Die Trennung von verschiedenen Zellpopulationen
ist ein zentraler Punkt in der Analyse unterschiedlicher Zellpopulationen.
Es sind im Stand der Technik verschiedenste Verfahren zur Trennung
von Zellen bekannt, die meist auf unterschiedlichen physikalischen
Eigenschaften oder auf Unterschieden in der Expression von bestimmten
Molekülen
beruhen.
Der Nachweis zirkulierender und/oder
mikrometastatischer veränderter
Zellen, wie Tumorzellen, in einer Mischung von Zellen unterschiedlicher
Zellpopulationen, dient einer frühen
Beurteilung der Prognose des Patienten sowie einer Stratifizierung
für mögliche sog.
adjuvante Therapieschritte. Für
eine sinnvolle Frühdiagnostik
muss eine äußerst geringe Zahl
veränderter
Zellen in der zu analysierenden Probe spezifisch nachweisbar sein.
Tumorzellen und andere veränderte Zellen
weisen im Vergleich zu ihren normalen Vorläufern praktisch immer genetische
Veränderungen
auf. Die Veränderungen
betreffen entweder das Auftreten tumorassoziierter und charakteristischer
Genexpressionsprofile und/oder sind durch spezifische Genmutationen
gekennzeichnet. Der Nachweis letzterer (z.B. Mutationen in den Genen
p53, BRCA1 & 2,
APC und andere) ist auf DNA-Ebene mit der diagnostisch notwendigen
Empfindlichkeit bisher technisch dann nicht möglich, wenn die Tumorzellen
gegenüber
den Normalzellen in der Probe unterrepräsentiert sind.
Demgegenüber ist der Nachweis von veränderten
Zellen, wie Tumorzellen, mit der Amplifikation einer sogenannten "gewebespezifischen
mRNA-Expression" in
der gebotenen Empfindlichkeit durchführbar (sog. molekulares Staging),
wenn folgende Voraussetzungen erfüllt sind:
- a.)
Das Ursprungsorgan des Tumors ist bekannt. Es lassen sich gewebespezifische
mRNA-Marker definieren, wie z.B.
i.) Cytokeratine, die generelle
Epithelmarker darstellen und bei bösartigen Tumoren epithelialer
Herkunft (Karzinomen) nachweisbar bleiben.
ii.) Sogenannte
Differenzierungsmarker unterschiedlicher Gewebe wie z.B. CEA (bei
Dickdarmkarzinom), PSA (bei Prostatakarzinom), AFP (bei Leberkarzinom),
Tyrosinase (bei malignem Melanom) u.a..
- b.) Die in der Untersuchungsprobe sonst noch vorhandenen normalen
Zellen (normale Blutleukozyten einer Blutprobe) exprimieren die
für das
molekulare Staging als Target eingesetzte mRNA-Marker nicht: Umgekehrt
eignen sich die mRNA-Marker, die in normalen Zellen exprimiert werden,
nicht für
das Staging.
Sind die Voraussetzungen erfüllt, lassen
sich mit geeigneten empfindlichen Methoden vagabundierende veränderte Zellen,
wie Tumorzellen, in einer Untersuchungsprobe über das gewebespezifische mRNA-Expressionsprofil
im Gegensatz zu den tumorspezifischen Genmutationen auch innerhalb
eines großen Überschusses
normaler Zellen nachweisen.
Technisch beruht der Nachweis auf
der in-vitro Herstellung einer cDNA-Kopie der Target-mRNA mit Hilfe
der reversen Transkription mit anschließender DNA Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR). Dieser Nachweis ist mit hoher Empfindlichkeit
möglich
und erfasst üblicherweise
eine einzelne Tumorzelle in 10E6 bis 10E7 normaler Blutzellen (d.h.
1 ml Blut).
Bisher hat die Anwendung von RT-PCR
Tests jedoch gravierende Einschränkungen.
Eine Vielzahl gewebespezifisch exprimierter Gene sind beschrieben,
die sich grundsätzlich
für den
Nachweis der aus diesen Geweben abgeleiteten veränderten Zellen, wie Tumorzellen,
eignen. Der Versuch dieses Nachweises ist aber aus den folgenden
Gründen
nicht immer erfolgreich, was sich durch system-immanente Besonderheiten
derartiger Amplifikationssysteme ergibt, die untenstehend erwähnt werden:
Die
analytische und die diagnostische Sensitivität von Nachweisverfahren auf
RT-PCR Basis ist sehr hoch. D.h. die Methode erlaubt den sicheren
Nachweis einzelner Moleküle
in Testsystemen bzw. in klinischem Untersuchungsmaterial. Daneben
ist die analytische Spezifität
sehr hoch. D.h. fehlerhafte Amplifikation anderer als der gewünschten
mRNA-Moleküle durch
sogenannte Kreuzhybridisierung der Primer lässt sich unter geeigneten Bedingungen
sicher ausschließen.
