KR20150020190A - 운동 뉴런 관련 병태 치료용 lingo-2 길항제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 LINGO-2 길항제를 투여함으로써 근위축성 측삭 경화증을 포함한 운동 뉴런 생존 및 축삭 성장과 관련한 질병, 장애 또는 손상의 치료 방법을 제공한다.

Description

운동 뉴런 관련 병태 치료용 LINGO-2 길항제{LINGO-2 ANTAGONISTS FOR TREATMENT OF CONDITIONS INVOLVING MOTOR NEURONS}
운동 뉴런은 근육 기능을 조절하는 뉴런이다. 이들은 중추 신경계에 위치하며 근육을 조절하기 위해 중추 신경계 밖으로 뻗은 축삭을 가지고 있다. 정상적으로, 상부 운동 뉴런은 뇌에 위치하고 있으면서 척수에 위치한 하부 운동 뉴런으로 신호를 전달하고, 하부 운동 뉴런은 근육 활동을 지시한다. 근육은 물론 호흡, 연하, 말하기, 보행을 포함한 많은 활동에 중요하다. 따라서, 운동 뉴런의 손상 또는 운동 뉴런의 기능 감소는 치명적인 임상 효과를 가져올 수 있으며, 운동 뉴런 관련된 많은 병태가 확인되었다.
상기 병태는 다음 질병, 장애 및 손상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 근위축성 측삭 경화증(ALS), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근위축증(PMA), 유전성 경직성 양하지마비(HSP), X-연관 척수연수 근위축증(SBMA; 케네디병(Kenney disease)), 진행성 연수마비, 가연수 마비, 척수성 근위축증(SMA), 후소아마비 증후군(PPS), 헌팅턴병, 본태성 진전(ET), 운동 뉴런 질병, 마비, 및 파킨슨병. ALS는 이들 질병 중에 두드러지는 것 중 하나이며, 매년 100,000명 중 1 내지 2명의 발병률을 보인다. ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런 모두가 파괴되면서 매우 빠른 속도로 진행되는 질병으로 수의근 운동능력을 상실하게 된다.
ALS 및 그밖의 운동 뉴런 관련 질병에 대한 몇몇 질병 변경 치료법이 가능하며, 손상된 뉴런과 연관된 특정 나트륨 통로를 차단하는 릴루졸(Riluzole) 사용을 들 수 있다. 상기 치료법이 질병 과정을 지연시킬 수는 있지만, 현재 운동 뉴런 질병 치료법은 존재하지 않는다. 따라서, 운동 뉴런 축삭의 재생 및/또는 운동 뉴런의 생존을 촉진하는 치료법이 운동 뉴런의 불충분한 기능 관련 질병을 갖는 환자들에게 크게 요구되고 있다.
LINGO-2(FLJ31810, 고류신 반복(Leucine-rich repeat) 및 명역글로불린 유사 도메인 포함 nogo 수용체 상호작용 단백질 2, LERN3, 고류신 반복 뉴런 단백질 3, 고류신 반복 뉴런 단백질 6C, LRRN6C, PRO31993, 또는 UNQ9234)는 피질 뉴런 및 후근신경절(DRG) 뉴런에서 발현되며 운동 뉴런 생존 및 운동 뉴런 축삭 길이를 음성적으로 조절한다. LINGO-2 길항제는 생체 내 및 시험관 내 모두에서 운동 뉴런의 생존 및 성장을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 그의 유도체는 LINGO-2 길항제로 사용될 수 있다. 또한, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, 및 LINGO-2 영역에 해당하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 LINGO-2 길항제로 사용할 수 있다. 따라서, 본원에서는 운동 뉴런을 LINGO-2 길항제와 접촉하여 운동 뉴런의 생존 및 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시예에서는 다음을 포함한다(여기에서, 각 실시예는 대분자 "E"에 숫자를 붙어 나타낸다):
E1) C09 항체와 동일한 LINGO-2 에피토프에 특이적으로 결합 할 수 있는 단리된 결합 분자.
E2) E1에 있어서, 상기 결합 분자가 C09 항체가 LINGO-2에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 단리된 결합 분자.
E3) C09 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 하나 이상 포함하는 단리된 결합 분자.
E4) E1 내지 E3 중 임의의 한 실시예에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 결합 분자.
E5) E1 내지 E4 중 임의의 한 실시예에 있어서, C09의 중쇄 가변 도메인(VH) CDR1 내지 3을 포함하며, 하나 이상의 VH CDR이 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 결합 분자.
E6) E5에 있어서, C09의 VH CDR1 내지 3을 포함하는 결합 분자.
E7) E1 내지 E6 중 임의의 한 실시예에 있어서, C09의 경쇄 가변 도메인(VL) CDR1 내지 3을 포함하며, 하나 이상의 VL CDR이 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 것인 결합 분자.
E8) E7에 있어서, C09의 VL CDR1 내지 3을 포함하는 결합 분자.
E9) E1 내지 E4 중 임의의 한 실시예에 있어서, C09의 VH CDR1 내지 3 및 VL CDR1 내지 3을 포함하는 결합 분자.
E10) E1 내지 E9 중 임의의 한 실시예에 있어서, VH를 포함하며, 상기 VH가 C09의 VH와 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 결합 분자.
E11) E10에 있어서, 상기 VH가 C09의 VH와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자.
E12) E1 내지 E11 중 임의의 한 실시예에 있어서, VL을 포함하며, 상기 VL이 C09의 VL과 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
E13) E12에 있어서, 상기 VL이 C09의 VL과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자.
E14) E1 내지 E13 중 임의의 한 실시예에 있어서, VH 및 VL을 포함하며, 상기 VH 및 VL이 C09의 VH 및 VL과 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자.
E15) E14에 있어서, 상기 VH 및 VL이 C09의 VH 및 VL과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자.
E16) E1 내지 E15 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 LINGO-2 LRR 도메인에 결합하는 결합 분자.
E17) E16에 있어서, 상기 결합 분자가 LINGO-2의 LRR7 내지 LRR12 내 에피토프에 결합하는 결합 분자.
E18) E16에 있어서, 상기 결합 분자가 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 343 내 에피토프에 결합하는 결합 분자.
E19) E1 내지 E18 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408 또는 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500의 LINGO-2 영역에 결합하는 결합 분자.
E20) E1 내지 E19 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 인간, 랫트 및 마우스 LINGO-2에 결합하는 결합 분자.
E21) E1 내지 E19 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 인간 및, 랫트 LINGO-2에 결합하는 결합 분자.
E22) E1 내지 E19 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 인간 및 마우스 LINGO-2에 결합하는 결합 분자.
E23) E1 내지 E19 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 인간 LINGO-2에 결합하는 결합 분자.
E24) E1 내지 E23 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 운동 뉴런 생존을 촉진하는 결합 분자.
E25) E1 내지 E24 중 임의의 한 실시예에 있어서, 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 결합 분자.
E26) E1 내지 E25 중 임의의 한 실시예에 있어서, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 분화를 촉진하는 결합 분자.
E27) E1 내지 E26 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 수초화(myelination)를 촉진하는 결합 분자.
E28) E1 내지 E27 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 AKT 인산화를 촉진하는 결합 분자.
E29) E1 내지 E28 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 포함하는 결합 분자.
E30) E1 내지 E28 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 자연 발생 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 단일쇄 항체를 포함하는 결합 분자.
E31) 임의의 E1 내지 E28 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 결합 분자가 단일클론 항체를 포함하는 결합 분자.
E32) VH를 코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 VH가 C09의 VH CDR1 내지 3을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
E33) VH를 코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 VH가 C09의 VH와 동일하거나, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
E34) VL을 코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 VL이 C09의 VL CDR1 내지 3을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
E35) VL을 코딩하는 핵산을 포함하며, C09의 VL과 동일하거나, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
E36) E32 내지 E35 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E37) E36에 있어서, 상기 항체, 또는 항원 결합 분자가 C09 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E38) E32 내지 E37 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2 LRR 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E39) E32 내지 E37 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및, 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 LRR7-LRR12 내 에피토프에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E40) E32 내지 E37 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408 또는 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500의 LINGO-2 영역에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E41) E32 내지 E37 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 아미노산 202 내지 343 내 에피토프에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E42) E32 내지 E41 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간, 랫트 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E43) E32 내지 E41 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 랫트 LINGO-2에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드
E44) E32 내지 E41 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E45) E32 내지 E41 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LINGO-2에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E46) E32 내지 E45 중 임의의 한 실시예에 있어서,상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 생존을 촉진할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E47) E32 내지 E45 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH, 상기 VL, 또는 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
E48) E1 내지 E31의 임의의 한 실시예의 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E49) E32 내지 E48의 임의의 한 실시예의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
E50) VH를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 VL을 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 VH 및 VL이 C09의 VH 및 VL과 동일하거나, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
E51) VH를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 VL을 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 VH CDR 1 내지 3 및 VL CDR 1 내지 3이 C09의 VH CDR 1 내지 3 및 VL CDR 1 내지 3인 조성물.
E52) E50 또는 E51 중 임의의 한 실시예에 있어서, VH를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 VL을 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 벡터에 있는 조성물.
E53) E50 또는 E51 중 임의의 한 실시예에 있어서, VH를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 VL을 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 상이한 벡터에 있는 조성물.
E54) E50 내지 E53 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LINGO-2에 특이적으로 결합할 수 있는 조성물.
E55) E54에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 C09 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 조성물.
