ES2620294T3 - Diagnóstico no invasivo de la aneuploidia fetal por secuenciación - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo para la presencia o ausencia de una aneuploidía fetal en una muestra de plasma materno que comprende una mezcla de ADN libre de células materna y fetal, comprendiendo los pasos de: (a) la obtención de una mezcla de ADN libre de células materna y fetal de dicha muestra; (b) la secuenciación de subsecuencias predefinidas de la ADN libre de células materna y fetal para obtener una pluralidad de etiquetas de secuencia alineadas a las subsecuencias predefinidas, en la que la secuenciación selectivamente comprende la secuenciación de moléculas de ácido nucleico que comprende las subsecuencias predefinidas utiizando un método de secuenciación que selectivamente captura moléculas de muestra que contienen las subsecuencias predefinidas, en la que dichas etiquetas de secuencia son de suficiente longitud para asignarse a una subsecuencia predefinida específica, en la que las subsecuencias predefinidas son de una pluralidad de cromosomas diferentes, en la que dicha pluralidad de cromosomas diferentes comprende al menos un primer cromosoma que presuntamente tiene una distribución anormal en dicha muestra y al menos un segundo cromosoma estando presuntamente normalmente distribuido en dicha muestra, en la que la captura selectiva se destina a subsecuencias predefinidas mapeando de modo único o con un desajuste a dicho al menos un primer cromosoma y dicho al menos un segundo cromosoma, y en la que dicho al menos un primer cromosoma es el cromosoma 18, 21, 13, X o Y; (c) la asignación de una pluralidad de etiquetas de secuencia a sus correspondientes subsecuencias predeterminadas; (d) la determinación de un número de etiquetas de secuenciación a las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma y un número de etiquetas de secuencia alineándose a las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma; y (e) el uso de número dle paso (d) para determinar un diferencial, entre el número de etiquetas de secuencia alineándose a las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma y el número de etiquetas de secuencia alineándose a las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma, siendo determinante de la sobrerepresentación o subrepresentación de dicho primer cromosoma en la mezcla de ADN libre de células materna y fetal.

Description

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Diagnostico no invasivo de la aneuploidia fetal por secuenciacion

Descripcion

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere al campo del diagnostico molecular, y mas particularmente al campo del diagnostico genetico prenatal.

Tecnica relacionada

[0002] A continuacion se presenta la informacion de fondo sobre determinados aspectos de la presente invencion, ya que pueden estar relacionados con las caracterlsticas tecnicas mencionadas en la descripcion detallada, pero no necesariamente se describen en detalle. Es decir, ciertos componentes de la presente invencion se pueden describir con mayor detalle en los materiales discutidos a continuacion. La discusion siguiente no debe interpretarse como una admision en cuanto a la relevancia de la informacion para la invencion reivindicada o el efecto de la tecnica anterior del material descrito.

[0003] Aneuploidia fetal y otras aberraciones cromosomicas afectan 9 de cada 1000 nacidos vivos (1). El patron de oro para el diagnostico de las anomallas cromosomicas es el cariotipo de las celulas fetales obtenido a traves de procedimientos invasivos como la vellosidad corionica de muestreo y amniocentesis. Estos procedimientos imponen riesgos pequenos pero potencialmente significativos tanto al feto como a la madre (2). La deteccion no invasiva de la aneuploidia fetal utilizando marcadores sericos maternos y ultrasonidos estan disponibles, pero tienen una fiabilidad limitada (3-5). Por lo tanto, existe el deseo de desarrollar pruebas geneticas no invasivas para anomallas cromosomicas fetales.

[0004] Desde el descubrimiento de las celulas fetales intactas en la sangre materna, ha habido un interes intenso en el intento de utilizarlas como una ventana de diagnostico en la genetica fetal (6-9). Si bien esto todavla no se ha aplicado en la practica (10), el descubrimiento posterior de que cantidades significativas de acidos nucleicos fetales libres de celulas tambien existen en la circulacion materna ha llevado al desarrollo de nuevas pruebas geneticas prenatales no invasivas para una variedad de rasgos (11, 12). Sin embargo, la medicion de la aneuploidia sigue siendo un reto debido al fondo alto de ADN materno; El ADN fetal a menudo constituye <10% del ADN total en el plasma libre de celulas maternas (13).

[0005] Los metodos desarrollados recientemente para la aneuploidia se basan en el enfoque de deteccion de la variacion alelica entre la madre y el feto. Lo et al. demostraron que las proporciones alelicas de ARNm especlfico de la placenta en el plasma materno podrlan utilizarse para detectar la trisomla 21 en ciertas poblaciones (14).

[0006] Del mismo modo, tambien mostraron el uso de relaciones alelicas de los genes impresos en el ADN del plasma materno para diagnosticar la trisomla 18 (15). Dhallan et al. utilizaron alelos fetales especlficos en el ADN del plasma materno para detectar la trisomla 21 (16). Sin embargo, estos metodos se limitan a poblaciones especlficas porque dependen de la presencia de polimorfismos geneticos en loci especlficos. Nosotros y otros argumentamos que deberla ser posible en principio utilizar la PCR digital para crear una prueba universal, independiente del polimorfismo para la aneuploidia fetal usando ADN plasmatico materno (17-19).

[0007] Un metodo alternativo para lograr la cuantificacion digital del ADN es la secuenciacion de escopeta directa seguida de mapeo para el cromosoma de origen y el recuento de fragmentos por cromosoma. Los recientes avances en la tecnologla de secuenciacion de ADN permiten una secuenciacion masiva paralela (20), produciendo decenas de millones de secuencias cortas en un solo recorrido y permitiendo un muestreo mas profundo de lo que puede lograrse mediante PCR digital. Como se conoce en la tecnica, el termino "etiqueta de secuencia" se refiere a una secuencia de acido nucleico relativamente corta (por ejemplo, 15-100) que puede usarse para identificar una cierta secuencia mayor, por ejemplo, mapearse a un cromosoma o region genomica o gene. Estos pueden ser ESTs o etiquetas de secuencias expresadas obtenidas a partir de ARNm.

Patentes y Publicaciones Especfficas

[0008] Science 309: 1476 (2 de septiembre de 2005) News Focus "An Earlier Look at Baby's Genes" describe los intentos de desarrollar pruebas para el slndrome de Down utilizando la sangre materna. Los primeros intentos de detectar el slndrome de Down utilizando celulas fetales de sangre materna fueron llamados "solo modestamente prometedores". El informe tambien describe el trabajo de Dennis Lo para detectar el gen Rh en un feto donde esta ausente en la madre. Otras mutaciones transmitidas por el padre tambien se han detectado, como fibrosis qulstica, beta-talasemia, una clase de enanismo y la enfermedad de Huntington. Sin embargo, estos resultados no siempre han sido reproducibles.

[0009] Venter et al, "The sequence of the human genome," Science, 2001 Feb 16;291(5507):1304-51, describe la secuencia del genoma humano, cuya informacion esta disponible publicamente de NCBI. Otra secuencia genomica

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de referenda es una construccion NCBI actual obtenida a partir de la pasarela de genoma UCSC.

[0010] Wheeler et al, "The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing," Nature, 2008 Apr 17;452(7189):872-6 describe la secuencia de ADN de un genoma diploide de un solo individuo, James D. Watson, secuenciado a redundancia de 7,4 veces en dos meses usando secuenciacion masivamente paralela en recipientes de reaccion de tamano picolitro. La comparacion de la secuencia con el genoma de referencia condujo a la identificacion de 3,3 millones de polimorfismos de un solo nucleotido, de los cuales 10,654 causan la sustitucion de aminoacidos dentro de la secuencia codificante.

[0011] Quake et al., US 2007/0202525 titulada "Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis", publicado 30 de agosto 2007 (y la aplicacion relacionada WO 2007/092473), describe un proceso en el que la sangre materna contiene ADN fetal se diluye hasta un valor nominal de aproximadamente 0,5 equivalentes de genoma de ADN por muestra de reaccion.

[0012] Chiu et al., "Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic DNA sequencing of DNA in maternal plasma," Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (51): 20458 - 20463 (23 de diciembre de 2008) describe un metodo para determinar la aneuploidla fetal usando secuenciacion masivamente paralela. La determinacion del estado de la enfermedad (aneuploidia) se hizo calculando una "puntuacion z". Puntuaciones Z se compararon con valores de referencia, de una poblacion restringida a fetos masculinos euploides. Los autores senalaron de pasada que el contenido G/C afecto el coeficiente de variacion.

[0013] Lo et al., "Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Massively Parallel Genomic Sequencing" de Estados Unidos 2009/0029377, publicada el 29 de enero de, 2009 (y la aplicacion relacionada WO 2009/013496), describe un metodo en el cual respectivas cantidades de una cromosoma cllnicamente relevante y los cromosomas de fondo se determinan a partir de resultados de secuenciacion masivamente paralelos. Se encontro que el porcentaje de representation de las secuencias asignadas al cromosoma 21 es mas alto en una mujer embarazada portadora de un feto de trisomla 21 cuando se compara con una mujer embarazada que lleva un feto normal. Para las cuatro mujeres embarazadas que portaban un feto euploide, una media del 1,345% de sus secuencias de ADN plasmatico se alinearon con el cromosoma 21.

[0014] Lo et al., "Determining a Nucleic Acid Sequence Imbalance", US 2009/0087847, publicada el 2 de abril de 2009 describe un metodo para determinar si existe un desequilibrio de secuencia de acido nucleico, tal como una aneuploidla, comprendiendo el metodo el derivo de un primer valor de corte a partir de una concentration media de una secuencia de acido nucleico de referencia en cada una de una pluralidad de reacciones, en donde la secuencia de acido nucleico de referencia es la secuencia de acido nucleico cllnicamente relevante o la secuencia de acido nucleico de fondo; comparar el parametro con el primer valor de corte; y basandose en la comparacion, determinando una clasificacion de si existe un desequilibrio de secuencia de acido nucleico.

[0015] Lo et al, "Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma nucleic acid analysis," Clinical Chemistry. 54: 3, 461-466 (Enero 2008) ensena que la aneuploidla fetal ha sido explorada a traves del uso del analisis de la relation alelica de marcadores epigeneticos y ARN en plasma fetal, y que se ha demostrado que la PCR digital ofrece alta precision para la relacion alelica y los analisis de dosis cromosomicas relativas.

[0016] WO 2005/039389 (Shimkets) ensena metodos Sequence-Based Karyotyping' para la detection de anomallas genomicas.

[0017] WO2007/092473 ensena un metodo para la deteccion de aneuploides fetales en una muestra de plasma materno en base a la secuenciacion paralela.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION

[0018] El siguiente breve resumen no pretende incluir todas las caracterlsticas y aspectos de la presente invention.

[0019] La presente invencion proporciona un metodo de ensayo para una distribution anormal de un cromosoma especificado en una muestra mixta de porciones cromosomicas normalmente y anormalmente distribuidas obtenidas de un sujeto, en el que la muestra es una mezcla de ADN materno y fetal en una muestra de plasma materno, que comprende:

(a) la obtencion de una mezcla de ADN libre de celulas materna y fetal de dicha muestra;

(b) la secuenciacion de subsecuencias predefinidas de ADN libre de celulas materna y fetal, para obtener una pluralidad de etiquetas de secuencia alineadas con las subsecuencias predefinidas, En el que la secuenciacion comprende selectivamente la secuenciacion de moleculas de acido nucleico que comprenden las subsecuencias predefinidas usando un metodo de secuenciacion que captura selectivamente moleculas de muestra que contienen las subsecuencias predefinidas, en donde dichas etiquetas de secuencia son de longitud suficiente

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para ser asignado a una subsecuencia predefinida especlfica, en el que las subsecuencias predefinidas son de una pluralidad de diferentes cromosomas, y en el que dicha pluralidad de cromosomas diferentes comprenden al menos un primer cromosoma sospechoso de tener una distribucion anormal en dicha muestra y al menos un segundo cromosoma que se presume de ser normalmente distribuido en dicha muestra, en el que la captura selectiva se dirige a mapeo de subsecuencias predefinidas de manera unica o con una falta de coincidencia con dicho al menos un primer cromosoma y dicho al menos un segundo cromosoma, y en el que dicho al menos un primer cromosoma es el cromosoma 18, 21, 13, X o Y;

(c) asignar la pluralidad de etiquetas de secuencia a sus subsecuencias predeterminadas correspondientes;

(d) determinar un numero de etiquetas de secuencia que se alinean con las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma; y una serie de etiquetas de secuencia que se alinean con las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma; y

(e) utilizando los numeros de la etapa (d) para determinar un differencial, entre el numero de etiquetas de secuencia que se alinean a las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma y el numero de etiquetas de secuencia alineadas con las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma, que es determinante de la sobre-representacion o subrepresentacion de dicho primer cromosoma en la mezcla de ADN libre de celulas maternas y fetales.

[0020] Tambien se describe en este documento un metodo para analizar una muestra materna, por ejemplo, a partir de sangre periferica. No es invasivo en el espacio fetal, como lo es la amniocentesis o el muestreo de vellosidades corionicas. En el metodo preferido, se utiliza ADN fetal que esta presente en el plasma materno. El ADN fetal esta en un aspecto de la descripcion enriquecido debido al sesgo en el procedimiento hacia fragmentos de ADN mas cortos, que tienden a ser ADN fetal. El metodo es independiente de cualquier diferencia de secuencia entre el genoma materno y fetal. El ADN obtenido, preferiblemente de una extraccion de sangre periferica, es una mezcla de ADN fetal y materno. El ADN obtenido esta al menos parcialmente secuenciado, en un metodo que da un gran numero de lecturas cortas. Estas lecturas cortas actuan como etiquetas de secuencia, en el sentido de que una fraccion significativa de las lecturas son suficientemente unicas para ser mapeadas a cromosomas especificos o localizaciones cromosomicas que se sabe que existen en el genoma humano. Se mapean exactamente, o se pueden asignar con un desajuste, como en los ejemplos a continuacion. Mediante el recuento del numero de marcas de secuencia asignadas a cada cromosoma (1-22, X e Y), se puede detectar la sobre-representacion o subrepresentacion de cualquier parte de cromosoma o cromosoma en el ADN mezclado aportado por un feto aneuploide. Este metodo no requiere la diferenciacion de secuencias del ADN fetal o materno, ya que la contribucion sumada de las secuencias materna y fetal en un cromosoma o parte cromosomica particular sera diferente entre un cromosoma diploide intacto y un cromosoma aberrante, es decir, con una copia extra, parte faltante o similar. En otras palabras, el metodo no se basa en una informacion de secuencia a priori que distinguiria el ADN fetal del ADN materno. La distribucion anormal de un cromosoma fetal o parte de un cromosoma (es decir, una delecion o insercion macroscopica) se puede determinar en el presente metodo por enumeracion de etiquetas de secuencia como mapeadas a diferentes cromosomas. El recuento mediano de valores autosomicos (es decir, el numero de etiquetas de secuencia por autosoma) se utiliza como una constante de normalizacion para tener en cuenta las diferencias en el numero total de etiquetas de secuencia para la comparacion entre muestras y entre cromosomas. El termino "parte cromosomica" se usa en la presente memoria para designar un cromosoma entero o un fragmento significativo de un cromosoma. Por ejemplo, el sindrome de Down moderado se ha asociado con la trisomia parcial 21q22.2 qter. Mediante el analisis de la densidad de etiquetas de secuencias predefinidas en las subsecciones de cromosomas (por ejemplo, 10 a 100 kb ventanas), una constante de normalizacion se puede calcular, y las subsecciones cromosomicas cuantificadas (por ejemplo, 21q22.2). Con un numero de etiquetas de secuencia suficientemente grande, el presente metodo puede aplicarse a fracciones arbitrariamente pequenas de ADN fetal. Se ha demostrado que es exacto hasta un 6% de concentracion fetal de ADN. A continuacion se muestra el uso exitoso de la secuenciacion de escopeta y la cartografia del ADN para detectar trisomia fetal 21 (sindrome de Down), trisomia 18 (sindrome de Edward) y trisomia 13 (sindrome de Patau), llevada a cabo de forma no invasiva utilizando ADN fetal libre de celulas en Plasma materno. Esto constituye la base de una prueba diagnostica no invasiva universal, independiente del polimorfismo, para la aneuploidia fetal. Los datos de la secuencia tambien nos permiten caracterizar el ADN plasmatico en un detalle sin precedentes, lo que sugiere que esta enriquecido para los fragmentos unidos a nucleosomas. El metodo tambien puede emplearse para que los datos de secuencia obtenidos puedan analizarse adicionalmente para obtener informacion sobre polimorfismos y mutaciones.

