos de tinción se siguieron los protocolos del respectivo proveedor.

[0560] La documentación y análisis de los geles de proteínas teñidos se realizó con el sistema de documentación ChemiDoc XRS System (Bio-Rad Laboratories Inc., n.° 170-8265) y software Image Lab, Versión 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., n.° 170-9690).

[0562] Determinación de títulos de muestras de lisados

[0564] La SDS-PAGE permite la detección específica de la proteína de interés en la mezcla de proteínas de la célula hospedadora. En cada gel se incluyó una serie de diluciones estándar de referencia en el intervalo lineal del procedimiento (que se determinó de antemano). Se utilizó una regresión lineal de las intensidades de banda (medidas por densitometría) frente a las concentraciones nominales del estándar de referencia para calcular una curva patrón, lo que, a su vez, se utilizó para extrapolar el contenido de scFv en la muestra.

[0566] Las muestras de lisado de concentraciones de producto desconocidas se cargaron en diferentes diluciones (al menos 1:10 en tampón de dilución) para tener al menos una concentración de scFv en el intervalo lineal del procedimiento. La cantidad de producto se calculó conforme a las intensidades de banda medidas del scFv y la concentración se determinó usando los factores de dilución de la preparación de la muestra. Los valores se promediaron para todas las muestras que estaban dentro del intervalo lineal de la curva estándar.

[0568] Como prueba adicional de la idoneidad del procedimiento para la cuantificación de la muestra de lisado, se realizó una prueba de inhibición/mejora añadiendo una muestra de lisado con una cantidad conocida de patrón de referencia. El cálculo de la recuperación de picos a una dilución de la muestra de 1:10 en tampón de dilución dio como resultado un valor del 95,4 % que tiene el mismo nivel de precisión que el observado con el patrón de referencia en tampón de dilución. Por lo tanto, no se observó una interferencia significativa de la matriz en los lisados celulares y el procedimiento se consideró adecuado para la cuantificación del contenido de scFv en los lisados celulares.

[0569] Pureza y contenido de proteínas

[0571] Para demostrar la idoneidad del procedimiento para determinar el contenido y, por lo tanto, también la pureza de las muestras de prueba, el límite inferior de detección (LOD) para un scFv de referencia se determinó visualmente (identificando la banda de proteína) a una carga nominal de 0,02 pg, la evaluación del histograma de intensidad de la calle respectiva muestra una relación señal/ruido a esta carga de aproximadamente 2. Además, el intervalo lineal para la cuantificación se determinó analizando densitométricamente las bandas principales.

[0573] El ajuste de los datos con una regresión lineal, da como resultado un coeficiente de determinación (R<2>) de 0,9998, lo que indica una buena calidad del ajuste. Además de la calidad general del ajuste, se determinó el error relativo de cada punto de datos individual para documentar la idoneidad del procedimiento en el intervalo elegido. Los errores relativos están por debajo del 10% para todos los puntos de datos que indican una buena precisión de este procedimiento.

[0575] 2.2.2 Absorbancia UV a 280 nm

[0577] El procedimiento de absorbancia UV a 280 nm es un ensayo de proteína total como se describe en el Capítulo 1057 de la USP. Las soluciones de proteínas absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm debido a la presencia de aminoácidos aromáticos. La absorbancia UV es una función del contenido de restos de tirosina y triptófano en la proteína y es proporcional a la concentración de proteína. La absorbancia de una solución de proteína desconocida se puede determinar de acuerdo con el Capítulo 851 de la USP sobre espectroscopía aplicando la ley de Beer: A= •*l*c, donde la absorbancia (A) es igual al producto de la absortividad molar (•), la longitud de la ruta de absorción y la concentración de la sustancia. La absortividad molar del scFv se calculó con el software Vector NTI<®>(Life Technologies Corporation).

[0579] La medición de la absorbancia UV se realizó con el lector Infinity M200 Pro equipado con placa Nanoquant (Tecan Group Ltd.). La absorbancia de las muestras de proteína se midió a 280 nm y 310 nm, donde la última longitud de onda sirvió como una señal de referencia que se restó de la señal de 280 nm. Para tener en cuenta la posible interferencia de la matriz de la muestra, se realizó una resta en blanco para cada medición.

[0581] La señal de absorbancia final de una muestra de proteína obtenida se usó para calcular la concentración de proteína usando la ley de Lambert-Beer.

[0583] Todas las mediciones se realizaron dentro del intervalo dado por las especificaciones del instrumento en el intervalo de medición de DO 0-4, cuando el fabricante especifique una reproducibilidad <1 % y una uniformidad < 3 %.