Demgegenüber ist die diagnostische Spezifität unzureichend.
D.h. regelmäßig werden
auch in klinischen Proben von Normalpersonen oder Patienten mit
nicht-malignen Erkrankungen positive Resultate für die gewählte "tumorassoziierte" Ziel-mRNA gefunden. Positive RT-PCR Resultate
können
also auch durch nicht-maligne Zellen der Probe verursacht werden.
Entsprechend lässt
sich ein Ergebnis im Einzelfall hinsichtlich der diagnostischen
Beurteilung schwer interpretieren.
Die daraus resultierende niedrige
diagnostische Spezifität
erklärt,
warum sich der Nachweis zirkulierender Tumorzellen durch RT-PCR
für die
Diagnostik minimaler Resterkrankung bisher nicht hat durchsetzen können (Jung
et al., EJCCCB, 1997, Jung et al., J Lab Med, 1999). Tatsächlich erlauben
die falsch-positiven Ergebnisse nicht die Nutzung dieser an sich
sehr vorteilhaften Methode.
Der wesentliche Grund für die unzureichende
diagnostische Spezifität
liegt in einer mRNA-Hintergrundexpression (synonym: illegitime Transkription;
Background-Transkription) durch die in der Untersuchungsprobe enthaltenen
normalen Zellen (z.B. in Blut und Knochenmark durch weiße Blutzellen).
Es konnte gezeigt werden, dass normale, weiße Blutzellen tumor-assoziierte
mRNA-Marker exprimieren können.
Diese "illegitime" Expression ist auf
der Basis der einzelnen Zelle spärlich,
führt aber
durch die hohe Zahl dieser natürlich
vorkommenden Zellen in der Probe zu einem deutlich messbaren Signal
und somit zu den genannten unspezifisch positiven Ergebnissen. Das
Muster der Hintergrundexpression kann dabei konstitutiv sein (Jung
et al., Br. J. Cancer (1999)), oder z.B. im Rahmen einer Entzündungsreaktion
induziert (Jung et al., Br. J. Cancer, (1998)) werden.
Aus der Literatur ist inzwischen
ersichtlich, dass das Problem der Hintergrundexpression den Nutzen der
Methode wesentlich verringert. Entsprechend wurden zur Erhöhung der
Spezifität
verschiedene Verfahren vorgeschlagen, die wie die üblichen
Trennungsverfahren die physikalischen oder Expressions-spezifischen
Eigenschaften der zu trennenden Zellen nutzen. Allerdings weisen
diese Verfahren häufig
wesentliche diagnostische Einschränkungen für die klinische Nutzbarmachung
auf.
Die gebräuchlichste Methode zur Trennung
von Zellpopulationen, z.B. aus dem Vollblut, ist die sogenannte
FICOLL-Dichtegradienten-Zentrifugation. Zum FICOLL-Gradienten existieren
eine Vielzahl von Varianten desselben Prinzips. Dieses beruht auf
einer Anreicherung mononukleärer
Zellen, in denen dann der Nachweis einer Tumorzelle geführt wird.
Die FICOLL-Methode ist nicht standardisierbar,
d.h. sie besitzt eine unterschiedliche Effektivität in der Wiedergewinnung
der separierten Zellen. Die Sensitivität des Tumorzellnachweises ist
maßgeblich
vom technischen Geschick des Untersuchers abhängig (Krüger et al., Clin Chem, 2000).
Daneben ist die Wiedergewinnung und Anreicherung von veränderten
Zellen, wie Tumorzellen, auch aufgrund ihres nicht vorhersagbaren Sedimentationsverhaltens
unsicher. Zusammenfassend betrachtet ist unklar, ob und wie viele
Tumorzellen bei der Zentrifugation verloren gehen und ob sich Tumorzellen
bezüglich
ihrer spezifischen Dichte generell so homogen verhalten, dass sie
sich stets mit mononukleären
Zellen zusammen separieren lassen und nicht in der verworfenen Granuloytenfraktion
sedimentieren. Insgesamt wird von einer Wiederfindung von zwischen
10 – 70
% berichtet.