E56) 임의의 E50 내지 E55 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2 LRR 도메인에 결합할 수 있는 조성물.
E57) E50 내지 E55 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 LRR2-LRR7 내 에피토프에 결합할 수 있는 조성물.
E58) E50 내지 E55 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408 또는 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500의 LINGO-2 영역에 결합할 수 있는 조성물.
E59) E50 내지 E55 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 아미노산 202 내지 343 내에피토프에 결합할 수 있는 조성물.
E60) E50 내지 E59 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간, 랫트 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E61) E50 내지 E59 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 랫트 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E62) E50 내지 E59 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E63) E50 내지 E59 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E64) E50 내지 E63 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 생존을 촉진할 수 있는 조성물.
E65) E50 내지 E63 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진할 수 있는 조성물
E66) E32 내지 E47의 임의의 한 실시예의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
E67) VH 폴리펩트드 및 VL폴리펩티드를 포함하며, 상기에서 VH 및 VL이 C09의 VH 및 VL과 동일하거나, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
E68) VH 폴리펩트드 및 VL폴리펩티드를 포함하며, 상기에서 VH CDR 1 내지 3 및 VL CDR 1 내지 3이 C09의 VH CDR 1 내지 3 및 VL CDR 1 내지 3인 조성물.
E69) E67 또는 E68에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LINGO-2에 특이적으로 결합할 수 있는 조성물.
E70) E69에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 C09 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 조성물.
E71) E67 내지 E70 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 및 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2 LRR 도메인에 결합할 수 있는 조성물.
E72) E67 내지 E70 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 LRR7 내지 LRR12 내 에피토프에 결합할 수 있는 조성물.
E73) E67 내지 E70 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408 또는 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500의 LINGO-2 영역에 결합할 수 있는 조성물.
E74) E67 내지 E70 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LINGO-2의 아미노산 202 내지 343 내 에피토프에 결합할 수 있는 조성물.
E75) E67 내지 E74 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간, 랫트 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E76) E67 내지 E74 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 랫트 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E77) E67 내지 E74 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 및 마우스 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E78) E67 내지 E74 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LINGO-2에 결합할 수 있는 조성물.
E79) E67 내지 E78 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 생존을 촉진할 수 있는 조성물.
E80) E67 내지 E78 중 임의의 한 실시예에 있어서,상기 VH 또는 상기 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진할 수 있는 조성물.
E81) E32 내지 E48 중 임의의 한 실시예의 폴리뉴클레오티드, E49 벡터, E50 내지 E65 또는 E67 내지 E80 중 임의의 한 실시예의 조성물, 또는 E66 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포.
E82) E81 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 항-LINGO-2 결합 분자의 제조 방법.
E83) E82의 방법으로 제조된 항-LINGO-2 결합 분자.
E84) (a) 시료를 E1 내지 E31 또는 E83 중 임의의 한 실시예의 결합 분자와 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 시료 내 결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 LINGO-2 발현을 검출하는 방법.
E85) E1 내지 E31 또는 E83 중 임의의 실시예의 결합 분자, E32 내지 E48 중 임의의 실시예의 폴리뉴클레오티드, E49의 벡터, E50 내지 E65 또는 E67 내지 E80중 임의의 실시예의 조성물, E66의 폴리펩티드, 또는 E81의 숙주 세포 및 (b) 담체를 포함하는 약학 조성물.
E86) 서열 번호 2의 폴리펩티드의 가용성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드가 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 단리된 핵산.
E87) 서열 번호 2의 폴리펩티드의 가용성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드가 운동 뉴런의 축삭 성장의 억제를 감소시켜 생존을 촉진하는 단리된 핵산.
E88) E86 또는 E87에 있어서, 서열 번호 2 아미노산 1 내지 500으로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
E89) E88에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 참조 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산서열을 포함하는 핵산.
E90) E88에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 참조 아미노산 서열과 동일한 아미노산서열을 포함하는 핵산.
E91) E86 내지 E90중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드에 융합된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 핵산.
E92) E91에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드가 면역글로불린, 혈청 알부민, 표적화 폴리펩티드, 리포터 폴리펩티드, 정제를 용이하게 하는 폴리펩티드, 상기 임의의 폴리 펩티드의 단편, 및 상기 폴리펩티드 또는 단편의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산.
E93) E92에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc, 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편, 히스티딘 태그, 및 운동 뉴런 당단백질 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산.
E94) 약학적으로 허용가능한 담체 및 E86 내지 E93 중 임의의 한 실시예의 핵산을 포함하는 조성물.
E95) E86 내지 E93 중 임의의 한 실시예의 핵산을 포함하는 벡터.
E96) E95에 있어서, 상기 핵산이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
E97) E96에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 벡터.
E98) E97에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
E99) E86 내지 E93 중 임의의 한 실시예의 핵산 및 E95 내지 E98 중 임의의 한 실시예의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E100) E99에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
E101) E86 내지 E93 중 임의의 한 실시예의 핵산에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
E102) E101에 있어서, 상기 폴리펩티드가 합성 제조되는 폴리펩티드.
E103) E101 또는 E102에 있어서, 상기 폴리펩티드가 중합체에 컨쥬게이트된 폴리펩티드.
E104) E103에 있어서, 상기의 중합체가 폴리알킬렌 글리콜, 당중합체, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
E105) E104에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 폴리펩티드.
E106) E103 내지 E105 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드가 1, 2, 3 또는 4 중합체에 컨쥬게이트 폴리펩티드.
E107) E106에 있어서, 중합체의 전체 분자량이 20,000 Da 내지 40,000 Da.인 폴리펩티드.
E108) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E109) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 운동 뉴런의 축삭 성장의 억제를 감소시킬 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E110) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 희소돌기아교세포의 분화를 촉진할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E111) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 수초화를 촉진할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E112) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, AKT 인산화를 촉진할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E113) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 결합단편이 LINGO-2 LRR 도메인에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E114) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 결합단편이 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 343 내 에피토프에 결합하는 항체 또는그의 항원 결합 단편.
E115) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 결합단편이 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408 또는 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500의 LINGO-2 영역에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E116) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 결합단편이 LINGO-2 LRRNT 또는 LRRCT 도메인에 결합하는 항체 또는그의 항원 결합 단편.
E117) E101 또는 E102의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 항체 또는 항체 결합단편이 LINGO-2 면역글로불린에 결합하는 항체 또는그의 항원 결합 단편.
E118) 약학적으로 허용가능한 담체 및 E102 내지 E107 중 임의의 한 실시예의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
E119) 약학적으로 허용가능한 담체 및 E99또는 E100의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
E120) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머(aptamer); 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량과 운동 뉴런을 접촉하는 단계를 포함하는, 상기 운동 뉴런의 생존을 촉진하기 위한 방법
E121) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량과 운동 뉴런을 접촉하는 단계를 포함하는, 상기 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법.
E122)(i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 운동 뉴런의 생존을 촉진하기 위한 방법.
E123) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법.
E124) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 운동 뉴런의 생존과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
E125) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 운동 뉴런의 축삭 성장과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
E126) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 희소돌기아교세포 사멸 또는 분화의 결여와 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
E127) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 탈수초화(demylination) 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
E128) (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드; (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드; (iv) LINGO-2 앱타머; 및 (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 수초형성장애(dysmyelination) 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법.
E129) E120 내지 E128 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 가용성 LINGO-2 폴리펩티드인 방법.
E130) E129에 있어서, 상기LINGO-2 길항제가 E120 내지 E128 중 임의의 한 실시예의 폴리펩티드를 포함하는 방법.
E131) E129에 있어서, 상기 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 (i) LINGO-2 Ig 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, (ii) LINGO-2 LRR 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, 및 (iii) 상기 LINGO-2 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 영역을 포함하는 방법.
E132) E130 또는 E131에 있어서, 상기 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 (i) LINGO-2 막횡단 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, (ii) LINGO-2 세포내 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, 및 (iii) LINGO-2 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 영역 결여된 방법.
E133) E120-E128 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
E134) E133에 있어서, 상기 LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 E1-E28 및 E80 중 임의의 한 실시예의 결합 분자인 방법.
E135) E120-E128 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
E136) E135에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드는 (i) 안티센스 폴리뉴클레오티드; (ii) 리보자임; (iii) 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (iv) 작은 헤어핀 RNA(shRNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
E137) E120 내지 E128 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제r가 LINGO-2 앱타머를 포함하는 방법.
E138) E122 내지 E127 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 포유동물이 운동 뉴런 관련 질병, 장애, 또는 손상으로 진단받은 방법.
E139) E124, E125, 또는 E138 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 손상은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근위축증(PMA), 유전성 경직성 양하지마비(HSP), X-연관 척수연수 근위축증(SBMA; 케네디병), 진행성 연수마비, 가연수 마비, 척수성 근위축증(SMA), 후소아마비 증후군(PPS), 헌팅턴병, 본태성 진전(ET), 운동 뉴런 질병, 마비, 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
E140) E139에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 손상이 근위축성 측삭 경화증(ALS)인 방법.
E141) E120 내지 E140 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제는 볼루스 주사 또는 지속 주입(chronic infusion)에 의해 투여하는 방법.
E142) E120 내지 E140 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제는 중추 신경계에 직접 투여되는 방법.
E143) E120 내지 E140 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제는 전신적으로 투여되는 방법.