[0585] 2.2.3 SE-HPLC (cromatografía líquida de alta presión con exclusión por tamaño)

[0587] SE-HPLC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida como se describe en el capítulo 621 de la USP. Este procedimiento separa las moléculas en función de su tamaño y forma utilizando una fase estacionaria hidrófoba y una fase móvil acuosa. La separación de moléculas se produce entre el volumen de vacío (V<0>) y el volumen de permeación total (V<t>) de una columna específica. Las mediciones por SE-HPLC se realizaron en un sistema Chromaster HPLC (Hitachi High-Technologies Corporation) equipado con inyección de muestra automatizada y un detector de UV ajustado a la longitud de onda de detección de 280 nm. El equipo está controlado por el software EZChrom Elite (Agilent Technologies, Versión 3.3.2 SP2) que también admite el análisis de los cromatogramas resultantes. Las muestras de proteína se aclararon mediante centrifugación y se mantuvieron a una temperatura de 6 °C en el muestreador automático antes de la inyección. Para el análisis de muestras de scFv se empleó la columna Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., # F6989201) con una fase móvil de solución salina tamponada estandarizada (acetato de sodio 50 mM a pH 6,0, cloruro de sodio 250 mM) al caudal recomendado. de 0,35 ml/min. La carga de la muestra diana por inyección fue de 5 pg. Las muestras se detectaron mediante un detector de UV a una longitud de onda de 280 nm y los datos se registraron mediante un paquete de software adecuado. Los cromatogramas resultantes se analizaron en el intervalo de V<0>a V<t>excluyendo así los picos asociados a la matriz con un tiempo de elución > 10 min.

[0589] Para asegurar una precisión intermedia del procedimiento, se midió de forma rutinaria un patrón de referencia al principio y al final de cada secuencia de HPLC. El patrón de referencia utilizado para esta prueba de idoneidad del sistema fue un scFv que se había producido como un lote y se dividió en alícuotas para usarse en cada punto de tiempo de medición.

[0591] 2.2.4 DSF (Fluorimetría diferencial de barrido)

[0593] El procedimiento DSF es un procedimiento no compendial para medir el desplegamiento de proteínas dependiente de la temperatura. La medición de la temperatura de desplegamiento térmico por DSF se realizó con una máquina de qPCR MX3005P (Agilent Technologies) controlada con el paquete de software MX Pro (Agilent Technologies) y equipada con un filtro de excitación/emisión ajustado a 492/610 nm. Las reacciones se prepararon en placas de PCR blancas Thermo fast 96 (Abgene; N.° AB-0600/W). Para la detección del desplegamiento de las proteínas, una solución madre disponible comercialmente del colorante SYPRO orange (Molecular Probes; n.° S6650) se utilizó a una dilución final de 1:1.000. Las muestras de proteína se diluyeron para las medidas de desplegamiento hasta una concentración final de 50 pg/ml en una solución salina tamponada estandarizada. El desplegamiento térmico se realizó mediante un programa de temperatura a partir de 25 °C aumentando hasta 96 °C en etapas de 1 °C con una duración de 30 segundos. Durante el programa de temperatura se registró la emisión de fluorescencia de cada muestra. Los datos brutos registrados se procesaron y evaluaron con un paquete de plantillas de Microsoft Excel (Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2, N.° 9) y los datos de fluorescencia se ajustaron con una ecuación de Boltzmann utilizando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) para obtener el punto medio de transición (T<m>).

[0595] Con el fin de producir medidas fiables y robustas del punto medio del desplegamiento, se realizaron al menos medidas duplicadas. Con respecto a la calidad de los datos, solo se consideraron las mediciones con una bondad de ajuste (R<2>)> 0,9900 y un intervalo de confianza del 95 % del T<m>menor del 0,5 %.

[0597] Para una evaluación de la precisión intermedia, se incluyó un patrón de referencia (scFv caracterizado conocido) con cada medición para permitir la comparación del rendimiento del ensayo en diferentes días.