Als zweites wesentliches Prinzip
der Anreicherung von Zielzellen gilt die Immunobead-Anreicherung. Dieses
Verfahren geht davon aus, dass man veränderte Zellen, wie Tumorzellen,
selektiv aus einem Zellgemisch über
Bindung an paramagnetische Partikel gewinnen kann. Voraussetzung
ist die Expression eines tumorassoziierten Markers in geeigneter
Dichte auf der Oberfläche
der Tumorzelle. Paramagnetische Partikel, an welche ein gegen diesen
Marker gerichteter Antikörper
gebunden ist, adsorbieren an die Zielzellen, um diese anschließend mittels
Magnet aus der Lösung anzureichern.
Die erfolgreiche Bindung des Antikörpers erfordert eine ausreichende
Dichte des Markers an der Zelloberfläche.
Die Methode der Immunobead-Anreicherung
hat zwei limitierende Voraussetzungen:
- 1) Der
Marker muss ein Oberflächenmarker
sein und ist damit abhängig
vom Tumortyp. Allerdings bedingt die Heterogenität von Karzinomen eine nicht
gleichmäßig hohe
und geeignete Expression des Markers auf allen individuellen Tumoren
bzw. ihren Metastasen. Die Zahl der Moleküle an der Oberfläche, die
für eine erfolgreiche
Anreicherung wesentlich ist, ist im wesentlichen unbekannt.
- 2) Um die Zellen in intaktem Zustand zu verarbeiten, erfordert
die Methode die Verarbeitung der nativen Untersuchungsprobe unmittelbar
im Anschluss an die Probennahme. Eine Degradation der empfindlichen mRNA
ist bereits innerhalb von Stundenfrist nach Abnahme zu beobachten
(Gerhard et al., J Clin Oncol 1994 Apr;12(4):725-9). Durch die damit
einhergehende sinkende mRNA-Qualität sinkt auch die diagnostische
Sensitivität
eines RT-PCR Tests rasch ab. Daraus folgt, dass sowohl die Probenverarbeitung
als auch der Zeitfaktor für
die Immunobead Separation zum Nachweis einzelner Tumorzellen auf
der Basis gewebespezifischer mRNA von entscheidender Bedeutung sind.
Diese Voraussetzungen sind für
eine Routineanwendung in der Diagnostik nicht gegeben.
Die Anmeldung
US 2002/0012931 beschreibt ein
Verfahren zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen, bei dem die
Zellen verantwortlich für
falsch-positive Signale beim Nachweis von GC-C (guanylyl cyclase C)
als CD34-positive Zellen im Blut identifiziert wurden. Diese falsch-positiven
Zellen sollen daher gemäß dem dort
beschriebenen Verfahren durch Eliminierung aus der Zellmischung
entfernt werden, z.B. über
Immunobeads. Anschließend
erfolgt dann der Nachweis der GC-C mRNA in den verbliebenen Zellen.
Hier erfolgt also eine Negativselektion der veränderten Zellen, d.h. die für das falsch-positive
Signal verantwortlichen Zellen werden herausgetrennt.
Für
beide oben dargelegten Verfahren gilt die zwingende Notwendigkeit,
für eine
unmittelbar anschließende
Weiterverarbeitung zu sorgen, damit die Integrität der mRNA innerhalb der gewonnenen
Zellen gewährleistet
ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, diese Einschränkungen
auch bei der standardisierten Durchführung auszuräumen. Insbesondere
dann, wenn sich eine RT-PCR Untersuchung in der Routinediagnostik
an das Auftrennungsverfahren anschließen soll. Hierzu muss das erfindungsgemäße Verfahren
folgende Voraussetzungen erfüllen:
- 1) Die in der Untersuchungsprobe für die illegitime
Expression verantwortlichen Zellen (Subpopulationen) müssen sich
einfach abtrennen lassen.
- 2) Dabei sollten die oben genannten abzutrennenden Subpopulationen
und ihre Bestandteile aus der Probe "entsorgt" werden. Die mRNA-Expression aus den
Hintergrundzellen muss mit dieser Entsorgung beseitigt sein.
- 3) Das Verfahren muss mit einem Minimum an Aufwand am Entnahmeort
sicher durchführbar
sein, damit es standardisierbar ist. Standardisiert bedeutet in
diesem Zusammenhang, dass zum einen die Vorrichtungen für die Probenentnahme
konfektionierbar sein müssen.