E144) E120 또는 E121에 있어서, (a) 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 상기 LINGO-2 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 상기 운동 뉴런을 형질감염시키는 단계, 및 (b) 상기 LINGO-2 길항제의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하는 방법
E145) E122-E143 중 임의의 한 실시예에 있어서, (a) 발현 조절 서열에 작동가능한 연결을 통해 상기 LINGO-2 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물에게 투여하는 단계, 및 (b) 상기 LINGO-2 길항제의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하는 방법.
E146) E145에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터로서 투여되는 방법.
E146) E145에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
E147) E146에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터 및 폭스바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
E148) E145 내지 E147 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 투여 단계는 (a) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 LINGO-2 길항제를 발현하는 배양된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포를 상기 포유동물에게 도입하여 상기 LINGO-2 길항제가 상기 포유동물에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
E149) E148에 있어서, 상기 배양된 숙주 세포는 치료받을 포유동물로부터 유래되는 방법.
E150) E146 내지 E149 중 임의의 한 실시예에 있어서, 상기 벡터는 국소 투여, 안내투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 피하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 방법.
도 1 랫트 조직의 Q-PCR. LINGO-2는 성체 쥐의 뇌 조직에서 높이 발현된다. LINGO-2 mRNA 발현은 Q-PCR를 수행하여 정량하였다.
도 2 P6 마우스 조직의 Q-PCR. LINGO-2는 생후 6일령(P6) 마우스 뇌 및 척수 조직에서 높이 발현된다. LINGO-2 mRNA 발현은 Q-PCR를 수행하여 정량하였다.
도 3 랫트 뉴런 세포군의 Q-PCR. LINGO-2는 피질뉴런 및 후근신경절(DRG)에서 높이 발현된다. LINGO-2 mRNA 발현은 Q-PCR를 수행하여 정량하였다.
도 4 LINGO-2-Fc 및 항-LINGO-2 항체는 운동 뉴런 생존을 촉진한다. 인간 운동 뉴런은 아비산나트륨으로 30분간 처리하고 인간 IgG(대조군), 가용성 LINGO-2-Fc, 또는 항-LINGO-2 항체 C09 Fab의 존재 하에서 회복하도록 하였다. 인큐베이션 후, 운동 뉴런을 항-βIII 튜불린 및 항-뉴로필라멘트를 이용한 면역세포화학법으로 염색하였다.
도 5 LINGO-2-Fc은 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다. 배아 16일령(E16) 랫트 척수의 운동 뉴런을 니코덴즈 기울기 원심분리에 의해 단리시켰다. 단리된 운동 뉴런은 아비산나트륨으로 30분간 처리하고 인간 IgG 또는 가용성 LINGO-2-Fc 존재 하에서 회복하도록하였다. 인큐베이션 후, 운동 뉴런을 항-뉴로필라멘트를 이용한 면역세포화학법으로 염색하였다.
도 6 LINGO-2 발현 수준은 SODG93A 마우스 내에서 상향 조절된다. 65일령의 양생형 및 SODG93A 마우스 내의 LINGO-2 RNA 수준은 제자리 혼성화를 이용하여 측정하였다. 각 유형의 마우스의 배쪽뿔(ventral horn) 부위 내 LINGO-2 양성 세포수를 계수하였다. 그래프는 LINGO-2 양성 세포 수(왼쪽) 및 LINGO-2 양성 세포 백분율(오른쪽)을 나타낸다.
도 7 항-LINGO-2 항체는 AKT 인산화를 상승 조절한다. AKT 인산화 수준은 대조군 시료 및 항-LINGO-2 항체 C09 또는 대조군 항체로 처리된 시료 내 웨스턴 블로트로 측정하였다.
도 8 항-LINGO-2 항체는 희소돌기아교세포 분화를 촉진한다. 수초 결합 당단백질(MAG) 및 수초 염기 단백질(MBP)의 수준은 대조군 시료 및 항-LINGO-2 항체 C09로 처리된 시료 내에서 1, 3 또는 10 ㎍/㎖의 농도로 측정하였다.
I. 정의
그외에 정의되어 있지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 해당하는 기술자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 상충되는 경우에는, 본 출원서가 정의를 포함하여 제한할 것이다. 문맥에서 요구되지 않는 경우, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 각각의 개별 문헌 또는 특허 출원이 참고에 포함되었다고 상세하게 개별적으로 나타내었으나, 본원에서 언급된 모든 발행물, 특허 및 그외 참고 문헌들은 사실상 전체로 참고에 포함된다.
본원에 기재된 방법과 유사하거나 등가의 방법 및 재료는 실제로, 또는 본 발명을 시험하는 데에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 아래에 기재된다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시하고자 하는 것이고 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명 및 청구항에서 명백해질 것이다.
본 발명을 더 명시하기 위해서, 하기 용어 및 정의를 제공한다.
"하나의"("a" 또는 "an") 실체라는 용어는 하나 이상의 그 실체를 의미한다는 것에 주목하여야 한다; 예를 들어, "하나의 면역글로불린 분자"는 하나 이상의 면역글로불린 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, "하나의"("a" 또는 "an"), "하나 이상의," "적어도 1"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐 아니라 복수의 핵산을 포함하고자 하며, 단리된 핵산 분자 또는 구조물(construct), 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 하나 이상의 임의의 핵산 세그먼트, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 타고난 환경으로 부터 제거되어진 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 나타낸다. 예를 들어, 항-LINGO-2 결합 분자를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 벡터에 포함된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가적인 예에는 이종의 재조합 숙주 세포 내에 유지된 폴리뉴클레오티드 또는 용액 내 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자는 생체 내 또는 시험관 내 폴리뉴클레오티드의 RNA 전사체를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 제조된 상기 분자를 더 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 인자와 같은 조절 인자일 수도 있거나 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이들은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역들의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역들로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 안정성 또는 다른 목적을 위해 하나 이상의 변형된 염기, 또는 변형된 DNA 또는 RNA 백본(backbone)을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이티드 염기 및 이노신과 같은 특이한 염기를 포함한다. DNA 또는 RNA에 다양한 변형이 만들어 질수 있다. 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈을 구성하는 핵산의 부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있다. 그러나, 임의의 측접 서열(flanking sequences), 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부분이 아니다. 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구조물, 예를 들어 단일 벡터에 존재하거나, 별도의 폴리뉴클레오티드 구조물, 예를 들어 별도의 (상이한) 벡터에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 개별적으로 코딩할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 항-LINGO-2 길항제를 코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종의 코딩 영역, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩할 수 있다. 이종의 코딩 영역은 분비 신호 펩티드 또는 이종의 기능성 도메인과 같이 특정 요소를 제한없이 포함한다.
특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 보통 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연관된(operably associated) 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 인자를 포함할 수 있다. 작동가능한 연관은 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드의 코딩 영역이 유전자 산물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 조절 하에 놓이도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되어 있는 경우이다. 프로모터 기능이 유도되어 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA가 전사되는 경우, 및 두 DNA 단편들 사이에 연결의 성질이 발현 조절 서열의 유전자 산물 발현 지시 능력을 방해하지 않거나 DNA 주형이 전사되는 능력에 간섭하지 않는 경우, 두개의 DNA 단편(예를 들어, 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 연관된 프로모터)은 "작동 가능하게 연관되어" 있다. 따라서, 프로모터 영역이 핵산의 전사에 영향을 줄 수 있다면 프로모터는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 연관되어 있는 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 실질적인 DNA 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터가 될 수 있다. 프로모터 외에 다른 전사 조절 인자, 예를 들어 인핸서, 작동인자, 억제인자, 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시되어 있다.
다양한 전사 조절 영역은 당업자들에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 사이토메갈로 바이러스의 프로포터 및 인핸서 세그먼트(인트론-A 관련 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(Simian Virus 40)(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma virus)), 척추동물 세포 내에서 기능을 하는 전사 조절 영역을 제한 없이 포함한다. 다른 전자 조절 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같이 척추동물 유전자에서 유래한 것들, 그외에 진핵세포 내 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 또다른 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서, 그외에 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도성 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 전사 조절 인자는 당업자들에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 코돈 및 피코르나바이러스 유래 인자(특히, 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또는 CITE 서열로 나타냄).
다른 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA) 형태이다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가적인 코딩 영역과 연관될 수 있다. 신호 가설에 의하면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 신호 펩티드 또는 선도 서열을 가지는데, 이들은 조면소포체를 통해 성장하는 단백질 사슬의 분비가 시작되면 성숙 단백질로부터 절단된다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호서열을 가지며, 이들은 완전한 또는 "전장"의 폴리펩티드로부터 절단되어 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생산한다는 것을 알고 있다. 특정 실시예에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드가 사용되며, 작동가능하게 연관된 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 능력을 보유한 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종의 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 선도 서열은 인간 조직 플라스미노젠 활성화 인자(TPA) 또는 마우스의 β-글루쿠로니다제의 선도 서열로 대체될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드" 뿐 아니라 복수의 "폴리펩티드를 포함하고자 하며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산)로 구성된 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 임의의 아미노산 사슬을 나타내며, 특정 길이의 산물을 나타내지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 언급할 때 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 중 어떤 용어를 대신하거나 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 폴리펩티드의 발현 후 변형 산물을 나타내며, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비자연 발생적 아미노산에 의한 변형을 제한 없이 포함한다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으나, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되지는 않는다. 이들은 또한 화학 합성을 포함한 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
폴리펩티드는 크기가 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 또는 2,000 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 반드시는 아니지만 정해진 3차원 구조를 가질 수있다. 정해진 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드를 접힌 폴리펩티드라고 나타내고, 정해진 구조를 갖지 않고 오히려 다양한 구조를 채택하는 폴리펩티드는 접히지 않은 폴리펩티드로 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예를 들어 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 1개 이상의 탄수화물이 연결된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체는 자신의 자연 환경 내에 존재하지 않는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어 단리된 폴리펩티드는 그의 본래의 환경 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 임의의 적합한 기술에 의해 분리되고, 분획화되거나, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제되어진 폴리펩티드가 천연 또는 재조합 형태이든, 숙주 세포 내에서 발현되어 재조합적으로 생산된 폴리펩티드는 단리되어진 것으로 간주된다.
폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 이소에스테르에 의해 서로 연결된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 아미노산 20 가지 유전자-코딩되는 아미노산외의 아미노산(예를 들어, 비자연 발생 아미노산)를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적인 처리 과정, 예를 들어 번역 후 처리 과정 또는 당업계에 잘 알려진 화학 변형법에 의해 변형될 수 있다.
LINGO-2 길항제를 나타낼 때, 용어 "단편," "변이체" "유도체" 및 "유사체"는 운동 뉴런의 생존을 촉진하는 임의의 길항제 분자를 포함한다. 또한, 상기 용어는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하느 임의의 길항제 분자를 포함한다. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 LINGO-2 단백질 가수분해 단편, 결실 단편 및 특히, 동물에 전달될 때 작용 부위에 보다 쉽게 도달하는 단편을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 단편은 선형뿐 아니라 3차원 에피토프도 포함하여 천연 폴리펩티드의 항원성 또는 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 임의의 일부위을 포함한다. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 상기에 기재한 단편들을 포함하는 변이체 LINGO-2 영역을 포함할 수 있으며, 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 변이형은 대립유전자 변이체와같이 자연적으로 발생할 수 있다. "대립유전자 변이체"는 생물체의 염색체에 주어진 유전자좌를 차지하고 있는 다른 형태를 나타낸다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). 비자연 발생 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이 유발 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가를 포함할 수 있다. LINGO-2 길항제는 또한 유도체 분자를 포함 수 있다. 예를 들어, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드에서 발견되지 않는 또다른 특징을 나타내도록 변경된 LINGO-2 영역을 포함할수 있다. 실시예는 융합 단백질 및 단백질 컨쥬게이트를 포함한다.
보존적 치환은 하기 군 내 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린, 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루타민산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인, 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 무극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함한다. 상기에 언급한 극성, 염기성 또는 산성 군 내 구성원을 동일 군 내의 또 다른 구성원으로 치환하는 것은 보존적 치환으로 간주될 수 있다.
비보존적 치환은 (i) 양전성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His 또는 Lys)로 음전성 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)를 치환하거나, 반대의 경우, (ii) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)로 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)를 치환하거나, 반대의 경우, (iii) 시스테인 또는 프롤린으로 임의의 다른 잔기를 치환하거나, 반대의 경우, 또는 (iv) 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Val, Ile, Phe 또는 Trp)로 작은 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기(예를 들어, Gly)를 치환하거나 반대의 경우를 포함한다.
두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 용어 "퍼센트 서열 동일성"은 두 서열을 최적으로 정렬하기 위해 도입되어야만 하는 추가 또는 결실(예를 들어, 갭)을 고려하여 비교 창에서 서열에 의해 공유되는 동일하게 일치된 위치의 수를 나타낸다. 일치된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 및 참조 서열 모두에서 나타난 위치이다. 표적 서열 내에 표시된 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문에 계수되지 않는다. 마찬가지로, 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산은 계수되지만 참조 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 계수되지 않기 때문에 참조 서열 내에 나타낸 갭은 계수되지 않는다.
서열 동일성의 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 서열 모두에서 나타나는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 전체 위치의 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하여 계산된다. 쉽게 이용가능한 온라인 또는 다운로드용 소프트웨어를 사용하여 두 서열 사이의 서열을 비교하고 퍼센트 서열 동일성을 결정할 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 공급원으로 부터 이용가능하고, 단백질 및 뉴클레오티드 서열 모두의 정렬에 이용가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기에 적합한 프로그램 중 하나는 바이오테크놀러지 정보용 미국 정부 기관 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 프로그램 BLAST suite의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN는 핵산 서열을 비교하는 데 사용되고 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 적합한 다른 프로그램은 예를 들어, Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher(EMBOSS suite of bioinformatics program의 일부)이 있으며, 또한 EBI(European Bioinformatics Institute)(www.ebi.ac.uk/Tools/psa)로부터도 이용 가능하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정열된 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내에 상이한 영역은 각각 자신의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 가까운 소수 첫째자리 수에 반올림하는 것에 주의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반내림하는 한편, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림한다. 또한, 길이값은 항상 정수여야 한다는 것에 주의한다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성을 계산하기 위한 서열 정렬의 생성은 1차 서열 자료에 의해 처리된 두개의 서열-서열 비교에만 제한되는 것이 아니라는 것을 인식할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 얻을 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성할 수 있는 한가지 가능한 프로그램은 www.clustal.org에서 이용가능한 ClustalW2이다. 적합한 다른 프로그램은 www.drive5.com/muscle/에서 이용가능한 MUSCLE이며, ClustalW2 및 MUSCLE은 예를 들어, EBI로부터 선택적으로 이용가능한다.
서열 정렬은 구조적인 자료(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적인 자료(예를 들어, 돌연변이 위치),또는 계통발생학적 자료와 같은 이종 공급원으로부터의 자료와 서열 자료를 통합하여 얻어질 수 있다는 것도 인식될 것이다. 이종의 자료를 통합하여 다중 서열 정렬을 얻는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용가능한 T-Coffee이며, 대안적으로 EBI로부터 이용가능한다. 계산된 퍼센트 서열 동일성에 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동적으로 큐레이트(curate) 될 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다.
항-LINGO-2 항체 또는 항체 폴리펩티드를 나타낼 때, 용어 "단편," "변이", "유도체," "유사체"는 대응하는 항체 또는 항체 폴리펩티드의 항원 결합 특성의 최소한 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 폴리펩티드 단편은 단백질 분해 단편, 결실 단편, 본원의 다른 부분에서 논의할 특이적 항체 단편을 포함한다. 항원과 관련하여 특별히 언급되지 않는다면, 본원에서 사용된 "그의 단편"은 면역특이적 단편, 즉 항원 특이적 단편을 나타낸다. 항-LINGO-2 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체는 상기에 기재된 단편을 포함하고, 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인한 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함한다. 변이체는 자연 발생하거나 비자연적으로 발생할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가를 포함할 수 있다. 또한, 변이체 폴리펩티드는 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 항-LINGO-2 항체 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 작용측기의 반응에 의해 화학적으로 유도된 하나 이상의 잔기를 갖는 "서브젝트(subject) 폴리펩티드"를 언급한다. 또한, 20가지 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체를 한개 이상 포함하는 펩티드도 "유도체"에 포함된다. 예를 들어, 프롤린이 4-히드록프롤린로 치환될 수 있으며; 리신은 5-히드록시리신으로 치환될 수 있으며; 히스티딘은 3-메틸히스티딘으로 치환될 수 있으며; 세린은 호모세린으로 치환될 수 있으며; 리신은 오르니틴으로 치환될 수 있다. 항-LINGO-2 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 참조 항체 또는 항체 폴리펩티드에서 발견되지 않은 추가적인 특징을 나타내도록 변경될 수 있다.
"폴리펩티드 단편"은 폴리펩티드의 짧은 아미노산 서열을 나타낸다. 단백질 단편은 "프리스탠딩(free-standing)"이거나, 단편이 일부 영역을 형성하는 좀 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 폴리펩티드 대표적인 예는 예를 들면 약 5 아미노산, 약 10 아미노산, 약 15 아미노산, 약 20 아미노산, 약 30 아미노산, 약 40 아미노산, 약 50 아미노산, 약 60 아미노산, 약 70 아미노산, 약 80 아미노산, 약 90 아미노산, 약 100 아미노산, 약 200 아미노산, 약 300 아미노산, 약 400 아미노산, 약 500 아미노산, 약 600 아미노산, 및 약 1,000 아미노산의 길이를 포함하는 단편을 포함한다.
"결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 나타낸다. 한 실시예에서, 결합 분자는 LINGO-2, 예를 들어 전장의 LINGO-2 또는 성숙 LINGO-2에 특이적으로 결합한다. 또다른 실시예에서, 결합 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
항-LINGO-2 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 유도체는 본원에 기재되어 있다. 자연 발생 항체와 같은 전체 크기의 항체를 구체적으로 언급하지 않는 경우, 용어 "항-LINGO-2 항체"는 전체 크기의 항체뿐 아니라 상기 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예를 들어 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작된 항체 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 단편을 포함한다.
특정 실시예에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 대안적으로, 돌연변이가 예를 들어 포화 돌연변이 유발에 의해서 코딩 서열의 전체 또는 일부분에 무작위적으로 도입될 수 있으며, 생성된 변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여 활성(예를 들어, LINGO-2 폴리펩티드, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 또는 인간, 영장류 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합에 결합하는 능력)을 보유하는 변이체를 확인할수 있다. 또한, "인간" 또는 "완전한 인간" 항체의 상기 변이체(또는 그의 유도체)도 "최적화"되거나 "항원 결합에 최적화"된 인간 또는 완전한 인간 항체로 나타낼 수 있으며, 항원에 대한 친화도가 향상된 항체를 포함할 수 있다.