[0021] Por lo tanto, la presente descripcion comprende, en ciertos aspectos, un metodo de ensayo para una distribucion anormal de una parte de cromosoma se especifica en una muestra mixta de porciones de cromosomas distribuidos normalmente y anormalmente obtenidos a partir de un unico sujeto, tal como una mezcla de ADN fetal y materno en una muestra de plasma materno. Uno lleva a cabo determinaciones de secuencia sobre los fragmentos de ADN en la muestra, obteniendo secuencias de multiples porciones cromosomicas de la muestra mezclada para obtener una serie de etiquetas de secuencia de longitud suficiente de secuencia determinada para asignarse a una localizacion cromosomica dentro de un genoma y de numero suficiente para reflejar la distribucion anormal. Usando una secuencia de referencia, se asignan las etiquetas de secuencia a sus correspondientes cromosomas incluyendo al menos el cromosoma especificado comparando la secuencia con la secuencia genomica de referencia. A menudo habra en el orden de millones de etiquetas de secuencia corta que se asignan a ciertos cromosomas y, lo que es

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mas importante, ciertas posiciones a lo largo de los cromosomas. Se puede entonces determinar un primer numero de etiquetas de secuencia asignadas a al menos una parte de cromosoma distribuida normalmente y un segundo numero de etiquetas de secuencia asignadas a la parte de cromosoma especificada, estando ambos cromosomas en una muestra mixta. El presente procedimiento tambien implica la correccion de las etiquetas de secuencia de distribucion no uniforme en diferentes porciones cromosomicas. Esto se explica en detalle a continuacion, en el que se crean varias ventanas de longitud definida a lo largo de un cromosoma, siendo las ventanas del orden de kilobasas de longitud, por lo que una serie de etiquetas de secuencia caera en muchas de las ventanas y ventanas que cubren cada cromosoma entero en cuestion, con excepciones para regiones no informativas, por ejemplo, regiones de centromero y regiones repetitivas. Varios numeros medios, es decir, valores medianos, se calculan para diferentes ventanas y se comparan. Mediante el recuento de etiquetas de secuencia dentro de una serie de ventanas predefinidas de igual longitud a lo largo de cromosomas diferentes, se pueden obtener resultados mas robustos y estadlsticamente significativos. El presente metodo tambien implica calcular una diferencia entre el primer numero y el segundo numero que es determinante de si existe o no la distribucion anormal.

[0022] En ciertos aspectos, la presente descripcion puede comprender un ordenador programado para analizar los datos de secuencia obtenidos a partir de una mezcla de ADN cromosomico materno y fetal. Cada autosoma (Cr. 122) se segmenta computacionalmente en ventanas contiguas que no se solapan. (Tambien se podrla utilizar una ventana corredera). Cada ventana es de longitud suficiente para contener un numero significativo de lecturas (etiquetas de secuencia, que tienen aproximadamente 20-100 pb de secuencia) y no tienen todavla un numero de ventanas por cromosoma. Tlpicamente, una ventana estara entre 10kb y 100kb, mas tlpicamente entre 40 y 60 kb. Por lo tanto, habrla, por ejemplo, aproximadamente entre 3.000 y 100.000 ventanas por cromosoma. Las ventanas pueden variar ampliamente en el numero de etiquetas de secuencia que contienen, en funcion de la ubicacion (por ejemplo, cerca de un centromero o region repetida) o contenido G/C, como se explica a continuacion. Se selecciona el recuento mediano (es decir, valor medio en el conjunto) por ventana para cada cromosoma; entonces la mediana de los valores autosomicos se utiliza para dar cuenta de las diferencias en el numero total de etiquetas de secuencias obtenidas para diferentes cromosomas y distinguir la variacion intercromosomal de sesgo de secuenciacion de aneuploidla. Este metodo de mapeo tambien se puede aplicar para discernir deleciones o inserciones parciales en un cromosoma. El presente metodo tambien proporciona un metodo para corregir el sesgo resultante del contenido de G/C. Por ejemplo, se encontro que el metodo de secuenciacion de Solexa produjo mas etiquetas de secuencia de fragmentos con mayor contenido de G/C. Al asignar un peso a cada etiqueta de secuencia basada en el contenido G/C de una ventana en la que cae la lectura. La ventana para el calculo del GC es preferiblemente menor que la ventana para el calculo de la densidad de la etiqueta de secuencia.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0023]

La Figura 1 es un diagrama de dispersion grafico que muestra las densidades de secuencia de etiqueta de dieciocho muestras, teniendo cinco genotipos diferentes, como se indica en la leyenda de la figura. La aneuploidla fetal es detectable por la sobre-representacion del cromosoma afectado en la sangre materna. La Figura 1A muestra etiqueta de secuencia de densidad relativa para el correspondiente valor de control de ADN genomico; los cromosomas se ordenan aumentando el contenido de G/C. Las muestras mostradas como se indica son plasma de una mujer con un feto T21; plasma de una mujer con un feto T18; plasma de un macho adulto normal; plasma de una mujer que lleva un feto normal; plasma de una mujer con un feto T13. Las densidades de las etiquetas de secuencia varlan mas con el aumento del contenido cromosomico G/C. La Figura 1B es un detalle de la Fig. 1A, que muestra la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma 21 relativa de la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma mediano 21 de los casos normales. Observese que los valores de 21 casos de 3 disomla se superponen a 1,0. La llnea discontinua representa el llmite superior del intervalo de confianza del 99% construido a partir de todas las muestras de disomla 21. Los cromosomas se enumeran en la Figura 1A con el fin de contenido de G/C, de bajo a alto. Esta cifra sugiere que se prefiere utilizar como un cromosoma de referencia en la muestra mixta con un nivel medio de contenido G/C, ya que se puede ver que los datos estan mas fuertemente agrupados. Es decir, los cromosomas 18, 8, 2, 7, 12, 21 (excepto en el slndrome de Down sospechado), 14, 9 y 11 pueden ser utilizados como el cromosoma diploide nominal si se busca una trisomla. La Figura 1B representa una ampliacion del cromosoma 21 de datos.

La Figura 2 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra la fraccion de ADN fetal y la edad gestacional. La fraccion de ADN fetal en el plasma materno se correlaciona con la edad gestacional. La fraccion de ADN fetal se estimo de tres maneras diferentes: 1. A partir de la cantidad adicional de secuencias de cromosomas 13, 18 y21 para T13, T18 y T21 respectivamente. 2. Del agotamiento en la cantidad de secuencias de cromosoma X para los casos masculinos. 3. De la cantidad de secuencias de cromosoma Y presentes para los casos masculinos. La llnea horizontal discontinua representa la fraccion minima estimada de ADN fetal requerida para la detection de aneuploidla. Para cada muestra, se promediaron los valores de fraccion de ADN fetal calculados a partir de los datos de diferentes cromosomas. Existe una correlation estadlsticamente significativa entre la fraccion fetal promedio de ADN y la edad gestacional (p = 0,0051). La linea discontinua representa la linea de regresion lineal simple entre la fraccion fetal promedio de ADN y la edad gestacional. El valor R2 representa el cuadrado del coeficiente de correlacion. La Figura 2 sugiere que el presente metodo se puede emplear en una

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fase muy temprana del embarazo. Los datos se obtuvieron a partir de la etapa de 10 semanas y mas tarde porque es la etapa mas temprana en la que se realiza el muestreo de vellosidades corionicas. (La amniocentesis se hace mas tarde). Desde el nivel del intervalo de confianza, se esperarla obtener datos significativos a partir de las 4 semanas de edad gestacional, o posiblemente antes.

La Figura 3 es un histograma que muestra la distribucion de tamano que muestra el ADN materno y fetal en el plasma materno. Muestra la distribucion de tamano de los fragmentos totales y cromosomicos Y especlficos obtenidos a partir de la secuenciacion 454 del ADN plasmatico materno de un embarazo masculino normal. La distribucion se normaliza a suma a 1. Los numeros de lecturas totales y lecturas asignadas al cromosoma Y son 144992 y 178 respectivamente. Insercion: Fraccion de ADN fetal acumulada en funcion del tamano del fragmento secuenciado. Las barras de error corresponden al error estandar de la fraccion estimada suponiendo que el error de los recuentos de fragmentos secuenciados sigue las estadlsticas de Poisson.

La Figura 4 es un par de graficos de llneas que muestran la distribucion de las etiquetas de secuencias alrededor de los sitios de inicio de transcripcion (TSS) de genes ReSeq en todos los autosomas y el cromosoma X de la muestra de ADN de plasma de un embarazo masculino normal (parte superior, Fig. 4A) y control de ADN genomico aleatoriamente esquilado (abajo, Fig. 4B). El numero de etiquetas dentro de cada ventana de 5 pb fue contado dentro de la region + 1000pb alrededor de cada TSS, teniendo en cuenta la hebra de cada etiqueta de secuencia asignada. Los conteos de todos los sitios de inicio de la transcripcion para cada ventana de 5 pb se sumaron y se normalizaron al recuento mediano entre las 400 ventanas. Se uso un promedio movil para suavizar los datos. Un pico en la cadena de sentido representa el comienzo de un nucleosoma, mientras que un pico en la cadena de antisentido representa el final de un nucleosoma. En la muestra de ADN de plasma que se muestra aqul, cinco nucleosomas bien posicionados se observan aguas abajo de los sitios de inicio de la transcripcion y se representan como ovalos grises. El numero inferior dentro de cada ovalo representa la distancia en pares de bases entre picos adyacentes en las cadenas de sentido y antisentido, correspondiente al tamano del nucleosoma inferido. No se observa patron obvio para el control del ADN genomico.

La Figura 5A es un grafico de diagrama de dispersion que muestra la densidad de etiqueta media de secuencia para cada cromosoma de todas las muestras, incluyendo el ADN de plasma libre de celulas de las mujeres embarazadas y donante masculino, as! como el control de ADN genomico a partir de donante varon, se traza anteriormente. Las excepciones son los cromosomas 13, 18 y21, donde se excluyen las muestras de ADN libres de celulas de mujeres portadoras de fetos aneuploides. Las barras de error representan la desviacion estandar. Los cromosomas estan ordenados por su contenido G/C. El contenido de G/C de cada cromosoma en relacion con el genoma de todo el valor (41%) tambien se representa. La Figura 5B es un grafico de diagrama de dispersion de la densidad de etiqueta media de secuencia para cada cromosoma frente al contenido de G/C del cromosoma. El coeficiente de correlacion es 0,927, y la correlation es estadlsticamente significativa (p <10-9).

La Figura 5C es un grafico de diagrama de dispersion de la desviacion estandar de la densidad de etiqueta de secuencia de cada cromosoma frente al contenido de G/C del cromosoma. El coeficiente de correlacion entre la desviacion estandar de la densidad de la etiqueta de secuencia y la desviacion absoluta del contenido G/C cromosomico del contenido G/C genomico es 0,963, y la correlacion es estadlsticamente significativa (p <10-12).

La Figura 6 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra la diferencia porcentual de la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma X de todas las muestras, en comparacion con la densidad de etiqueta mediana de secuencia de cromosoma X de todos los embarazos femeninos. Todos los embarazos masculinos muestran una sub-representation del cromosoma X.

La Figura 7 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra una comparacion de la estimation de la fraccion de ADN fetal para muestras de ADN libres de celulas a partir de 12 embarazos masculinos utilizando los datos de secuenciacion de los cromosomas X e Y. La llnea discontinua representa una llnea de regresion lineal simple, con una pendiente de 0,85. El valor R2 representa el cuadrado del coeficiente de correlacion. Existe una correlacion estadlsticamente significativa entre la fraccion de ADN fetal estimada de los cromosomas X e Y (p = 0,0015).

La Figura 8 es un grafico de llneas que muestra la distribucion de longitud de fragmentos secuenciados de muestra de ADN de plasma libre de celulas madre de un embarazo normal de sexo masculino a resolution 1 pb. La secuenciacion se realizo en la plataforma 454/Roche. Se retienen lecturas que tienen al menos un 90% de mapeo al genoma humano con una precision mayor o igual al 90%, totalizando 144992 lecturas. El eje Y representa el numero de lecturas obtenidas. La longitud media es de 177 pb, mientras que la longitud media es de 180 pb.

La Figura 9 es un esquema que ilustra como se utiliza la distribucion de etiqueta de secuencia para detectar la sobre e infrarrepresentacion de cualquier cromosoma, es decir, una trisomla (sobre la representation) o un cromosoma que falta (tlpicamente un cromosoma X o Y, al ser autosomas que faltan generalmente letales). Como se muestra en los paneles A y C de la izquierda, se traza primero el numero de lecturas obtenidas frente a una ventana que se correlaciona con una coordenada cromosomica que representa la position de la lectura a lo

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largo del cromosoma. Es decir, se puede ver que el cromosoma 1 (panel A) tiene aproximadamente 2,8 x 108 pb. Tendrla este numero dividido por ventanas de 50kb. Estos valores se repliegan (paneles B y D) para mostrar la distribucion del numero de etiquetas de secuencia/ventana de 50kb. El termino "bin" es equivalente a ventana. A partir de este analisis, se puede determinar un numero mediano de lecturas M para cada cromosoma que, a efectos de ilustracion, se puede observar a lo largo del eje x en el centro aproximado de la distribucion y se puede decir que es mayor si hay mas etiquetas de secuencia atribuibles a ese cromosoma. Para el cromosoma 1, ilustrado en los paneles A y B, se obtiene una M1 mediana. Tomando la M mediana de los 22 autosomas, se obtiene una constante de normalizacion N que puede usarse para corregir las diferencias en las secuencias obtenidas en diferentes series, como se puede ver en la Tabla 1. Asl, la densidad de secuencia de secuencia normalizada para el cromosoma 1 serla M1/N; para el cromosoma 22 serla M22/N. Un examen detallado del panel A, por ejemplo, mostrarla que hacia el extremo cero del cromosoma, este procedimiento obtuvo aproximadamente 175 lecturas por ventana de 50 kb. En el centro, cerca del centromero, no habla lecturas, porque esta parte del cromosoma esta mal definida en la biblioteca del genoma humano.