Zum anderen ist es erforderlich, dass das Probenentnahmeprotokoll
so gestaltet ist, dass es von unterschiedlichen Untersuchern aufgrund
gleicher Vorgehensweise gleich effizient durchgeführt werden
kann. Definitionsgemäß kann hierzu
kein technisch unstandardisiertes Verfahren (z.B. FICOLL-Dichtegradient, Immunseparation)
verwendet werden.
- 4) Das Verfahren darf am Ort der Abnahme nicht an die Notwendigkeit
des Vorhaltens aufwendiger technischer Geräte geknüpft sein, weil es dann nicht
für eine
breite Anwendung routinefähig
ist.
- 5) Das Verfahren muss so schnell durchführbar sein, dass die Integrität der mRNA
in der Probe nicht gefährdet
wird. Anderenfalls wird die diagnostische Sensitivität kritisch
erniedrigt.
Kurze Beschreibung
der Erfindung
Um die o.a. Erfordernisse zu erfüllen, umfasst
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Trennung der normalen zellulären
Subpopulation (en) bzw. Fraktion (en) – wie unten definiert – von den
veränderten
Zellen in einer Probe den Schritt des Inkubierens der Mischung von
Normalzellen und veränderten
Zellen in einer hypotonen Lösung
und Zerstörung
von Fraktionen davon.
Das Verfahren basiert dabei auf dem
neuen Gedanken, im Gegensatz zur bisher gängigen Methodik, verschiedene
für die
illegitime Expression des zu untersuchenden mRNA-Markers verantwortliche
zelluläre Subpopulation
(en) bzw. Fraktion (en) in der Lösung
durch hypotonen Einfluss zu zerstören, bevor die Probe zur Analyse
der veränderten
Zellen weiterverarbeitet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei weiterhin
den Schritt des Gewinnen der nicht eliminierten Zellen umfassen.
Sollte das Verfahren zur weiteren Analyse der gewonnenen Zellen
genutzt werden, so schließt
sich an den Wiedergewinnungsschritt ein Analyseschritt, z.B. eine
RT-PCR an.
Es zeigte sich, dass eine Inkubation
in einer hypotonen Lösung
zu einer differenzierten Zerstörung
von Zellfraktionen in Proben führt.
Insbesondere weisen veränderte
Zellen, wie Tumorzellen, einen größeren Widerstand gegen die
hypotonen Verhältnisse
in der Lösung
auf als üblicherweise
in der Probe vorkommende Zellpopulationen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis
von veränderten
Zellen, wie Tumorzellen, verwendet werden. Eine Möglichkeit
ist die Nutzung des Verfahrens zur Diagnose von metastasierendem
Krebs.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit zum Nachweis
von veränderten
Zellen, wie Tumorzellen bereitgestellt. Dieses Kit umfasst eine
hypotone Lösung
oder Mittel um die Lösung
hypoton zu machen und Primer zum Nachweis von mRNA kodierend für einen
tumorspezifischen Marker. Weiterhin umfasst das Kit bevorzugt eine RNA-stabilisierende
Lösung,
umfassend ein hoch konzentriertes chaotropes Salz.
Dieses Kit kann zu Diagnose von metastasierendem
Krebs eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung
der Abbildungen
1: 1a zeigt den Nachweis von
Cytokeratin 20 (CK20) und (PBGD) unter verschiedenen hypotonen Bedingungen
bei Normalblut. 1b zeigt
den Nachweis von Cytokeratin 20 (CK20) und (PBGD) unter verschiedenen
hypotonen Bedingungen bei Normalblut mit einer bestimmten Anzahl
von Tumorzellen (HT29).
2: 2 zeigt den Nachweis von
Cytokeratin 20 (CK20) und (PBGD) unter verschiedenen hypotonen Bedingungen
bei Normalblut mit 25 Tumorzellen (HT29).
3: 3 zeigt den relativen Anteil
der Granulozyten-Subpopulation
innerhalb der Blutzellen in Abhängigkeit
der Behandlung mit hypotonen Lösungen.
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
Zum Verständnis der Anmeldung werden
die folgenden Begriffe, wie sie hier verwendet werden näher erläutert.