한 실시예에서, LINGO-2 길항제는 "항체" 또는 "면역글로불린" 분자, 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작된 항체 분자 또는 항체 분자에 유사한 방식으로 결합하는 단편이다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 최소한 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 보통 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물계에서 면역글로불린 기본 구조는 비교적 잘 이해되고있다. 예를 들어 문헌(Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988))을 참고한다.
자연 발생 항체에서, 각 항원 결합 도메인 내에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성환경에서 3차 배열을 취하면서 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치되어지는 인접하지 않은 짧은 아미노산 서열이다. "프레임워크(framework)" 영역으로 나타내는 항원 결합 도메인 내 잔여 아미노산은 더 적은 분자간 가변성을 보인다. 프레임워크 영역은 대개 β-시트를 취하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 경우에 따라 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄간, 비공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR 배치를 제공하는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 데 역할을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원의 에피토프에 상보적인 표면을 결정한다. 상기 상보적인 표면은 항체와 그의 동족(cognate) 에피토프의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산이 정확하게 정의되어 있기 때문에, 상기 아미노산은 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services,(1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), 전체가 본원에 참고로 포함됨]을 참고한다.
기술 분야에서 사용되고/되거나 수용되는 용어 정의가 두가지 이상이 경우, 본원에서 사용된 용어의 정의는 명백히 반대로 기술되지 않는다면 상기 모든 의미를 포함하고자 한다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 인접하지 않는 항원 결합 부위를 기재하는 데에 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 상기 특정 영역은 본원에서 참고로 포함된 카밧[Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"], 및 클로티아 및 레스크[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 의해 기재되었으며, 상기에서 서로를 비료해 볼 때 정의는 아미노산 잔기가 중복되거나 부분집합이다. 그렇지만, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 나타내는데 어떤 정의를 적용할 지는 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있도록 의도된다. 상기에 인용된 각 참고에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기는 하기 표 1에 비교하여 기재되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR 서열 및 크기에 따라 다르다. 당업자들은 어느 아미노산 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열로 주어진 특정 CDR을 포함하는 지를 결정할 수 있다.
CDR 정의1
카밧 클로티아
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링은 카밧 등에 의해 제시된 넘버링 방법에 따른다(하기 참고).
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열을 위한 넘버링 시스템을 정의 하였다. 당업자는 서열 자체외에 임의의 실험 자료에 의존하지 않고 "카밧 넘버링"을 가변 서열에 분명하게 부여할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카밧 넘버링"은 카밧이 제시한 넘버링 시스템(Kabat et al. U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983))을 나타낸다. 명시되어 있지 않은 경우, LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 변이체 또는 유도체 내 특정 아미노산 잔기 위치 번호의 언급은 카밧 넘버링 시스템에 따른다.
한 실시예에서, 항원 결합 분자는 참조 항체 분자의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른실시예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자의 2개 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 실시예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자의 3개 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 실시예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자의 4개 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 실시예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자의 5개 이상의 CDR을 포함한다. 또다른 실시예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자의 6개 이상의 CDR을 포함한다. 특정 실시예에서, 참조 항체 분자는 C09이다. 서브젝트 항원 결합 분자 내에 포함될 수 있는 하나 이상의 CDR을 포함하는 전형적인 항체 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 전형적인 분자는 본원에 기재된다.
자연 발생 항체와 같이 전체 크기의 항체를 구체적으로 나타내지 않는 경우, 용어 "항-LINGO-2 항체"는 전체 크기의 항체뿐 아니라 상기 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예를 들어 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작된 항체 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 단편을 포함한다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다중클론, 단일클론, 다중특이성, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 디설파이드 연결된 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에 개시된 결합 분자에 대한 항-Id 항체를 포함하여)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
단쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 가변 영역 단독 또는 다음의 전체 또는 일부와 함께 포함될 수 있다; 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한, 본원에서는, 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인과 가변 영역의 임의의 조합을 포함하는 항원 결합 단편이 제공된다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의의 조류 및 포유동물을 포함한 동물 기원일 수 있다. 특정 실시예에서, 항체는 인간, 마우스, 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭의 항체이다. 또 다른 실시예에서, 가변 영역은 (예를 들어, 상어 유래의) 기원에서 연골어류일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하나 이상의 CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중부 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함한다. 예를 들어, 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부분, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부분, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 결합 폴리펩티드는 적어도 CH2 도메인 일부분(예를 들어, CH2 도메인의 전체 또는 부분)이 결여될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 상기 도메인들(예를 들어, 중쇄 부분)은 자연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다르게 변형될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 결합 폴리펩티드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로 부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로 부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자, 부분적으로 IgG3 분자로 부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 G1 분자, 부분적으로 IgG4 분자로 부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 전형적으로, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인의 적어도 하나를 포함한다.
본원에 개시된 항-LINGO-2 항체, 또는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 그의 변이체는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원, 예를 들어, 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, 전장 또는 성숙 LINGO-2)의 에피토프 또는 일부분에 관하여 기재되고, 구체화될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용을 하는 표적 폴리펩티드의 일부분이 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"이다. 표적 폴리펩티드는 단일의 에피토프를 포함할 수 있으나, 통상적으로 2개 이상의 에피토프를 포함하고, 항원의 크기, 구조, 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 표적 폴리펩티드 상의 "에피토프"는 비폴리펩티드 인자이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다는 것에 주의한다.
항체를 위한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5 아미노산으로 생각된다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 7 이상, 9 이상, 또는 약 15 내지 30 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. CDR은 3차 구조의 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식하기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산는 인접해 있을 필요는 없으며, 일부 경우에는 심지어 동일 펩티드 사슬에 존재할 수 없다. 항-LINGO-2 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 LINGO-2의 인접하거나 인접하지 않는 아미노산 서열을 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 또는 약 15 내지 약 30 포함할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 일반적으로 항체가 그의 항체 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합한다는 것과 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 약간의 상보성을 수반한다 것을 의미한다. 상기 정의에 따라, 항체가 무작위의, 관련되지 않은 에피토프에 결합할 때보다 쉽게 그의 항원 결합 도메인을 통해 자기 에피토프에 결합할 때, 항체는 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 한정하는 데에 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 주어진 에피토프에 더 높은 특이성을 갖는다고 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 비해 에피토프 "C"에 더 높은 특이성을 가지고 결합한다라고 할 수 있다.
"우선적으로 결합한다"는 항체가 관련된, 비슷한, 동종의, 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 관련된 에피토프와 교차 반응할 수 있다고 하더라도 관련 에피토프보다 주어진 에피토프에 더 잘 결합할 것이다.
비제한적인 실시예를 통해, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(KD)보다 작은 KD 로 제1 에피토프에 결합한다면, 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 실시예에서, 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 10배 이상 작은 친화도를 갖는 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 실시예에서, 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 100배 이상 작은 친화도를 갖는 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다.
또 다른 비제한적 실시예에서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 오프 레이트(off-rate)(KOFF)보다 작은 KOFF 로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 실시예에서, 제2 에피토프에 대한 항체의 KOFF보다 10배 이상 작은 친화도를 갖는 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 실시예에서, 제2 에피토프에 대한 항체의 KOFF보다 100배 이상 작은 친화도를 갖는 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주될 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, LINGO-2, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 또는 인간, 영장류 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합) 또는 그의 단편 또는 변이체에 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 l0-3 sec-1보다 작거나 같은 오프 레이트(k(off))로 결합한다고 할 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, LINGO-2, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 또는 인간, 영장류 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합) 또는 그의 단편 또는 변이체에 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1보다 작거나 같은 오프 레이트(k(off))로 결합한다고 할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, LINGO-2, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 또는 인간, 영장류 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합) 또는 그의 단편 또는 변이체에 5103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1보다 크거나 같은 온 레이트(k(on))로 결합한다고 할 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, LINGO-2, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 또는 인간, 영장류 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합) 또는 단편 또는 그의 변이체에 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1보다 크거나 같은 온 레이트(k(on))로 결합한다고 할 수 있다.
항체가 참조 항체의 주어진 에피토프와의 결합을 약간 차단하는 정도로 주어진 에피토프에 우선적으로 결합한다면, 항체는 참조 항체의 주어진 에피토프와의 결합을 경쟁적으로 억제한다라고 한다. 경쟁적 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 분석법에 의해 결정될 수 있다. 항체는 참조 항체의 주어진 에피토프와의 결합을 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상 경쟁적으로 억제한다라고 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 면역글로불린 분자의 CDR과 각 에피토프의 결합 세기의 단위를 나타낸다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28)]을 참고한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합활성(avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원 사이 복합체의 전체 안정성, 즉 항원과 면역 글로블린과 혼합물의 기능적 결합력을 나타낸다. 예를 들어, 문헌(Harlow, 29-34 페이지)을 참고한다. 결합활성은 특이적 에피토프와 집단 내의 개별 면역글로불린 분자의 친화도, 및 면역글로불린과 항원의 원자가 모두와 관련된다. 예를 들어, 2가 단일클론 항체와, 중합체와 같이 매우 반복되는 에피토프 구조를 갖는 항원 사이의 상호작용은 높은 결합활성 중 하나이다.
항-LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 그들의 교차 반응성에 대해 기재되고 구체적으로 명시될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "교차 반응성"은 한 항원에 특이적 항체가 제2의 항원과 반응하는 능력;두개의 상이한 항원성 물질 사이의 관계성의 척도를 나타낸다. 따라서, 항체가 그의 형성을 유도했던 것 외의 에피토프에 결합하는 경우, 항체는 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 통상 유도하는 에피토프와 동일하게 상보적인 구조적 특징을 다수 포함하고, 일부 경우에는 본래의 것보다 실제로 더 잘 맞을 수 있다.