[0024] Es decir, en los paneles de la izquierda (A y C), se traza la distribucion de lecturas por coordenada de cromosoma, es decir, la posicion cromosomica en terminos de numero de lecturas dentro de cada ventana deslizante de 50 kb que no se solapa. Despues, se determina la distribucion del numero de etiquetas de secuencia para cada ventana de 50 kb y se obtiene un numero medio de etiquetas de secuencia por cromosoma para todos los autosomas y el cromosoma X (Ejemplos de Cr 1 [arriba] y Cr 22 [abajo] se ilustran aqul). La mediana de los 22 valores de M (de todos los autosomas, cromosomas 1 a 22) se utiliza como normalizacion de la N constante. La densidad de la etiqueta de secuencia normalizada de cada cromosoma es M/N (por ejemplo, Cr 1: M1/N; Cr 22: M22/N). Tal normalizacion es necesaria para comparar diferentes muestras de pacientes ya que el numero total de las etiquetas de secuencia (por lo tanto, la densidad de la etiqueta de secuencia) para cada muestra de paciente es diferente (el numero total de etiquetas de secuencia fluctua entre ~ 8 a ~ 12 millones). El analisis fluye asl de la frecuencia de lecturas por coordenada (A y C) a # lecturas por ventana (B y D) a una combinacion de todos los cromosomas.

[0025] La Figura 10 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra datos de diferentes muestras, como en la Figura 1, excepto que el sesgo para el muestreo G/C ha sido eliminado.

[0026] La Figura 11 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra el peso dado a las diferentes muestras de secuencias segun el porcentaje de contenido de G/C, con menor peso dado a las muestras con un mayor contenido de G/C. El contenido de G/C oscila entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70%; el peso puede variar en un factor de aproximadamente 3.

[0027] La Figura 12 es un grafico de diagrama de dispersion que ilustra los resultados de pacientes seleccionados, como se indica en el eje x, y, para cada paciente, una distribucion de la representacion del cromosoma en el eje Y, como se desvla de un estadlstica t representativo, indicado como cero.

[0028] La Figura 13 es un grafico de diagrama de dispersion que muestra el porcentaje de ADN fetal mlnimo del cual sobre- o subrepresentacion de un cromosoma se pudo detectar con un nivel de confianza del 99,9% para los cromosomas 21, 18, 13 y Cr. X, y un valor para todos los otros cromosomas.

[0029] La Figura 14 es un grafico grafico de diagrama de dispersion que muestra una relacion lineal entre log10 de porcentaje de ADN fetal mlnimo que se necesita frente a log10 del numero de lecturas necesario.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA REALIZACION PREFERENTE

Descripcion general

Definiciones

[0030] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento tienen el mismo significado que el comunmente entendido por aquellos de experiencia ordinaria en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque se pueden usar cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqul en la practica o pruebas de la presente invencion, se describen los metodos y materiales preferidos. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, biologla celular y molecular y qulmica son las bien conocidas y comunmente usadas en la tecnica. Ciertas tecnicas experimentales, no definidas especlficamente, se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describen en varias referencias generales y mas especlficas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. A los efectos de la claridad, los siguientes terminos se definen a continuacion.

[0031] "Densidad de etiqueta de secuencia" significa que el valor normalizado de etiquetas de secuencias para una ventana definida de una secuencia en un cromosoma (en una realizacion preferida, la ventana es de aproximadamente 50 kb), donde se utiliza la densidad de etiqueta de secuencia para la comparacion de diferentes muestras y para analisis subsiguiente. Una "etiqueta de secuencia" es una secuencia de ADN de longitud suficiente

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que puede asignarse especlficamente a uno de los cromosomas 1-22, X o Y. No necesariamente tiene que ser, pero puede ser no repetitivo dentro de un solo cromosoma. Se puede permitir cierto grado pequeno de desajuste (0-1) para explicar los polimorfismos menores que pueden existir entre el genoma de referencia y los genomas individuales (materno y fetal) que se estan siendo mapeados. El valor de la densidad de la etiqueta de secuencia se normaliza dentro de una muestra. Esto puede hacerse contando el numero de etiquetas que caen dentro de cada ventana en un cromosoma; obtener un valor mediano del numero total de etiquetas de secuencia para cada cromosoma; obtener un valor mediano de todos los valores autosomicos; y utilizando este valor como una normalizacion constante para tener en cuenta las diferencias en el numero total de secuencias de etiquetas obtenidas para diferentes muestras. Una densidad de etiqueta de secuencia calculada de esta manera serla idealmente de aproximadamente 1 para un cromosoma disomico. Como se describe adicionalmente a continuacion, las densidades de las etiquetas de secuencia pueden variar de acuerdo con los artefactos de secuenciacion, mas notablemente el sesgo G/C; esto se corrige como se describe. Este metodo no requiere el uso de un estandar externo, sino, mas bien, proporciona una referencia interna, derivada de todas las etiquetas de secuencias (secuencias genomicas), que pueden ser, por ejemplo, un unico cromosoma o un valor calculado a partir de todos los autosomas.

"T21" significa la trisomla 21.

"T18" significa la trisomla 18.

"T13" significa la trisomla 13.

[0032] "Aneuploidla" se utiliza en un sentido general para referirse a la presencia o ausencia de un cromosoma entero, as! como la presencia de duplicaciones parciales cromosomicas o deleciones o kilobasas o mayor tamano, en lugar de mutaciones geneticas o polimorfismos donde las diferencias de secuencia existe.

[0033] "Secuenciacion masivamente paralela" significa tecnicas para la secuenciacion de millones de fragmentos de acidos nucleicos, por ejemplo, mediante la union de ADN genomico fragmentado al azar a un plano, la superficie opticamente transparente y en amplificacion de fase solida para crear una celula de flujo de secuenciacion de alta densidad con millones de grupos, cada uno con -1,000 copias de molde por centlmetro cuadrado. Estas moldes se secuenciaron utilizando la tecnologla del ADN de cuatro colores de secuenciacion por slntesis. Vease, productos ofrecidos por Illumina, Inc., San Diego, California. En el presente trabajo, se obtuvieron secuencias, como se describe a continuacion, con un Illumina/Solexa 1G Genome Analyzer. El metodo Solexa/Illumina enumerado a continuacion se basa en el del implemento de origen genomico fragmentado al azar de ADN a una superficie plana, opticamente transparente. En el presente caso, el ADN de plasma no tiene que cortarse. Los fragmentos de ADN unidos se extienden y se amplifican por puente para crear una celula de flujo de secuenciacion de densidad ultra-alta con e 50 millones de grupos, cada uno contiene -1,000 copias de la misma molde. Estas moldes se secuenciaron utilizando una tecnologla robusta de secuenciacion por slntesis de ADN de cuatro colores que emplea terminadores reversibles con tintes fluorescentes extralbles. Este novedoso enfoque garantiza una alta precision y la verdadera base de secuenciacion de bases por caso, la eliminacion de errores especlficos de secuencia de contexto y permite la secuenciacion a traves de homopollmeros y secuencias repetitivas.

[0034] Deteccion de fluorescencia de alta sensibilidad se consigue utilizando excitacion laser y la optica de reflexion interna total. Lecturas de secuencia corta se han alineado contra un genoma de referencia y las diferencias geneticas se denominan utilizando el software de analisis de tuberlas de datos desarrollado especialmente.

[0035] Las copias del protocolo para la secuenciacion del genoma completo utilizando la tecnologla Soelxa se

pueden encontrar en Bio Techniques Protocol Guide 2007 publicado en diciembre de 2006: p 29,
www.biotechniques.com/default.asp? page=protocol&subsection=article_display&id=112378. Adaptadores de oligonucleotidos de Solexa se ligaron a los fragmentos, produciendo una biblioteca genomica totalmente representativa de moldes de ADN sin clonacion. La amplificacion clonal de molecula unica consiste en seis pasos: Hibridacion de molde, amplificacion de molde, linealizacion, bloqueo de los extremos 3', desnaturalizacion e hibridacion del cebador. La secuenciacion por slntesis de Solexa utiliza cuatro nucleotidos de propiedad que poseen fluoroforo reversible y propiedades de terminacion. Cada ciclo de secuenciacion se produce en presencia de los cuatro nucleotidos.

[0036] La secuenciacion utilizada actualmente se lleva a cabo preferiblemente sin una preamplificacion o etapa de clonacion, pero se puede combinar con los metodos basados en la amplificacion en un chip microfluldico que tiene camaras de reaccion tanto para la PCR y la secuenciacion basada en una molde microscopica. Solo se necesitan aproximadamente 30 pb de la informacion de la secuencia aleatoria para identificar una secuencia como perteneciente a un cromosoma humano especlfico. Las secuencias mas largas pueden identificar de forma exclusiva objetivos mas particulares. En el presente caso, las lecturas se obtuvo un gran numero de 25 pb, y debido al gran numero de lecturas obtenidas, la especificidad 50% permitio suficiente representation de etiqueta de secuencia.

[0037] Una description mas detallada de un metodo de secuenciacion masiva en paralelo, que emplea el metodo

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454 referenciado a continuation se encuentra en Rogers y Venter, "Genomics: Massively parallel sequencing," Nature, 437, 326-327 (15 de septiembre de 2005). Como se describe all!, Rothberg y otros (Margulies, M. et al, Nature 437, 376-380 (2005)), han desarrollado un sistema altamente paralelo capaz de secuenciacion de 25 millones de bases en un perlodo de cuatro horas - alrededor de 100 veces mas rapido que la corriente de secuenciacion del estado de la tecnica de Sanger y la plataforma basada en electroforesis capilar. El metodo podrla permitir a un individuo preparar y secuenciar un genoma entero en unos pocos dlas. La complejidad del sistema se encuentra principalmente en la preparation de la muestra y en la plataforma microfabricada, masivamente paralela, que contiene 1,6 milliones reactores de tamano de picolitro en una diapositiva 6,4-cm2. La preparacion de la muestra comienza con la fragmentation del ADN genomico, seguido por la union de secuencias adaptadoras a los extremos de las piezas de ADN. Los adaptadores permiten que los fragmentos de ADN se unan a pequenas cuentas (alrededor de 28p de diametro). Esto se realiza en condiciones que permiten que solo una pieza de ADN se una a cada perla. Las perlas estan encerradas en gotitas de aceite que contienen todos los reactivos necesarios para amplificar el ADN usando una herramienta estandar llamada la reaction en cadena de la polimerasa. Las gotas de aceite forman parte de una emulsion de manera que cada perla se mantenga aparte de su vecino, lo que garantiza que la amplification no este contaminada. Cada cuenta termina con aproximadamente 10 millones de copias de su fragmento de ADN inicial. Para llevar a cabo la reaccion de secuenciacion, el ADN de la molde de transporte de perlas se cargan en los pocillos del reactor de pico litro - teniendo cada pocillo espacio para una sola perla. La tecnica utiliza un metodo de secuenciacion por slntesis desarrollado por Uhlen y colegas, en el que se sintetiza el ADN complementario a cada cadena de molde. Las bases de nucleotidos se utilizan para la secuenciacion liberan un grupo qulmico a medida que la base forma un enlace con la creciente cadena de ADN, y este grupo impulsa una reaccion de emision de luz en presencia de las enzimas y luciferina especlficas. Lavados secuenciales de cada uno de los cuatro nucleotidos posibles se ejecutan sobre la placa, y un detector detecta cuales de los pozos emiten luz con cada lavado para determinar la secuencia de la cadena creciente. Este metodo ha sido adoptado comercialmente por 454 Life Sciences.

[0038] Otros ejemplos de secuenciacion masiva en paralelo se dan en US 20070224613 por Strathmann, publicada el 27 de septiembre de 2007, titulada "Massively Multiplexed Sequencing." Ademas, para una description mas detallada de la secuenciacion masiva en paralelo, vease el documento US 2003/0022207 a Balasubramanian, et al., publicada el 30 de enero de 2003, titulada " Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis."

Descripcion general del metodo y materiales

Vision de conjunto

[0039] Diagnostico prenatal no invasivo de la aneuploidla ha sido un problema diflcil porque el ADN fetal constituye un pequeno porcentaje del total de ADN en la sangre materna (13) y las celulas fetales intactas son aun mas raras (6, 7, 9, 31, 32). Mostramos en este estudio el desarrollo exitoso de una prueba verdaderamente universal, independiente de polimorfismo no invasivo para la aneuploidla fetal. Al secuenciar directamente el ADN del plasma materno, se podrla detectar la trisomla 21 fetal ya en la semana 14 de gestation. El uso de ADN libre de celulas en lugar de celulas intactas permite evitar complejidades asociadas con microquimerismo y celulas extranas que podrlan haber colonizado la madre; estas celulas se producen en cantidades tan bajas que su contribution al ADN libre de celulas es insignificante (33, 34). Ademas, hay pruebas de que el ADN fetal libre de celulas se borra de la sangre hasta niveles indetectables dentro de unas pocas horas despues del parto y por lo tanto no se arrastrara de un embarazo al siguiente (35-37).

[0040] Formas raras de aneuploidla causadas por translocaciones desequilibradas y duplication parcial de un cromosoma son en principio detectables por el metodo de secuenciacion aleatoria, ya que la densidad de las etiquetas de secuencias en la region triplicada del cromosoma serla mas alta que el resto del cromosoma. La detection de aneuploidla incompleta causada por mosaicismo tambien es posible en principio, pero puede ser mas diflcil, ya que no solo depende de la concentration de ADN fetal en el plasma materno sino tambien el grado de mosaicismo fetal. Se requieren mas estudios para determinar la eficacia de la secuenciacion de escopeta en la deteccion de estas formas raras de aneuploidla.