[0599] 2.2.5 Estudio de estabilidad

[0601] Para evaluar la estabilidad de diferentes construcciones scFv como lectura de la capacidad de desarrollo de estas moléculas, se diseñó un protocolo de estudio de estabilidad a corto plazo. Las construcciones de proteínas se concentraron en una formulación salina tamponada simple (véase anteriormente) a las concentraciones diana de 1 y 10 mg/ml. El contenido de monómero se determinó mediante SE-HPLC para confirmar que la pureza supera los criterios de éxito de > 95 %. Posteriormente, las muestras de proteínas se almacenaron a <-65, -20, 4 y 37 °C durante 4 semanas y se analizaron alícuotas en varios puntos de tiempo. La lectura principal es el análisis por SE-HPLC, lo que permite la cuantificación de oligómeros y agregados solubles de peso molecular superior. Como medidas de apoyo, el contenido de proteínas se determina mediante la absorbancia UV a 280 nm, lo que da una indicación de si durante el período de almacenamiento se perdieron cantidades sustanciales de proteína por precipitación. Para el almacenamiento se utilizaron tubos con tapón de rosca (Sarstedt, n.° cat. 72.692.005) con cantidades de llenado de 30-1500 pg por alícuota. Además, la pureza se determina mediante SDS-PAGE que indica la estabilidad de la construcción con respecto a la degradación o multimerización covalente.

[0603] Ejemplo 3: Generación de diacuerpo e IgG humanizados

[0605] La construcción de diacuerpo monocatenario se diseñó ordenando los dominios variables en una configuración VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA. En estas construcciones, los dominios VLA y VHA y VLB y VHB forman conjuntamente el sitio de unión para TNFv Los enlazadores peptídicos L1-L3 que conectan los dominios variables se construyeron a partir de repeticiones de glicina/serina. Los dos enlazadores cortos L1 y L3 están compuestos por una sola repetición G<4>S, mientras que el enlazador largo L2 está compuesto por la secuencia (G<4>S)<4>. Las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios variables humanizados (Ejemplo 2; 1.2.1.) se sintetizaron y clonaron de novo en un vector adaptado para la expresión en E.coli que se basa en un esqueleto pET26b(+) (Novagen). La expresión y purificación se realizaron como se describe para los scFv en el Ejemplo 2; 1.2.1.

[0607] La IgG humanizada se construyó clonando los dominios variables en un vector de expresión de mamífero adecuado para la expresión heteróloga transitoria que contiene una secuencia líder y los respectivos dominios constantes, por ejemplo, los vectores pFUSE-rlgG (Invivogen). La expresión transitoria de la IgG funcional se realizó mediante cotransfección de vectores que codifican las cadenas pesada y ligera con el sistema Freestyle<™>MAX en células CHO S. Después de cultivar durante varios días, se recuperó el sobrenadante de las células secretoras de anticuerpos para su purificación. Posteriormente, las IgG secretadas se purificaron por afinidad mediante Proteína A sefarosa (GE Healthcare). Las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE, absorbancia UV a 280 nm y SE-HPLC.

[0608] Las afinidades de las moléculas de anticuerpo se determinaron usando un instrumento Biacore como se describe en el Ejemplo 2 en 2.1.1).

[0610] Tabla 10

[0611] ka (M -V ) kd(s-1) K<d>(M)

[0613] IgG 1,90 x 106 7,92 x 10-5 4,17 x 10-11

[0615] scDb 9,40 x 105 2,02 x 10-5 2,15 x 10-11

[0617] scFv 8,93 x 105 3,38 x 10-5 3,79 x 10-11

[0619] Las potencias de las moléculas de anticuerpo se determinaron en un ensayo L929 (el procedimiento se describe en el Ejemplo 2 en 2.1.2).

[0620] Tabla 11

[0621] Potencia CI<50>(nM)

[0623] IgG 0,02

[0625] scDb 0,01

[0627] scFv 0,03

[0629] Ejemplo 4: Determinación de la estequiometría de la unión a TNF*

[0631] La estequiometría de unión de 16-22-H5 a TNF* se determinó usando SE-HPLC. 16-22-H5-scFv y TNF* se incubaron en dos proporciones molares diferentes, a saber, en una relación molar de 1:1 y 4,5:1. Dado que el TNF* existe como un trímero en solución, las relaciones molares indicadas se refieren al TNF*<trímero.>Por lo tanto, en la proporción de 4,5:1, el 16-22-H5-scFv está en exceso y debería ocupar todas las posiciones de unión a TNF*<trímero>dando como resultado complejos de 1 TNF*<trímero>con 3 scFv. Sin embargo, en condiciones equimolares, no hay suficiente scFv presente para saturar los 3 sitios de unión teóricos de TNF*. Por tanto, también se esperan variantes complejas con menos de 3 scFv unidos. Se incubaron TNF* y 16-22-H5-scFv durante 2 horas a TA para permitir la formación del complejo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos. Se analizaron 10 pl de cada muestra en SE-HPLC. El análisis SE-HPLC se realizó con tampón fosfato 50 mM a pH 6,5, NaCl 300 mM como eluyente a un caudal de 0,35 ml/min. Los picos de proteína eluida se detectaron a una longitud de onda de 280 nm. La columna se calibró con el kit de calibración de filtración en gel de GE Healthcare (LMW, HMW) de antemano para la determinación de los pesos moleculares aparentes.

