TWI719112B - 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途 - Google Patents

Abstract

一種雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段之用途。

Description

雙重V區類抗體蛋白質之用途

一種雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段之用途。

發明背景

介白素-4(IL-4)是一種多功能型的細胞激素(pleiotropic cytokine)，其對於淋巴B細胞和T細胞、非淋巴細胞(包含單核細胞、內皮細胞和纖維母細胞具有廣譜的生物效應，舉例來說，IL-4會刺激一些IL-2和IL-3-依賴性的細胞株增生、誘導休眠B細胞上表現第II類主要組織相容性複合體分子和增進人類B細胞分泌IgG4和IgE。IL-4和Th2型的免疫反應有關，係由Th2細胞分泌並促進Th2細胞的分化，並已知IL-4和多種疾病有關，例如過敏和氣喘。

IL-13是最近被確認的一種具有112個胺基酸之細胞激素(Minty,A.等人，Nature,1993,362,248-250，和McKenzie,A.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1993,90,3735-3739)，其係由活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞和受到活化的肥大細胞(mastocytes)分泌，因為IL-13具有多種和IL-4相同的生物特性，因此IL-13被定義為一種類IL-4的細胞激素。IL-13的活性確實和B細胞中的IL-4(Defrance,T.等人，J.Exp.Med.,1994,179,135-143,Punnonen,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1993,90,3730-3734,Fior,R.等人，Eur.Cytokine Network,1994,5,593-600)、單核細胞(Muzio,M.R.F.等人，Blood,1994,83,1738-1743,De Waal Malefyt,R.等人，J.Immunol,1993,151,6370-6381,Doyle,A.等人，Eur.J.Immunol.1994,24,1441-1445, Montaner,L.J.等人，J.Exp.Med.,1993,178,743-747,Sozzani,P.等人，J.Biol.Chem.,1995,270,5084-5088)和其他非造血細胞(Herbert,J.M.等人，Febs Lett.,1993,328,268-270和Derocq,J.M.等人，Febs Lett.1994,343,32-36)十分相似。在另一方面，與IL-4不同，它並不會對休眠或活化的T細胞產生一特殊影響(Zurawuki,G.等人，Immunol.Today,1994,15,19-26)。

IL-13對於單核細胞/巨噬細胞、B淋巴細胞和特定造血前驅物之多種生物活性已由A.J.Minty及IL-13之評論文章詳細敘述，此外，也有一些資料指出這種生長激素對於其他細胞類型也會產生一種多效作用(pleiotropic effect)。這些會直接受到IL-13影響的非造血細胞包括有內皮和微小膠質細胞、角質細胞和腎臟和大腸直腸癌。

進行細胞內生物分子傳遞的訊號分析之階段之一係在於確認該生物分子的膜受體，這些研究對於IL-13受體的探討發現，IL-13和IL-4具有相同的受體，或是至少具有一共用受體複合體的一些成分，以及共用的訊號傳遞元素(Zurawski S.M.等人，Embo Journal,1993,12,2663-2670,Aversa,G.等人，J.Exp.Med.,1993,178,2213-2218,Vita,N.等人，Biol.Chem.,1995,270,3512-3517,Lefort,S.等人，Febs Lett.,1995,366,122-126)。此受體係出現在多種類型細胞的表面，根據所考慮細胞類型而有不同之數目。A.J.Minty已指出關於IL-13和IL-4受體的分布比較(Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease.Eds D.G.Remick and J.S.Frie,Marcel Decker,N.Y.1996)。

細胞表面受體和受體複合體係以不同親和性和IL-4和/或IL-13結合，和IL-4和/或IL-13結合的受體和受體複合體之主要成分為IL-4Rα、IL-13Rα1和IL-13Rα2，這些鏈係以IL-4Rα/IL-13Rα1(第II類IL-4R)和IL-4Rα/γc(第I類IL-4R)之單體或異二聚體(heterodimers)表現於細胞表面。IL-4Rα單體和IL-4Rα/γc異二聚體會和IL-4結合，但是不會和IL-13結合。IL-13Rα1和IL-13Rα2單體則可以和IL-13鍵結，卻不會和IL-4鍵結。IL-4Rα/IL-13Rα1異二聚體則可以和IL-4及IL-13結合(Murata等人，Int.J.Hematol.,1999,69,13-20)。

Th2型的免疫反應會促進抗體產生及體液免疫性，以擊退細胞外的病原菌。Th2細胞是產生Ig蛋白質(體液免疫性)的中介物並且會產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13(Tanaka，等人，Cytokine Regulation of Humoral Immunity,251-272,Snapper,ed.,John Wiley & Sons,New York(1996))。Th2型的免疫反應的特色在於產生特定細胞激素(例如IL-4和IL-13)以及特殊種類的抗體(IgE和IgG4)，且為典型的過敏反應，並可能造成眼睛流淚以及氣喘症狀，例如呼吸道發炎和肺部氣道肌肉的收縮。

基於IL-4和IL-13的生物特性和在許多疾病(包括氣喘)中扮演重要角色，使得它們為治療用的重要細胞激素(Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005,Vo.5,161-166)。目前已知IL-4可以抑制自體免疫疾病，且IL-4和IL-13都已顯示出增進抗腫瘤免疫反應的潛力。IL-4、IL-13以及其受體的增加已與特發性肺部纖維化(IPF)的致病有關(Jakubzick C.等人，Am J Pathol.2004：164(6)：1989-2001；Murray LA等人Int J Biochem Cell Biol.2008：40(10)：2174-82)，此文獻中的證據則證實Th2細胞激素IL-4和IL-13在IPF的致病機轉上扮演多重的角色，作為肺部組織重建和纖維化的媒介物。雖然肺部中Th2類型的CD4+t細胞可能是IL-4和IL-13的主要來源，並且係與作為細胞外間質重建之重要調控物相關(Wynn,TA,Naat.Rev.Immunol,4：583-594,2004)，但是其他細胞例如肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨嗜細胞和上皮細胞也可能為這些細胞激素的來源(Gordon S和Martinez FO,Immunity Rev.32：593-604,2010)。在IPF患者中，支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13的含量相較於正常的對照組係上升，有些證據則會推測，可將這些細胞激素抑制或中和的治療具有延緩IPF患者中纖維化進程，因為這兩種細胞激素都和過敏性疾病和纖維化疾病的發病有關，藉由抑制這些細胞激素有可能可以產生治療上的效益。

因此，有必要開發出不具免疫原性且安全用於人類之抑制IL-4、抑制IL-13的改良藥劑以及同時抑制IL-4和IL-13的單一藥劑。本發明人先前報導一種具有特異性結合至IL-4和IL-13之四個結合位置的雙重V區類抗體鍵 結胜肽(WO2009/052081(PCT/US2008/079787)，其係完整地以參考方式併入本文中。

發明說明

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有利用梯行法計算血漿濃度和時間曲線圖中時間零點到實際時點的面積(AUC_last)為約433微克˙小時/毫升至約14200微克˙小時/毫升。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，且此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在進一步具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子(peptide linker)彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在更進一步之具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有以血漿濃度和時間曲線圖外推至極限值之區域面積(AUC)為約459微克˙小時/毫升至大約670014500微克˙小時/毫升。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在其他具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全 治療劑量係等於或小於300毫克，在更進一步之具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有一觀察到的最大血漿濃度(C_max)介於約0.717微克/毫升至大約28.7微克/毫升。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有達到最大血漿濃度的第一時間(t_max)為約96小時至約168小時。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人 類個體IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有t_last為約1679小時至約2020小時。在本發明之另一具體實例中，此具有雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有t_1/2Z值為約244小時至約536小時。在本發明之一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段係包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有V_SS/F值為約6830毫升至約18770毫升。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3 的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種最大安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段，其具有CL/F值為約12.1毫升/小時至約38.4毫升/小時。在本發明之另一具體實例中，此雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段係包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種確認或監測存在已投與至人類個體之安全治療劑量的特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段的方法，該方法包含：(a)將一劑量之該雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段投與該人類個體；(b)檢測選自由下列組成之群組中一或多個事件：在急診室或在家因為過敏性支氣管痙攣而進行的加強治療、血液惡病質(blood dyscrasias)、抽搐、丙胺酸轉胺酶(ALT)讀值大於正常範圍值上限(upper limit of normal range，ULN)的3倍且總膽紅素讀值大於ULN的2倍、無症狀下ALT升高至大於ULN的10倍、出現藥物依賴或是藥物濫用現象、ALT升高至大於或等於ULN 的2倍、hsCRP等於或超過72小時大於10毫克/公升、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)讀值大於ULN的2倍、在心電圖(ECG)儀器上心室去極化(ventricular depolarization and repolarization time，QT)，其中QT為經過ECG儀器校正的讀值(QTc)，亦即QTc大於或等於500毫秒，以及IP注射部位具部出現嚴重的皮膚反應；以及(c)確認(b)步驟中所檢測之一或多個事件並未發生，其中該劑量被確認為投與至人類個體之該安全治療劑量。在本發明之進一步具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質及雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種監測一治療劑量之特異性結合至IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段投與至人類個體是否安全的方法，該方法包含：(a)將該治療劑量之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段投與該人類個體；(b)檢測包括有下列事件群組中之一或多個事件：在急診室或在家因為過敏性支氣管痙攣而進行的加強治療、血液惡病質(blood dyscrasias)、抽搐、丙胺酸轉胺酶(ALT)讀值大於正常範圍值上限(ULN)的3倍且總膽紅素讀值大於ULN的2倍、無症狀下ALT升高至大於ULN的10倍、出現藥物依賴或是藥物濫用現象、ALT升高至大於或等於ULN的2倍、hsCRP在等於或超過72小時大於10毫克/公升、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)讀值大於ULN的2倍、在心電圖(ECG)儀器上出現心室去極化及再極化時間(QT)，其中QT為經過ECG儀器自動校正者(QTc)(即QTc大於或等於500毫秒)、在IP注射部位局部出現的嚴重皮膚反應；以及(c)測定(b)步驟中所檢測之一或多個事件並未發生，其中所 述劑量經投與於人體後確認為安全治療劑量。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質及雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此互連接，而SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種選擇安全治療劑量之之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段及監測該治療劑量安全使用的方法，該方法包含：(a)將一劑量之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域的片段投與至該人類個體；(b)檢測該人類個體之一待測血液樣本中的C反應蛋白質(CRP)含量；以及(c)確認(b)步驟所檢測的C反應蛋白質(CRP)含量小於20毫升/公升，其中該劑量即為被選定為投與至該人類個體的安全劑量。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質及雙重V區類抗體區域的片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種選擇安全治療劑量之特異性結合至人類個體IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段及監測該治療劑量安全使用的方法，該方法包含：(a)將一劑量之雙重V區 類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段投與該人類個體；(b)在一心電圖(ECG)儀器上檢測一血管去極化和再極化時間(QT)，其中該QT係被該人類個體之此ECG儀器自動校正者(QTc)；以及(c)測定當步驟(b)所檢測的QTC小於500毫秒，其中該劑量被選定為投與至該人類個體之安全治療劑量。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質及雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係提供一種方法以確認一治療劑量之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段投與人類是否安全及可容忍的方法，該方法包含：(a)在一非人類的靈長類動物模型中施行一非致免疫性研究；及(b)根據在該非人類的靈長類動物模型所施行的非致免疫性研究結果來決定使用於人類患者中的安全治療劑量。在本發明之一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種測量一待測樣本中人類抗體總量的方法，該方法包含：(a)提供一抗人類κ鏈的單株抗體；(b)添加一待測樣本至 該抗人類κ鏈的單株抗體；(c)添加具有磺酸基-標誌(sulfo-tag)標記的抗人類抗體至該抗人類κ鏈的單株抗體及待測樣本中；及(d)對於具有標誌標記且結合至待測樣本的抗人類抗體進行定量，其中具有標誌標記的抗人類抗體結合至待測樣本的總量可決定此一待測樣本中人類抗體的總量。在另一具體實例中，抗人類κ鏈係吸附於一擷取裝置。

本發明之一具體實例係為一種檢測一待測樣本中可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體比例之方法，該方法包含：(a)提供一抗人類IL-4抗體；(b)添加人類IL-4至此抗人類IL-4抗體中；(c)添加一含有可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體之待測樣本至人類IL-4和抗人類IL-4抗體中；(d)添加人類IL-13至包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體之待測樣本、人類IL-4和抗人類IL-4抗體的待測樣本中；(e)添加生物素化抗人類IL-13抗體至包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體、人類IL-4和抗人類IL-4抗體的待測樣本中；及(f)添加具有標誌標記的卵白素至生物素化抗人類IL-13抗體及包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體、人類IL-4和抗人類IL-4抗體的待測樣本中；及(g)對於結合至生物素化抗人類IL-13抗體的具有標誌標記之卵白素進行定量，其中，具有標誌標記的結合卵白素的量可以決定待測樣本中可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體比例。在本發明之另一具體實例中，抗人類IL-4抗體係吸附於一擷取裝置。在本發明之另一具體實例中，雙特異性抗體包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。

本發明之一具體實例係為一種檢測待測樣本中可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體比例之方法，該方法包含：(a)提供一抗人類IL-13抗體；(b)添加人類IL-13至此抗人類IL-13抗體中；(c)添加一包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體之待測樣本至人類IL-13和抗人類IL-13抗體中；(d)添加人類IL-4至包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體之待測樣本、人類IL-13 和抗人類IL-13抗體的待測樣本中；(e)添加生物素化抗人類IL-4抗體至包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體、人類IL-13和抗人類IL-13抗體的待測樣本中；及(f)添加具有標誌標記的卵白素至生物素化抗人類IL-4抗體及包含可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體、人類IL-13和抗人類IL-13抗體的待測樣本中；及(g)對於結合至生物素化抗人類IL-4抗體的具有標誌標記的卵白素進行定量，其中，具有標誌標記的結合卵白素之量可以決定待測樣本中可結合IL-4及IL-13的雙特異性抗體比例。在本發明之另一具體實例中，抗人類IL-13抗體係吸附於一擷取裝置。在本發明之另一具體實例中，雙特異性抗體包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。