[0041] El presente metodo es aplicable a grandes deleciones cromosomicas, como el slndrome 5p-(cinco p menos), tambien conocido como Slndrome del maullido o Slndrome de Cri du Chat. Slndrome 5p se caracteriza en el momento del nacimiento por un llanto agudo, bajo peso al nacer, falta de tonicidad muscular, microcefalia y posibles complicaciones medicas. Del mismo modo trastornos similarmente susceptibles descritos por los presentes metodos son p-, monosomla 9P, tambien conocido como slndrome de Alfi o 9P-, slndrome de deletion 22q11.2, Slndrome de Emanuel, tambien conocido en la literatura medica como el Slndrome Supernumerario Der (22), trisomla 22, translocation desequilibrada 11/22 o trisomla parcial 11/22, microdelecion y microduplicacion en 16p11.2, que esta asociado con el autismo, y otras supresiones o desequilibrios, incluyendo aquellos que actualmente se desconocen.

[0042] Una ventaja de utilizar la secuenciacion directa para medir la aneuploidla no invasiva es que es capaz de hacer un uso completo de la muestra, mientras que los metodos basados en la PCR analizan solo unas pocas secuencias especlficas. En este estudio, se obtuvo en promedio 5.000.000 lecturas por muestra en un solo paso, de los cuales -66.000 se mapearon en el cromosoma 21. Al representar las 5.000.000 lecturas solo una parte de un

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genoma humano, en principio, menos de un equivalente genomico de ADN es suficiente para la deteccion de aneupioidla mediante secuenciacion directa. En la practica, se utilizo una mayor cantidad de ADN ya que no hay perdida de la muestra durante la preparacion de la biblioteca de secuenciacion, pero puede ser posible reducir mas la cantidad de sangre necesaria para el analisis.

[0043] Informacion de secuencia de escopeta de mapeo (es decir, informacion de secuencia de un fragmento cuya posicion genomica flsica no se desconoce) puede hacerse en un numero de formas, que implican la alineacion de la secuencia obtenida con una secuencia correspondiente en un genoma de referencia. Vease, Li et al., "Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality score," Genome Res., 2008 agosto 19. [Epub en avance de la edicion impresa].

[0044] Hemos observado que ciertos cromosomas tienen grandes variaciones en los recuentos de fragmentos secuenciados (a partir de una muestra a otra, y que esto depende en gran medida del contenido de G/C (Figura 1A). No esta claro en este momento si esto se deriva de artefactos PCR durante la preparacion de la biblioteca de secuenciacion o la generacion de cluster, el proceso de secuenciacion, o si se trata de un verdadero efecto biologico relativo a la estructura de cromatina. Sospechamos que es un artefacto ya que tambien observamos sesgo G/C en el control de ADN genomico, y tales sesgos en la plataforma de secuenciacion Solexa recientemente se ha informado (38, 39). Tiene una consecuencia practica ya que la sensibilidad a la deteccion de aneuploidla variara de cromosoma en el cromosoma; afortunadamente las aneuploidlas humanas mas comunes (por ejemplo, 13, 18, y2l) tienen una baja variacion y por lo tanto sensibilidad de deteccion alta. Tanto este problema como las limitaciones de volumen de muestra, posiblemente, pueden resolverse mediante el uso de tecnologlas de secuenciacion de molecula individuales, que no requieren el uso de PCR para la preparacion de la biblioteca (40).

[0045] Las muestras de ADN de plasma usadas en este estudio se obtuvieron de 15 a 30 minutos despues de la amniocentesis o de vellosidades corionicas. Debido a que estos procedimientos invasivos interrumpen la interfaz entre la placenta y la circulacion materna, se ha discutido si la cantidad de ADN fetal en la sangre materna podrla incrementarse despues de procedimientos invasivos. Ninguno de los estudios realizados hasta la fecha han observado un efecto significativo (41, 42).

[0046] Nuestros resultados apoyan esta conclusion, ya que usando el ensayo de PCR digitales se estimo que el ADN fetal constituye menos de o igual a 10% del ADN total libre de celulas en la mayorla de nuestras muestras de plasma materno. Esto esta dentro del rango de valores previamente reportados en muestras de plasma materno obtenidas antes de procedimientos invasivos (13). Serla valioso contar con una medicion directa que se refiriese a este punto en un estudio futuro.

[0047] La fraccion de ADN fetal promedio estimada a partir de los datos de secuenciacion es superior a los valores estimados de los datos digitales de PCR por un factor promedio de dos (p <0,005, prueba t en par en todos los embarazos masculinos que tienen un conjunto completo de datos). Una posible explicacion de esto es que la etapa de PCR durante la preparacion de la biblioteca Solexa amplifica preferentemente fragmentos mas cortos, que otros han encontrado estar enriquecido para el ADN fetal (22, 23). Nuestras propias mediciones de distribucion de la longitud de una muestra no son compatibles con esta explicacion, pero tampoco podemos rechazarla por el momento. Tambien debe senalarse que mediante el uso de las etiquetas de secuencias encontramos alguna variacion de la fraccion fetal incluso en la misma muestra, dependiendo en que cromosoma utilizamos para hacer el calculo (Figura 7, Tabla 1). Esto es mas probable debido a los artefactos y errores en los procesos de secuenciacion y cartografla, que son sustanciales - recordar que solo la mitad de las etiquetas de secuencia se asignan al genoma humano con un error o menos. Por ultimo, tambien es posible que las mediciones de la PCR estan sesgadas ya que solo son el muestreo de una pequena fraccion del genoma fetal.

[0048] Nuestros datos de secuenciacion sugieren que la mayorla del ADN de plasma libre de celulas es de caracterlsticas de origen y comparte apoptoticos de ADN nucleosomal. Al no ser ocupacion de nucleosomas en todo el genoma eucariotico necesariamente uniforme y depende de factores tales como la funcion, expresion, o secuencia de la region (30, 43), la representacion de las secuencias de diferentes loci en el plasma materno libre de celulas puede no ser igual, como se espera normalmente en el ADN genomico extraldo de celulas intactas. Por lo tanto, la cantidad de un locus particular puede no ser representativa de la cantidad de todo el cromosoma y se debe tener cuidado cuando se disena ensayos para medir la dosis de genes en el ADN del plasma materno libre de celulas que se dirigen solo a unos pocos loci.

[0049] Historicamente, debido a los riesgos asociados con el muestreo de vellosidades corionicas y la amniocentesis, el diagnostico invasivo de aneuploidla fetal se ofrece principalmente a las mujeres en riesgo de llevar un feto aneuploides basado en la evaluacion de los factores de riesgo como la edad materna, los niveles de marcadores de suero, y los hallazgos ecograficos. Recientemente, un boletln de practica del American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) recomienda que "las pruebas de diagnostico invasivo de aneuploidlas debe estar disponible para todas las mujeres, independientemente de la edad de la madre" y que "asesorla previa debe incluir un analisis de los riesgos y beneficios de pruebas invasivas en comparacion con las pruebas de deteccion" (2).

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[0050] Un test genetico no invasivo basado en los resultados descritos aqul y en futuros estudios a gran escala presumiblemente llevarla lo mejor de ambos mundos: un mlnimo riesgo para el feto al tiempo que proporciona la information genetica. Los costos del ensayo ya son bastante bajos; el coste de secuenciacion por muestra de este escrito es de aproximadamente $ 700 y se espera que el coste de la secuenciacion se continue disminuyendo de forma espectacular en un futuro proximo.

[0051] La secuenciacion de escopeta potencialmente puede revelar muchas mas caracterlsticas hasta ahora desconocidas de acidos nucleicos libres de celulas, tales como las distribuciones de ARNm de plasma, as! como caracterlsticas epigeneticas de ADN en plasma como la metilacion del ADN y la modification de histonas, en campos, incluyendo perinatologla, oncologla y trasplantes, mejorando as! nuestra comprension de la biologla basica de la gestation, el desarrollo humano temprano y la enfermedad.

Metodos de secuenciacion

[0052] El equipo de secuenciacion disponible comercialmente se utilizo en los presentes ejemplos ilustrativos, a saber, la plataforma de secuenciacion de Solexa/Illumina y la plataforma 454/Roche. Sera evidente para los expertos en la tecnica que un numero de diferentes metodos de secuenciacion y variaciones se pueden utilizar. Un metodo de secuenciacion que se puede utilizar con ventaja en los presentes metodos implica el emparejado de secuenciacion final. Cebadores de secuenciacion marcados con fluorescencia se podrlan utilizar para secuenciar simultaneamente ambas cadenas de un molde de ADN de doble cadena, como se describe por ejemplo, en Wiemann et al. (Anal. Biochem. 224:117 [1995]; Anal Biochem 234: 166 [1996]. Ejemplos recientes de esta tecnica han demostrado co- secuenciacion de multiplex usando la qulmica de la reaction de termination de colorantes de cuatro colores por primera vez por Prober et al. (Science 238: 336 [1987]). Solexa/Illumina ofrece un "modulo de extremos emparejados" a su Analizador de Genoma. Mediante el uso de este modulo, despues de que el Analizador de Genoma haya completado la primera lectura de secuenciacion, el modulo de extremos emparejados dirige la reslntesis de los moldes originales y la segunda ronda de generation de cluster. El modulo de extremo emparejado esta conectado al analizador del genoma a traves de una sola conexion de fluidos. Ademas, 454 ha desarrollado un protocolo para generar una biblioteca de lecturas de extremos emparejados. Estas lecturas de extremos emparejados son aproximadamente 84 nucleotidos de fragmentos de ADN que tienen una secuencia de adaptador de 44-mer en el medio flanqueado por una secuencia de 20-mer en cada lado. Los dos 20-meros que flanquean son segmentos de ADN que originalmente se encontraban aproximadamente 2,5 kb aparte en el genoma de interes.

[0053] Mediante el uso de lecturas de extremos emparejados en el presente metodo, se puede obtener mas informacion de la secuencia de un fragmento de ADN de plasma dado, y, de manera significativa, tambien se puede obtener informacion de la secuencia de ambos extremos del fragmento. El fragmento se correlaciona con el genoma humano como se explica aqul en otro lugar. Despues de la cartografla de los dos extremos, se puede deducir la longitud del fragmento de partida. Dado que el ADN fetal es conocido por ser mas corto que los fragmentos de ADN maternos circulantes en el plasma, se puede utilizar esta informacion sobre la longitud del fragmento de ADN para aumentar eficazmente el peso dado a las secuencias obtenidas a partir de fragmentos de ADN mas cortos (por ejemplo, aproximadamente 300 pb o menos). Los metodos para la ponderacion se dan a continuation.

[0054] Otro metodo para aumentar la sensibilidad al ADN fetal es centrarse en ciertas regiones en el genoma humano. Se puede utilizar los metodos de secuenciacion que seleccionan secuencias a priori, que se asignan a los cromosomas de interes (como se describe aqul en otros lugares, tales como 18, 21, 13, X e Y). Tambien se puede optar por centrarse, utilizando este metodo, en deleciones cromosomicas parciales, como el slndrome de deletion 22q11. Otras microdeleciones y microduplicaciones se exponen en la Tabla 1 del documento US 2005/0181410, publicada el 18 de agosto de 2005 bajo el tltulo "Methods and apparatuses for achieving precision genetic diagnosis."

[0055] En subsecuencias de secuencia seleccionada, se puede emplear metodologlas basadas en secuencias como la secuenciacion de matriz o perlas de captura con secuencias genomicas especlficas utilizadas como sondas de captura. El uso de una matriz de secuenciacion puede implementarse como se describe en Chetverin et al, "Oligonucleotide arrays: new concepts and possibilities". Biotechnology (NY). 1994 Nov; 12 (11): 1093-9, as! como Rothberg, US 2002/0012930 A1 titulada "Method of Sequencing a Nucleic Acid," y Reeve et al., "Sequencing by Hybridization," US 6.399.364. En estos metodos, el acido nucleico diana a secuenciarse puede ser ADN genomico, ADNc o ARN. La muestra se procesa de cadena sencilla y se captura en condiciones de hibridacion con una serie de sondas de cadena simple, que se catalogan por codigos de barras o por separation flsica de una matriz. La emulsion PCR, tal como se utiliza en el sistema 454, el sistema de solidos, y Polonator (Dover Systems) y otros tambien se pueden emplear, donde la captura se dirige a secuencias diana especlficas, por ejemplo, secuencias de genoma que se trazan de forma unica en el cromosoma 21 o de otro cromosoma de interes, o a una region del cromosoma como 15q11 (Prader-Willi), o repeticiones excesivas CGG en el gen FMR1 (slndrome del cromosoma X fragil).

[0056] El metodo de subsecuenciacion es en un aspecto contrario a las metodologlas convencionales de secuenciacion masivamente paralelas, que tratan de obtener toda la informacion de la secuencia en una muestra. Este metodo alternativo ignora selectivamente cierta informacion de la secuencia utilizando un metodo de

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secuenciacion que captura selectivamente moleculas de la muestra que contienen ciertas secuencias predefinidas. Tambien se pueden usar los pasos de secuenciacion tal y como se ejemplifican, pero en la cartografia de los fragmentos de secuencia obtenidos, dar mayor peso a las secuencias que se asignan a las areas conocidas por ser mas fiables en su cobertura, como los exones. De lo contrario, el metodo procede, como se describe a continuacion, donde se obtiene un gran numero de lecturas de secuencia a partir de uno o mas cromosomas de referencia, que se comparan a un gran numero de lecturas obtenido a partir de un cromosoma de interes, despues de considerar las variaciones derivadas de la longitud cromosomica, contenido de G/C, secuencias repetidas y similares.

[0057] Tambien se pueden concentrar en ciertas regiones en el genoma humano, de acuerdo con los presentes procedimientos con el fin de identificar monosomias parciales y trisomias parciales. Como se describe a continuacion, los presentes metodos implican el analisis de datos de secuencias en una "ventana" deslizante cromosomica definida, tales como las regiones contiguas 50kb, que no se superponen repartidas en un cromosoma. Trisomias parciales de 13q, 8p (8p23.1), 7q, 6p distal, 5p, 3q (3q25.1), 2q, 1q (1 q42.1 y 1q21-qter), monosomia parcial Xpand 4q35.1 se han reportado, entre otros. Por ejemplo, las duplicaciones parciales del brazo largo del cromosoma 18 puede resultar en el sindrome de Edwards en el caso de una duplicacion de 18q21.1 -qter (Vease, Mewar et al., "Clinical and molecular evaluation of four patients with partial duplications of the long arm of chromosome 18," Am J Hum Genet 1993 Dec; 53 (6):. 1269-1278).

Secuenciacion de escopeta de ADN de plasma libre de celulas

[0058] ADN de plasma libre de celulas de 18 mujeres embarazadas y un donante masculino, asi como ADN genomico de sangre total del mismo donante masculino, se secuenciaron en la plataforma Solexa/Illumina. Se obtuvo un promedio de ~ 10 millones de etiquetas de secuencia de 25 pb por muestra. Alrededor del 50% (es decir, - 5.000.000) de las lecturas mapeadas de modo unico para el genoma humano con un maximo de 1 desajuste contra el genoma humano, que cubre ~ 4% del genoma entero. Un promedio de ~ 154,000, ~ 135.000, -66,000 etiquetas de secuencia asignadas a los cromosomas 13, 18, y21, respectivamente. El numero de etiquetas de secuencia para cada muestra se detalla en la siguiente Tabla 1 y la Tabla 2.