Osmolarität/ Osmolalität: Die Osmolarität gibt die
Konzentration osmotisch wirksamer Teilchen in 1 Liter Untersuchungsmaterial
(osm/L) an. Die Osmolalität
gibt die Konzentration osmotisch wirksamer Teilchen in 1 kg Lösungsmittel
(osm/kg). Milliosmole werden mit mosm abgekürzt.
Hypotonie: Lösungen mit gleichem osmotischem
Druck sind isoton. Lösungen
mit erhöhter
Osmolalität werden
als hyperton, Lösungen
mit erniedrigter Osmolalität
als hypoton bezeichnet.
Zerstören von Zellen: Aufhebung der
Zellintegrität
durch chemisch-biologische oder physikalische Methoden. Zum Beispiel
werden bei der Zugabe einer hypotonen Flüssigkeit Zellen zum Platzen
gebracht.
Tumor-assoziierte/spezifische mRNA:
Im Verlauf der Genexpression werden von einem Gen (DNA) eine oder
mehrere "Kopien" in Form der mRNA
(messenger RNA) erstellt. Dieser Vorgang wird als Transkription
bezeichnet. Im weiteren Verlauf wird die genetische Information
der mRNA in eine Aminosäuresequenz übersetzt
(Translation). Auf diese Weise entstehen Eiweiße, welche multiple Aufgaben übernehmen.
Tumor- spezifische / assoziierte RNA Moleküle sind charakteristisch für Tumoren
und werden nicht bzw. häufig
in geringer Menge in normalen Zellen gebildet. Die für ein tumorassoziiertes
Molekül
kodierende mRNA ist damit der Vorläufer des durch immuncytochemische
Verfahren nachweisbaren Tumormarkers.
Solide Tumore: Solide Tumore unterscheiden
sich von nichtsoliden Tumoren in der Bildung einer messbaren, zusammenhängenden
Tumormasse. Als Beispiel für
solide Tumoren lassen sich die Karzinome, als Beispiel für nicht-solide
Tumore die Leukämie
anführen.
Stabilisieren: Im vorliegenden Fall
wird unter Stabilisierung zum einen die Verhinderung des Abbaus der
RNA verstanden, zum anderen der Schutz von Tumorzellen vor Zerstörung durch
eine hypotone Lösung.
Bestandteile der Zellen: Unter Zellbestandteilen
werden alle Strukturen, Substanzen und Moleküle gerechnet, die die Zelle
in Ihrer Form und Funktion definieren. Hierzu gehören z. B.
der Zellkern, die Zellmembran, das Zytoplasma, die DNA, RNA, Proteine
usw.
Zellen: Gemeint ist die Gesamtheit,
der den Menschen ausmachenden Zellen.
Zellarten: Gemeint sind bestimmte
Zellen wie z.B. Blutzellen oder Tumorzellen, Darmepithelzellen usw.
Zellpopulationen: Gemeint sind Untergruppen
innerhalb einer Zellart wie z.B. die weißen (Leukozyten) und roten
(Erytrozyten) Blutzellen innerhalb der Blutzellen.
Subpopulationen: Gemeint sind Untergruppen
innerhalb der Zellpopulationen wie z.B. die Granulozyten und Lymphozyten
innerhalb der weißen
Blutzellen (Leukozyten) Zellfraktionen: Gemeint sind Untergruppen innerhalb
der Subpopulationen wie z.B. die Eosinophilen und Basophilen innerhalb
der Granulozyten.
Normalzellen/Nicht-Tumorzellen: Gemeint
sind alle nicht maligne oder anderweitig veränderten Zellen. Im Vorliegenden Fall
wird von normalen Blutzellen ausgegangen. Im Gegensatz dazu stehen
die veränderten Zellen,
wie Tumorzellen oder Vorläufern
von Tumorzellen.
Hintergrundexpression: Veränderte Zellen
wie z.B. Tumorzellen exprimieren große Mengen bestimmter Markermoleküle (z.B.
tumor-assoziierte mRNA's
wie CK20- CEA- oder PSA-mRNA) welche für bestimmte Zellarten wie Epithelzellen
charakteristisch sind. Normale Blutzellen exprimieren z.T. sehr
geringe Mengen dieser mRNA's.
So führt
die große
Zahl normaler Blutzellen in einer Probe zu einem Signal, welches
dem von wenigen das Markermolekül
in großen
Mengen produzierenden Tumorzellen entspricht.