本發明之一具體實例係為一種檢測一待測樣本中抗藥物抗體之方法，該方法包含：(a)將一待測樣本與一可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體以及一具有標誌標記且可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體結合；(b)添加卵白素至待測樣本、可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體以及一具有標誌標記且可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體中；及(c)對於具有標誌標記且可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體之量進行定量，其中具有標誌標記且可以和IL-4及IL-13結合的雙特異性抗體決定待測樣本中抗藥物抗體人類抗體之量。在本發明之另一具體實例中，卵白素係吸附於一擷取裝置。

本發明之一具體實例係為一種定量及監測人類個體或非人靈長類在投與藥物後血清中抗藥物抗體量的方法，其中該藥物為特異性結合至IL-4及IL-13之雙重V區之類抗體蛋白質和雙重V區類抗體區域片段，該方法包含：(a)投與一劑量之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段至該人類個體或該非人靈長類；(b)自該人類個體或該非人靈長類中得到該血清 之樣本；及(c)測定該血清樣本中抗藥物抗體的量。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。

本發明之一具體實例係為一種定量及監測人類個體或非人靈長類血清中特異性結合至IL-4及IL-13之雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段的總量之方法，該方法包含：(a)投與一劑量之該雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段至該人類個體或該非人靈長類；(b)由該人類個體或該非人靈長類中得到一血清樣本；及(c)測定該樣本中該雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段的總量。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。

本發明之一具體實例係為一種定量或監測人類個體或非人靈長類血清中特異性結合至IL-4和IL-13、功能上可結合至IL-4及IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段比例之方法，該方法包含：(a)投與一劑量之該雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段至該人類個體或該非人靈長類；(b)由該人類個體或該非人靈長類中得到一血清樣本；及(c)測定該樣本中功能上可結合至IL-4及IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段之比例。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈 包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物氣喘的方法，係包含下列步驟：對該哺乳類動物投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類特發性肺纖維化的方法，係包含下列步驟：對哺乳類動物投與一有效治療量之具雙重V區類抗體蛋白質和具有雙重V區且可特意鍵結於IL-4和IL-13的類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，有雙重V區的類抗體蛋白質和具有雙重V區的類抗體片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。更進一步地，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物受到IL-4或IL-13或IL-4和IL-13誘導STAT6磷酸化所媒介的疾病之方法，係包含：投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區的類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物受到IL-4或IL-13或IL-4和IL-13誘導IL-6釋放所媒介的疾病之方法，係包含：投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物受到IL-4或IL-13或IL-4和IL-13誘導趨化激素(eotaxin)釋放所媒介的疾病之方法，係包含：投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白 質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物受到IL-4或IL-13或IL-4和IL-13誘導LOX表現所媒介的疾病之方法，係包含：投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此胜肽連結子彼此連接。在另一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之一具體實例係為一種治療哺乳類動物受到IL-4或IL-13或IL-4和IL-13誘導紅血球增生所媒介的疾病之方法，係包含：投與一有效治療量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體片段。在本發明之另一具體實例中，雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含一可變異的輕鏈和一可變異的重鏈，此輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。在另一具體實例中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3係與一胜肽連結子彼此連接，且SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4係與此 胜肽連結子彼此連接。在一具體實例中，此胜肽連結子係由SEQ ID NO：6組成。在另一具體實例中，安全治療劑量係等於或小於300毫克，在另一具體實例中，安全治療劑量係選自由下列組成之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克和300毫克。

本發明之詳細說明

除非有另外給予定義，所有此處使用的技術性和科學性用語皆為本發明所屬技術領域中具有通常技藝人士所一般了解的相同意義。

此處所揭露的公開資料、專利申請案、專利案和其他參考文獻系完整並於本文中作為參考，其內容與本案所揭露並內容不相同。

除非本文另有明定，此說明書或申請專利範圍中所使用單數型態的“一”(“a”、“an”及“the”)包括複數的參照。

此外，根據本發明，所使用的分子生物學、微生物學和重組核醣核酸技術皆為此領域之已知技術，這些技術皆已完全揭露於文獻中，請參照：Sambrook,Fritsch & Maniatis所著分子選殖：實驗室操作，第二版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(以下以“Sambrook等人，1989”表示)；DNA選殖：實用方法，第一卷和第二卷(D.N.Glover編輯，1985)；寡核醣合成(M.J.Gait編輯，1984)；核酸雜交[B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1985)]；轉錄和轉譯[B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1984)]；動物細胞培養[R.I.Freshney編輯(1986)]；免疫細胞和酵素[IRL Press,(1986)]；B.Perbal分子選殖實用指引(1984)，F.M.Ausubel等人(eds.)；最新分子生物方法John Wiley & Sons,Inc.(1994)。

以下一些用詞和用語之非限定的定義係被提供以引導熟習該項技術者。

“介白素-4”(IL-4)係指自然產生或內生性(endogenous)的哺乳類IL-4蛋白質，以及那些和自然產生或內生性哺乳類IL-4蛋白質具有相同胺基酸序列的蛋白質{例如重組蛋白質、合成蛋白質(即利用有機化學合成方法所產生的蛋白質)}，因此，如同此處之定義，介白素-4包括成熟IL-4蛋白質、 多形性或對偶的變異型態、或是其他IL-4蛋白質和前述IL-4蛋白質修飾物或未修飾型態的異型體(isoform)(例如，脂化和糖化)，舉例來說，這些自然生產或內生性的IL-4蛋白質包括野生型IL-4蛋白質，例如成熟的IL-4、多形性或對偶變異體、和其他自哺乳類動物(例如，人類和非人類的靈長類)天生具有的IL-4蛋白質之異型體或突變體，舉例來說，這些蛋白質可從如天然產生IL-4的來源回收或分離出來。這些和天然產生或內生性對應IL-4的蛋白質或具有相同胺基酸序列的蛋白質是按相應的哺乳動物之名稱命名的。例如，當相對應的哺乳動物是人類時，該蛋白質則稱為人類IL-4。有數種已知的突變IL-4蛋白質係揭露於WO 03/038041。

“介白素-13”(IL-13)係指自然產生或內生性的哺乳類IL-13蛋白質，以及那些和自然產生或內生性哺乳類蛋白質具有相同胺基酸序列的IL-13蛋白質(例如重組蛋白質、合成蛋白質(即利用有機化學合成方法所產生的蛋白質))，因此如此處所定義，IL-13一詞包括成熟的IL-13蛋白質、多形態或對偶變異體或是其他IL-13異構體(例如利用選擇性剪切或是其他細胞過程)，以及前述蛋白質之修飾或未修飾的形式(如脂化或糖基化)。天然出現或內源的IL-13包括野生型蛋白質，例如成熟的IL-13、多形態或對偶變異體以及其它在哺乳動物中天然出現的異構體和突變體(如人或非人靈長類動物)。例如，此處所用的IL-13包括人類IL-13變體，其中位於成熟的人IL-13之110位置的精胺酸(Arg)被胺基酸Gin所置換(成熟IL-13中第110位置相當於蛋白質前驅物的第130位置)，胺基酸Gin與氣喘(特異反應性和非特異反應性氣喘)以及其它IL-13的變體有關(Heinzmann等人，Hum MoI Genet 9：549-59(2000))，舉例來說，這些蛋白質可從如天然產生IL-13的來源回收或分離出來。這些蛋白質以及與天然出現或內源的相應IL-13有相同胺基酸序列的蛋白質是按相應的哺乳動物之名稱命名的。例如，當相應的哺乳動物是人時，該蛋白質則稱為人類IL-13。本領域己知有幾種突變IL-13蛋白質係揭露於WO 03/035847。

“實質相同”一詞對抗體鏈多胜肽序列來說可解釋為顯示與參考多肽序列至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同 一性之抗體鏈。就核酸序列而言，該詞可解釋為顯示與參考核酸序列至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性之核苷酸序列。任何熟悉該項技藝之人士只要利用任何生物資訊工具便可以達到確認序列的目的，舉例來說，基本局部比對檢索軟體(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)便是一個經常使用於序列確認的工具(Altschul等人，Journal of Molecular Biology 215(3)：403-410,1990)。

“同一性”或“同源性”係指一候選序列中的核苷酸鹼基或胺基酸殘基與其比較的對應序列殘基相同，其經比對序列且若必要時引入間隔(gap)後達到整段序列最大同一性百分比，且不考慮保守性取代作為序列同一性之部分。無論N端或C端延伸或插入均不應理解為降低同一性或同源性。用來進行比對的方法和電腦軟體係已為本領域所熟知。可使用序列分析軟體測量序列同一性。

抗體或抗原的“功能片段、變異體、衍生物或類似物”等以及它們的多種形式一詞是指具有與全長標的抗體或抗原在性質上相同的生物活性的化合物或分子。例如，抗IL-4抗體的功能片段或類似物是可結合IL-4分子的片段或類似物，或是可防止或基本上降低配體、促進或拮抗性抗體結合IL-4的能力的片段或類似物。

“取代型”變異體是天然序列中至少一個胺基酸殘基被除去並被不同的胺基酸插入其相同位置的變異體。所述取代可為單一性的，其中該分子中僅有一個胺基酸被取代；或可為多個的，其中該相同分子有兩個或更多的胺基酸被取代。多個取代可位於連續的位置。同樣，一個胺基酸可被多個殘基取代，其中這樣的變異體包括取代和插入二者。“插入型”變異體是一個或多個胺基酸被插入到緊鄰一段天然序列某個特定位置處的胺基酸變異體。緊鄰胺基酸意指與該胺基酸的α-羧基或α-胺基官能基相互連接。“缺失型”變異體是天然胺基酸序列中一個或多個胺基酸被除去的變異體。在一般狀況下，缺失型變異體在其分子的特定區域內有一個或兩個胺基酸被剔除。

“抗體”被用於最寬泛的含義，具體涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、攜帶一個或多個CDR 或源自CDR序列的抗體片段或合成多肽，只耍這些多肽表現出所需的生物活性。抗體(Abs)和免疫球蛋白(Igs)是具有相同結構特徵的糖蛋白。一般情況下，抗體被認為是具有確定或公認的特異性的Igs。因此，儘管抗體表現出與特異標的的結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏標的特異性的抗體樣分子。本發明所述抗體可為任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)或亞類(例如IgG₁、IgG₂、IgG_2a、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂等)的抗體(“類型”和“種類”、以及“亞型”和“亞類”在本文中可互換使用)。天然或野生型，即得自未經人工操縱的群體成員，抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾吞的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條重鏈的一端具有可變功能區(V_H)，隨後是多個固定功能區。每條輕鏈的一端具有可變功能區(V_L)，另一端具有固定功能區。所謂“未經人工操縱”意指未經含有或表達外來抗原結合分子的處理。野生型可指一個群體中發現的最普遍的等位基因或種類或指得自未操縱動物的抗體，相比較於等位基因或多態型，或得自以某種形式的操縱例如誘變、使用重組方法等改變該抗原結合分子的胺基酸變異體或衍生物。

如本文所使用，“抗IL-4抗體”意指特異性結合本文所定義的IL-4的抗體或源自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限於抑制或實質降低IL-4與其受體的結合或抑制IL-4活性的分子。

如本文所使用，“抗IL-13抗體”意指特異性結合本文所定義的IL-13的抗體或源自這些抗體的多肽(衍生物)，其包括但不限於抑制或實質降低IL-13與其受體的結合或抑制IL-13活性的分子。

就抗體的可變功能區而言，“可變”係指抗體之間有廣泛序列差異的相關分子的某些部分，且被用於針對其特異標的特定抗體的特異識別和結合。但是，可變性在抗體的整個可變功能區內不是均勻分布的。可變性集中在被稱為互補決定區域(CDRs；即CDR1、CDR2和CDR3)或超變區的三個區段，它們均位於輕鏈和重鏈的可變功能區內。可變功能區內保守程度更高的部分被稱為構架(FR)區或構架序列。天然重鏈和輕鏈的每個可變功能區均包括四個FR區，其主要呈現β-折疊構型，其係藉三個CDRs連接起來 以形成環狀連接，在某些情形下形成部分的β-折疊結構。每條鏈的CDRs通常被FR區域連接起來，並且借助於來自其他鏈的CDRs形成標的結合位置(頂位或決定位)(參見Kabat等人Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白胺基酸殘基的編號是依據Kabat等人的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統而進行的。除非另有說明，一個CDR可具有特異結合對應頂位的能力。

本文中使用之“絞鏈”或“絞鏈區”係指包含抗體的第一和第二固定功能區之間的胺基酸的彈性多肽。

“抗體片段”指完整或全長鏈或抗體的一部分，一般是標靶結合區域或可變區域。抗體片段的實例包括但不限於F_ab、F_ab' 、F_(ab')2和F_v片段。“功能片段”或“抗IL-4和/或IL-13抗體的類似物”是可防止或實質降低所述受體結核配體或啟動信號轉導的能力的片段或類似物。正如本文所使用，功能片段一般與“抗體片段”含義相同，且就抗體而論，可只能防止或實質降低所述受體結合配體或啟動信號轉導能力的片段，例如F_v、F_ab、F_(ab')2等等。“F_v”片段由一條重鏈的可變功能區和一條輕鏈的可變功能區透過非共價結合方式形成的二聚體(V_H-V_L二聚體)組成。在該構形中，每個可變功能區的三個CDRs相互作用，以確定V_H-V_L二聚體表面上的標的結合位置，與完整抗體的情況一樣，所述六個CDRs共同賦予完整抗體的標的結合特異性。但是即使是單個可變功能區(或僅包含3個標靶特異性CDRs的F_v之一半)，仍可具有識別和結合標的的能力。

“單鏈F_v”、“sF_v”或“scAb”抗體片段包含抗體的V_H和V_L功能區域，其中這些功能區域位於單條多肽鏈上。一般而言，所述F_v多肽還包括一段位於V_H和V_L區域之間的多肽連接體，其通常為彈性分子，可使sFv形成適合於和標的結合所需結構。

“雙抗體(diabodies)”一詞係指具有兩個抗原結合位置的抗體片段，這些片段可包含在同一條多肽鏈上與一輕鏈可變功能區域(V_L)相連的重鏈可 變功能區域(V_H)。通過使用過短的連結子使得同一條鏈上的兩個可變功能區域無法配對，所述雙抗體功能區域被迫與另一條鏈的結合功能區域配對，以產生成兩個抗原結合位置。