Tabla 1.

Muestra

Cariotipo fetal Edad gestacional (semanas) Volumen de Plasma Cantidad de ADN Aprox cantidad de ADN de entrada * Numero total de etiquetas de secuencia

P1 plasma ADN §

47xx +21 35 1,6 761 8,0 8206694

P2 plasma ADN §

47XY 21 18 1,4 585 5,2 7751384

P6 plasma ADN §

47xx +21 14 1,6 410 4,3 6699183

P7 plasma ADN §

47XY 21 18 2,2 266 3,8 8324473

P14 plasma ADN §

47xx +21 23 3,2 57 1,2 8924944

P17 plasma ADN §

47xx +21 16 2,3 210 3,2 11599833

P19 plasma ADN §

46XY 18 3,2 333 7,0 7305417

P20 plasma ADN §

47XY 21 18 1,3 408 3,6 11454876

P23 plasma ADN §

46XY 10 1,6 258 2,7 11851612

P26 plasma ADN §

46XY 13 3,0 340 6,7 11471297

P31 plasma ADN §

46XY 20 2,2 278 4,0 8967562

P40 plasma ADN §

46XY 11 2,6 217 3,7 9205197

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Muestra

Cariotipo fetal Edad gestacional (semanas) Volumen de Plasma Cantidad de ADN Aprox cantidad de ADN de entrada * Numero total de etiquetas de secuencia

P42 plasma ADN §

46XY 11 3,0 276 5,5 8364774

P52 plasma ADN §

47XY 21 25 1,6 645 6,8 9192596

P53 plasma ADN §

47xx +21 19 1,6 539 5,7 9771887

P57 plasma ADN §

47xx 18 23 2,0 199 2,6 15041417

P59 plasma ADN §

47XY + 21 2,0 426 5,6 11910483

P64 plasma ADN §

47XY + 17 1,8 204 2,4 12097478

Hombre de Donantes de ADN de plasma §

- - 1,8 485 5,8 6669125

Donante masculino Sangre Total ADN genomico §

- - - - 2,1 8519495

P25 plasma ADN

46XY 11 5,6 132 4,9 242,599

P13 plasma ADN §

46XY 18 5,6 77 2,9 4168455

Tabla 2.

Muestra

Numero de etiquetas de secuencia asignada unica para el Genoma Humano (hg18) con un maximo de 1 falta de coincidencia % de ADN fetal estimado por PCR digital con Ensayo SRY (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado por etiquetas de secuencia ChrY (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado por el agotamiento de CHRX etiquetas de secuencia (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado mediante la adicion de etiquetas de secuencia trisomicas de cromosoma (fetos aneuploides) Contenid o de G/C general de etiquetas de secuenci a (%)

P1 plasma ADN §

4632637 35,0 43,65

P2 plasma ADN §

4313884 6,4 15,4 21,6 15,5 48,72

P6 plasma ADN §

3878383 22, 9 44,78

P7 plasma ADN §

4294865 9,1 31,0 33,8 28,6 48,07

P14 plasma ADN §

3603767 30,5 46,38

P17 plasma ADN §

5968932 7,8 44,29

P19 plasma ADN §

3280521 <5,9 t 4,14 21,5 50,09

P20 plasma ADN §

6032684 10,0 15,7 11,3 11,5 44,02

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Muestra

Numero de etiquetas de secuencia asignada unica para el Genoma Humano (hg18) con un maximo de 1 falta de coincidencia % de ADN fetal estimado por PCR digital con Ensayo SRY (fetos masculino s) % de ADN fetal estimado por etiquetas de secuencia ChrY (fetos masculino s) % de ADN fetal estimado por el agotamiento de CHRX etiquetas de secuencia (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado mediante la adicion de etiquetas de secuencia trisomicas de cromosoma (fetos aneuploides) Conteni do de G/C general de etiqueta s de secuenc ia (%)

P23 plasma ADN §

6642795 5,3 12,2 9,6 43,80

P26 plasma ADN §

3851477 10,3 18,2 14,2 42,51

P31 plasma ADN §

4683777 Datos que faltan t 13,2 17,0 48,27

P40 plasma ADN §

4187561 8,6 20,0 17,1 42,65

P42 plasma ADN §

4315527 <4,4 t 9,7 7,9 44,14

P52 plasma ADN §

5126837 6,3 25,0 26,3 26,4 44,34

P53 plasma ADN §

5434222 25,8 44,18

P57 plasma ADN §

7470487 23,0 42,89

P59 plasma ADN §

6684871 26,4 44,0 39,8 45,1 43,64

P64 plasma ADN §

6701148 <4,4 t 14,0 8,9 16,7 44,21

Donante masculino de ADN de plasma §

3692931 48,30

Donante masculino Sangre Total ADN genomico §

5085412 46,53

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Muestra

Numero de etiquetas de secuencia asignada unica para el Genoma Humano (hg18) con un maximo de 1 falta de coincidencia % de ADN fetal estimado por PCR digital con Ensayo SRY (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado por etiquetas de secuencia ChrY (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado por el agotamiento de CHRX etiquetas de secuencia (fetos masculinos) % de ADN fetal estimado mediante la adicion de etiquetas de secuencia trisomicas de cromosoma (fetos aneuploides) Contenido de G/C general de etiquetas de secuencia (%)

P25 plasma ADN

144992$ 41,38

P13 plasma ADN §

2835333 9,8 5,7 n/a' 39,60

El volumen de plasma es el volumen utilizado para la Creation de Biblioteca de Secuenciacion (ml). La cantidad de ADN esta en el plasma (celula equivalente/ml de plasma)*. La cantidad aproximada de ADN de entrada es que el uso para la construction de biblioteca de secuenciacion (ng).

* Como se cuantifico por PCR digital con ensayo TaqMan EIF2C1, convirtiendo de copias a ng asumiendo 6,6pg/equivalente celular.

f Para la secuencia 454, este numero representa el numero de lecturas con la cobertura de al menos 90% de precision y 90% cuando se asigna a hg18.

$ Materiales insuficientes estaban disponibles para la cuantificacion de % de ADN fetal con PCR digital para estas muestras (o bien ninguna muestra se mantenla para el analisis o bien hubo insuficiencia de muestreo).

§ Secuenciado en la plataforma de Solexa/Illumina; Secuenciado de 454/plataforma Roche II Muestra P13 era la primera en analizarse por secuenciacion de escopeta. Era un feto normal y el valor de cromosoma era claramente disomico. Sin embargo, hubo algunas irregularidades con esta muestra y no se incluyeron en el analisis adicional. Esta muestra se secuencio en un instrumento Solexa diferente que el resto de las muestras de este estudio, y se secuencio en la presencia de un numero de muestras de origen desconocido. El contenido de G/C de esta muestra era menor que el sesgo G/C del genoma humano, mientras que el resto de las muestras estan por encima. Tenia el menor numero de lecturas, y tambien el menor numero de lecturas asignadas con exito para el genoma humano. Esta muestra parecla ser atlpica en la densidad de etiqueta de secuencia para la mayorla de los cromosomas y la fraction de ADN fetal calculado a partir de los cromosomas X no estaba bien definida. Por estas razones, sospechamos que las irregularidades se deben a problemas tecnicos con el proceso de secuenciacion.___________________________

[0059] En la Tabla 1 y la Tabla 2, cada muestra representa un paciente diferente, por ejemplo, P1 en la primera fila. El numero total de etiquetas de secuencias variadas, pero con frecuencia se estaba en el intervalo de 10 millones, utilizando la tecnologla Solexa. La tecnologla 454 utilizada para P25 y P13 dio un numero menor de lecturas.

[0060] Se observo una distribution no uniforme de las etiquetas de secuencias a traves de cada cromosoma. Este patron de variation intracromosomica era comun entre todas las muestras, incluyendo el ADN genomico cortado al azar, lo que indica que la variation observada mas probablemente se debla a los artefactos de secuenciacion. Aplicamos una ventana deslizante arbitraria de 50kb a traves de cada cromosoma y conto el numero de etiquetas que caen dentro de cada ventana. La ventana se puede variar en tamano para dar cuenta de un mayor numero de lecturas (en cuyos casos una ventana mas pequena, por ejemplo, 10 kb, da una imagen mas detallada de un cromosoma) o un numero mas pequeno de lecturas, en cuyo caso una ventana mas grande (por ejemplo, 100kb) todavla puede ser utilizada y detectara supresiones, omisiones o duplicaciones cromosomicas. Se selecciono la concentration mediana de 50 kb por ventana para cada cromosoma. La mediana de los valores autosomicos (es decir, 22 cromosomas) se utilizo como una constante para dar cuenta de las diferencias en el numero total de etiquetas de secuencias obtenidas para diferentes muestras de normalization. La variation inter-cromosomica dentro de cada muestra tambien era consistente entre todas las muestras (incluyendo el control de ADN genomico). La densidad de etiqueta de secuencia media de cada cromosoma se correlaciona con el contenido de G/C del cromosoma (p <10-9) (Figura 5A, 5B). La desviacion estandar de la densidad de etiqueta de secuencia para cada cromosoma tambien se correlaciona con el grado absoluto de la desviacion de contenido de G/C cromosomico del contenido de G/C en todo el genoma (p <10-12) (Figura 5A, 5C). El contenido de G/C de etiquetas secuenciadas de todas las muestras (incluyendo el control de ADN genomico) era de un promedio de 10% mas alto que el valor de la secuencia de genoma humano (41%) (21) (Tabla 2), lo que sugiere que hay un fuerte sesgo G/C derivado del

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proceso de secuenciacion. Hemos trazado en la Figura 1A la densidad de etiqueta de secuencia para cada cromosoma (ordenados por el aumento de contenido G/C) con respecto al valor correspondiente del control de ADN genomico para eliminar este sesgo.

Deteccion de aneuploidia fetal

[0061] La distribucion de la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma 21 para los 9 embarazos T21 esta claramente separada de la de los embarazos que llevan disomla 21 fetos (p <10-5), prueba t de Student) (Figura 1A y 1B). La cobertura del cromosoma 21 para los casos T21 es aproximadamente ~ 4-18% mas alto (promedio ~ 11%) que la disomla de los 21 casos. Debido a que la densidad de etiqueta de secuencia del cromosoma 21 para los casos T21 debe ser (1+X/2) de la de disomla de 21 embarazos, donde X es la fraccion del ADN total en plasma procedente del feto, como aumento de la cobertura en el cromosoma 21 en casos T21 corresponde a una fraccion de ADN fetal de ~ 8% - 35% (promedio ~ 23%) (Tabla 1, Figura 2). Hemos construido un intervalo de confianza de 99% de la distribucion de la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma 21 de disomla de embarazos 21. Los valores de los 9 casos T21 se encuentran fuera del llmite superior del intervalo de confianza y los 9 casos de disomla 21 se encuentran por debajo del llmite (Figura 1B). Si se utilizo el llmite superior del intervalo de confianza como un valor umbral para la deteccion de T21, la fraccion minima de ADN fetal que se detecta es ~ 2%.

[0062] El ADN de plasma de mujeres embarazadas con fetos T18 (2 casos) y un feto T13 (1 caso) tambien se secuenciaron directamente. El exceso de representacion se observo para el cromosoma 18 y el cromosoma 13 en casos T18 y T13 respectivamente (Figura 1A). Mientras que no habia suficientes muestras positivas para medir una distribucion representativa, es alentador que todos estos tres aspectos positivos son los valores extremos de la distribucion de los valores de disomia. Los T18 son grandes valores atipicos y son claramente estadisticamente significativos (p <10-7), mientras que la significacion estadistica de la caja T13 solo es marginal (p <0,05). La fraccion de ADN fetal tambien se calculo a partir del cromosoma sobrerrepresentado como se describe anteriormente (Figura 2, Tabla 1).

La fraccion de ADN fetal en plasma materno

[0063] Mediante el uso digital de Taqman PCR para un unico locus en el cromosoma 1, se estimo la concentration de aDn libre de celulas promedio en las muestras de plasma materno secuenciadas ser -equivalente de 360 celulas/ml de plasma (rango: equivalente de 57 a 761 celulas/ml de plasma) (Tabla 1), de acuerdo a los valores en bruto se informo anteriormente (13). La cohorte incluyo 12 embarazos masculinos (6 casos normales, 4 casos T21, 1 caso T18 y 1 caso T13) y 6 embarazos femeninos (5 casos T21 y 1 caso T18). DYS14, un locus de multiples copias en el cromosoma Y, era detectable en el plasma materno por PCR en tiempo real en todos estos embarazos pero no en cualquiera de los embarazos femininos (datos no mostrados). La fraccion de ADN fetal en el ADN de plasma sin celulas maternas generalmente se determina mediante la comparacion de la cantidad de locus especifico fetal (como el locus SRY en el cromosoma Y en los embarazos masculinos) a la de un locus en cualquier autosome que es comun tanto a la la madre como al feto utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (13, 22, 23). Se aplico un ensayo de duplex similar sobre una plataforma PCR digital (vease metodos) para comparar los recuentos del locus SRY y un locus en el cromosoma 1 en embarazos masculinos. SRY locus no era detectable en ninguna de las muestras de ADN de plasma de embarazos femeninos. Encontramos con la PCR digital que para las muestras mayoritarias, el ADN fetal constituyo § 10% del ADN total en el plasma materno (Tabla 2), estando de acuerdo con los valores previamente reportados (13).

[0064] El porcentaje de ADN fetal entre el ADN libre de celulas totales en el plasma materno tambien puede calcularse a partir de la densidad de las etiquetas de secuencias de los cromosomas sexuales masculinos para embarazos. Mediante la comparacion de la densidad de etiqueta de secuencia del cromosoma Y de ADN de plasma de embarazos masculinos a la del ADN en plasma adulto de sexo masculino, que calcula el porcentaje de aDn fetal a ser en promedio ~ 19% (rango: 4-44%) para todos los embarazos masculinos (Tabla 2, arriba, Figura 2). Debido a que los varones humanos tienen 1 cromosoma X menos que las hembras humanas, la densidad de etiqueta de secuencia del cromosoma X en los embarazos masculinos debe ser (1-e/2) de la de los embarazos femeninos, donde E es la fraccion de ADN fetal. Observamos de hecho una subrepresentacion de cromosoma X en embarazos masculinos en comparacion con la de los embarazos femininos (Figura 5). Basandose en los datos del cromosoma X, se estimo que el porcentaje de ADN fetal era en promedio ~ 19% (rango: 8-40%) para todos los embarazos masculinos (Tabla 2, arriba, Figura 2). El porcentaje de ADN fetal se estimo a partir de los cromosomas X e Y para cada muestra de embarazo masculino correlacionada entre si (p = 0,0015) (Figura 7).