[0633] El panel inferior de la figura 12 muestra el perfil de elución con cantidades equimolares de scFv y TNF* que está superpuesto con los perfiles de TNF*<trímero>solo y scFv solo. Debido a la trimerización del TNF* en solución, existen teóricamente hasta tres sitios de unión equivalentes para el scFv presente en cada trímero y, por lo tanto, las moléculas de scFv son limitantes. En estas condiciones, se identificaron las tres especies complejas (3:1, 2:1, 1:1). El panel superior de la figura 12 muestra el perfil de elución del complejo con cantidades en exceso de scFv. El excedente de scFv no unido se eluyó en el tiempo de retención esperado. El pico de TNF* se consumió cuantitativamente para la formación del complejo y desapareció por completo. El pico de este complejo se desplazó hacia tiempos de retención más bajos y se correlacionó bien con el tiempo de retención del pico con el mayor peso molecular de la configuración equimolar. Por esta razón, se concluyó que todos los sitios de unión disponibles en el TNF* estaban ocupados por scFv y, por lo tanto, la estequiometría de unión es 3:1 (scFv:TNF*) si el scFv está disponible en exceso.

[0635] Además de estas observaciones cualitativas, la estequiometría de unión aparente también se calculó basándose en el PM aparente del complejo 16-22-H5-scFv:TNF* según lo determinado mediante SE-HPLC. Basado en el tiempo de retención, se calculó que el PM aparente era 139,7 kDa. Según la ecuación (1) a continuación, se calculó que la estequiometría de unión aparente era 3,3. Esto se correlaciona bien con el número teórico de tres sitios de unión equivalentes disponibles para scFv en el TNF*<trímero>y las observaciones anteriores en las que se determinó una estequiometría de unión de 3:1.

[0637] Ecuación (1): estequiometría de unión (scFv: TNF*) = “ (..........— -----------(................... ^

[0639] PM (aplicación compleja): 139,7 kDa

[0641] PM (TNF* theo): 52,2 kDa

[0643] PM (scFv theo): 26,5 kDa

[0645] Ejemplo 5: Formación de complejos TNF*:anticuerpo (reticulación del TNF*)

[0647] La capacidad del 16-22-H5-scDb para unirse simultáneamente a dos moléculas de TNF* se probó en un instrumento Biacore T200 en tampón HEPES que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM y glicerol al 0,05 %. Se capturó TNF* biotinilado (Acro Biosystems) a través de un oligo ADNss biotinilado utilizando el kit Biotin CAPture (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyectaron 0,25 pg/ml de TNF* biotinilado con un caudal de 10 pl/min durante 3 minutos para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 300 UR (unidades de resonancia). Los anticuerpos 16-22-H5-scDb y 16-22-H5-scFv, como control, se inyectaron sobre la superficie inmovilizada con TNF* durante 2 minutos a un caudal de 30 pl/min a una concentración de 90 nM. Tras la asociación de los fragmentos de anticuerpos, se inyectó TNF* (Peprotech) durante 5 minutos con un caudal de 30 pl/min a 90 nM. Las concentraciones de anticuerpo y TNF* se seleccionaron cerca de la saturación de la unión. La medición se realizó a 25 °C. La figura 13 ilustra que el 16-22-H5-scDb bivalente es capaz de unir dos moléculas de TNF* simultáneamente mientras, como se esperaba, el 16-22-H5-scFv monovalente se une solo a una molécula de TNF*.