F_ab片段含有輕鏈的可變功能區域和固定功能區以及重鏈的可變和第一個恆定功能區(C_H1)。F_ab’片段與F_ab片段的不同之處在於前者在C_H1功能區的羧基端加入數個殘基，以包括一個或多個來自抗體絞鏈區的半胱胺酸。通過裂解於F_(ab')2胃蛋白酶消化產物的鉸鏈半胱胺酸處的雙硫鍵，可生成F_ab’片段。對抗體另外進行酵素和化學處理可生成其他目的功能片段。

“線性Fab”一詞係指Miller等所述之四價抗體(Miller等人(2003)，J Immunol.170：4854-4861)。“線性Fab”是由一連串相同的CH1-VH功能區所組成的，在每一個CH1-VH位置與相同的輕鏈配對。研發了這些分子是為了增加抗體的效價並透過親合力效應來增強其功能性親和力，但是，它們是單特異性的。

“雙特異抗體(BsAbs)”一詞係指在同一個分子裡組合了兩個抗體的抗原結合位置的分子。因此，雙特異抗體能夠同時結合兩個不同的抗原。除了診斷目的之應用之外，雙特異抗體藉由重新指向強有力的效應系統至疾病區域或增加抗體的中和或刺激活動來提供新的治療應用之路。

本文中之單株抗體特別包括“嵌合(chimeric)”抗體，嵌合抗體中有部分的重鏈和/或輕鏈係相似或同源於一源自一特定物種或屬於一特定抗體種類或亞類(類型或亞型)的抗體之對應序列，而嵌合抗體中其他的鏈體則相似或同源於一源自另一特定物種或屬於另一特定抗體種類或亞類(類型或亞型)的抗體之對應序列，如同這些抗體的片段較長因此可以存在有預定生物活性以鍵結於IL-4和/或IL-13、影響IL-4和/或IL-13活性或代謝的能力(美國專利第4,816,567號；和Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA 81：6851(1984))。所以，由一個類別抗體的CDRs可以嫁接至不同類別或亞類抗體的FR。

單株抗體是具有高度特異性的抗體，其引導至單一標的位置、頂位(epitope)或決定位(determinant)。而且，不同於一般傳統型抗體(多株)的製 備，傳統型抗體通常會包括有多種可以直接對應於一抗原不同決定位(頂位)的抗體，但是每一個單株抗體則是直接對應於一標的的單一決定位。除了特異性之外，多株抗體具有可以由一寄主細胞合成的優勢，也不會被其他免疫球蛋白汙染，並且可以用於選殖編碼於抗體鏈的相關基因和mRNA。修飾語“單株”說明了抗體的特性是得自基本同源抗體群的抗體，其不應理解為需要籍任何特定方法產生所述抗體。例如，本發明所使用的單株抗體可能是嗜菌體抗體實驗室使用已知技術製造或是自多株抗體中純化所得。本發明中所述的單株抗體也可能是利用Kohler等人所提出的融合瘤方法(Nature 256：495(1975))或是利用已知的重組技術進行製備。

本發明使用“多價抗體”一詞係指一個抗體包含兩個或多個抗原結合位置，因而能同時結合兩個或多個具有相同或不同結構的抗原。“二價”一詞表示抗體包含兩個抗原結合位置。“四價”一詞則表示抗體包含四個抗原結合位置。

本發明所使用“抗原結合位置”一詞係指抗體中包含特異結合或是全部或部分互補於一抗原之部分。當抗原很大時，抗體可能只能結合到抗原的一個特定部份，該部份被稱為頂位。抗原結合功能區可由一個或多個抗體可變功能區提供。在較理想的狀況下，抗原結合功能區是由抗體輕鏈可變功能區(VL)和抗體重鏈可變功能區(VH)結合而成。

本發明中所使用“抗原”一詞係指能夠被本發明的抗體所結合的分子或分子之一部份。抗原可有一個或多個頂位。本發明中抗原可被抗體辨識的例子包括但不限於血清蛋白如細胞激素，例如IL-4、IL5、IL9和IL-13，生物活性胜肽、細胞結構分子，如受體、轉運蛋白、離子通道、病毒和細菌蛋白。

本發明所使用的術語“單特異的”係指本發明的多價抗體僅可識別出一個抗原，所有的抗原結合位置都是相同的。

本發明所使用的術語“雙特異的”係指本發明的多價抗體可在兩個同一或不同的抗原上識別出兩個不同的頂位。

有趣的是，雙特異性抗體(BsAbs)是在單一分子內產生結合兩個抗體 於抗原結合位置，因此，這樣的分子可以同時結合兩種不同的抗原，除了應用於診斷目的外，這也提供了一個新的治療途徑，也就是說，通過強有力的效應系統重定向到病變區域(致癌細胞往往會發展出一機制來抑制正常細胞受到單株抗體處發產生的免疫反應，像是抗體依賴性細胞毒性(Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)、補體依賴性細胞毒殺作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC))或是藉由增加抗體的中和活性或是刺激活性。初步將兩個完整抗體特異結合至不同標的的抗原以達到治療目的是利用化學融合雜結合分子(Staerz等人(1985),Nature 314：628-631)。

雙特異性抗體係由兩融合瘤融合產生，每一個融合瘤皆具有產生不同免疫球蛋白的能力(Milstein和Cuello，1983,1984)，但是使用較複雜的物種(至少十個不同物種)在細胞培養中產生雙特異性抗體則會產生純化上的困難和增加製造成本(George和Huston,1997)，儘管利用雜結合或前述所述的細胞融合來產生雙特異性抗體有助於提升製造效率，但仍有多個因子會造成大規模治療應用上的困難，這些因子包括，在體外試驗中抗體的快速清空、需要密集的技術以在實驗室中產生各種種類的分子、需要更多得純化步驟以將雜結合物自同源結合物或單特異性抗體中分離，以及產率不高等。

遺傳工程已經利用於提升頻率以進行設計、修飾和產生具有預定結合特性和酵應功能的抗體及抗體衍生物，有多種重組方法可以更有效的生產雙特異性抗體，不管是抗體片段(Carter等人(1995),J.Hematotherapy 4：463-470；Pluckthun等人(1997)Immunotechology 3：83-105；Todorovska等人(2001)J.Immunol.Methods 248：47-66)或是全長免疫球蛋白IgG的形式(Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15)。

美國專利第7612181號專利提供一種根據美國專利第US5989830號所述的雙Fv形式所產生的小鼠雙變異功能區免疫球蛋白(Dual-Variable-Domain IgG，DVD-IgG)雙特異性抗體。WO2009/052081(TBTI)則提供一種人類化的雙特異性形式，係為本案所參照，係將固定功能區附 加於雙Fv形式的各鏈(CH1-Fc至重鏈，κ和λ固定功能區結合至輕鏈)以產生功能性的雙特異性雙重V區類抗體結合蛋白。

本發明之一具體實例係為一種雙特異性抗體，其已建構為包含一雙重V區的類抗體蛋白質或具有可以特異結合於兩種同一或不同抗原的兩個頂位的片段。本發明之一具體實例係一種特異結合於IL-13和IL-4之雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，其中該可變異輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列。本發明之再一具體實例係一種特異結合於IL-13和IL-4之雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，其中該可變異重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的胺基酸序列。本發明之再一具體實例係一種特異結合於IL-13和IL-4雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，其中該可變異重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。本發明之再一具體實例係一種特異結合至IL-13和IL-4之雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，此可變異輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此可變異重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列。本發明之再一具體實例係一種特異結合至IL-13和IL-4之雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其中該雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段包含一可變異輕鏈和一可變異重鏈，此可變異輕鏈包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的胺基酸序列，而此可變異重鏈包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的胺基酸序列，其中一胜肽連結子係將SEQ ID NO：1連結至SEQ ID NO：3，及一胜肽連結子將SEQ ID NO：2連結至SEQ ID NO：4。本發明之再一具體實例係huTBTI3_2_1或SAR156597，其包含特異結合至IL-13和IL-4之雙特異性抗體或其雙特異性抗體片段，其包含(a)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3胺基酸序列的可變異輕鏈功能區；(b)包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4胺基酸序列的可變異重鏈功能區；(c)一將SEQ ID NO：1連結至SEQ ID NO：3之胜肽連結子，及一將SEQ ID NO：2連結至SEQ ID NO：4之胜肽連結子，其中胜肽連結子係具有SEQ ID NO：6組成之胺基酸序列；及(d)固定區域功能區。

本發明所使用的術語“多特異的”指本發明的多價抗體可在同一或多個不同的抗原上識別出多個不同的頂位。

本發明所使用的術語“連結子”係指一個用來連結本發明抗體結構可變功能區的胜肽。胜肽連結子可包含任何胺基酸，較佳為苷胺酸(G)和絲胺酸(S)。在重鏈多肽和輕鏈多肽之間或內部，連結子可為相同或不同。此外，連結子的長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。重鏈功能區和輕鏈功能區的胜肽連接體較佳為GGGGS。重鏈和輕鏈的連結子單元數目可以是相同的(對稱的順序)，也可以是彼此不同的(非對稱的順序)。

胜肽連結子的長度要足夠以便能提供適當程度的彈性並防止抗體上的兩個部分相互干擾彼此的活性。舉例來說，透過立體阻礙可以使得蛋白質產生適度的折疊，並且若必要時讓抗體分子與兩個或多個可能在相同細胞上寬廣間隔的受體相互作用，但其長度較佳為為短的使得抗體部分在細胞中維持穩定。

因此，胜肽連接子的長度、組成和/或構型可容易地由本領域技術人員選定，以便產生具有最適化條件的多價抗體。

非人(例如鼠)抗體的“人類化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的片段(例如抗體的F_v、F_ab、F_ab' 、F_(ab')2或其他抗體的標的結合亞序列)，與人抗體相比，其含有源自非人類免疫球蛋白的序列。一般而言，所述人類化抗體基本上總共包括一個、典型為兩個的可變功能區，其中所有或基本上所有CDR區域對應於非人免疫球蛋白的CDR區域，以及所有或基本上所有FR區域是人免疫球蛋白模板序列的FR區域。所述人類化抗體還可包括至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是被選擇的人免疫球蛋白模板的固定區。一般而言，目的是擁有在人體內最低致免疫性的抗體分子。因此，有可能一個或多個CDRs中的一個或多個胺基酸也可被更換成 在人宿主體內致免疫性更低的胺基酸，而非降低一或多個CDRs的對IL-4和/或IL-13的特異結合功能。或者，FR可為非人的，但免疫原性最強的那些胺基酸被替換為免疫原性較低的胺基酸。但是，上文所討論的CDR移植並非是獲得人類化抗體的唯一途徑。例如，僅修飾CDR區域可能不夠充分，因為構架區殘基與決定CDR環的三維結構和抗體與其配體的總親和力的現象並非鮮見。因此，可實施任何方法，以使非人親代抗體分子被修飾為對人致免疫性更低的抗體分子，而且並非總是需要與人抗體的全序列同一性(global sequence identity)。因此，也可通過例如僅取代數個殘基實現人類化，尤其是取代曝露在抗體分子上且沒有被包埋在該分子內部因此不易接近宿主免疫系統的殘基。本文所教示取代抗體分子上的“活動”或“彈性”殘基方面，其目標是降低或減緩所形成分子的免疫原性，卻不包括所述抗體對其表位或決定位的特異性。請參見：Studnicka等人，Prot Eng 7(6)805-814,1994；Mol Imm 44：1986-1988,2007；Sims等人，J Immunol 151：2296(1993)；Chothia等人，J Mol Biol 196：901(1987)；Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285(1992)；Presta等人，J Immuol 151：2623(1993),WO 2006/042333和美國第5,869,619號專利。

“抗體同源物”或“同源物”指任何按此處所教示之特異性結合IL-4和/或IL-13的任何分子。因此，抗體同源物包括天然或重組抗體、不論修飾與否，保留了目的生物學性質，例如結合IL-4或IL-13，的抗體部分，例如F_ab或F_v分子、單鏈抗體以及攜帶一個或多個CDR區域的多肽等。所述同源物的胺基酸序列無需與天然存在的抗體胺基酸序列相同，但可經改變或修飾以攜帶取代胺基酸、插入胺基酸、缺失胺基酸、蛋白質上常見的二十個胺基酸以外的胺基酸等，以獲得具有增強或其它有利性質的多肽。

具有同源序列的抗體是其胺基酸序列與本發明的IL-4，IL-13或雙特異IL-4/IL-13抗體的胺基酸序列具有序列同源性的抗體。在一較佳狀態下，同源性於本發明抗體的可變區域的胺基酸序列。應用於本文胺基酸序列的“序列同源性”定義為經例如根據Pearson & Lipman(Proc Natl Acad Sci USA 85,2444-2448(1988))所述的FASTA檢索方法測定與其它胺基酸序列具有 至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。

嵌合抗體是具有源自不同物種抗體的不同部分者，例如不同抗體、不同種類的抗體、不同動物物種，例如具有源自鼠單株抗體的可變區與人免疫球蛋白固定區配對的抗體等。因此，人類化抗體是一種嵌合抗體。用於生產嵌合抗體的方法為本領域將關技藝人士所知曉，請參見Morrison,1985,Science 229：1202；Oi等人，1986,BioTechniques 4：214；Gillies等人，1989,J Immuol Methods 125：191-202和美國專利號第5,807,715, 4,816,567和4,816,397號專利。

人工抗體包括scFv片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體和mru(參見Winter & Milstein的文獻回顧，1991,Nature 349：293-299；和Hudson,1999,Curr Opin Imm 11：548-557)，其中每種均具有抗原結合或頂位結合能力。在單鏈F_v片段(scF_v)中，抗體的V_H和V_L功能區利用彈性胜肽相互連接。一般情況下，所述連結子是約為15個胺基酸的胜肽。如果連結子較小，例如為5個胺基酸，則會形成雙抗體。抗體的最小結合單元為CDR，通常為具有足夠特異識別和結合能力的重鏈CDR2。這種片段被稱為分子識別單元或mru。數個mru可藉短的連結子胜肽連接，從而形成具有高於單個mru親和力的人工結合蛋白。