[0065] Representamos en la Figura 2 la fraccion de ADN fetal calculada a partir de la sobrerrepresentacion del cromosoma trisomico en embarazos aneuploides, y la falta de representacion del cromosoma X y la presencia del cromosoma Y para los embarazos masculinos contra la edad gestacional. La fraccion de ADN fetal promedio para cada muestra se correlaciona con la edad gestacional (p = 0,0051), una tendencia que tambien se informo anteriormente (13).

Distribucion del Tamano de ADN de plasma libre de celulas

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[0066] Se analizaron las bibliotecas de secuenciacion con un sistema de electroforesis capilar comercial lab-on-a- chip. Hay una consistencia notable en el tamano del fragmento de pico, as! como la distribucion alrededor del pico, para todas las muestras de ADN de plasma, incluidos los de las mujeres embarazadas y donante masculino. El tamano de fragmento maximo de 26lbp estaba en la media (rango: 256-264bp). Restar la longitud total de los adaptadores Solexa (92bp) de 260bp da 169bp como el tamano de fragmento maximo real. Este tamano corresponde a la longitud del ADN envuelto en un cromatosoma, que es un nucleosoma unido a una histona H1 (24). Debido a que la preparation de la biblioteca incluye una PCR de 18 ciclos, existe la preocupacion de que la distribucion puede no ser imparcial. Para verificar que la distribucion de tamano observada en el electroferograma no es un artefacto de la PCR, tambien secuenciado el ADN de plasma libre de celulas de una mujer embarazada que lleva un feto masculino utilizando la plataforma 454. La preparacion de la muestra para este sistema utiliza emulsion PCR, que no requiere la amplification competitiva de las bibliotecas de secuenciacion y crea producto que es en gran medida independiente de la eficiencia de amplificacion. La distribucion de tamano de las lecturas asignadas a lugares unicos del genoma humano se asemejan a los de las bibliotecas de secuenciacion Solexa, con un pico predominante en 176bp, despues de restar la longitud de 454 adaptadores universales (Figura 3 y Figura 8). Estos hallazgos sugieren que la mayorla de ADN libre de celulas en el plasma se deriva de las celulas apoptoticas, de acuerdo con los resultados anteriores (22, 23, 25, 26).

[0067] De particular interes es la distribucion de tamanos de ADN materno y fetal en el plasma libre de celulas madre. Dos grupos han demostrado previamente que la mayorla del ADN fetal tiene rango de tamano del de mono- nucleosoma (<200-300bp), mientras que el ADN materno es mas largo. Debido a que la secuencia 454 tiene una longitud de lectura dirigida de 250 pb, se interpreto el pequeno pico en alrededor de 250 pb (Figura 3 y Figura 8) como el llmite de la instrumentation de secuenciacion de fragmentos de mayor peso molecular. Hemos trazado la distribucion de todas las lecturas y aquellas mapeadas al cromosoma Y (Figura 3). Se observo una ligera disminucion de lecturas de cromosoma Y en el extremo superior de la distribucion. Las lecturas <220bp constituyen 94% del cromosoma Y y 87% de las lecturas totales. Nuestros resultados no estan totalmente de acuerdo con los resultados anteriores en que no vemos un enriquecimiento tan dramatico de ADN fetal en longitudes cortas (22, 23). Se necesitan mas estudios para resolver este punto y para eliminar cualquier sesgo potencial residual en el proceso de preparacion 454 de la muestra, pero merece la pena senalar que la capacidad de secuenciar muestras de plasma individuales permite la medicion de la distribucion de enriquecimientos de longitud a traves de muchos pacientes individuales en lugar de la medicion de la longitud media de enriquecimiento de muestras de pacientes agrupados.

ADN de plasma libre de celulas comparte caracteristicas de ADN Nucleosomal

[0068] Al sugerir nuestras observaciones de la distribucion de tamanos de ADN en plasma libre de celulas que el ADN de plasma es principalmente de origen apoptotico, se investigo si las caracteristicas del ADN nucleosomal y posicionamiento se encuentran en el ADN de plasma. Una de estas caracteristicas es el posicionamiento de nucleosomas en torno a los sitios de inicio de transcription. Los datos experimentales de la levadura y humano han sugerido que los nucleosomas se agotan en los promotores aguas arriba de los sitios de inicio de transcripcion y nucleosomas estan bien posicionados cerca de los sitios de inicio de transcripcion (27-30). Se aplico una ventana de 5 pb que abarca +/- 1000 pb de sitios de inicio de transcripcion de todos los genes RefSeq y se conto el numero de etiquetas de asignacion a las cadenas con sentido y antisentido dentro de cada ventana. Un pico en la cadena con sentido representa el comienzo de un nucleosoma, mientras que un pico en la cadena antisentido representa el final. Despues de alisarse, vimos que para la mayorla de las muestras de ADN de plasma, al menos 3 nucleosomas muy bien ubicados pudieron detectarse aguas abajo de los sitios de inicio de transcripcion, y en algunos casos, hasta 5 nucleosomas bien posicionados podrlan detectarse, de conformidad aproximada a los resultados de Schones et al. (27) (Figura 4). Se aplico el mismo analisis en las etiquetas de secuencias de ADN genomico cortado al azar y no observamos ningun patron obvio en la localization de la etiqueta, aunque la densidad de etiquetas era mayor en el sitio de inicio de transcripcion (Figura 4).

Correction de sesgo de secuenciacion

[0069] En las Figuras 10 y 12 se muestran los resultados que se pueden obtener cuando los numeros de la etiqueta de secuencia se tratan estadlsticamente con base en datos de la referencia del genoma humano. Es decir, por ejemplo, las etiquetas de secuencia de fragmentos con mayor contenido de GC pueden ser sobre-representadas, y sugieren una aneuploidla donde no existe. La information de etiqueta de secuencia puede no ser informativa, ya que solo una pequena parte del fragmento ordinariamente se secuenciara, mientras que es el contenido total de G/C del fragmento que causa el sesgo. Por lo tanto, se proporciona un metodo, descrito en detalle en los Ejemplos 8 y 10, para corregir este sesgo, y este metodo puede facilitar el analisis de muestras que de otra manera no producirlan resultados estadlsticamente significativos. Este metodo, para la correccion de sesgo G/C de lecturas de secuencia de secuenciacion masiva en paralelo de un genoma, comprende la etapa de dividir el genoma en una serie de ventanas dentro de cada cromosoma y calcular el contenido de G/C de cada ventana. Estas ventanas no tienen que ser las mismas que las ventanas que se utilizan para el calculo de la densidad de etiqueta de secuencia; que pueden ser del orden de 10 kb-30kb de longitud, por ejemplo. Entonces se calcula la relation entre la secuencia de la cobertura y el contenido de G/C de cada ventana mediante la determination de un numero de lecturas por una ventana dada y un contenido de G/C de la ventana. El contenido de G/C de cada ventana se conoce de la secuencia de referencia del genoma humano. Ciertas ventanas seran ignoradas, es decir, sin lecturas o sin contenido de G/C.

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Entonces se asigna un peso a la serie de lecturas por una ventana dada (es decir, el numero de etiquetas de secuencia asignadas a esa ventana) en base al contenido de G/C, donde el peso tiene una relacion con el contenido de G/C de tal manera que los numeros crecientes de lecturas con contenido G/C creciente se traduce en la disminucion de peso por el aumento del contenido de G/C.

EJEMPLOS

[0070] Los ejemplos siguientes describen la secuenciacion directa de ADN libre de celulas a partir de plasma de mujeres embarazadas con la tecnologla de secuenciacion de escopeta de alto rendimiento, obteniendo un promedio de 5 millones de etiquetas de secuencia por muestra del paciente. Las secuencias obtenidas se asignan a ubicaciones cromosomicas especlficas. Esto nos permitio medir la sobrerepresentacion y de cromosomas de un feto aneuploide. El enfoque de secuenciacion es independiente de polimorfismo y por lo tanto de aplicacion universal para la deteccion no invasiva de aneuploidla fetal. Usando este metodo se identificaron con exito los 9 casos de trisomla 21 (slndrome de Down), 2 casos de trisomla 18 y 1 caso de trisomla 13 en una cohorte de 18 embarazos normales y aneuploides; trisomla se detecto en edades gestacionales tan pronto como la semana 14. La secuenciacion directa tambien nos permitio estudiar las caracterlsticas de ADN de plasma libre de celulas, y hemos encontrado pruebas de que este ADN se ha enriquecido para las secuencias de los nucleosomas.

EJEMPLO 1: Inscripcion de sujetos

[0071] El estudio fue aprobado por El Comite de Revision Institucional de la Universidad de Stanford. Las mujeres embarazadas con riesgo de aneuploidla fetal fueron reclutadas en el Centro de Diagnostico Perinatal del Hospital Infantil de Lucile Packard de la Universidad de Stanford durante el perlodo de abril de 2007 hasta mayo de 2008. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante antes de la extraction de sangre. Se recogio sangre de 15 a 30 minutos despues de la amniocentesis o vellosidades corionicas a exception de 1 muestra que se recogio durante el tercer trimestre. El analisis del cariotipo se realizo a traves de la amniocentesis o muestreo de vellosidades corionicas para confirmar el cariotipo fetal. 9 trisomla 21 (T21), 2 trisomla 18 (T18), 1 trisomla 13 (T13) y 6 embarazos unicos normales fueron incluidos en este estudio. La edad gestacional de los sujetos en el momento de la extraccion de sangre oscilo entre 10 a 35 semanas (Tabla 1). La muestra de sangre de un donante masculino se obtuvo del Centro de Sangre de Stanford.

EJEMPLO 2: Procesamiento de muestra y cuantificacion de ADN

[0072] 7 a 15 ml de sangre periferica extralda de cada sujeto y del donante se recogio en tubos con EDTA. La

sangre se centrifugo a 1600g durante 10 minutos. El plasma se transfirio a tubos de microcentrlfuga y se centrifugo a 16000g durante 10 minutos para eliminar las celulas residuales. Las dos etapas de centrifugation se llevaron a cabo dentro de las 24 horas despues de la recogida de sangre. El plasma libre de celulas se almaceno a -80°C hasta su procesamiento posterior y se congelo y se descongelo solo una vez antes de la extraccion de ADN. Se extrajo el ADN a partir de plasma libre de celulas usando Micro Kit de ADN de QAaRsmp (Qiagen) o el kit de plasma NucleoSpin (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADN genomico fue extraldo de 200 pl de sangre entera de los donantes utilizando Mini-Kit de ADN de Sangre QAaRsmp (Qiagen). PCR digital de microfluidos (Fluidigm) se utilizo para cuantificar la cantidad de ADN total y fetal mediante ensayos TaqMan de orientation en el locus EIF2C1 en el cromosoma 1 (delantero: 5 'GTTCGGCTTTCACCAGTCT 3' (SEQ ID NO: 1); Inverso: 5' CTCCATAGCTCTCCCCACTC 3' (SEQ ID NO: 2); Sonda: 5' HEX-GCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 3); tamano de amplification: 81bp) y el locus SRY en el cromosoma Y (delantero: 5' CGCTTAACATAGCAGAAGCA 3' (SEQ ID NO: 4); inverso: 5' AGTTTCGAACTCTGGCACCT 3' (SEQ ID NO: 5); Sonda: 5' FAM-T GTCGCACTCTCCTT GTTTTT GACA-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 6); tamano de amplificacion: 84bp) respectivamente. Un ensayo de Taqman orientado a DYS 14 (delantero: 5 'ATCgTcCATTTCCAGaAtCA 3' (SEQ ID NO: 6); inverso: 5' GTTGACAGCCGTGGAATC 3' (SEQ ID NO: 7); Sonda: 5 'FAM-

TGCCACAGACTGAACT GAAT GATTTT C-BHQ1 3' (SEQ ID NO: 8); tamano de amplificacion: 84bp), un locus de multiples copias en el cromosoma Y, se utilizo para la determination inicial de sexo fetal a partir de ADN de plasma libre de celulas con en tiempo real tradicional PCR. Las reacciones de PCR se realizaron con 1x iQ Supermix (BioRad), 0,1% de Tween-20 (PCR digital microfluldico solo), los cebadores 300 nM, y sondas 150 nM. El protocolo de ciclos termicos de PCR era 95C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15s y 60C durante 1 min. Los cebadores y sondas fueron adquiridos de IDT.

EJEMPLO 3: Secuenciacion

[0073] Un total de 19 muestras de ADN de plasma libres de celulas, incluyendo 18 de mujeres embarazadas y 1 de un donante de sangre masculino, y la muestra de ADN genomico a partir de sangre entera del mismo donante masculino, se secuenciaron en la plataforma Solexa/Illumina. ~ 1 a 8ng de fragmentos de ADN extraldos de 1,3 a 5,6 ml de plasma libre de celulas se uso para la preparation de biblioteca de secuenciacion (Tabla 1). La preparation de biblioteca se llevo a cabo segun el protocolo del fabricante, con ligeras modificaciones. Debido a que el plasma libre de celulas de ADN se fragmenta en la naturaleza, hay una mayor fragmentation por nebulizacion o sonicacion se realizo sobre muestras de ADN de plasma.

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[0074] El ADN genomico de sangre entera del donante masculino se sometio a ultrasonidos (Misonix XL-2020) (24 ciclos de 30s sonicacion y 90 de pausa), produciendo fragmentos con un tamano entre 50 y 400 pb, con un pico a 150pb. ~ 2ng de ADN genomico sometido a ultrasonidos se utiliza para la preparation de la biblioteca. Brevemente, las muestras de ADN eran de punta roma y se ligan a los adaptadores universales. La cantidad de adaptadores utilizados para la ligation era de 500 veces menos que los escritos en el protocolo del fabricante. Se llevaron a cabo 18 ciclos de PCR para enriquecer fragmentos con adaptadores utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. Las distribuciones de tamano de las bibliotecas de secuenciacion se analizaron con el kit de ADN 1000 en el 2100 Bioanalyzer (Agilent) y se cuantificaron mediante PCR digital de microfluidos (Fluidigm). Las bibliotecas fueron secuenciadas utilizando el Analizador de Genoma Solexa 1 G de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0075] ADN de plasma libre de celulas de una mujer embarazada con un feto masculino normal tambien se secuencio en la plataforma 454/Roche. Los fragmentos de ADN extraldo de 5,6 ml de plasma libre de celulas (equivalente a ~ 4.9ng de ADN) se utiliza para la preparacion de la biblioteca de secuenciacion. La biblioteca de la secuenciacion se preparo de acuerdo con el protocolo del fabricante, excepto que no nebulizacion se realizo en la muestra y la cuantificacion se realizo con PCR digital de microfluido en lugar de electroforesis capilar. A continuation, la biblioteca se secuencio en el 454 Genome Sequencer FLX System de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0076] Las bibliotecas de secuenciacion de Solexa de electroferogramas se prepararon a partir de ADN de plasma libre de celulas obtenido a partir de 18 mujeres embarazadas y 1 macho donante. La biblioteca Solexa preparada a partir de ADN genomico de sangre entera se sometio a ultrasonidos del donante masculino tambien se examino. Para las bibliotecas preparadas a partir de ADN libre de celulas, todas tenlan picos a 261bp media (rango: 256- 264bp). El tamano maximo real de fragmentos de ADN en el ADN de plasma es ~ 168bp (despues de la elimination de adaptador universal Solexa (92bp)). Esto se corresponde con el tamano de un cromatosoma.