[0648] Además, la formación de complejos TNF*-anticuerpo se evaluó en diferentes proporciones de TNF* y formatos de anticuerpo 16-22-H5 usando SE-HPLC. Se incubaron 16-22-H5-IgG (150 kDa) y 16-22-H5-scDb (52 kDa) con TNF* (52 kDa) en diferentes proporciones molares (1:3, 1:1, 3:1) con respecto a los sitios de unión. Por lo tanto, IgG y scDb tienen 2 y TNF* tiene 3 sitios de unión. Las mezclas de anticuerpo-TNF* se incubaron durante al menos 30 minutos a 37 °C, se enfriaron durante 10 minutos a TA y se almacenaron durante la noche a 2-8 °C. Se inyectaron de cinco a 10 ul de mezcla de proteínas a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en una columna TOSHO TSKgel UP-SW3000. El análisis se realizó con tampón fosfato 150 mM a pH 6,8, NaCl 100 mM como eluyente a un caudal de 0,3 ml/min. Los picos de proteína eluida se detectaron a una longitud de onda de 214 nm. La columna se calibró previamente utilizando la mezcla estándar de proteínas BEH450 SEC (Waters) para la determinación de los pesos moleculares aproximados de los complejos. La figura 14A muestra la formación de complejos 16-22-H5-IgG:TNF*. Los complejos que son • 600 kDa indican la formación de complejos que consisten en • 2 TNF* y • 3 moléculas de IgG. La figura 14B muestra la formación de complejos 16-22-H5-scDb:TNF*. Los complejos que son • 300 kDa indican la formación de complejos que consisten en • 2<t>N<f>* y • 3 moléculas scDb.

[0650] Ejemplo 6: Ihibición de la proliferación celular

[0652] La capacidad de diferentes formatos de anticuerpos de 16-22-H5 y adalimumab para inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se probó en una reacción mixta de linfocitos (MLR). Se cultivaron PBMC de 2 donantes sanos (RPMI1640) en una proporción 1:1 en placas de 96 pocillos durante 48 horas a 37 °C/5 % de CO<2>. Después de la activación, las células se trataron con anticuerpos anti-TNF* o anticuerpo de control IgG (todos a una concentración final de 10 pg/ml) por sextuplicado durante otros 5 días a 37 °C/5 % de CO<2>. 24 horas antes del final de la incubación, se añadió BrdU (20 pl/pocillo) a cada pocillo y se determinó la proliferación midiendo la absorción de BrdU usando un ELISA de proliferación celular disponible comercialmente (Roche Diagnostics). El índice de estimulación se determinó calculando la proporción de captación de BrdU entre las células tratadas con anticuerpo y las células tratadas con mitomicina C (25 ng/ml). La Tabla 12 y la figura 15 ilustran que todos los formatos de anticuerpos probados de 16-22-H5 inhibieron significativamente la proliferación de linfocitos T comparable a adalimumab.

[0654] Tabla 12

[0657]

[0660] Ejemplo 7: Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS

[0662] Se sembraron monocitos CD14<+>en RPMI1640 en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 16 horas a 37 °C/CO<2>al 5 % en una incubadora humidificada. Luego, las células se trataron con anticuerpos anti-TNF* o anticuerpo de control IgG por duplicado durante 1 hora usando concentraciones finales de anticuerpo que variaban de 2 a 2.000 ng/ml. Los monocitos se lavaron 3 veces con medio de cultivo celular y posteriormente se incubaron con LPS (100 ng/ml) durante 4 horas a 37 °C/5 % de CO<2>. Las concentraciones de IL-1* y TNF* en los sobrenadantes del cultivo celular se determinaron usando kits de ELISA disponibles comercialmente (R&D Systems). Los resultados se muestran en las Tablas 13 y 14 y en las Figuras 16A y B. La CI<50>se determinó usando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. Con respecto a la secreción de IL-1*, los valores de CI<50>para 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5-scFv y adalimumab se resumen en la Tabla 13 a continuación.

[0664] Tabla 13. Secreción de IL-1*

[0667]

[0670] En cuanto a la secreción de TNF*, los valores de CI<50>determinados para 16-22-H5-IgG, 16-22-H5-scDb, 16-22-H5scFv se resumen en la Tabla 14.

[0671] Tabla 14. Secreción de TNF*

[0673]

[0675] Tabla 15. Secuencias consenso de V*1 reor anizada

[0676]

[0678] T l 1 n i m r I n l lín rmin l *

[0680]

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al factor alfa de necrosis tumoral humano (TNF*), en donde dichos anticuerpo o fragmento funcional comprenden (i) un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:54 y (ii) un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:13.

2. El fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un fragmento variable de cadena única (scFv).

3. El fragmento funcional de la reivindicación 2, en el que dicho scFv tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 55.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es una inmunoglobulina G (IgG).

5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Un vector o un plásmido que comprenden el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o el vector o el plásmido de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para preparar el anticuerpo o el fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 7 en un medio en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento funcional y recuperar el anticuerpo o el fragmento funcional de las células o del medio.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y, opcionalmente, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptables.

10. El anticuerpo o el fragmento funcional según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio.

11. El anticuerpo o el fragmento funcional para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

12. El anticuerpo o el fragmento funcional para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.

13. El anticuerpo o el fragmento funcional para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en donde dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.