目的抗體的功能等效物也包括在本發明的範圍內。術語“功能等效物”包括帶有同源序列的抗體、抗體同源物、嵌合抗體、人工抗體和修飾的抗體，例如，其中每個功能等效物是按照其結合IL-4和/或IL-13、抑制IL-4和/或IL-13信號傳導能力或功能，或抑制IL-4和/或IL-13結合到其受體的能力所定義。熟悉該項技藝人是可輕易理解“抗體片段”和“功能等效物”的群組意義有部分重疊。製備保留IL-4和/或IL-13結合能力的功能等效物的方法已為本領域技術人員知曉，並揭露於WO 93/21319,EPO Ser.No.239,400,WO 89/09622,EPO第338,745和332,424號專利。

本發明所述的等效物還包括修飾抗體，例如利用共價吸附到任何類型分子到抗體的修飾抗體。舉例來說，修飾抗體包括已經進行修飾的抗體， 例如由已知保護性或阻斷性族群進行糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、脫醯胺化、磷酸化、醯胺化、衍生化等修飾、蛋白質化切割、連接至一細胞配體、連接至一毒素或毒性成分或其他蛋白質等。共價吸附並不需要產生一個可以受到產生抗獨特反應的免疫能力，利用已知技術可以達到這樣的修飾，包括但不限定有特定化學切割、乙醯化、甲醯化、代謝合成等。此外，被修飾抗體可含有一個或多個非典型的胺基酸。

進行治療目的所使用的“哺乳類動物”包括任何分類為哺乳類動物的動物，包括人類、家畜、農場動物、非人類的靈長類和動物園、運動動物或寵物，例如狗、馬、貓和牛等。

本發明中使用“治療”、“治療劑量”或“投與一有效治療量”等用語係指治療處理和防範或預防性的治療過程。其可為預防、治癒、回復、減輕、減少、抑制或制止疾病狀態、疾病進程、致病源(例如細菌或病毒)或其他異常狀況中的有害影響。

本發明之一具體實例係用於治療氣喘或特發性肺纖維化症狀。IL-4和IL-13根據其生物學上的功能而成為重要的治療性細胞激素，也在許多疾病中扮演關鍵的角色，例如氣喘(Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005,Vo.5,161-166)。IL-4已經展現了可以抑制自體免疫疾病的功能，而IL-4和IL-13都具有可以強化抗腫瘤免疫反應的能力，因此提升IL-4和IL-13及其受體都和特發性肺纖維化(IPF)致病產生連結(Jakubzick C.等人，Am J Pathol.2004：164(6)：1989-2001；Murray LA等人Int J Biochem Cell Biol.2008：40(10)：2174-82)。文獻中的證據則證實TH2細胞激素IL-4和IL-13在IPF的致病中扮演多重的角色，例如可為肺組織重建和纖維化的媒介物(Wynn,TA,Naat.Rev.Immunol,4：583-594,2004)，而其他種類細胞例如肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨嗜細胞和上皮細胞也有可能是這些細胞激素的潛在來源(Gordon S和Martinez FO,Immunity Rev.32：593-604,2010)。在IPF的病患身上，支氣管肺泡灌洗液中IL-13和IL-4的含量會比正常的對照組來得高。這些證據可以推測，藉由抑制或中和這些細胞激素將有可能可以延緩IPF病患的纖維化進程而達到治療效果。因為這兩種細 胞激素都和過敏性疾病以及纖維化疾病的致病有關，所以抑制這些細胞激素有可能可以提供治療效益。

“分離”或“純化”抗體係指實質上不含來自該蛋白質所衍生之細胞或組織來源或培養基之細胞物質或其他汙染蛋白質，或是當化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物。而“實質上不含細胞物質”係包括在製備抗體時，將多肽/蛋白質自其分離或重組製造之細胞的細胞成分分離。所以，實質上不含細胞物質之抗體包括製備含有低於30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(乾重)汙染蛋白質的抗體。當重組製造抗體時，其較佳地實質上不含培養基，也就是說，培養基代表少於約20%、10%、5%、2.5%或1%體積之蛋白質製劑。當以化學方式合成抗體時，其較佳地實質上不含化學前驅物或是其他化學品或試劑，也就是說，將抗體和化學前驅物或是其他參與蛋白質合成的化學藥劑或試劑完全分離。因此，抗體之這類製劑具有低於約30%、20%、10%、5%或1%(以乾重計)的化學前趨物或非感興趣的抗體之化合物。在一較佳具體實例中，抗體係經過分離或純化。

如同此處所使用，“治療藥劑”或是“多種治療藥劑”係指任何可以用來治療、處理或改善和IL-4及/或IL-13代謝或活性異常有關疾病、障礙、病徵的藥劑。

如同此處所使用，“治療劑量”係指任何藥劑的用量可以用來治療、處理或改善和IL-4及/或IL-13代謝或活性異常有關的疾病、障礙、病徵。

如同此處所使用，“安全治療劑量”係指任何藥劑或是任何藥劑的劑量可以用來治療、處理或改善和IL-4及/或IL-13代謝或活性異常有關的疾病、障礙、病徵，並同時維持臨床上可接受的效益/風險可能性。安全治療劑量係選自包括有下列劑量之群組：10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、150毫克及300毫克。安全治療劑量之一具體實例為介於約10毫克至約300毫克。更，安全治療劑量之進一步具體實例係為約300毫克或低於約300毫克。

本發明之一具體實例係藉由檢測選自下列組成的群組中一或多個事件之發生來確認或監測安全治療劑量：在急診室或在家因為過敏性支氣管 痙攣而進行的加強治療、血液惡病質(blood dyscrasias)、抽搐、丙胺酸轉胺酶(ALT)讀值大於正常範圍值上限(upper limit of normal range，ULN)的3倍且總膽紅素讀值大於ULN的2倍、無症狀下丙胺酸轉胺酶(ALT)升高至大於ULN的10倍、出現藥物依賴或是藥物濫用現象、ALT升高至大於或等於ULN的2倍、hsCRP等於或超過72小時大於10毫克/公升、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)讀值大於ULN的2倍、在心電圖(ECG)儀器上出現心室去極化及再極化時間(ventricular depolarization and repolarization time，QT)，其中QT在經過ECG儀器校正後的讀值(QTc)大於或等於500毫秒，IP注射部位局部出現嚴重的皮膚反應以及C反應蛋白質(CRP)讀值低於20毫克/公升。用來計算前述事件之方法將在實施例中進行細部討論，而這些方法係已為熟悉該項技藝人士所知曉。

當IL-4和IL-13與其細胞表面受體接合後，細胞內的訊號有部分會藉由訊號分子訊號傳遞子的磷酸化和轉錄6(transcription 6，Stat6)的活化子媒介。因此，抑制Stat6磷酸化(pStat6)可以用來測試一分子抑制IL-4和IL-13受體活性的能力。

IL-4和IL-13會刺激特發性肺纖維化的肺纖維細胞釋出IL-6和趨化激素，所以抑制IL-6和趨化激素的釋出可能可以應用於測試一分子抑制IL-4和IL-13受體活性的方法。

本發明之一具體實例係一種可以抑制IL-4和IL-13誘導STAT6磷酸化、IL-6釋出或趨化激素釋出之抗體，其IC50濃度介於約0.01nM至約100nM間。在一具體實例中，IC50則介於約0.1nM至約100nM間。在更進一步的具體實例中，IC50則介於約0.1nM至約10nM間。本發明之額外具體實例中，IC50之數值為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、 8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0nM。

在描述數值時使用“約”一詞係指在在具有下限值小於該指定數值5%、10%或15%，且具有上限值大於該指定數值5%、10%或15%之數值。

本發明之一具體實例係一種檢測一待測樣本中人類總抗體含量、特定抗體比例(例如雙特異性抗體)或抗藥物抗體的方法，此待測樣本可以是哺乳類動物身上的任何體液，實施例並不限定是使用血液樣本、血清樣本或組織樣本。檢測方法中係使用一“擷取裝置”，此擷取裝置係供一或多個抗體吸附於其上，且擷取裝置並不限定但包括為培養盤的孔槽，孔槽數目可能為12孔槽或是96孔槽。此外，擷取裝置並不限定為盤狀，也可能包含任何可以讓抗體吸附的裝置，例如一沖洗管柱。本發明一實施例係使用具有標誌標記的抗體，此標誌係為任何可供偵測的材質，實施例並不限定例如為鹽基桃紅精(rhodamine)的螢光標誌，或是例如為螢光素酶(luciferase)或磺酸基-標誌的酵素標誌。

第1圖顯示huTBTI3_2_1對於單核細胞受到IL-4和IL-13刺激而產生IL-4和IL-13誘導的Stat6磷酸化的影響。

第2圖顯示huTBTI3_2_1對於特發性肺纖維化病患身上肺纖維母細胞受到IL-4和IL-13刺激釋放IL-6和趨化激素的影響。

第3圖顯示huTBTI3_2_1對於特發性肺纖維化病患身上肺纖維母細胞受到IL-4和IL-13刺激誘導LOX表現的影響。

第4圖顯示huTBTI3_2_1對於獼猴抗原引發的呼吸道過度敏感和過敏源引發急性氣喘的影響，數值皆以平均值±平均標準差的形式呈現，相對於對照抗體治療組，以*表示p<0.05，以**表示p<0.01。

第5圖顯示huTBTI3_2_1對於獼猴身上抗原引發的總介白素堆積和過敏源引發急性氣喘的影響，數值皆以平均值±平均標準差的形式呈現，相對於對照抗體治療組，以*表示p<0.05，以**表示p<0.01。

第6圖顯示huTBTI3_2_1對於獼猴抗原引發的呼吸道嗜酸性白血球 堆積和過敏源引發急性氣喘的影響，數值皆以平均值±平均標準差的形式呈現，相對於對照抗體治療組，以*表示p<0.05，以**表示p<0.01。

第7圖顯示huTBTI3_2_1對於在過敏源引發的急性氣喘下，獼猴血清中的IgE的抗體效價，數值皆以平均值±平均標準差的形式呈現，相對於對照抗體治療組，以*表示p<0.05，以**表示p<0.01。

第8圖顯示SAR156597對於IL-4和IL-13誘發正常人類支氣管上皮細胞(NHBE，圖左)以及人類小氣道上皮細胞(human small airway epithelial cells，SAEC，圖右)釋放生長轉化因子(TGFβ)的影響。

第9圖顯示藉由檢測人類輕鏈κ濃度(A組)、對IL-4和IL-13具有功能之抗體比例(B組)及抗藥物抗體(ADA)(C組)來檢測血清中人類抗體總量的示意圖。

第10圖顯示在第0、14、21、28和35天對獼猴投與單一劑量huTBTI3_2_1在PBS中(Batch #LP08045)的靜脈注射(2.5毫克/公斤)之功能性huTBTI3_2_1濃度和時間關係圖(A組)；表格則總結了在對猴子施打第1次劑量和第5次劑量huTBTI3_2_1，2.5毫克/公斤，在PBS中(Batch #LP08059)後的藥物動力學參數(B組)。

第11圖顯示由TDU11325之10至300毫克的單一皮下劑量後，平均SAR156597血漿濃度。

實施例

本發明可由參考下列非限制性實例(其為本發明之例示)而更加了解。下列所示實例應不以任何方式被解釋為限制本發明寬廣之範圍。

名詞“huTBTI3_2_1”和“SAR156597”可互換且係指同一種雙重V區類抗體蛋白質，其包含一包含胺基酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的可變異輕鏈和一包含胺基酸序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的可變異重鏈。

實施例1：選殖及生產人類化抗IL-4/IL-13的雙重特異性抗體

人類化抗IL-4/IL-13的雙重特異性抗體之選殖及生產方法係已描述於依據專利合作條約提出申請之第WO2009/052081(PCT/US2008/079787)中，係納入本文中供參考，為了方便進行對照，係簡要說明如下。

用來表現雙特異性抗體(BsAb)的形式是美國專利第5,989,830號中所述的雙功能區雙頭形式的IgG變異體。在此形式下，IgG分子係在N端對應之重鏈和輕鏈藉由一第二抗體的附加變異區域延伸對應形成。因此，所形成的IgG分子是一種異四聚體(heterotetramer)，其係由兩條重鏈和兩條輕鏈所組成。此重鏈係由兩種不同的變異重功能區(variables heavy domains，VH1-VH2)組成，這些變異重功能區係源自兩種不同抗體並藉由一包括十個胺基酸(G4S)₂的連結子接合且融合至IgG4固定功能區。此輕鏈由兩種不同的變異輕功能區(variables light domains，VL1-VL2)組成，這些變異輕功能區係源自不同兩種抗體並藉由一包括十個胺基酸(G4S)₂的連結子接合且融合至IgG4固定κ區。

8D4-8變異體(8D4-8，是一種小鼠抗IL-4單株抗體，其係由對Biozol diagnostica Vertrieb GmbH(德國Eching公司)的8D4-8基因進行選殖所得，Biozol公司是美國加州聖地牙哥BioLegend公司的德國經銷商)的變異重功能區和變異輕功能區之序列是利用在PCR中在個別5’端編碼(G4S)₂-(GGA TCC)-8D4-8的部分導入BamHI切點(GGA TCC)而產生。8D4-8變異體的VH的3’端序列係終止於一個ApaI的切點位置(對應CH1功能區的第一個胺基酸位置)，隨後其會融合於IGHG4序列(Q569F4，其終端的Lys和雙重突變之S241P和L248E被刪除)，8D4-8的3’端係終止於BsiWI切點，其係對應於固定鏈的前兩個胺基酸並且隨後會被融合至IGKC(基因庫序號Q502W4)。

B-B13變異體(B-B13是一種選殖自B-B13細胞株(Cell Sciences,Inc.,Canton,MA USA)的小鼠抗IL-13單株抗體)中輕鏈和重鏈的序列係利用PCR在其個別3’端編碼(G4S)₂-(B-B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC(SEQ ID NO：7)部分序列處導入BamHI切點所形成。B-B13變異體的VH和VL都是利用在5’端的NheI切點，接上ATG起 始碼和領導胜肽編碼的序列所形成。

B-B13和8D4-8的VH會透過在(G4S)₂連結子內BamHI切點相互融合，B-B13和8D4-8的VL會透過在(G4S)₂連結子內BamHI切點相互融合，因此，所產生的輕鏈和重鏈會具有下列之組成。