EJEMPLO 4: Analisis de Datos

Analisis de la secuencia de la escopeta

[0077] La secuenciacion de Solexa produjo 36 a 50 pb lecturas. La primera de 25 pb de cada lectura fue mapeada al constructo de genoma humano 36 (hg18) usando ELAND de la tuberla de analisis de datos Solexa. Las lecturas que fueron asignadas de forma unica con el genoma humano que tiene como maximo 1 desajuste se conservaron para el analisis. Para comparar la cobertura de los diferentes cromosomas, se aplico una ventana deslizante de 50 kb a traves de cada cromosoma, excepto en las regiones de huecos de montaje y los microsatelites, y se conto el numero de etiquetas de secuencia que cae dentro de cada ventana y el valor de la mediana fue elegido para ser el representante del cromosoma. Debido a que el numero total de etiquetas de secuencias para cada muestra era diferente, para cada muestra, que normalizo la densidad de etiqueta de secuencia de cada cromosoma (excepto el cromosoma Y) a la densidad de etiqueta mediana de secuencia entre autosomas. Los valores normalizados se utilizaron para la comparacion entre las muestras en el analisis posterior. Se estimo la fraction de ADN fetal del cromosoma 21 para los casos T21, el cromosoma 18 de los casos T18, el cromosoma 13 de la caja T13, y los cromosomas X e Y para los embarazos masculinos. Para el cromosoma 21,18, y 13, la fraccion de ADN fetal se estimo como 2 * (x-1), donde x era la relation de la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma sobrerrepresentado de cada caso de trisomla a la densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma mediana de los casos de disomla. Para el cromosoma X, el ADN fetal se estimo como 2 * (1-x), donde X es la proparte de densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma X de cada embarazo masculino a la densidad de etiqueta de secuencia mediana de cromosoma X de todos los embarazos femeninos. Para el cromosoma Y, la fraccion de ADN fetal se estimo como la relacion de densidad de etiqueta de secuencia de cromosoma Y de cada embarazo masculino a la de ADN de plasma de donante masculino. Debido a que se detecto un pequeno numero de secuencias del cromosoma Y en los embarazos de mujeres, solo se consideran las etiquetas de secuencias comprendidas en las regiones transcritas en el cromosoma Y y restamos el numero medio de etiquetas en embarazos femininos de todas las muestras; esto equivale a una correction de un pequeno porcentaje. La anchura de los intervalos de confianza del 99% se calculo para todos los embarazos de disomla 21 como t * s/VN, donde N es el numero de disomla 21 embarazos, t es la estadlstica t correspondiente a a = 0.005 con grado de libertad igual a N-1 y s es la desviacion estandar. Un intervalo de confianza da un rango estimado de valores, que es probable que incluya un parametro desconocido de la poblacion, el rango estimado se calcula a partir de un conjunto dado de datos de la muestra. (Definition tomada de Valerie J. Easton y Glosario de Estadlsticas de John H. McColl v1.1)

[0078] Para investigar la distribution de las etiquetas de secuencias alrededor de los sitios de inicio de transcription, se aplico una ventana deslizante de 5 pb de -1000bp a + 1000 pb de los sitios de inicio de transcripcion de todos los genes RefSeq en todos los cromosomas excepto cromosoma Y. El numero de etiquetas de secuencia asignada a las hebras sentido y antisentido dentro de cada ventana se conto. El promedio movil con una ventana de 10 puntos de datos se utilizo para suavizar los datos. Todos los analisis se realizaron con Matlab.

[0079] Se seleccionaron las etiquetas de secuencias que se mapearon unicamente para el genoma humano con un maximo de 1 desajuste (en promedio ~ 5000000) para el analisis. Se examino la distribucion de las lecturas a lo largo de cada cromosoma. Debido a que la distribucion de las etiquetas de secuencias a traves de cada cromosoma

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era no uniforme (posiblemente artefactos tecnicos), dividimos la longitud de cada cromosoma en la ventana deslizante no superpuesta con una anchura fija (en este analisis particular, se utiliza una ventana 50kbp), saltandose las regiones de huecos de montaje del genoma y regiones con repeticiones de microsatelites conocidos. La anchura de la ventana debe ser lo suficientemente grande de tal manera que hay un numero suficiente de etiquetas de secuencias en cada ventana, y debe ser lo suficientemente pequeno tal que hay un numero suficiente de ventanas para formar una distribucion. Con la profundidad de secuenciacion creciente (es decir, aumento del numero total de etiquetas de secuencia), la anchura de la ventana se puede reducir. Se conto el numero de etiquetas de secuencia en cada ventana. Se examino la distribucion del numero de etiquetas de secuencia por 50 kb para cada cromosoma. El valor mediano del numero de etiquetas de secuencias por 50kb (o 'densidad de etiqueta de secuencia') para cada cromosoma se eligio con el fin de suprimir los efectos de las regiones insuficientemente o excesivamente representadas dentro del cromosoma. Debido a que el numero total de etiquetas de secuencias obtenidas para cada muestra era diferente, a fin de compararse entre muestras, normalizamos cada valor de densidad de etiqueta de secuencia cromosomica (excepto el cromosoma Y) por la densidad de etiqueta de secuencia mediana entre todos los autosomas (cromosomas no sexuales).

[0080] Para los datos de 454/Roche, lecturas se alinearon con el constructo de genoma humano 36 (hg18, vease el protocolo de transferencia de hipertexto (HTTP) genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) utilizando el mapeador de referencia 454. Las lecturas que tienen exactitud mayor que o igual a 90% y la cobertura (es decir, fraccion de lectura asignada) mayor que o igual a 90% se seleccionaron para su analisis. Para estudiar la distribucion de tamano de ADN total y fetal, el numero de lecturas retenidas caen dentro de cada ventana de 10 pb entre 50 pb a 330 pb se conto. El numero de lecturas incluidas en diferentes rangos de tamano pueden estudiarse, es decir, lecturas de entre 50-60 pb, 60-70 pb, 70-80 pb, etc., hasta aproximadamente 320-330 pb, que es alrededor de la longitud de lectura maxima obtenida.

EJEMPLO 5: Recuperacion de Datos del Genoma

[0081] La informacion relativa al contenido G/C, ubicacion de los sitios de inicio de transcripcion de los genes RefSeq, lugar de huecos de montaje y microsatelites se obtuvieron del Explorador de Genoma UCSC.

EJEMPLO 6 Enriquecimiento de Nucleosomas

[0082] Se analizo la distribucion de etiquetas de secuencia alrededor de los sitios de inicio de transcripcion (TSS) de genes RefSeq (datos no mostrados). Los graficos eran similares a la Figura 4. Cada grafico representa la distribucion para cada muestra de plasma ADN o ADNg. Los datos se obtuvieron a partir de tres carreras de secuenciacion diferentes (PI, P6, P52, P53, P26, P40, P42 se secuenciaron en conjunto; ADN masculino genomico, ADN de plasma masculino, P2, P7, P14, P19, P31 se secuenciaron juntos, P17, P20, P23, P57, P59, P64 se secuenciaron juntos). El segundo lote de muestras sufre mayor sesgo G/C como se observa a partir de la variacion inter e intra-cromosomica. Sus distribuciones alrededor de TSS tienen tendencias similares con varias variables en la SAT. Dicha tendencia no es tan prominente como en la distribucion de muestras secuenciadas en otras ejecuciones. No obstante, al menos 3 nucleosomas bien posicionados fueron detectables aguas abajo de los sitios de inicio de transcripcion para la mayorla de las muestras de ADN de plasma, que sugiere que comparte ADN de plasma libre de celulas caracterlsticas de ADN nucleosomal, una pieza de evidencia de que este ADN es de origen apoptotico.

EJEMPLO 7: Calculo de la fraccion de ADN fetal en plasma materno de embarazos masculinos:

i. Con ensayos PCR TaqMan Digitales

[0083] La PCR digital es la amplification de ADN de una sola molecula. La muestra de ADN se diluye y se distribuye a traves de multiples compartimentos de tal manera que, en promedio, hay menos de 1 copia de ADN por compartimento. Un compartimento que presenta fluorescencia al final de una PCR representa la presencia de al menos una molecula de ADN.

Ensayo para el ADN total: EIF2C1 (cromosoma 1)

Ensayo de ADN fetal: SRY (cromosoma Y)

[0084] El numero de compartimentos positivos desde el chip PCR digital de microfluidos de cada ensayo se convierte en el recuento mas probable de acuerdo con el metodo descrito en la informacion de apoyo de la referencia siguiente: Warren L, Bryder D, Weissman IL, Quake SR (2006) Factor de transcripcion de perfiles en progenitores hematopoyeticos individuales por RT-PCR digital. Proc Nat Acad Sci, 103: 17807-12.

Fraccion de ADN fetal £ = (conteo SRY) / (conteo EIF2C1 conteo / 2)

ii. Con marcadores de secuencias

[0085] De CHRX:

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Siendo la fraccion de ADN fetal £

Contribucion materna Contribucion feto masculino Contribucion feto femenino

CHRX

2 (1- X ) X 2 X

Embarazos masculinos densidad de etiqueta de secuencia ChrX (fetal y maternal) = 2(1-£) + £ = 2 - £ Embarazos femininos densidad de etiqueta de secuencia ChrX (fetal y maternal) = 2(1-£) + 2 £ = 2

[0086] Siendo x la relacion entre la densidad de etiqueta de secuencia de CHRX de embarazos macho a hembra. En este estudio, el denominador de esta relacion se toma como la densidad de etiqueta media de secuencia de todos los embarazos femeninos.

[0087] Por lo tanto, la fraccion de ADN fetal X = 2 (1-x)

De ChrY:

[0088] Fraccion de ADN fetal X = (densidad de etiqueta de secuencia de ChrY en la densidad de etiqueta de plasma materno/secuencia de ChrY en plasma macho)

[0089] Notese que en estas derivaciones, se supone que el numero total de etiquetas de secuencia obtenida es la misma para todas las muestras. En realidad, el numero total de etiquetas de secuencias obtenidas para diferente muestra es diferente, y hemos tenido en cuenta estas diferencias en nuestra estimacion de la fraccion de ADN fetal mediante la normalizacion de la densidad de etiqueta de secuencia de cada cromosoma mediana de las densidades de etiqueta de secuencia autosomica para cada muestra.

Calculo de la fraccion de ADN fetal en plasma materno de embarazos aneuploides (trisomia):

[0090] Siendo la fraccion de ADN fetal e

Contribucion materna Contribucion del feto con trisomia Contribucion de feto disomico

Cromosoma trisomico

2 (1- X ) 3 X 2 X

Embarazos trisomicos conteos de secuencia de cromosoma trisomico (fetal y materno)

= 2(1- £) + 3 £ = 2 + £

Embarazos disomicos conteos de secuencia de cromosoma trisomico (fetal y materno)

= 2(1- £) + 2 £ = 2

[0091] Siendo x la relacion de conteos de secuencia de cromosoma trisomico (o densidad de etiqueta de secuencia) de embarazos trisomicos a disomicos. En este estudio, el denominador de esta relacion se toma para ser la densidad de etiqueta de secuencia mediana de todos los embarazos disomicos.

[0092] Por lo tanto, la fraccion de ADN fetal X = 2 (x-1).

EJEMPLO 8: Correccion de sesgo de densidad de etiqueta de secuencia resultante de contenido G/C o A/T entre los diferentes cromosomas en una muestra

[0093] Este ejemplo muestra un refinamiento de resultados que indican secuencias de asignacion a diferentes cromosomas y que permite la determinacion del conteo de diferentes cromosomas o regiones de los mismos. Es decir, los resultados como se muestran en la Figura 1A pueden ser corregidos para eliminar las variaciones en la densidad de etiqueta de secuencia que se muestran para los cromosomas mas altos en contenido de G/C, que se muestra hacia la derecha de la figura. Esta difusion de los valores resulta del sesgo de secuenciacion en el metodo utilizado, donde un mayor numero de lecturas tienden a ser obtenido dependiendo del contenido de G/C. Los resultados del metodo de este ejemplo se muestran en la Figura 10. La Figura 10 es una superposicion que muestra los resultados de un numero de diferentes muestras, como se indica en la leyenda. Los valores de densidad de etiqueta de secuencia en las Figs 1 y 10 se normalizaron a los de un control de ADN genomico masculino, ya que los valores de densidad no son siempre 1 para todos los cromosomas (incluso despues de la correccion GC)

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pero son consistentes entre una muestra. Por ejemplo, despues de la correccion GC, los valores de todas las muestras para chr19 se agrupan alrededor de 0,8 (no mostrado). El ajuste de los datos a un valor nominal de 1 se puede hacer mediante el trazado del valor relativo al control ADNg masculina. Esto hace que los valores para todos los cromosomas se agrupen alrededor de 1.