Diese Expression von Markermolekülen auf
sehr niedrigem Niveau durch normale Blutzellen wird hier als Hintergrund
definiert, Synonyme für
die Hintergrundexpression sind illegitime Transkription; Background-Transkription.
CP-Wert: Der "Crossing Point" (CP-Wert; Schwellenzyklus) einer PCR-Reaktion
gemessen im Lightcycler (Roche) ist der PCR-Zyklus, bei der die
PCR-Amplifikation in die exponentielle Phase eintritt. Gemeint ist
damit genau der Zeitpunkt der PCR-Reaktion (Zyklusnummer) bei der
die Fluoreszenz einer bestimmten Reaktion über die Hintergrundfluoreszenz
hinaus ansteigt. Dieser Zeitpunkt verhält sich am zuverlässigsten proportional
zu der am Anfang der Amplifikation vorhandenen Konzentration des
Templates. Dieser Zeitpunkt wird durch die Lightcycler-Software
von Roche automatisch graphisch ermittelt.
Je niedriger ein CP-Wert, desto mehr
Kopien des zu amplifizierenden Nukleinsäureabschnittes liegen in der
Probe vor. Wird kein CP-Wert ermittelt, so liegt auch kein amplifikationsfähiges Zielmolekül in einer
Probe vor.
Porphobilinogen Deaminase (PBGD):
PBGD ist ein so genanntes "House-keeping-Gen" und wird auf niedrigen
Niveau konstitutiv von allen somatischen Zellen exprimiert. Es fungiert
als positive Kontrolle für
die Anwesenheit von mRNA in der Probe.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Trennung
von Zellfraktionen umfassend Normalzellen und veränderte Zellen
bereitgestellt. Die Zellfraktionen aus Normalzellen und veränderten
Zellen werden dabei dem Schritt des Inkubierens in einer hypotonen
Lösung
unterworfen. Dabei findet eine Zerstörung einer oder mehrerer Zellfraktionen
statt.
Der Erfindung liegt die Feststellung
zugrunde, dass Zellen eine unterschiedliche Resistenz gegenüber einer
hypotonen Lösung
aufzeigen, bevor ihre Zellintegrität aufgehoben wird. Genauer
wurde von den Erfindern festgestellt, dass veränderte Zellen, wie Tumorzellen,
gegenüber
hypotonen Einflüssen
resistenter sind als Normalzellen.
Diese neue Eigenschaft von veränderten
Zellen gegenüber
Normalzellen erlaubt die Trennung dieser verschiedenen Fraktionen
mit Hilfe einer Inkubation in einer hypotonen Lösung.
Dem Schritt der Inkubation in hypotoner
Lösung
kann sich ein Aufreinigungsschritt anschließen. Dabei werden die nicht
desintegrierten Zellen gesammelt. Anschließend können die so gewonnenen Zellen
einer Analyse unterworfen werden. Diese Analyse kann z.B. eine Analyse
mit Hilfe der RT-PCR sein.
Die Analyse der gewonnenen Zellen
kann das Bestimmen der Expression eines Tumormarkers, wie einer
Tumorassoziierter/spezifischer mRNA, umfassen. Insbesondere dann,
wenn dieses Verfahren Teil eines Diagnoseverfahrens von Tumoren
ist, wie zirkulierenden und mikrometastasierenden Tumorzellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die
Abtrennung von Zellfraktionen, umfassend Normalzellen, die für eine Hintergrundexpression
eines Tumormarkers verantwortlich ist, von veränderten Zellen, wie Tumorzellen,
die in einer geringen Zahl in der Untersuchungsprobe vorliegen können. Somit
erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren
den Nachweis von veränderten
Zellen, wie Tumorzellen, in Untersuchungsproben, die aufgrund einer
Hintergrundexpression des ausgewählten
Tumormarkers durch Normalzellen üblicherweise nicht
möglich
ist. Die Hintergrundexpression durch Normalzellen kann zu einem
falsch positiven Signal in der Untersuchungsprobe führen.
Die Untersuchungsproben können Mischungen
von Normalzellen und veränderten
Zellen aus Körperflüssigkeiten
oder Gewebe sein. Insbesondere kann die Körperflüssigkeit eine der folgenden
sein: Blut, Urin, Liquor, Knochenmark, Lymphe, Aszites, Sputum.
Wie oben bereits erwähnt können die
veränderten
Zellen Tumorzellen sein. Bevorzugt sind die Tumorzellen zirkulierende
und/oder mikrometastasierende Tumorzellen von soliden Tumoren wie
Karzinomen in Geweben und Körperflüssigkeiten,
wo diese Art des Tumors nicht auftritt.