雙特異性抗體重鏈：NheI-領導胜肽(leader peptide)-VH-B-B13-(G4S)₂-VH 8D4-8-ApaI切點序列。

雙特異性抗體輕鏈：NheI-領導胜肽-VL-B-B13-(G4S)₂-VL 8D4-8-BsiWI切點。

所有反應過程中的PCR片段都會利用Invitrogen公司的TOPO TA選殖套組(產品編號#45-0641)進行選殖至pCR^®4-TOPO質體中，並利用M13正向和M13反向引子進行定序。

完成定序後，重鏈透過ApaI切點融合至IGHG4序列中，而可變異輕鏈則透過BsiWI切點融合至IGKC序列中，所產生的雙功能區重鏈和輕鏈會利用限制酶NheI和HindIII進行切割，所產生的片段則分別被接合至游離型表現載體pXL的NheI/HindIII切點，以產生TBTI重鏈和輕鏈的哺乳類表現質體。

請參見表1所示，利用表1中的B-B13的VH和VL以及8D4-8變異重功能區和變異輕功能區彼此相互結核可以產生四種人類化的雙特異性抗IL-4/IL-13抗體，相對應的輕鏈和重鏈序列則請參見表2所示。

實施例2：huTBTI3_2_1對於人類全血單核細胞中IL-4或IL-13誘導之STAT6磷酸化的影響

人類檸檬酸鈉抗凝結全血係取自一現場之正常捐贈平台，使用捐贈者編號245、217、229和002號之樣本。

huTBTI3_2_1係在賽諾菲-安萬特公司生產，批號為LP08059，其係以每毫升5.63毫克的濃度保存於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)中並儲存於4℃。

重組人類IL-13(冷凍乾燥狀態)係採購自R&D Systems公司，目錄編號為213-IL，並懸浮於含有0.2%濃度為10微克/毫升小牛血清蛋白的PBS中。用於進行分析的IL-13最終濃度是3微微克/毫升(毫微克/毫升)，係添加於完全RPMI培養基中。重組人類IL-4(冷凍乾燥狀態)係採購自AMS生物科技股份有限公司，目錄編號為111-40-134，其係懸浮於含有0.2%濃度為20微克/毫升小牛血清蛋白的PBS中。用於進行分析的IL-4最終濃度是1毫微克/毫升，係添加於完全RPMI培養基中。

huTBTI3_2_1係利用完全RPMI培養基進行連續稀釋形成10倍的稀釋溶液，並且添加至96孔槽之培養盤中，每一孔槽中係含有100微升的正常人類周邊血液(peripheral blood)，對於捐贈編號245、217和002的樣本來說，孔槽中的huTBTI3_2_1最終濃度係100nM,33.33nM,11.11nM,3.70nM,1.24nM,0.41nM,0.14nM,0.05nM,0.02nM，和0.005nM，對於捐贈編號229的樣本，孔槽中的huTBTI3_2_1最終濃度係100nM,33.33nM,11.11nM,3.70nM,1.24nM,0.41nM和0.14nM。

培養盤係置於37℃、5%的CO₂培養箱中培養15至30分鐘後，在每一孔槽中加入重組人類IL-4(每毫升1微微克)或是IL-13(每毫升3微微克)，並在37℃、5%的CO₂培養箱中培養15分鐘，隨後血球細胞會在37℃之溫度下和裂解/固定緩衝液(lysis/fix buffer)作用10分鐘，並以300×g之轉速在室溫下離心5分鐘。移除上清液的部分並且利用磷酸鹽緩衝液清洗沉澱下來的細胞，並且使用預冷的酒精在4℃下與細胞反應30分鐘以進行打洞(permeabilized)。加入利用螢光進行標記的抗體(抗-磷酸-Stat6-Alexa Fluor 647染劑，最終稀釋濃度1：5，及抗-CD33-FITC染劑，最終稀釋濃度1：10)和細胞在室溫下於暗處進行反應30分鐘，利用FACS染色緩衝液(BD公司，目錄編號554656)清洗後，使細胞通過FACS Calibur^TM流式細胞儀進行分析並取得FACS數據。

FACS數據之分析是利用CellQuest^TM軟體(BD公司，版本5.2)，利用CD33染劑(螢光素異硫氰酸鹽，fluorescein isothiocyanate)和pStat6(Alexa Fluor 647)染劑可以產生點狀圖(請參考第1圖所示)，所有的單核細胞係根據相對顆粒度(side scatter)和相對大小(forward scatter)進行篩選。根據螢光強度，在基準控制組和缺少huTBTI3_2_1下受到IL-4或IL-13刺激的樣品之間，挑選CD33+染色、Stat6磷酸化陽性單核細胞。所有單核細胞中，呈現pStat6陽性的單核細胞可以利用CellQuest^TM軟體(BD公司，版本5.2)進行區域統計而得。

huTBTI3_2_1對IL-4或IL-13誘導的Stat6磷酸化之影響係利用受IL-4或IL-13刺激的單核細胞最大抑制反應來計算(Stat6磷酸化)。最大反應的定義是，在缺少huTBTI3_2_1時，利用IL-4或IL-13刺激所產生的pStat6⁺細胞比例，並且利用未受刺激下所產生的pStat6+細胞比例為基準訊號，因此，最大反應的計算公式如下：

劑量反應曲線可以圖示為：以最大反應比例(%)為Y軸，以huTBTI3_2_1之濃度(nM)/SPEED v2.0-LTS為X軸，進而計算出50%最大反應濃度(IC₅₀)。

劑量反應曲線係利用下列四個參數的邏輯模式所得：

參數c和d是下限值和上限值，b的負值是e的相對斜率，e則是IC₅₀， 亦即在上限值d和下限值c之間的一半反應劑量。四個參數(b、c、d、e)係利用非線性最小平方法(non-linear least squares method)加以計算所得。利用SPEED v2.0-LTS內部軟體SAS系統8.2中SAS的程序非線性迴歸分析(Nonlinear regression；NLIN)。透過三重複實驗曲線取得IC₅₀的估計值後，便可以計算出3個IC₅₀數值的幾何平均數。

在捐贈編號245、229和217的樣本上，huTBTI3_2_1對於IL-4誘導的Stat6磷酸化產生抑制作用的IC_50s數值分別為1.32nM、0.73nM和0.78nM。而在捐贈編號245、229和002的樣本上，huTBTI3_2_1對於IL-13誘導的Stat6磷酸化產生抑制作用的IC_50s數值分別為2.65nM、3.68nM和1.32nM。

由3個實驗中取得huTBTI3_2_1抑制IL-13或IL-4誘導的Stat6磷酸化的IC₅₀幾何平均數分別為2.34nM和0.91nM(請參考表3所示)。

實施例3：huTBTI3_2_1對於人類IPF肺纖維母細胞中IL-4或IL-13誘導的IL-6釋放或趨化激素(eotaxin)釋放之影響

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的患者之人類肺纖 維母細胞，名稱為LL97A(AlMy)，編號為CCL-191、F-12K培養基(Ham’s F-12培養基經Kaighn’s修飾)和胎牛血清(FBS)係取自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)。牛血清白蛋白(BSA)係購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)公司。重組人類IL-13(rhIL-13)購自PeproTech(Rocky Hill,NJ)公司。重組人類IL-4(rhIL-4)則是購自R&D SYSTEMS(Minneapolis,MN)公司。DuoSet酵素連接免疫吸附分析發展系統(ELISA Development System，R&D SYSTEMS)則用來進行CCL11/趨化激素和IL-6得分析。

在7號通道的LL97A細胞會塗布在96孔槽的細胞培養盤上，每一孔槽接種20000個細胞，並加入含有15% FBS的F-12K培養液後，培養於37℃的5% CO₂潮濕培養箱中24小時。隨後將培養液更換為含有0.1% BSA的F-12K培養液，於37℃下在5% CO₂潮濕培養箱隔夜培養至血清耗盡。細胞隨後分別利用3倍濃縮的八種不同濃度的huTBTI3_2_1稀釋液在37℃下在5% CO₂潮濕培養箱隔夜培養反應，其中huTBTI3_2_1稀釋液係添加有每毫升15微微克(1.2nM)的rhIL-13和每毫升5微微克的rhIL-4(0.36nM)，使得每個孔槽的溶液總體積為200微升。所有試驗都進行三重複。自每一孔槽取出150微升的上清液並且利用300微升含有0.1%BSA(3倍稀釋)的F-12K培養液進行稀釋，以進行趨化蛋白和IL-6ELISA。

根據DuoSet公司的酵素免疫分析發展系統(ELISA Development System)說明書對於R&D SYSTEMS公司的人類CCL11/趨化激素和IL-6進行ELISAs，ELISA盤中各孔槽的反應結果係利用SPECTRA_MAX340PC讀取裝置(分子生物裝置)在光學強度(OD)450奈米和540奈米下進行讀取，進行數值計算前係將OD 540奈米的讀值減去OD 450奈米的讀值。

CCL11(趨化激素)和IL-6在上清液中的含量係利用SOFTmax的4參數的標準曲線計算而得。每個樣品的讀值減去未受rhIL-13/rhIL-4刺激的樣本平均讀值(基準線)，再與受rhIL-13/rhIL-4刺激但沒有添加huTBTI3_2_1(設定為100%陽性)的樣本平均讀值進行比較以作為正向對照比例(%)。誤差曲線細表示三重覆生物樣品(細胞處理)的平均標準誤差。huTBTI3_2_1抑制 IL-4/IL-13刺激IL-6釋出的IC50濃度為7.8nM，而抑制IL-4/IL-13刺激趨化激素釋出的IC50濃度為3.8nM(第2圖)。

實施例4：huTBTI3_2_1對於IPF)肺纖維母細胞中IL-4或IL-13誘導的LOX表現之影響

為了要評估huTBTI3_2_1對於IL-4和IL-13刺激的分泌前纖維化酵素(profibrotic enzymes)表現之影響，係利用類似於實施例3的方法來檢測賴胺醯氧化酶(LOX)的mRNA的含量。LOX的基因表現係利用Taqman聚合酶鏈反應系統來測定以及正常化為看門基因(housekeeping gene)GAPDH。

使用標準Taqman方法，簡言之，以Cells-to-Ct套組(ABI公司，目錄編號AM1729)取得細胞破碎液，20倍的人類GAPDH TaqMan內生性對照引子/探針套組購自Applied Biosystems公司(組件編號4310884E)，探針染劑為VIC-TAMRA。20倍的人類引子探針套組(在5’端有FAM進行標記，在3’端有非螢光的螢光消除物質(nonflourescent quencher))是購自Applied Biosystems公司的人類LOX：乙醇氧化酵素(AOD)，基因名稱為賴胺醯氧化酶，分析序號為Hs00184700_m1。反轉錄(RT)係利用具有4個區塊組裝的PELTIER THERMAL CYCLER系統進行表現，型號為PTC 225，購自MJ RESEARCH。Taqman設備係Applied Biosystems公司的7900HT Fast Real-Time PCR系統，組件編號為4330966，序號為279001674。自每個樣品抽取20微升細胞破碎液(或是沒有添加模板的水為對照)後加入80微升的RT精華混合液(master mix)(包含有50微升的2倍RT緩衝液、5微升的20倍RT酵素混合液、25微升不含有核醣核酸酶的清水)。RT定序：在37℃下進行反轉錄60分鐘，在95℃下進行去活化5分鐘，之後維持在4℃之溫度。進行Taqman即時PCR，根據下列配方配製PCR混合液：10微升的Taqman基因表現精華混合液(master mix)(2倍)、1微升的Taqman基因表現分析溶液(20倍)、1微升的人類GAPDH內生性控制溶液(20倍)和3微升的水，並添加5微升的DNA。Taqman循環條件：在50℃進行1次循環2分鐘的UDG培養、在95℃進行1次循環10分鐘的酵素活化反應、在95℃進行40次循環15秒的PCR反應和在60℃反應1分鐘。

LOX活性會引發細胞外膠原蛋白和彈力蛋白交鏈，並造成胞外基質的硬化，其上行調控作用係和實驗性肺部纖維化有關(Rodriguez,C.等人，Drug News Perspect.21：218-224,2008)。

IL-4和IL-13誘導的LOX基因表現，且此表現受到huTBTI3_2_1的抑制和劑量有關，此IC50濃度約為3-6nM(請參見第4圖所示)。這個影響可以在至少三個IPF病患身上的肺纖維化程度觀察到，IL-4和IL-13無法誘導基因生產纖維結合素(fibronectin)以及胰島素生長因子(IGF，數據未示)。這些數據證明了IPF受試者的肺纖維化表現出功能性IL-4/IL-13受體，其受到IL-4和IL-13的活化並造成直接或間接的促纖維化效應。IPF病患受到IL-4和IL-13引發的促纖維化會受huTBTI3_2_1抑制。

實施例5：huTBTI3_2_1在獼猴上對抗過敏源引發急性氣喘的效果

因為huTBTI3_2_1並不會結合嚙齒動物IL-4或IL-13，因此並無法以嚙齒動物模型的肺纖維來測試這個分子的保護效果。雖然huTBTI3_2_1可以和彌猴IL-4和IL-13鍵結，但是卻沒有可以用在此一物種的肺纖維模型。所以，為了要測試在肺部組織中huTBTI3_2_1對IL-4和IL-13的抑制效應，我們試圖探討其他在非人類靈長類物種(獼猴)身上所發生的急性氣喘能夠產生的保護效應。本研究中使用了天生對豬蛔蟲過敏原(Ascaris suum allergens)具有敏感性的母獼猴(Macaca fascicularis)。

研究中藉由使獼猴吸入豬蛔蟲萃取物來誘發獼猴的呼吸道過度敏感和呼吸道發炎症狀，在施打抗體的六天，獼猴係接受huTBTI3_2_1(2.5毫克/公斤靜脈注射)、同劑量的比較抗體(anti-IL-13,IMA638)或是對照抗體(對照抗體並不會鍵結IL-4或是IL-13)。

氣道收縮反應(肺阻力(lung resistance)增加)係利用MI²呼吸分析儀來檢測乙醯膽鹼吸入的增加劑量，此試驗係在施藥前至少24小時進行，施藥後24小時再進行一次測試，因為需要乙醯膽鹼有足夠的刺激濃度來達到100%肺阻力的增加(PC₁₀₀)，所以也需要計算呼吸道過度敏感現象。在完成呼吸道過度敏感反應測試後，便進行支氣管肺泡灌洗，以計算呼吸道中的總白血球細胞和嗜酸性白血球數目。細胞數量以每毫升灌洗液中的細胞數目來表 示。也要計算投與抗體前後乙醯膽鹼PC₁₀₀數值和細胞數量的差異。