예를 들어, 특정 항체가 참조 에피토프와 연관되지만 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 및 50% 이상의 동일성(당업계에 공지되고 본원에서 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프와 결합한다는 점에서, 상기 항체는 약간의 교차 반응성을 갖는다. 항체가 참조 에피토프와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(당업계에 공지되고 본원에서 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프와 결합하지 않는다면, 항체는 교차 반응성이 거의 없거나 전혀 가지지 않는다고 할 수 있다. 항체가 특정 에피토프와 임의의 다른 유사체, 오솔로그(ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는다면, 특정 에피토프에 "매우 특이적"이라고 간주될 수 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫번째(아미노 가장 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 아미노 말단이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은 통상의 넘버링 체계(카밧 넘버링 시스템에서 잔기 244 내지 360; EU 넘버링 시스템에서 잔기 231 내지 340; 문헌(Kabat EA et al.) 참고)를 이용하여 항체의 대략 잔기 244 내지 360에 걸쳐 있는 중쇄 분자의 일부분을 포함한다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 가까이 쌍을 이루지 않는다는 점에서 특이하다. 오히려, 두개의 N-연결된 탄수화물 분지쇄가 완전한 천연 IgG 분자의 두 CH2 도메인 사이에 놓이게 된다. 또한, CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인에서 C-말단까지 걸쳐있으며 대략 108 잔기를 포함한다는 것은 잘 입증되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 일부분을 포함한다. 상기 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하며, 유연하기 때문에, 두개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이도록 해준다. 힌지 영역은 3개의 별개 도메인, 즉 상부, 중부 및 하부 도메인으로 세분화될 수 있다(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "디설파이드 결합"은 두개의 황 원자 사이의 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 티올기를 포함하여 다른 티올기와 디설파이드 결합 또는 다리를 형성한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디설파이드 결합으로 연결되어 있고, 두개의 중쇄는 카밧 넘버링 시스템을 이용한 경우 239 및 242에 대응하는 위치에 두개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다(EU 넘버링 시스템 경우, 226 또는 229 위치).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위는 한 종으로부터 얻거나 유래되고 불변 영역(완전하거나 부분적이거나 본 발명에 따라 변형될 수 있는)을 또 다른 종에서 얻어진 임의의 항체를 포함한다. 특정 실시예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)에서 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간" 또는 "완전히 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 하기에, 예를 들어 미국 특허 제 5,939,598호(Kucherlapati et al.)에 기재되는 바와 같이 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린으로 형질전환되고 내재의 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로 부터 단리된 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전히 인간" 항체는 또한 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하며, 상기에서 가변 도메인은 인간 면역글로불린 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는다. "인간" 또는 "완전히 인간" 항체는 또한 본원에서 기재된 항체 분자(예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하고, 상기 변이체로 필수적으로 구성되거나, 상기 변이체로 구성된, 상기에 기재된 바와 같이 "인간" 또는 "완전히 인간" 항체를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 변이체는 LINGO-2 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다.
당업자에게 공지된 표준 기술은 인간 항-LINGO-2 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내 돌연변이를 도입하는 데 이용될 수 있다. 상기에 아미노산 치환을 일으키는 부위 지정 돌연변이 유발법 및 PCR-매개 돌연변이 유발법이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또한 VLCDR3에 비하여 50 미만의 아미노산 치환, 40 미만의 아미노산 치환, 30 미만의 아미노산 치환, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 2 미만의 아미노산 치환을 코딩할 수 있다. 한 실시예에서, 항체에 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 변경될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조작된 항체"는 공지된 특이성을 갖는 항체로부터 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 치환에 의해, 필요한 경우 부분적인 프레임워크 영역 치환 및 서열 변화에 의해 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 모두의 가변 도메인이 변경된 항체를 나타낸다. CDR은 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 서브클래스의 항체로 부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 클래스의 항체 및/또는 상이한 종의 항체로부터 유래될 것이라고 예상된다. 공지된 특이성을 갖는 비인간 항체로부터 하나 이상의 "공여(donor)" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역으로 이식된 조작된 항체는 본원에서 인간화 항체로 나타낸다. 특정 실시예에서, 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또다른 것으로 옮기기 위해 공여 가변 영역으로부터 완전한 CDR로 CDR 모두를 대체할 필요는 없다. 오히려, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기들을 이동시키는 것으로 충분할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,180,370호에 설명이 기재되었기 때문에, 통상의 실험을 수행하거나 시행 착오 시험을 함으로써 기능적으로 조작되거나 인간화 항체를 얻는 것은 당업자의 능력 내에 있을 것이다.
인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘다의 가변 도메인 내 프레임워크 영역은 인간 기원의 잔기만을 포함할 수 있으며, 이 경우 인간화 항체의 상기 프레임워크 영역은 "완전히 인간 프레임워크 영역"으로 나타낸다는 것이 또한 인지된다. 대안적으로, 공여 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 하나 이상의 잔기는 적합한 결합을 유지하거나 LINGO-2 항원에 결합을 향상시킬 필요가 있는 경우 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘다의 가변 도메인 내 인간 프레임워크 영역(들)의 대응하는 부위 내에서 조작될 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 인간 및 공여 프레임워크 잔기의 혼합물을 포함할 것이고, 본원에서 "부분적으로 인간 프레임워크 영역"으로 나타낸다.
예를 들어, 항-LINGO-2 항체의 인간화는 필수적으로 윈터 및 공동 연구자의 방법(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))을 따라, 설치류 또는 변이형 설치류 항-LINGO-2 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응 서열에 치환시켜 수행될 수 있다. 또한 본원의 참고에 포함되어 있는 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참고한다. 생성된 인간화 항-LINGO-2 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 완전히 인간 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 설치류 또는 변이형 설치류 CDR을 포함한다. 일부 경우에, 인간화 항-LINGO-2 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내 잔기들이 대응하는 비인간(예를 들어, 설치류) 잔기에 의해 대체되며(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 5,693,761호; 제 5,693,762;및 제 6,180,370호 참고), 이 경우 생성되는 인간화 항-LINGO-2 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인내에 부분적으로 인간 프레임워크 영역을 포함한다.
또한, 인간화된 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 수행을 더 개선하기 위해 만들어 진다(예를 들어, 원하는 친화도를 얻기 위해). 통상적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 통상적으로 두개 이상의 가변 도메인의 모두를 실질적으로 포함할 것이며, 상기 가변도메인 내에 CDR의 전체 또는 실질적으로 전체가 비인간 면역글로불린의 것에 해당하거나 프레임워크 영역의 전체 또는 실질적으로 전체가 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상 인간 면역글로불린의 Fc의 한부분 이상을 선택적으로 포함할 것이다. 더 자세한 내용은 본원의 참고에 포함된 문헌[Jones et al., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참고한다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 완전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 비인간 종의 대응하는 서열로 치환되어진 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기는 설치류 항체 내 유사한 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예를 들어 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참고한다. 또한, 인간화 항체 및 선정된 항원에 대한 친화도가 향상된 인간화 항체를 생산하는 기술을 발표한 미국 특허 제6,180,370호, 및 국제 공보 WO 01/27160를 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결된," "융합된" 또는 "융합"은 서로 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 두개 이상의 성분 또는 구성요소를 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 방법을 포함한 모든 방법에 의해 함께 연결하는 것을 나타낸다. "인-프레임 융합"은 두개 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 본래 ORF의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 ORF을 연결하여 연속적으로 더 긴 ORF를 형성하는 것을 나타낸다. 따라서, 생성되는 재조합 융합 단백질은 본래 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 해당하는 2개 이상의 세그먼트를 포함하는 단일 단백질이다(상기 세그먼트들은 자연에서는 정상적으로 연결되지 않는다). 따라서, 리딩 프레임은 융합된 세그먼트를 통해 연속적이어 지지만, 세그먼트들은 예를 들어 인-프레임 연결 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다.
폴리펩티드의 맥락에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열 내 서로 이웃하는 잔기들이 폴리펩티드의 1차 구조 내에서 인접하고 있는 아미노말단에서 카복실 말단 방향의 폴리펩티드 내 아미노산 순서이다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 나타낸다. 상기 과정은 유전자 녹다운뿐 아니라 일시적 발현 및 안정적 발현 모두를 제한없이 포함하는, 세포 내에 유전자가 기능적으로 존재함을 표현하는 것을 포함한다. 이는 유전자의 메신저 RNA(mRNA), 전이 RNA (tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사 및 상기 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 제한 없이 포함한다. 최종 목적 산물이 생화학물질인 경우, 발현은 그 생화학물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 기재된 유전자 산물은 또한 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화된 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질 첨가, 다른 단백질 서브유닛과 연관, 단백질 분해 절단 등이 된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 투여 시 및 필요 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 치료 결과는 예를 들어, 증상의 감소, 생존 연장, 운동성 향상 등일 수 있다. 치료 결과는 "치유(cure)"일 필요는 없다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방적 유효량"은 원하는 예방 효과를 얻기 위해 투여 시 및 필요 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 통상, 예방적 투여는 질병의 초기 단계에, 또는 그 이전에 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "치료하다" 또는 "치료"는 치료법 및 예방을 위한 조치를 나타내며, 상기에서 대상은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예를 들어 자가 면역 병태의 진행을 예방하거나 지연(감소)시키는 것이다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는 확인 가능하거나 불가능하던지, 증상의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된 상태(즉, 악화되지 않는), 질병의 진행을 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분 또는 전체)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. "치료" 는 또한 치료를 받지 않는 경우 기대되는 생존과 비교하여 생존을 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람은 이미 병태 또는 장애가 있는 사람뿐 아니라 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 사람, 또는 병태 및 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.