Insbesondere handelt es sich bei
den mikrometstasierenden Tumorzellen um Tumorzellen epithealen Ursprungs.
In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Untersuchungsprobe um Knochenmark oder Vollblut.
Die Normalzellen der Untersuchungsprobe,
welche eine oder mehrere Tumor-assoziierte mRNA-Spezies exprimieren
können
sein:
Zellen der myeloischen wie der lymphatischen
Differenzierungsreihe
in unterschiedlichen Reifungsstufen. Hierzu gehören im einzelnen undifferenzierte
Myeloblasten und Reifungsstufen bis zum segmentierten Granulozyten
und Monozyten/ Makrophagen; undifferenzierte Megakaryoblasten und Reifungsstufen
bis zum Thrombozyten; Proerythroblasten und Reifungsstufen bis zum
Retikulozyten
In der lymphatischen Reihe gehören hierzu
Leukozyten der lymphatischen Reihe in unterschiedlichen
Differenzierungsstufen,
hierbei insbesondere lymphatische Stammzelle und Reifungsstufen
bis zu differenzierten Effektorzellen der T- bzw. B-Lymphozytenreihe.
Diese Normalzellen oder Nicht-Tumorzellen,
die entweder im Ruhezustand oder erst im aktivierten/stimulierten
Zustand die tumor-assoziierte mRNA exprimieren, werden erfindungsgemäß zuerst
unter Verwendung einer hypotonen Lösung aus der Probe eliminiert
bevor ein Nachweis der Tumorzellen erfolgt.
Die hypotone Lösung weist eine Osmolalität von kleiner
100 mosm/kg auf. Bevorzugt liegt die Osmolalität der Lösung in einem Bereich von 30-60
mosm/kg, genauer von 40 mosm/kg.
Die hypotone Lösung kann als solche zu den
Zellen gegeben werden oder durch Zugabe von Hilfsmitteln wie Sephadex,
Aktivkohle, Ionentauscher kann die Osmolalität der Lösung erniedrigt werden. Bevorzugt wird
eine hypotone Lösung
verwendet basierend auf einer Lösung
von Salzen wie z.B.: NaCl, KCl, NH3Cl, Phosphat
buffered Saline (PBS), Hank's
Balanced Salt Solution (HBBS) und Mischungen davon.
Die hypotone Lösung kann auch weitere Hilfsstoffe
enthalten, die den desintegrierenden Effekt der hypotonen Lösung fördern oder
den Abbau von Bestandteilen der disintegrierten Zellen beschleunigen.
Diese Hilfsstoffe können
sein: ionische sowie nicht-ionische Tenside wie z.B. Saponin, Triton,
Tween, Sodiumdodecylsulfat (SDS). Weiterhin Nukleinsäure-abbauende
Enzyme (RNAsen und DNasen) und/oder Protein-abbauende Enzyme (Proteinase
K, Pronase oder andere).
Bevorzugt enthält die hypotone Lösung Nukleinsäure-abbauende
Enzyme und/oder Protein-abbauende Enzyme, z.B. RNAse.
Aufgrund der generellen Instabilität zellulärer mRNA
ist es vorteilhaft, dass die Eliminierung der Nicht-Tumorzellen
schnell und unmittelbar nach der Probenentnahme vor Ort erfolgt.
Die Zeitnähe
gewährleistet
die Integrität
der Untersuchungsprobe und sichert, dass auch kleine Mengen von
Tumorzellen in der Probe nachgewiesen werden können (diagnostische Sensitivität).
Die Eliminierung (Zerstörung) erfolgt
dabei erfindungsgemäß durch
das Inkubieren der Zellen der Untersuchungsprobe in einer hypotonen
Lösung.
Dabei können
dann durch die Zellen freigesetzte Bestandteile, wie RNAsen, oder
künstlich
zugesetzte Bestandteile, wie Enzyme einschließlich RNAsen, die beschädigten oder
lysierten Zellen abbauen und dabei insbesondere deren mRNA -und
damit die illegitimen mRNA-Transkripte-
beseitigen.