在抗原挑戰前24小時及投與抗體7天後分別進行採血，以進行總免疫球蛋白E(IgE)效價(titers)之測試，並計算IgE的效價變化比例。

抗原挑戰會造成呼吸道過度敏感(亦即methacholine PC100減少)(第4圖)和呼吸道中總介白素和嗜酸性白血球會堆積(第5圖和第6圖)，與對照抗體相較，使用huTBTI3_2_1(劑量為2.5毫克/公斤)或IMA638(劑量為2.5毫克/公斤)進行預防性治療可以明顯降低呼吸道過度敏感症狀的發生，使用IMA638而非huTBTI3_2_1則可以明顯減少因抗原誘導所產生呼吸道中總介白素堆積的現象(第5圖和第6圖)，而使用huTBTI3_2_1或IMA638對於嗜酸性白血球的堆積現象並無明顯影響，使用huTBTI3_2_1而非IMA638可以明顯降低IgE的抗體效價(第7圖)。

實施例6：體外試驗huTBTI3_2_1對於重組人類和彌猴IL-4和IL-13誘導的TF-1細胞增生的影響

利用進一步的研究來探討huTBTI3_2_1抑制IL-4和IL-13誘導細胞活性的能力，並藉由IC₅₀的變化確認因為IL-4(hIL-4)和IL-13(hIL-13)誘導的TF-1細胞增生會受到抑制，IL-4(hIL-4)和IL-13(hIL-13)誘導的TF-1細胞增生通常是被應用在文獻中以進行這些細胞激素的生物活性分析。

TF-1細胞和huTBTI3_2_1係共同培養72小時，培養時係添加有hIL-4(5毫微克/毫升)、hIL-13(15毫微克/毫升)、cIL-4(5毫微克/毫升)或cIL-13(30毫微克/毫升)，並在培養的最後3小時添加3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物做為細胞增生的標記物，並記錄光學強度490奈米時的讀值。

huTBTI3_2_1以濃度依賴方式明顯地抑制hIL-4,cIL-4,hIL-13和cIL-13所誘導TF-1細胞增生並具有可比較的潛力。對抗hIL-4和cIL-4誘導的細胞增生之IC₅₀幾合平均值分別是2.03nM和0.53nM，而對抗hIL-13和cIL-13誘導的細胞增生之IC₅₀幾合平均值分別是3.02nM和0.45nM，相關數值如表4所示。

這個研究的結果證明在細胞受到細胞激素刺激後，huTBTI3_2_1可以中和IL-4和IL-13的生物活性，因而造成TF-1細胞增生能力的降低，因此，關注這些細胞激素和huTBTI3_2_1將有助於提供一個方法以中斷IPF病患的纖維化進程。

實施例7：SAR156597對於IL-4和IL-13調節的TGF-β釋放之影響

IL-4和IL-13已經展現具有刺激TGFβ自人類肺部上皮細胞釋放的能力，我們則確認了SAR156597對於這種人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)和人類支氣管上皮細胞(NHBE)所釋放的促纖維化細胞激素(profibrotic cytokine)的影響。SAEC係接種於12孔槽的培養盤，每一孔槽中的細胞數目是50,000個細胞，所使用的培養基是小氣道上皮培養液(Lonza)，培養時間為3天。NHBE則接種於12孔槽的培養盤，每一孔槽中的細胞數目是75,000個細胞，所使用的培養基是BMEM培養基(Lonza)，培養時間為3天。之後細胞以含有5微克/毫升胰島素和5微克/毫升運鐵蛋白(transferrin)的基本培養基進行隔夜培養以使細胞飢餓化，再以含有15毫微克/毫升(1.2nM)的rhIL-13和5毫微克/毫升(0.36nM)的rhIL-4混合物與不同濃度的SAR156597進行培養。在細胞上清液中的TGFβ2係藉由ELISA進行檢測(E-biosciences，目錄編號BMS254)。SAR156597抑制NHBE和SAEC細胞中IL-4和IL-3刺激的TGFβ2釋放係與劑量有關(第8圖)。

實施例8：重複對獼猴進行人類雙特異性抗-IL-4/IL-13(huTBTI3_2_1)單株 抗體的五分鐘靜脈注射(2.5毫克/公斤)後的藥物動力學研究

為了要探討huTBTI3_2_1的藥物動力特性，在重複投與藥劑後檢測人類化雙特異性單株抗體(BsAb)對IL-4/IL-14的作用狀態，以證明huTBTI3_2_1會隨時間累積並監測動物產生的抗藥物抗體。

自德州休士頓查爾斯河取得雄性常尾獼猴(6-8公斤)，並進行靜脈灌注5分鐘。五種劑量係連續供給。並在下列時點進行採血(1毫升)：(第一劑量)0小時、0.5小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、144小時、168小時、240小時；(第二、三及四劑量)0小時、0.5小時、2小時、24小時；(第五劑量)0小時、0.5小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、144小時、168小時、240小時、336小時、504小時、672小時、840小時、1008小時。

血清樣本在進行分析前皆儲存於-20℃之環境中，其中兩個獨立的分析使用搭配Meso Scale Discovery(MSD)公司技術的激發電化學發光(enhanced electro-chemiluminescence,EECL)分析來確認血清中huTBTI3_2_1的含量(請參考第9圖所示)，而第三種分析係用於評估抗藥物抗體(anti-drug-antibody，ADA)反應，也就是抗雙特異性猴子抗體反應。

第一種分析(繪圖於第9圖的A)係利用檢測人類輕鏈κ來偵測血清中的人類抗體總量，在這個分析中，MSD高鍵結培養盤係利用稀釋於PBS且濃度為1微克/毫升的抗人類κ鏈小鼠單株抗體(選殖體4G7；Abcam；#ab1936)進行塗布一個晚上，隨後在4℃溫度下與稀釋倍率1：1000和1：5000的血清樣本反應一個晚上，並加入濃度1微克/毫升具有磺酸基-標誌標記的山羊抗人類抗體(MSD公司，目錄編號#R32AJ-1)以MSD plate Sector Imager 6000之儀器進行結果讀取。

第二種分析(繪圖於第9圖的B)係用於檢測血清樣本中可以鍵結IL-4和IL-13的雙特異性抗體比例(檢測功能性抗體的數量)，在這個分析中，MSD高鍵結培養盤係在4℃下依序添加2微克/毫升小鼠抗人類IL-4(選殖體4D9；Ancell；#ANC-396)、200毫微克/毫升重組人類IL-4(eBioscience, #34-8049)和稀釋倍數1：1000和1：5000的猴子血清進行隔夜培養，隨後添加含有200毫微克/毫升生物素化的兔子多株抗人類IL-13抗體(eBioscience；#13-7138)的200毫微克/毫升重組人類IL-13(eBioscience；#34-8139)以及1微克/毫升的磺酸基-標誌卵白素(MSD；# R32AA-1)以顯現有鍵結的雙特異性抗體。

第三種分析，係利用架橋分析來檢測ADA(繪圖於第8圖的C)，簡單來說，10倍稀釋血清在4℃下和生物素化和磺酸基-標誌huTBTI3_2_1混合物(各別最終濃度為2微克/毫升)進行隔夜培養，複合物係取出並放置於塗布有卵白素的培養盤(MSD；#L11SA-1)，在室溫下培養4小時，並且利用MSD plate Sector Imager 6000儀器來顯示結果。

標準樣本濃度係如下表所示比例的製備於含有0.5% BSA的PBS中，在進行huTBTI3_2_1總量分析中，將校正樣本製備於含有0.5% BSA的PBS、0.1%猴子血漿或是只含有0.5% BSA的PBS並無顯著差異。在檢測huTBTI3_2_1對IL-4和IL-13特異部分，將校正樣本製備於含有0.5% BSA的PBS、0.1%猴子血漿或是只含有0.5% BSA的PBS並無顯著差異。兩條校正曲線皆利用線性回歸除以1/x²進行權重並且在所有校正點間呈現線性(R²>0.98)。

平行於對血清進行的ADA檢測，將模擬ADA稀釋液和具有生物素化及磺酸基-標誌的huTBTI3_2_1混合以得到數據確認曲線。抗體是老鼠抗-人類IgG4(Abcam；#ab1950-1)並且在多個抗體測試中產生最好的訊號對雜訊比例。

huTBTI3_2_1對於總分析和分析分別的定量下限值(lower limits of quantitation，LLOQ)分別為70奈克/毫升和5奈克/毫升。ADA反應的測定為與模擬ADA反應比較為定性而非定量。

藥物動力學參數係利用WinNonLin 5.2程式中非間隔模型202計算血清濃度/個別動物第5次注射劑量之幾何平均數加以計算所得。

針對IL-13/IL-4的雙特異性抗體huTBTI3_2_1在母獼猴血清中的出現量會受到測量以建立藥物動力學參數的重複劑量。

huTBTI3_2_1係以每公斤2.5毫克的劑量重覆進行靜脈注射施打於獼猴，並且進行連續採樣。在投與第一次到第五次劑量時，抗體有出現累積的現象，C_max值和部分AUV_0-336h會分別由128,000毫微克/毫升增加至220,000毫克/毫升和由180,000奈克˙小時/毫升增加至42,000,000奈克˙小時/毫升，在施打第五次劑量後，抗體會具有良好的出現量，此時AUC_0-inf為81,000,000奈克˙小時/毫升(請參見第10圖所示)，抗體的血清清空率(serum clearance)為0.000032升/小時-公斤，分布體積為0.014升/公斤，最終消除半衰期為330小時。

研究中有一隻猴子在第5至7天時出現暫時性抗藥物抗體(ADA)反應，ADA含量回歸到第二次注射當天的背景值含量，此後便未再出現明顯的ADA值上升現象，其他猴子則未曾產生明顯ADA之現象。

在進行試驗期間或是試驗完成之後，也沒有出現特殊的臨床症狀或是 體重下降的情形。

實施例9：上升單一皮下劑量的huTBTI3_2_1於年輕健康男性個體中安全性、容忍性和藥物動力學之隨機性、雙盲性和以安慰劑為對照組的研究之研究設計摘述。

這是第一次探討將huTBTI3_2_1投與於人體的研究，所以必需要小心的逐漸提升投與於人體的劑量，以取得關於單一皮下注射(single subcutaneous，SC)劑量有關於安全性、容忍性和藥物動力學(PK)方面的初步資料。劑量增加的試驗是以一群年輕的男性受試者為對象(年齡介於18至45歲，體重介於50.0至95公斤，身體質量指數介於每平方公尺18.0至30.0公斤之間，經由全面性健康評估認受試者為健康狀態，休息十分鐘後以仰臥姿態進行心跳和血壓測試結果分別為：收縮壓介於95mmHg至140mmHg，舒張壓介於45mmHg至90mmHg，心率介於40bpm至100bpm，休息10分鐘後以仰臥姿態進行正常標準12極導心電圖結果分別為：120毫秒<PR<220毫秒；QRS<120毫秒；QTc

430毫秒，實驗室參數介於正常範圍內，C反應蛋白質不應該超過每公升3毫克(利用高敏度檢測方法)，心肌肌鈣蛋白I不應超出實驗室上限值)。

此為單一中心、隨機、雙盲、設有安慰劑對照的試驗，係將前述的健康男性受試者區分為四個小組進行逐漸增加單一SC劑量的試驗。每一個劑量的組別/群組會包括有8名受試者(其中6名受試者接受huTBTI3_2_1注射，2名受試者接受安慰劑注射)，這樣逐步增加注射劑量的實驗設計是將新治療方法導入人體適用的典型方式。

在進行施打後在85天的觀察期間(大約12星期)，治療緊急不良事件(treatment-emergent adverse events，TEAEs)和PK分析應該適度的被納入考量以計算單株抗體典型的消耗半衰期為15天，如果在接受注射治療12星期後，ADA或是自體免疫抗體(類風濕性關節炎因子試驗(RF)、抗細胞核抗體(Anti-nuclear antibody，ANA)和抗嗜中性細胞胞質抗體(Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies，ANCA))的數值相較於基準線出現上升的狀態，那麼在進行注射後的6個月便需增加追蹤訪查的步驟以確認狀況是否解除或 是一個長期的阻抗現象，如果在四個不同劑量小組的最後上升劑量需要更多有關於低於最高劑量的相關劑量資訊，便需另外設置一含有8名受試者的第五小組以進行劑量試驗和評估。

為了要評估huTBTI3_2_1的免疫調節機制，因此要納入各種有關於發言的特定實驗室測試進行考量。

C反應蛋白質(C-reactive protein，CRP)：

發炎係和例如CRP之急性期蛋白(acute phase proteins)增加有關，在高敏度檢測方法中，一般定義高敏度C反應蛋白質(hsCRP)的正常上限值(ULN)定為3毫克/公升以作為心血管風險之評估，但是美國的第三健康單位則認為CRP一般介於3和10毫克/公升，偶爾則會上升至10至15毫克/公升(Kushner I.，等人Am J Med 2006；119(2)：166.e17-28；Ridker,PM，等人，Circulation 2003：107(3)：391-7；Pearson TA，等人，Circulation 2003：107(3)：499-511；Ridker PM等人，2000：342(12)：836-43；Unek,IT等人，Clin Med Res.2010；8(2)89-95)。利用連續採集正常樣本進行分析可以發現，連續採樣結果中，當P<0.05有明顯差異時(也就是說，最小比例變化並不太像造成分析變異性或受試者間正常變異的原因)，臨界差異會高達118%(Macy EM等人，Clin Chem 1997：43(1)：52-8)。C反應蛋白質的數值在10毫克/公升以上時，通常會被認為是一個臨床上明顯的數值，當數值一旦超出時，通常便會引起關注，在急性發炎反應期間，C反應蛋白質的數值常常可見為超過100毫克/公升(Clin B和Olshaker JS,J.Emerg Med.1999：17(6)1019-25)，CRP的增加通常會被視為一種主動性血管炎(Konttinen YT等人，Ind J Rheumatol 2007：2(3)：100-4,Hesselink DA等人，Scand J Rheumatol 2003：32(3)151-5)。在這個試驗中，在臨床觀察中使用hsCRP做為藥物相關發炎反應和可能引發血管炎的主要檢測指標，當hsCRP數值超過10毫克/公升長達72小時後，便需要觀察是否有引發血管炎的早期症狀。一般來說，藥物引發的血管炎一旦停止治療後便會回復，而例如hsCRP這類的發炎標誌也會回復至正常值或基準值(Wiik,A,Curr Opin Rheumatol 2008：20(1)35-9；Calabrese LH和Duna GF,Curr Opin Rheumatol 1996； 8(1)34-40)，此外，當開始施藥時，C反應蛋白質的數值不斷上升至20毫克/公升，便需要考量發生藥物相關預發炎刺激的可能性，並且在排除其他引發發炎反應的原因，例如急性感染，或可能理由後，才可以停止進一步的用藥。