"피험체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물,"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 피험체, 특히 포유동물 피험체를 의미한다. 포유동물 대상은 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 기니아 피그, 랫트, 및 마우스와 같은 애완 동물, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류, 개와 늑대와 같은 갯과 동물, 고양이, 사자, 및 호랑이와 같은 고양이과, 말, 당나귀, 얼룩말과 같은 말과 동물, 소, 돼지, 및 양과 같은 식용동물, 및 사슴, 기린, 곰 등의 유제류를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시예에서, 포유동물은 인간 피험체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "LINGO-2 길항제의 투여로 이익을 얻는 피험체" 및 "치료가 필요한 동물"은 예를 들어 항-LINGO-2-폴리펩티드의 검출을 위해 사용된 LINGO-2 길항제의 투여(예를 들어 진단 과정을 위해)로 이익을 얻고/얻거나, 항-LINGO-2-항체와 같은 LINGO-2 길항제로 ALS와같은 질병의 치료, 즉 완화 또는 예방으로 이익을 얻는 피험체, 예를 들어 포유동물 피험체를 포함한다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"은 siRNA에 의해 유전자 발현의 사일런싱 또는 감소를 나타내다. 이는 사일런스된 유전자의 서열과 자신의 이중식 영역에서 상동성인 siRNA에 의해 개시되는, 동물 및 식물에서 서열 특이적인 전사후 유전자 사이런싱 과정이다. 유전자는 염색체에 통합되어 존재하거나 게놈에 통합되지 않은 형질감염 벡터 내에 존재하여, 생물에 내인성 또는 내인성일 수 있다. 유전자의 발현은 완전히 또는 부분적으로 억제된다. RNAi는 또한 표적 RNA의 기능을 억제하는 것으로 생각될 수 있다.;표적 RNA의 기능은 완전하거나 부분적일 수 있다.
II. LINGO-2
LINGO-2는 피질 뉴런 및 후근신경절(DRG)에서 발현되며, 운동 뉴런의 생존 및 운동 뉴런의 축삭 성장을 음성적으로 조절한다.
자연 발생의 인간 LINGO-2는 606 아미노산의 폴리펩티드이다. 인간 LINGO-2 mRNA를 코딩하는 폴리펩티드는 진 뱅크(GenBank)에 등록번호 NM_152570로 보고되어 있다;
Figure pct00001
Figure pct00002
인간 LINGO-2의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1의 뉴클레오티드 651 내지 2471에 의해 코딩됨)은 진 뱅크 등록번호 NP_689783으로 보고되어 있다.
Figure pct00003
마우스 LINGO-2 mRNA를 코딩하는 폴리펩티드는 진 뱅크에 등록번호 NM_175516.4로 보고되어 있다;
Figure pct00004
Figure pct00005
마우스 LINGO-2의 폴리펩티드 서열은 진 뱅크 등록번호 NP_780725로 보고되어 있다.
Figure pct00006
랫트 LINGO-2 mRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 진 뱅크 등록번호 NM_001107926.1로 보고되어 있다:
Figure pct00007
Figure pct00008
랫트 LINGO-2의 폴리펩티드 서열은 진 뱅크 등록번호 NP_001101396으로 보고되어 있다.
Figure pct00009
자연발생 인간 LINGO-2 폴리펩티드(FLJ31810로도 알려짐, 고류신반복 및 면역글로불린 유사 도메인 nogo 수용체 상호작용 단백질 2, LERN3, 고류신반복 뉴런 단백질 3, 고류신반복 뉴런 단백질 6C, LRRN6C, PRO31993, 또는 UNQ9234)는 606개 아미노산(서열 번호 2)의 약 68Kda 단백질이다. LINGO-2는 3가지 이상의 다른 인간 파라로그(paralog), LINGO-1, LINGO-3, 및 LINGO-4를 포함하는 LINGO 단백질 패밀리의 일원이다. 문헌(Mi et al., Nature Neurosci. 7: 221-28 (2004))을 참고한다. 인간 LINGO-2 폴리펩티드는 고류신반복 스트레치(N-말단 캡(LRRNT) 및 C-말단 캡(LRRCT) 포함)를 포함한다. LINGO-2는 또한 Ig 도메인, 막횡단 영역, 및 세포내 도메인을 포함한다. 또한, 자연 발생 LINGO-2 단백질은 단백질의 N-말단에 신호 서열을 포함한다. 당업자는 본원에 보고된 LINGO-2의 여러 도메인 길이가 대략적이라는 것을 인식할 것이다. 표 2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 기초로 하여 LINGO-2 도메인의 대략적인 경계를 열거한다.
LINGO-2 도메인
도메인 또는 영역 서열 번호 2의 잔기
신호 서열 1-27
LRRNT 28-57
LRR 58-79
LRR 82-103
LRR 106-127
LRR 130-151
LRR 154-175
LRR 178-199
LRR 202-223
LRR 226-247
LRR 250-271
LRR 274-295
LRR 298-319
LRR 322-343
LRRCT 355-408
Ig 410-500
막횡단 546-566
세포내 568-606
LINGO-2의 조직 분포는 랫트 및 마우스에서 연구되었다. 성체 랫트 LINGO-2의 발현은 정량 PCR(Q-PCR)에 의해 결정된 바와 같이 중추 신경계에 국소화되어 있다. P6(생후 6일) 마우스에서, LINGO-2의 발현은 정량 PCR(Q-PCR)에 의해 결정된 바와 같이 피질 뉴런 및 후근신경절에 국소화되어 있다(도 1 및 2 참고).
III. LINGO-2 길항제의 사용 방법
LINGO-1 및 LINGO-2 폴리펩티드는 본원에서 증명된 바와 같이 대략 60.7% 아미노산 서열 동일성을 공유하지만, 상기 폴리펩티드의 길항작용은 세포에 상이한 효과를 가져온다. 보다 구체적으로, LINGO-1 길항제는 재수초화(remyelination)를 촉진하는 반면, LINGO-2 길항제는 촉진하지 못한다. 또한, LINGO-1과LINGO-2의 발현 패턴도 상이하다. 특히, LINGO-2는 뇌보다 척수에서 높은 발현을 보이는 반면, LINGO-1은 척수보다 뇌에서 높은 발현을 보인다.
운동 뉴런 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장과 관련된 질병, 장애 또는 손상, 예를 들어, 근위축성 측삭 경화증을 상기 질병을 앓고 있는 동물에서 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 방법은 유효량의 LINGO-2 길항제를 동물에게 투여하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 필수적으로 구성되거나, 상기 단계로 구성된다. 특정 실시예에서 LINGO-2 길항제는 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드, LINGO-2 앱타머, 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본원은 유효량의 LINGO-2 길항제와 운동 뉴런을 접촉하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 필수적으로 구성되거나, 상기 단계로 구성되는, 운동 뉴런 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법(포유동물 내 또는 시험관 내)을 제공한다. 운동 뉴런이 포유동물 내에 존재하는 경우, 양은 치료적 유효량일 수 있다. 특정 실시예에서 LINGO-2 길항제는 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드, LINGO-2 앱타머, 및 그들의 조합으로 구성된 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용되는 LINGO-2 길항제, 예를 들어, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, LINGO-2 항체, LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드, 또는 LINGO-2 앱타머는 축삭 성장 또는 뉴런 생존을 음성적으로 조절하는 LINGO-2의 능력을 정지, 감소, 예방 또는 억제하는 치료제로서 제조되거나 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, LINGO-2 길항제는 특정 유형의 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진할 수 있다. 예를 들어, LINGO-2 길항제는 상부 운동 뉴런 또는 하부 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진할 수 있다. LINGO-2 길항제는 알파 운동 뉴런 또는 감마 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진할 수 있다. LINGO-2 길항제는 체성(somatic) 운동 뉴런, 특수 내장 운동 뉴런(아가미 운동 뉴런), 또는 일반 내장 운동 뉴런(내장 운동 뉴런)의 축삭 성장을 촉진할 수 있다.
일부 실시예에서, LINGO-2 길항제는 특정 유형의 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있다. 예를 들어, LINGO-2 길항제는 상부 운동 뉴런 또는 하부 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있다. LINGO-2 길항제는 알파 운동 뉴런 또는 감마 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있다. LINGO-2 길항제는 체성 운동 뉴런, 특수 내장 운동 뉴런(아가미 운동 뉴런), 또는 일반 내장 운동 뉴런(내장 운동 뉴런)런의 생존을 촉진할 수 있다.
일부 실시예에서, LINGO-2 길항제는 희소돌기아교세포 분화를 촉진할 수 있다.
일부 실시예에서, LINGO-2 길항제는 AKT 인산화를 촉진할 수 있다. 일부 실시예에서는, LINGO-2 길항제는 DRG 세포내 AKT 인산화를 촉진할 수 있다.