[0094] Densidades de etiquetas de secuencia de cromosoma perifericas pueden considerarse como significativamente por encima de una densidad de etiqueta media de secuencia; cromosomas disomicos se agrupan alrededor de una llnea que recorre un valor de densidad de alrededor de 1. Como se puede ver all!, los resultados del cromosoma 19 (a la derecha, mas alto en contenido G/C), por ejemplo, muestran un valor similar cuando disomico como otros cromosomas disomicos. Las variaciones entre los cromosomas con contenido bajo y alto G/C se eliminan de los datos que han de examinarse. Las muestras (tales como P13 en el presente estudio) que no podrlan haberse interpretado de forma inequlvoca ahora pueden serlo. Dado que el contenido de G/C es lo contrario del contenido A/T, el presente metodo corregira para ambos. Cualquiera de sesgo G/C o sesgo A/T pueden resultar de diferentes metodos de secuenciacion. Por ejemplo, se ha informado por otros que el metodo Solexa da como resultado un mayor numero de lecturas de secuencias en las que el contenido de G/C es alto. Vease, Dohm et al., "Substantial biases in ultra-short read data sets from high-throughput DNA sequencing", Nuc. Acids Res. 36 (16), e105; doi: 10.1093/NAR/gkn425. El procedimiento del presente ejemplo sigue los siguientes pasos:

a. Calcular el contenido de G/C del genoma humano. Calcular el contenido de G/C de cada ventana 20kb que no se solapan de cada cromosoma del genoma humano (HG18) utilizando la secuencia de comandos hgG/CPercent del "arbol de fuentes de kent," del Explorador de Genoma de UCSC que contiene diferentes programas de utilidades, a disposition del publico bajo licencia. El fichero de salida contiene las coordenadas de cada bin 20kb y el correspondiente contenido de G/C. Se encontro que un gran numero de lecturas se obtuvieron rangos G/C mas altos (aproximadamente 55-70%) y muy pocas lecturas se obtuvieron en porcentajes de contenido G/C mas bajo, con esencialmente ninguno por debajo de aproximadamente 30% G/C (datos no mostrados). Debido a que la longitud real de un fragmento de ADN secuenciado no se conoce (solo secuenciamos el primer 25bp de un extremo de una portion de ADN en la celula de flujo), y es el contenido de G/C de toda la portion de ADN que contribuyo al sesgo de secuenciacion, se elige una ventana arbitraria de la secuencia de ADN genomico humano conocido para determinar el contenido de G/C de diferentes lecturas. Elegimos una ventana 20kb para examinar la relation entre el numero de lecturas y contenido de GC. La ventana puede ser mucho mas pequena, por ejemplo, 10 kb o 5 kb, pero un tamano de 20 kb hace que el calculo sea mas sencillo.

b. Calcular la relacion entre la secuencia de la cobertura y el contenido de G/C. Asignar peso a cada lectura de acuerdo con el contenido de G/C. Para cada muestra, se cuenta el numero de lectura por bin 20kb. El numero de lectura se representa frente a contenido de G/C. El numero medio de lectura se calcula para cada contenido de 0,1% G/C, haciendo caso omiso de los bins sin lecturas, bins con cero por ciento de G/C, y bins con lecturas sobre-abundantes. El reclproco del numero promedio de lecturas para un por ciento G/C particular con respecto a la mediana del numero global de la lectura se calcula como el peso. Cada lectura se asigna entonces un peso en funcion del por ciento G/C de la ventana de 20kb en el que caiga.

c. Investigar la distribution de lecturas a traves de cada autosoma y el cromosoma X. En este paso, el numero de lecturas, tanto no ponderado como ponderado, en cada ventana 50kb que no se solapa se registra. Para el conteo, se opto por una ventana de 50kb con el fin de obtener un numero razonable de lecturas por la ventana y numero razonable de ventanas por cromosoma para examinar las distribuciones. Tamano de la ventana puede ser seleccionado basandose en el numero de lecturas obtenido en un experimento dado, y puede variar en un amplio rango. Por ejemplo, 30K-100K puede utilizarse. Regiones de microsatelites conocidas se ignoran. Un grafico que muestra los resultados de chr1 de P7 se muestra en la Figura 11, la cual ilustra la distribucion de peso de esta etapa (c) a partir de la muestra P7, en la que el peso asignado a diferentes contenidos de G/C se muestra; Lecturas con mayor contenido de G/C estan excesivamente representadas de la media y por lo tanto se les da menos peso.

d. Investigar la distribucion de las lecturas a lo largo de chrY. Calcular el numero de lecturas chrY en las regiones transcritas despues de aplicar el peso a lecturas en chrY. El cromosoma Y es tratado de forma individual, ya que es corto y tiene muchas repeticiones. Incluso los datos de la secuencia del genoma femenino se asignaran en alguna parte en el cromosoma Y, debido a errores de secuenciacion y de alineacion. El numero de lecturas chrY en las regiones transcritas despues de aplicar peso a lecturas en chrY se utiliza para calcular el porcentaje de ADN fetal en la muestra.

EJEMPLO 9: Comparacion de diferentes muestras de pacientes utilizando analisis estadfsticos (estadfstica t)

[0095] Este ejemplo muestra otro refinamiento de los resultados tal como se obtiene usando los ejemplos anteriores. En este caso, multiples muestras de pacientes se analizan en un solo proceso. Figura 12 ilustra los resultados de un analisis de pacientes P13, P19, P31, P23, P26, P40, P42, P1, P2, P6, P7, P14, P17, P20, P52, P53, P57, P59 y P64, con sus respectivos cariotipos indicaron, como en la Tabla 1, anteriormente. La llnea punteada muestra el intervalo de confianza del 99%, y los valores extremos se puede identificar con rapidez. Se puede ver consultando debajo de la llnea que los fetos masculinos tienen menos cromosoma X (triangulos solidos). Una exception es P19, donde se

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cree que no habla suficientes lecturas totales para este analisis. Se puede ver al mirar por encima de la ilnea que los pacientes de trisomla 21 (clrculos solidos) son P 1, 2, 6, 7, 14, 17, 20, 52 y 53. P57 y 59 tienen trisomla 18 (rombos abiertos) y P64 tiene trisomla 13 (estrella). Este metodo puede ser presentado por el siguiente proceso de tres pasos:

Paso 1: Calcular en estadistica t para cada cromosoma en relacion con todos los demas cromosomas en una muestra. Cada estadistica t comunica el valor de cada cromosoma mediano con respecto a otros cromosomas, teniendo en cuenta el numero de lecturas asignado a cada cromosoma (ya que la variation de la escala mediana con el numero de lecturas). Como se describio anteriormente, los presentes analisis arrojaron sobre 5.000.000 lecturas por muestra. Aunque uno puede obtener 3-10 million lecturas por muestra, estas son lecturas cortas, por lo general solo alrededor de 20 a 100 pb, por lo que uno en realidad solo ha secuenciado, por ejemplo aproximadamente 300 millones de 3000 millones pb en el genoma humano. Por lo tanto, se usan metodos estadlsticos donde se tiene una pequena muestra y la desviacion estandar de la poblacion (3.000 millones, o 47 millones para el cromosoma 21) es desconocida y que se desea estimar desde el numero de la muestra de lecturas con el fin de determinar el significado de una variacion numerica. Una forma de realizar esto es mediante el calculo de la distribucion t de Student, que se puede utilizar en lugar de una distribucion normal esperadq de una muestra mas grande. La estadistica t es el valor obtenido cuando se calcula la distribution t. La formula utilizada para este calculo es la siguiente. Utilizando los metodos que aqui se presentan, otras pruebas t se pueden utilizar.

Paso 2: Calcular la matriz promedio de estadistica t promediando los valores de todas las muestras con cromosomas disomicos. Cada dato de muestra del paciente se coloca en el matriz, en donde la fila es chr1 a chr22, y la columna tambien es chr1 a chr22. Cada celula representa el valor t cuando se comparan los cromosomas en la fila y la columna correspondiente (es decir, la position (2,1) de la matriz es el valor t del examen de chr2 y chr1) la diagonal de la matriz es 0 y la matriz es simetrica. El numero de lecturas de mapeo a un cromosoma se compara individualmente a cada uno de chr1-22.

Paso 3: Reste la matriz promedio de estadistica t de la matriz de estadistica t de cada muestra. Para cada cromosoma, la mediana de la diferencia en la estadistica t se selecciona como el valor representativo.

[0096] La estadistica t de confianza del 99% para el gran numero de muestras es de 3,09. Cualquier cromosoma con una estadistica t representativa era de -3,09 a 3,09 se determina como no disomico.

EJEMPLO 10: Calculo del numero requerido de lecturas de secuencia despues de la correccion de sesgo G/C

[0097] En este ejemplo, se presenta un metodo que se utilizo para calcular la concentration minima de ADN fetal en una muestra que seria necesario para detectar una aneuploidia, en base a un cierto numero de lecturas obtenidas para ese cromosoma (excepto el cromosoma Y). Figura 13 y la Figura 14 muestran los resultados obtenidos a parti r de muestras de ADN de plasma de 19 pacientes, 1 donante muestra de ADN de plasma, y ejecuciones en duplicado de una muestra de ADNg donante. Se estima en la Figura 13 que el % de aDn fetal minimo del cual se puede detectar exceso de representation de Chr21 a la mejor tasa de muestreo (~ 70K lecturas asignadas a Chr21) es ~ 6%. (indicado por lineas continuas en la Fig. 13). Las lineas se dibujan entre aproximadamente 0,7 X105 lecturas y concentracion de ADN fetal 6%. Se puede esperar que con los numeros mas altos de lecturas (no se ejemplifican aqui) el porcentaje de ADN fetal necesario se reducira, probablemente a aproximadamente 4%.

[0098] En la Figura 14, los datos de la Figura 13 se presentan en una escala logaritmica. Esto muestra que la concentracion de ADN fetal minimo requerido escala de forma lineal con el numero de lecturas en una relacion de raiz cuadrada (pendiente de -.5). Estos calculos se realizaron

imagen1

Para valores grandes de n (n> 30), estadistica t * "2 "1 donde ^2-/1 es la diferencia en las medias

(o la cantidad de sobrerepresentacion o subrepresentacion de un cromosoma particular) a medirse; s es la desviacion estandar del numero de lecturas por 50kb en un cromosoma particular; n es el numero de muestras (es decir, el numero de ventanas 50kb por cromosoma). Al ser fijo el numero de ventanas de 50kb por

cromosoma, ni = n2. Si suponemos que si H S2,

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anchura del intervalo de

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confianza al nivel de confianza gobernado por el valor de t. Por lo tanto,

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Para todos los

cromosomas en todas las muestras, podemos calcular el valor -*1 que corresponde al minimo exceso o falta de representacion que se puede resolver con el nivel de confianza regido por el valor de t. Nota que

2*(=-l) *100%

' corresponde al % de ADN fetal minimo de los cuales se puede detectar cualquier

representacion excesiva o insuficiente de cromosomas. Esperamos que el numero de lecturas asignadas a cada cromosoma juegue un papel en la determinacion de la desviacion estandar si, ya que de acuerdo a la distribucion de Poisson, la desviacion estandar es igual a la raiz cuadrada de la media. Mediante el trazo

2*( = -l) *100%

Ji vs. numero de lecturas asignadas a cada cromosoma en todas las muestras, podemos

evaluar el % de ADN fetal minimo del cual cualquier exceso o falta de representacion de los cromosomas se puede detectar debido a la frecuencia de muestreo actual.

[0099] Despues de la correccion del sesgo de G/C, el numero de lecturas por ventana de 50kb para todos los cromosomas (excepto el cromosoma Y) se distribuye normalmente. Sin embargo, hemos observado valores atipicos en algunos cromosomas (por ejemplo, una sub-region en el cromosoma 9 tiene representacion cerca de cero; una sub-region en el cromosoma 20, cerca del centromero tiene representacion inusualmente alta) que afectan el calculo de la desviacion estandar y la media. Por lo tanto, decidimos calcular un intervalo de confianza de la mediana en lugar de la media para evitar el efecto de los valores atipicos en el calculo del intervalo de confianza. No esperamos que el intervalo de confianza de la mediana y la media sea muy diferente si el pequeno numero de valores atipicos se ha eliminado. El intervalo de confianza del 99,9% de la mediana para cada cromosoma se estima a partir del proceso de arranque de 5000 muestras de la distribucion de lecturas 50kb utilizando el metodo de percentil. La anchura media del intervalo de confianza se calcula como intervalo de confianza 0,5*. Se traza 2* (anchura media de intervalo de confianza de la mediana)/media* 100% frente al numero de lecturas asignadas a cada cromosoma para todas las muestras.

[0100] Remuestreo de proceso de arranque y otros calculos implementados en ordenador descritos aqui se llevaron a cabo en MATLAB®, disponible de The MathWorks, Natick, MA.

REFERENCIAS

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Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un metodo de ensayo para la presencia o ausencia de una aneupioidla fetal en una muestra de plasma materno que comprende una mezcla de ADN libre de celulas materna y fetal, comprendiendo los pasos de:

   (a) la obtencion de una mezcla de ADN libre de celulas materna y fetal de dicha muestra;

   (b) la secuenciacion de subsecuencias predefinidas de la ADN libre de celulas materna y fetal para obtener una pluralidad de etiquetas de secuencia alineadas a las subsecuencias predefinidas, en la que la secuenciacion selectivamente comprende la secuenciacion de moleculas de acido nucleico que comprende las subsecuencias predefinidas utiizando un metodo de secuenciacion que selectivamente captura moleculas de muestra que contienen las subsecuencias predefinidas, en la que dichas etiquetas de secuencia son de suficiente longitud para asignarse a una subsecuencia predefinida especlfica, en la que las subsecuencias predefinidas son de una pluralidad de cromosomas diferentes, en la que dicha pluralidad de cromosomas diferentes comprende al menos un primer cromosoma que presuntamente tiene una distribucion anormal en dicha muestra y al menos un segundo cromosoma estando presuntamente normalmente distribuido en dicha muestra, en la que la captura selectiva se destina a subsecuencias predefinidas mapeando de modo unico o con un desajuste a dicho al menos un primer cromosoma y dicho al menos un segundo cromosoma, y en la que dicho al menos un primer cromosoma es el cromosoma 18, 21, 13, X o Y;

   (c) la asignacion de una pluralidad de etiquetas de secuencia a sus correspondientes subsecuencias predeterminadas;

   (d) la determinacion de un numero de etiquetas de secuenciacion a las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma y un numero de etiquetas de secuencia alineandose a las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma; y

   (e) el uso de numero dle paso (d) para determinar un diferencial, entre el numero de etiquetas de secuencia alineandose a las subsecuencias predeterminadas de dicho primer cromosoma y el numero de etiquetas de secuencia alineandose a las subsecuencias predeterminadas de dicho segundo cromosoma, siendo determinante de la sobrerepresentacion o subrepresentacion de dicho primer cromosoma en la mezcla de ADN libre de celulas materna y fetal.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha secuenciacion comprende la union de fragmentos de ADN a una superficie transparente optica, llevandose a cabo amplificacion de fase solida a los fragmentos de ADN unidos para crear una celula de flujo de secuenciacion de alta densidad con milliones de aglomeraciiones de ADN y la secuenciacion de aglomeraciiones de ADN por un metodo de secuenciacion por slntesis de ADN de cuatro colores, empleando terminadores reversibles con tintes fluorescentes removibles.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la aneuploidea es una aneuploidea de un cromosoma seleccionado del grupo que consiste del cromosoma 13, cromosoma 18 y cromosoma 21.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el paso de asignacion de etiquetas de secuenciacion a las correspondientes porciones de cromosoma permite un desajuste.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la longitud de las etiquetas de secuenciacion es de una longitud de aproximadamente 25bp a aproximadamente 100 bp.
6. 6. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la captura selectiva comprende el uso de perlas de captura con secuencias genomicas especlficas como sondas de captura.
7. 7. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la captura selectiva se dirige a secuencias genomicas, mapeandose unicamente a al menos un primer cromosoma.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha secuenciacion comprende el uso de un ensayo de secuenciacion.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra se convierte en monocatenaria y dichas subsecuencias predefinidas se capturan bajo condiciones de hibridizacion por un numero de sondas monocatenarias que se catalogan por el uso de codigos de barras o que se separan flsicamente en un ensayo.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 1, el cual comprende ademas la determinacion de la fraccion de ADN fetal de la ADN obtenida del suero materno o muestra de plasma.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que la fraccion de ADN fetal se determina por PCR digital.