心肌肌鈣蛋白I：

藉由監測血清中心肌肌鈣蛋白I(cTnI)來檢測因為潛在的冠狀動脈血管炎引起的心肌損傷(Kim M和Kim K,Pediatr Cardiol,1999：20(3)：184-8)。因為cTnI的數值上升可能和其他心肌損傷(包括劇烈運動)以外的因子有關，所以在本研究中將其與臨床病徵、症狀、ECG和hsCRP加以觀察(Wu AH,等人Clin Chem.2007；53(12)：2086-96)。

對於血管炎的補充測試：

為了要進一步確認在個別受試者身上hsCRP數值持續增加和發炎之間的關連性，研究中也同時進行了更多有關於血管炎的實驗室測試，其中包括了對於補體(C3、C4和CH₅₀)、冷凝集球蛋白、ANCA(對細胞核週邊ANCA(perinuclear ANCA)和細胞質ANCA(cytoplasmic ANCA)進行免疫螢光測試，或是對抗蛋白酶3(anti-protease 3，PR3)及抗白細胞髓過氧化酶(Myeloperoxidase)進行確認性免疫反應)、RF和ANA的測試。在對所有受試者投與藥物之前先建立基準值，之後才是對hsCRP數值有出現持續上升現象的受試者進行這些補充性試驗，以確認是否和血管炎有關(大於10毫克/公升至少72小時)，在這些個案中，補充性試驗的結果可以馬上呈現(盡快)並且在後續數個訪視。

上述被納入補充性試驗的分析項目對於血管炎是否發生的機制可以提供一個內部的檢視，ANCA則是一個新的分類標準(Sunderkötter C和Sindrilaru A.Eur J Dermatol.2006；16(2)：114-24；Watts R等人，Ann Rheum Dis.2007；66(2)：222-7；Watts RA等人，Rheumatology(Oxford).2010 Jul 20：1-3)。ANCA因為其出現在一般嗜中性白血球(neutrophil)中的間接免疫螢光分析(IIF)圖像和所作用的標的抗體而產生分類地位(Pollock W等人J Immunol Methods.2009；347(1-2)：19-23；De Rosa FG和Agnello V.J Rheumatol.2009；36(9)：1953-5；Clin Sci(Lond).2005；108(2)：101-12)。如果MPO-ANCA的檢測結果為陽性，便可以懷疑其可能為過敏性肉芽腫(Churg-Strauss syndrome)或顯微性多血管炎(Microscopic polyangiitis)；如果PR3-ANCA檢測結果為陽性，便比較可能是韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis，WG)；如果ANCA檢測為陰性，便可以推估為冷凝球蛋白性血管炎(cryoglobulinemic vasculitis)，且可以排除潛在疾病，特別是C型肝炎和B型肝炎、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、修格蘭氏症候群(Sjogren’s syndrome)。血清C3和C4通常會消耗在冷凝球蛋白血症(cryoglobulinemia)，而在結節性多動脈炎以及ANCA陽性血管炎表現正常，在包括如感染、發炎性腸道疾病和其他結締組織疾病(例如類風濕性關節炎)之疾病中，ANCA都會呈現陽性反應，在這些情況中，ANCA呈現陽性反應、但PR3或白細胞髓過氧化酶則為陰性反應。

血管內皮細胞活化標記：

血管炎病變的發展通常和內皮細胞以及嗜中性白血球有關(Tesfamariam B和DeFelice AF.Vascul Pharmacol.2007；46(4)：229-37；Toxicol Appl Pharmacol.2005；207(2 Suppl)：441-5)，加強例如e-選擇素(e-selectin)這類吸附分子的表現可以提升內皮細胞和循環性發炎細胞的相互作用，已知有多種內皮活化標記例如內皮收縮素-1和凝血酶調節素(thrombomodulin)在血管炎發作的期間會增加表現。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在貝雪氏病(Behcet’s disease)、顯微性多血管炎(microscopic polyangiitis)、結節性多發動脈炎(polyarteritis nodosa)、巨細胞動脈炎(giant cell arteritis)、和全身性血管炎等病患身上會改變血管通透性並且增加在血清中含量(Cekmen M等人，Int J Dermatol.2003；42(11)：870-5)。如果在多名受試者身上都出現有因為治療意外引發的發炎症狀(例如持續的hsCRP升高)或是實驗室數值出現與血管炎一致的變化，那麼便需要進行建檔用血清或是血漿的採樣(在給藥前或是給藥後一段時間收集樣本)並進行分析，以對於多種和血管內皮活化有關的標記進行探討，並加以確認發炎 的本質。

淋巴細胞亞群：

為了確認人類淋巴細胞的特定子類型並不會受到huTBTI3_2_1的選擇性影響，利用流式細胞儀進行淋巴細胞的評估，這項評估包括了總T細胞、T輔助細胞(CD4)、T抑制細胞(CD8)和總B細胞(CD19)表現的絕對數量和在總淋巴細胞中所占的比例，亦即CD4/CD8的比例。

致免疫性：

全身性投與單株抗體和ADA的產生有關，其可以改變PK和/或治療性抗體的活性(Hansel TT等人Nat Rev Drug Discov.2010；9(4)：325-38)，致免疫性的評估係利用酵素鏈結免疫吸附分析法(ELISA)對於抗huTBTI3_2_1抗體進行分析，這是一種功能性的分析以評估huTBTI3_2_1抗體中和性，並且使用於未來的研究之中。

尿白蛋白：

當尿液中出現蛋白質時是一種腎小球通透性增加的徵兆，在進行藥物臨床試驗的期間，則可以作為腎臟可能受到損傷的證據，標準的尿液試紙分析便是一種典型應用於蛋白質檢測的方法，但是試紙法並沒有辦法檢測出腎小球功能上可能發生於血管炎早期的更為細微狀況變化，因此，在進行huTBTI3_2_1臨床試驗出其便需要更靈敏的檢測方法進行尿白蛋白的檢測。清晨集尿法便是用來監測微量白尿蛋白(microalbuminuria)的方法，並且所獲得的白蛋白/肌酸酐比例可以用來校正尿液稀釋溶液中的的變動狀況。而治療後在尿液中出現微量白尿蛋白則被定義為在連續3次的採尿檢測中有2次的白蛋白/肌酸酐比例大於30微克/毫克，並會建議病患進行糖尿病的監控(美國糖尿病學會。糖尿病的標準醫療照護方法--2009.Diabetes Care.2009；32 Suppl 1：S13-61)。因為運動會在瞬間提升尿白蛋白，因此在採尿之前必需要禁止過度的運動(Heathcote KL等人，Clin Invest Med.2009；32(4)：E261-5)。在確認微量白尿蛋白時，過度運動24小時內取得得尿白蛋白檢測結果必需要被排除。當在連續3次的採尿檢測中有2次的白蛋白/肌酸酐比例大於300微克/毫克時，便會被當作發生微量白尿蛋白的證據 (美國糖尿病學會。糖尿病的標準醫療照護方法--2009.Diabetes Care.2009；32 Suppl 1：S13-61)。

試驗產品(investigational product(IP))注射部位的耐受度：

在進行施藥後，對於試驗產品(IP)注射部位的不適反應和組之反應都應該進行至少為期兩周的監控，其中包括了對於出現疼痛部位的標準定量和定性評估(詞語口頭評估)(Melzack R.麥克基爾疼痛良表：主要症狀和評分方法，Pain 1975；1：277-299)、紅斑和腫脹/硬結/水腫等評估(產業綱領：健康成人的毒性分級和青少年志願者參加預防性疫苗臨床試驗，於美國衛生部食品與藥物管理局生物製劑驗證與研究中心，2007年9月)。

表11提供TDU11325逐步增加劑量的階段，每一次的劑量都是前一次劑量的2倍，劑量的逐步增加是治療用單株抗體在進行臨床試驗初期典型使用的方法，並且藉由仔細的監控可以作為安全性訊號潛力的支持。

根據較低注射劑量的結果可以進行較高huTBTI3_2_1注射劑量的測試，較高劑量可以包含低於、等於或高於300毫克組別的任何劑量，更多的劑量組別可以包括但不受限於175毫克、200毫克、225毫克、250毫克、275毫克和300毫克，更多的劑量組別也可以是300毫克、350毫克、400毫克或更高劑量。

huTBTI3_2_1或安慰劑係在禁食狀態下進行肽臍靜脈注射，注射部位為肚臍左側或右側4至10公分並且高於腰線處，TDU11325劑量組別則義務性的開始，其規模如同小組，以作為安全措施。對於每一個劑量組別來說，有2位受試者在第一天便接受注射，組別中剩餘的受試者則依序在2天(~48小時)後進行注射，但每天接受注射的人數不超過2人。

贊助者和研究人員會根據研究人員所提供的初步安全性數據來決定是否由劑量“n”增加至下一較高的“n+1”劑量，此初步安全性數據係包括有8名受試者中至少6人在劑量為“n”時，施藥前至少21天(22天)的盲性安全數據，因此必須要考慮在一個小組中交錯給藥，每4星期至少要開始進行一個新劑量的試驗。為了進行決定所揭露的數據至少包括有不良事件、血液學、淋巴細胞亞群、凝血功能、尿常規檢查、血清生化(包括hsCRP和cTnI)、ECG、血壓、心率和體溫。在進行研究的過程中也必須檢視可用的PK數據。

除了典型的嚴重不良事件和不良事件發生率/研重程度的評估之外，贊助商和研究人員在探討潛在的干擾因素後，必須遵循下列指標性的條件來決定停藥的劑量：●至少出現一個無法合理排除與治療有關且程度嚴重的不良事件(相同義思)，一個不良事件程度為”嚴重”的定義是足以影響每日活動和需要進行症狀治療；●QTc

500毫秒●連續兩次間隔超過24小時以上的採血結果中hsCRP>20毫克/公升注意：如果在既定的採血時點所取得的血液樣本中hsCRP為>20毫克/公升，需要在採血24小時後進行增加的採血(或是盡快)以進行反覆測試。

用來製備為皮下注射溶液的冷凍乾燥huTBTI3_2_1，每一小管中含有185毫克的huTBTI3_2_1和賦形劑，並保存於2℃和8℃的溫度下(36℉和46℉)，早上要注射前利用1.7毫升無菌且無活體致熱源(nonpyrogenic)的蒸餾水在室溫下將其重組(不可超過SC注射前一小時)。進行重組後，用來進行注射的溶液中組分及濃度為：100毫克/毫升huTBTI3_2_1於6.3毫莫耳 /升的磷酸二氫鈉、3.7毫莫耳/升的胺丁三醇、5%(重量/體積)蔗糖，3%(重量/體積)脯胺酸和0.2%(重量/體積)聚山梨酯80，最終酸鹼值為pH7.0。若是注射液為安慰劑，每一小管中含有2毫升的液體，液體中包括有用來重組huTBTI3_2_1相同濃度配方的賦形劑。

注射前的禁食期間建議是注射前至少10小時並且持續到注射後2小時。

在基準值和進行研究期間的安全性和容忍性試驗包括有：

●生理測試(至少包括：心臟和呼吸系統聽診、雙臂和雙腿的周邊動脈搏動、瞳孔、膝、阿基里斯腱、蹠反射、周圍淋巴結和腹部檢查、檢查皮膚，手和腳)；●體重(公斤)；●由後向前的胸部X光檢查(在篩選時，除非臨床指示給藥)；●體溫(可以是口溫或耳溫，但是驗中對所有受試者都應採用同一種檢測方法)；●仰臥姿勢3分鐘後和站立姿勢10分鐘後量測的心率和收縮壓和舒張壓；●實驗室測試(所有早上在禁食狀態下的採血樣本，也就是除非特別註明，10小時前只能喝水)：- 血液：紅細胞計數(RBC)，血細胞比容(Hct)，血紅蛋白(Hb)，具有差別的白細胞計數(WBC)(嗜中性白血球細胞，嗜酸性白血球細胞，嗜鹼性白血球細胞，單核細胞和淋巴細胞)，血小板； - 凝血功能：凝血酶原時間(PT)，國際標準化比值(INR)，纖維蛋白原和活化部分凝血活酶時間(aPTT)；- 血清生化反應：電解質：鈉，鉀，氯，鈣；肝功能：ALT，AST，鹼性磷酸酶，γ-谷胺醯轉移酶(GGT)，總膽紅素和結合膽紅素；腎功能：尿素，肌酸酐；代謝：葡萄糖，白蛋白，總蛋白，總膽固醇，三甘油酯；潛在的肌肉毒性：肌酸激酶(CK)；潛在的心臟毒性：cTnI；炎症標誌物：高敏CRP(hsCRP)；-淋巴細胞亞群：利用流式細胞儀計算總T細胞(CD3)、T輔助細胞(CD4)、T抑制細胞(CD8)和總B細胞(CD19)，並呈現出絕對樹目和總淋巴細胞的比例，即CD4/CD8比例。 - 致免疫性：抗huTBTI3_2_1抗體- 血管炎的輔助測試(在基準值，且接著在hsCRP等於或超過72小時數值超過10毫克/升之個體上才會後續給藥)：補充性測試：C3，C4，CH₅₀；冷凝球蛋白；類風濕因子(RF)；抗細胞核抗體(Anti-nuclear antibody，ANA)：HEp2 IIF(效價和圖樣)；抗嗜中性細胞胞質自體抗體(ANCA)：對細胞核週邊ANCA(pANCA)和細胞質ANCA(cANCA)進行免疫螢光測試，或是對抗蛋白酶3(PR3)及抗白細胞髓過氧化酶進行確認性免疫反應。