Anschließend kann erfindungsgemäß eine so
genannte Stabilisierung der Probe erfolgen. Dieser Schritt des Stabilisierens
kann vor oder nach Gewinnung der nicht-zerstörten Zellen erfolgen. Erfolgt
die Stabilisierung nach Gewinnung der nicht-zerstörten Zellen
führt die
Lösung
zur Lyse aller verbliebenen Zellen, so wie der veränderten
Zellen, insbesondere Tumorzellen, bei gleichzeitiger Stabilisierung
der mRNA dieser Zellen. Bei der Lyse muss die Deaktivierung freier
Enzyme, die eine Nukleinsäure-abbauende
Aktivität
aufzeigen, gewährleistet
sein, damit diese nicht die nunmehr ebenfalls freigesetzte tumor-assoziierte
mRNA der veränderten
Zellen, wie Tumorzellen, zersetzen.
Diese Lösung kann zur RNA-Stabilisierung
ein hoch konzentriertes chaotropes Salz (z.B. Guanidiniumisothiocyanat
oder Guanidiniumhydrochlorid)enthalten.
Die tumor-assozierte /spezifische
mRNA, die bei der Analyse der gewonnenen Zellen nachgewiesen wird,
kann ausgewählt
sein aus Cytokeratin 18 (CK18), Cytokeratin 19 (CK19), Cytokeratin
20 (CK20)soiw andere Mitglieder der Cytokeratinfamilie, carcinoembryonic
antigen (CEA), ErbB2, ErbB3, Epithelial mucin-1, epithelial mucin-18,guanylyl-cyclase
C, Cdx-1, Cdx-2,
prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen
(PSA), Sucrose Isomaltase, Lactase, Carbonanhydrase, Tyrosinase,
Thyroglobulin, Tyrosin Hydroxylase, Neuronen-spezifisches Glycoprotein,Desmoplaktin
I, epitheliales glycoprotein 40 und gastrointestinal Tumor assoziiertes
Antigen.
Eine Verstärkung des Lyse-Efektes der
hypotonen Lösung
auf Zellfraktionen des Blutes ist durch Verwendung von spezifischen
Antikörpern
gegen die durch die hypotone Lyse zu zerstörenden Zellfraktionen zusammen
mit der Verwendung von Komplement möglich. Hierbei werden Zellen
wie z.B die Granulozyten durch Antikörper gegen Oberflächenantigene
wie z.B. CD123, CD125 und Komplement so vorgeschädigt, dass eine geringer hypotone
Lösung
(>100mosm/kg) in einem
folgenden Schritt reicht, um die Zielzellen zu lysieren. Voraussetzung
ist, dass die eingesetzten Antikörper
in der Lage sind, eine Komplement-Lyse auszulösen.
Antikörper, die keine Komplement-Lyse
vermitteln können,
können
aber in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
ebenfalls genutzt werden, um das System zu ergänzen. Solche Antikörper richten
sich gegen Oberflächenantigene
auf den Tumorzellen, binden daran und stabilisieren diese, so dass
die nachzuweisenden Tumorzellen auch bei sehr niedrigosmolalen Bedingungen
(< 15mosm/kg) intakt
bleiben.
Es ist klar, dass das erfindungsgemäße Verfahren
in Kombination mit bekannten Verfahren verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäße Kit zum Nachweis von Tumorzellen
in einer Probe umfasst eine hypotone Lösung, und Primer zum Nachweis
der Anwesenheit von mRNA kodierend für einen Marker für veränderte Zellen, wie
Tumorzellen. Dieser Marker kann eine Tumor-assoziierte/spezifische
mRNA sein. Wenn die Analyse den Nachweis von mRNA umfasst, enthält das Kit
vorteilhafterweise eine RNA-stabilisierende Lösung, umfassend ein hoch konzentriertes
chaotropes Salz.
Die im Kit enthaltene hypotone Lösung oder
Mittel zur Herstellung hypotoner Verhältnisse führen einer Osmolalität von kleiner
100 mosm/kg. Bevorzugt weist die hypotone Lösung eine Osmolalität von 30-60 mosm/kg
auf.
Das erfindungsgemäße Kit kann insbesondere in
der Routinediagnostik zur Diagnose von metastasierenden Krebs eingesetzt
werden. Dabei werden Tumorzellen in der Untersuchungsprobe nachgewiesen
ohne durch illegitime Expression des Markers durch Normalzellen
ein falsch positives Signal zu erhalten.
Im Folgenden wird die Erfindung mit
Beispielen näher
erläutert.
Diese Beispiele sollen aber in keiner Weise für die Erfindung einschränkend sein.