●血液學測試：HBsAg、B型肝炎核心抗體、抗HCV抗體、抗HIV1抗體及抗HIV2抗體；●存檔血液樣本：血清和血漿樣本係製備並儲存以進行更進一步的 實驗室參數分析並支持安全性評估結果，特別是在多名受試者身上觀察到持續性的發炎反應(例如hsCRP>10毫克/公升持續至少72小時)或是出現因為治療而產生的血管炎標記時，便有可能需要進行血管內皮活性的生物標誌的研究分析。 對於血清來說，將10毫升的血液樣本收集放置於一乾燥的紅蓋試管中，收集動作需在15分鐘內完成並且在4℃下以大約1500克的轉速進行離心10分鐘，隨後將血清以粗略的定量方式分置於3個儲存用試管(利用塑膠材質的移液管)，並馬上緊閉蓋口直立放置於-20℃冰箱或是冷卻裝置中，對於血漿來說，將10毫升添加有乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA)的血液樣本收集放置於一乾燥的紫蓋試管中，收集動作需在15分鐘內完成並且在4℃下以大約1500克的轉速進行離心10分鐘，隨後將血漿以粗略的定量方式分置於三個儲存用試管(利用塑膠材質的移液管)，並馬上緊閉蓋口直立放置於-20℃冰箱或是冷卻裝置中。

●尿常規檢查： - 收集中段尿液樣本並且進行下列分析。 - 使用一試劑試紙分析來檢測蛋白質、葡萄糖、血液(血紅素)、白血球、酮糖體和pH，當葡萄糖檢測結果為陽性時，應該要依照局部臨床試驗標準操作流程使用另一個方法來確認葡萄糖檢測結果，如果初步檢測顯示受試者尿液中有蛋白質、葡萄糖或血液時，則應該要另外採集另一份尿液樣本以進行尿常規檢查之結果確認；- 尿液沉降也應該進行檢測，至少應該確認下列組成分：紅血球細胞，變形紅血球，白血球，腎小管上皮細胞，圓柱(透明，RBC，WBC，顆粒，糯，脂肪，腎細胞)，細菌，酵母菌和滴蟲。這些組份的存在應在當地的實驗室使用實驗室標準術語和單位進行評分(例如，高倍視野的細胞數量，很少或豐富)。報告上應註記 的任何異常現象。 - 尿液微量白蛋白：對白蛋白和肌酸酐進行定量分析並計算白蛋白和肌酸酐之比值(微克/毫克)。

●尿液毒物篩檢：安非他命/甲基苯丙胺，巴比妥類，苯二氮卓類，大麻，可卡因，鴉片；●酒精的呼吸或血液檢測；●不良事件，應該由受試者自發的提出報告或是由研究人員進行觀察所得，細針對不良事件或相關反應的定義進行監測；●標準12導極ECGs當生命跡象、ECG和血液檢品都如同投與試驗性產品和/或用餐一樣按照規劃在同一時間進行，這些測試都必須要注射IP和/或用餐前完成。有時生命跡象、ECG和血液樣本會重複用來進行PK或是安全性的分析，但仍需要遵守下列的檢驗順序：ECG、生命跡象、PK樣本和安全性檢測樣本。 在處於仰臥姿勢的至少十分鐘內應該要利用心電圖設備將12導極心電圖結果記錄下來，在進行試驗的過程中這些電極每一次應該都要放置在同一個位置(利用洗不掉的筆來標記電極放置的位置)。 每一個心電圖應該包含有12個電極每十秒檢測的同步檢測數值，並且進行下列計算：- 一個單一12導極的心電圖(25毫米/秒，10毫米/毫伏)輸出時會同時註記有心率、PR、QRS、QT、QTc自動校正值，包括日期、時間、開始及受試者編號、檢測人員簽明和每個電極至少3個檢測值。試驗性藥物選擇和自動數值都記錄在eCRF中，輸出資料應該保留在網置站，如同預期，在第1天給藥前也需要進行三重複試驗。

肚臍附近的皮膚狀況也應該受到測試是否因為SC注射而產生潛在的反應。對於每一個紅斑和腫脹的症狀(包括硬塊和/或水腫)應該以公分為單 位分別記錄下最大直徑。紅斑和腫脹應該根據類似於FDA對於疫苗接種評估的指引方針分別給予評分。如果沒有在同一時間觀察到一參數因為治療產生的改變，便記錄為0分。

此外，搔癢的程度和丘疹、膿泡和囊泡化的出現也要分別利用下列評分標準加以計分：0分=沒有；1分=難以察覺；2分=輕度；3分=中度；4分=嚴重

程度中度的皮膚反應或是有惡化狀況都應該被舉報為不良事件，下列症狀的出現與否或是其他粗淺的觀察結果都應該加以記錄但不需要進行評分：侵蝕，乾燥，脫屑，開裂，結痂和玻璃化。此外，根據麥克基爾疼痛評量利用口頭數自評分表(受試者自評)針對所產生的疼痛強度進行評分記錄，受試者疼痛評分大於等於3分時需要舉報為一不良事件。

0分=無疼痛感；1分=輕度；2分=令人不適；3分=中度；4分=嚴重；5分=極痛苦

藥物動力學

所有採集到要進行TBTI3_2_1 PK分析的血液樣本都要在預定採樣時間的±15%的期間內完成，受試者提供血漿樣本的數量和所有樣本的數目都如表14所示。

利用ELISA分析可以進行人類血漿中huTBTI3_2_1的定量，生物素化的IL-4被塗布在一卵白素培養盤上並且用於和huTBTI3_2_1鍵結，隨後用硫磺基標誌-IL-13加以檢測，這樣的形式使用電化學冷光分析便可以檢測停留在至少一IL-4未鍵結位置和至少一IL-13未鍵結位置的huTBTI3_2_1，因為相較之下，huTBTI3_2_1的血漿濃度會比IL-4和IL-13的濃度還要高，這個分析便可以反映出huTBTI3_2_1的總濃度。

在進行huTBTI3_2_1檢測時可能存在的ADA干擾必需要在進行臨床樣本分析時列入考量。

為了要檢測潛藏於人類血漿中的抗huTBTI3_2_1抗體(ADA)，使用了一種電化學冷光呈色檢測的橋接定性ELISA方法(bridging qualitative ELISA)，在進行每一次篩選分析時，切點應該提供5%的偽陽性率，高於血漿樣本被認為有抗huTBTI3_2_1抗體潛在陽性的數值。

陽性反應的樣本會進行篩選分析，其係利用確認性分析(和huTBTI3_2_1競爭)來確認抗體的存在以及消除在初步篩選分析中出現的偽陽性檢測結果。進行ADA分析時huTBTI3_2_1的干擾會被記錄下來，如此便可以知道不影響ADA檢測極限的最高劑量濃度，在探討這個參數時也應該一併考量到致免疫性的干擾。

血漿濃度係用來決定表18中所列的huTBTI3_2_1的PK參數，計算時是使用標準非區間技巧。

對於C_max,AUC_last,AUC等參數來說，根據Gough等人的建議(Pharmacokinetics UK Joint Working Group Drug Infor J 1995：29：1039-1048)經驗試驗模式(PK參數=α×劑量^β)根據一“估計”解釋來進行劑量比例之評估。

試驗模式會套用在指數轉化刻度上：log(參數)=log(α)+β x log(劑量)+誤差

無法符合模式的狀況下，要利用殘插圖(residual plots)和殘基平均數的平方和純誤差殘基平均數的平方的F試驗來加以評估，如果模式可以適用的話，則計算β值得90%信心區間，並且更進一步用來取得PK參數的90%信心區間，和r倍率(r=2和r是高劑量和低劑量的比值)的關係會隨著劑量的增加而提升，取r值的β估計值(“b”)和信心界限的次方來加以估計：r^b±t×SE(b)

如果出現無法符合模式的證據，要在下降劑量的範圍中進行嘗試以符合模式(例如排除一極端劑量值)，此外，也會將固定劑量搭配使用固定效應模式，利用明顯PK參數的對數值，藉由第一次電腦進行信心區間的估算以取 得配對劑量組別在固定要應模式架構下的差異，可以估計參數90%信心區間會隨著配對劑量的增加而提升，並且利用反對數轉換計算進行比例轉換。

對於參數t_1/2z來說，利用一線性固定效應模式來進行劑量影響之評估：Log(t_1/2z)=劑量+誤差

定點估算和幾合平均數t_1/2z的90%信心區間係用於各個劑量組別進行統合跨越劑量之計算。t_max數值的分布係呈現於各別劑量直方圖中。

不良事件和嚴重不良事件的定義

不良事件是指當一個受試者在的醫療管理藥劑產品後產生的任何不易處理的醫療現象，不良事件不一定和治療有絕對的因果相關性。嚴重不良事件是指任何發生在任何劑量的不易處理的醫療現象：●造成死亡，或●生命受威脅，或- 注意：”生命受威脅”一詞在”嚴重”的定義中指的是受試者在事件發生的時後有引發死亡的危險，而不是說如果當事件更為嚴重時。

●需要住院或延長住院治療，或●造成持續或顯著傷殘/工作能力喪失，或●是一種先天性異常/出生缺陷，或●是醫藥上重要事件：- 醫藥上和科學上的判斷應該用來決定在其他狀況下加快報告是否適當，例如重要醫藥事件可能不會直接產生生命危害或是死亡或是住院治療的必要，但是可能會使受試者陷於危險狀態或是需要進行介入治療以防止上述定義的其他症狀之一發生。

注意：作為決定哪種症狀為醫學上重要事件的指引，可以參考下列舉例，但非詳盡無疑：

需要在急診室或在家進行過敏性支氣管強化治療； 例如顆粒性球缺乏症(agranulocytosis)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、骨髓造血發育不全(Bone Marrow aplasia)、骨髓生成不良症(myelodysplasia)、全血球減少症(pancytopenia)之類的血液體液不調；抽搐(convulsions)；丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)大於；3倍正常範圍上限值(ULN)且膽紅素大於2倍ULN；無症狀出現ALT增加至10倍ULN；或出現藥物依賴或藥物成癮症狀。

需要直接告知贊助商的不良事件：

●ALT的增加量等於ULN的2倍或大於ULN的2倍

●hsCRP大於10毫克/公升超過或等於72小時

●心肌肌鈣蛋白I(cTnI)大於2倍ULN

如果觀察到cTnI大於2倍ULN，便應該持續追蹤cTnI、肌酸酐激酶(CK)和心肌B部分的肌酸酐激酶(CK-MB)的數值(在額外進行採血時和後續的天數)，同時需要搭配額外ECG的記錄，直到測試結果回復至正常值。如果cTnI的數值持續增加、CK-MB/CK比值增加和/或觀察到ECG記錄上的緊急異常現象，便應該徵詢心臟科醫師的建議。

●QTc

500毫秒

如果持續出現QTc自動檢測值大於等於500毫秒的現象時，研究人員應該要進行人工讀值確認或是委認醫師利用Fridericia方程式來校正QT值，受試者應該在特別安排受到監控。也應該採集適當的血液樣本(例如進行cTnI)，在一般和臨床責任基準持續進行ECG監測，直到QTc間隔回復至一正常數值，此正常數值應該在研究人員取得贊助商同意後來加以決定。

●在IP注射部位出現嚴重的局部皮膚反應。

●IP超量症狀

- IP的超量(突發性或蓄意性)可能是研究人員預料之中的事件或是由受試者自行發現的症狀(並非根據全身性IP試驗評估)並且定義為至 少兩倍的超出劑量。

實驗室檢查異常包括：

●嗜中性白血球減少症

- 定義為嗜中性血球<1500/毫米³(但是非裔受試者數值<1000/mm³)

●血小板減少症

- 定義為血小板數量<100,000/毫米³

●急性腎功能衰竭

- 血清中的肌酸酐快速增加至超過150微莫耳/公升(1.7毫克/百毫升)

●疑似橫紋肌溶解

實施例10：隨機性、雙盲性、安慰劑對照試驗探討對於健康年輕男性受試者(TDU11325)進行單一劑量皮下注射SAR1 56597的安全性、容忍度和藥物動力學

下表，表20~35是有關TDU11325研究的整體性數據

<110> 賽諾菲公司 Bender,Florent Li,Danxi Minnich,Anne Naadimuthu,Amirtha Swanson,Brian Rao,Ercole Tang,Lei Yu,Haixin

<120> 雙重V區類抗體蛋白質之用途

<130> US2011/027 WO PCT

<150> FR 1162177

<151> 2011-12-21

<150> US 61/557635

<151> 2011-11-09

<150> US 61/537243

<151> 2011-09-21

<150> US 61/453275

<151> 2011-03-16

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化小鼠/小鼠VL3區域

<400> 1

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化小鼠/小鼠VH2區域

<400> 2

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化小鼠/小鼠VL1區域

<400> 3

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化小鼠/小鼠VH1區域

<400> 4

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化小鼠/小鼠VH2區域

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連結子

<400> 6

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

Claims (7)

1. 一種包含最大安全治療劑量之特異性結合至IL-4和IL-13的雙重V區類抗體蛋白質或其片段之組成物用於製備醫藥品之用途，該醫藥品係用於治療哺乳動物中經由IL-4或IL-13或IL-4與IL-13所媒介之疾病，其中該雙重V區類抗體蛋白質或片段包含可變異輕鏈區與可變異重鏈區，其中該可變異輕鏈區包含具胺基酸序列SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3，其中該可變異重鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：5，且其中該最大安全治療劑量為150毫克至300毫克。
2. 如請求項1之用途，其中雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之可變異輕鏈與含有胺基酸序列SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之可變異重鏈。
3. 如請求項1或2之用途，其中雙重V區類抗體蛋白質或雙重V區類抗體區域片段包含肽連接子使SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3與肽連接子連接在一起以及SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4與肽連接子連接在一起。
4. 如請求項3之用途，其中肽連接子包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
5. 如請求項1或2之用途，其中該最大安全治療劑量選自由150毫克及300毫克組成之群組。
6. 如請求項3之用途，其中該最大安全治療劑量選自由150毫克及300毫克組成之群組。
7. 如請求項4之用途，其中該最大安全治療劑量選自由150毫克及300毫 克組成之群組。

Images