추가의 실시예는 LINGO-2 길항제를 포유동물, 선택적으로 질병, 장애 또는 손상 부위에, 또는 인근 부위에 운동 뉴런 축삭 확장의 억제를 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 운동 뉴런 생존을 유도하여 운동 뉴런의 파괴와 관련된 질병, 장애 또는 손상을 치료하는 방법을 포함한다.
LINGO-2 길항제는, 예를 들어, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드, 또는 LINGO-2 앱타머를 환자에 직접 투여법으로 투여될 수 있다. 대안적으로, LINGO-2 길항제는 특정 LINGO-2 길항제를 생산하는 발현 벡터를 통하여 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, LINGO-2 길항제는 (1) LINGO-2 길항제를 발현하는 핵산, 예를 들어, 벡터로 이식가능한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계 및 (2) 형질전환된 숙주 세포를 포유동물에 이식하는 단계를 포함하는 치료 방법으로 투여된다. 일부 실시예에서는, 숙주 세포는 질병, 장애 또는 손상 부위에 이식될 수 있다. 일부 실시예에서, 이식가능한 숙주 세포는 포유동물로부터 제거하여, 일시적으로 배양하고, LINGO-2 길항제를 코딩하는 단리된 핵산으로 형질전환 또는 형질 감염되고, 숙주 세포가 제거되었던 동일한 포유동물에 다시 이식된다. 세포는 이식된 동일한 부위로부터 제거될 수 있으나 요구되는 것은 아니다. 간혹 생체 외 유전자 치료법으로 알려진 상기 실시예는 일정기간 동안 LINGO-2 길항제의 지속적인 공급을 제공할 수 있다.
본원에서 제공된 방법에 의해 치료 또는 개선될 수 있는 질병 또는 장애는 운동 뉴런 생존과 관련된 질병, 장애 또는 손상을 포함한다. 상기 질병은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근위축증(PMA), 유전성 경직성 양하지마비(HSP), X-연관 척수연수 근위축증(SBMA; 케네디병) 진행성 연수마비, 가연수 마비, 척수성 근위축증(SMA), 후소아마비 증후군(PPS), 헌팅턴병, 본태성 진전(ET), 운동 뉴런 질병, 마비, 파킨슨병, 및 기타 운동 기능 관련 질병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시예에서는, LINGO-2 길항제의 투여는 감소된 운동 뉴런기능과 관련된 특정 증상을 감소 또는 예방하기에 충분하다. 예를 들어, LINGO-2 길항제는 근위축증, 근력저하, 근섬유다발수축, 섬유성 연축, 근긴장저하, 반사저하증, 무력증, 근육긴장항진, 반사항진, 간헐성 경련, 마비(예를 들어, 사지마비, 양측 하지 마비, 또는 단마비), 강직, 바빈스키 시험, 안정시 진전, 무정위 운동증, 무도병, 발리스무스, 지연 운동이상증, 경직, 근육긴장이상증, 운동실조, 운동 거리 측정 장애, 길항운동반복부전, 안구진탕증, 운동 개시 지연, 운동완만증, 또는 그밖의 운동장애를 향상, 안정화 또는 예방할 수 있다.
IV. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드
LINGO-2 폴리펩티드는 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 상기 표2는 인간 LINGO-2 폴리펩티드의 여러가지 도메인을 기재하고 있다. 유사한 도메인 구조가 다른 종, 예를 들어 마우스 LINGO-2 폴리펩티드(서열 번호 4)에 대해 추론될 수 있다. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 전형적으로 LINGO-2 폴리펩티드의 막횡단 도메인이 결여되고, 선택적으로 LINGO-2 폴리펩티드의 세포질 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어, 특정 가용성 인간 LINGO-2 폴리펩티드는 인간 LINGO-2의 막횡단 도메인을 포함하는 서열 번호 2의 아미노산 546 내지 566이 결여된다. 추가적으로, 특정 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 LINGO-2 폴리펩티드의 LRR 도메인 및 Ig 도메인을 포함한다.
변이형 LINGO-2 폴리펩티드는 또한 대응하는 야생형 폴리펩티드와 서열이 다르다. 특히, 특정 아미노산 치환은 LINGO-2 생물학적 활성에 주목할 만한 손실 없이 LINGO-2 서열에 도입될 수 있다. 전형적인 실시예에서, 변이형 LINGO-2 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고/하거나 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408, 및 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 500 또는 LINGO-2 상동체의 등가 단편(예를 들어, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 주어진 LINGO-2 단편과 상이한 서열의 변이형 LINGO-2 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환(보존적 또는 비보존적) 또는 하나 이상의 결실 및/또는 하나 이상의 삽입을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 예를 들어 포유동물에서 운동 뉴런 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
가용성 LINGO-2 폴리펩티는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6의 6이상, 예를 들어 10, 15, 20, 25,30, 40, 50, 60, 70, 100 이상의 아미노산 단편을 포함할 수 있다. 또한, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 하나 이상, 예를 들어, 5, 10, 15, 또는 20개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 참조 LINGO-2 폴리펩티드와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 대응하는 단편도 고려된다. 특정 실시예에서, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 예를 들어 포유동물에서 운동 뉴런 생존을 촉진하거나 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
"LINGO-2 참조 아미노산 서열" 또는 "참조 아미노산 서열"은 어떤 아미노산 치환의 도입 없이 구체적으로 명시된 서열을 의미한다. 당업자는 어떤 치환도 존재하지 않는 경우 "단리된 폴리펩티드"는 참조 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
또다른 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 57; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 79; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 103; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 127; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 57; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 79; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 103; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 127; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 79; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 103; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 127; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 103; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 127; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 127; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 151; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 175; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 199; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 223; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 247; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 271; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 295; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 319; 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 322 내지 343; 서열 번호 2의 아미노산 322 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 322 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 322 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 355 내지 408; 서열 번호 2의 아미노산 355 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 355 내지 545; 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 500; 서열 번호 2의 아미노산 410 내지 545;을 포함하는, 또는 상기 아미노산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 아미노산으로 구성된 인간 LINGO-2 폴리펩티드 단편을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 예를 들어 포유동물에서 운동 뉴런의 생존을 촉진하고/하거나 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
당업자에게 잘 이해되고 있듯이, 상기에 열거된 LINGO-2 단편은 LINGO-2 도메인 영역의 대안적인 예측에 기초하여 어느 한쪽 끝에서(길거나 짧거나) 길이가 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산 정도 다를 수 있다. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 대응하는 단편, 또는 본원에 기재된 상기 서열의 단편 또한 고려되어 진다.
가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 2가지 이상의 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드 이량체로 동종이량체 또는 이종이량체가 고려되어진다. 본원에서 기재된 바와 같이 두가지 이상의 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 적합한 펩티드 링커를 통해 직접 연결될 수 있다. 상기 펩티드링커는 본원의 다른곳에서 기재된다.
또한, 상기에 열거된 임의의 단편은 N-말단에 분비 신호 펩티드, 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 27을 더 포함할 수 있다. 본원의 다른 부분에 기재된 다른 분비 신호 펩티드도 사용될 수 있다.
가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 고리형일 수 있다. 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 고리화는 선형 펩티드의 형태적인 자유를 감소시켜, 구조적으로 더 제한된 분자를 생성한다. 많은 펩티드 고리화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 펩티드의 N-말단과 C-말단 아미노산 잔기 사이에 아미드 결합 형성에 의해 "백본 대 백본" 고리화된다. "백본 대 백본" 고리화 방법은 두개의 ω-티오 아미노산 잔기(예를 들어, 시스테인, 호모시스테인) 사이에 디설파이드 결합의 형성을 포함한다. 특정 가용성 LINGO-2 펩티드는 고리형 LINGO-2 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드의 N- 및 C-말단을 변형을 포함한다. 상기 변형은 시스테인 잔기, 아세틸화 시스테인 잔기, NH2 폴리펩티드 및 비오틴을 갖는 시스테인 잔기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 펩티드 고리화의 다른 방법은 전체가 본원의 참고로 포함되어 있는 문헌(Li & Roller. Curr. Top. Med. Chem. 3:325-341 (2002))에 기재되어 있다.
V. 항체 및 그의 항원 결합 단편
LINGO-2 길항제는 또한 LINGO-2-특이적 항체 또는 LINGO-2 활성의 길항제인 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 예를 들어, 항체 C09를 포함한다. 예를 들어, LINGO-2에 특정 LINGO-2 항체의 결합은 운동 뉴런에서 발현된 바와 같이 운동 뉴런 생존의 억제를 차단하거나, 운동 뉴런 축삭 성장 억제를 차단한다. 특정 실시예에서, LINGO-2 길항제 항체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을, 예를 들어, 포유동물에서 촉진한다.
특정 실시예에서, 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 예를 들어, 항체 C09는 LINGO-2에 결합하여 운동 뉴런의 생존을 촉진하거나 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
특정 실시예에서 항-LINGO-2 항체는 인간, 랫트, 마우스 또는 인간, 랫트, 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합에 결합한다.
A. 항-LINGO-2 항체 폴리펩티드
단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 C09와 동일한 LINGO-2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체 또한 제공된다. 또다른 실시예에서, 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 C09의 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한 LINGO-2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 또다른 실시예에서, 단리된 결합 분자, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 C09의 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한 LINGO-2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
또다른 실시예에서, 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 결합하고 항체 C09가 LINGO-2, 예를 들어 인간, 랫트, 마우스 또는 인간, 랫트, 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 결합하고 C09의 VH 및 VL을 포함하는 항체가 LINGO-2, 예를 들어 인간, 랫트, 마우스 또는 인간, 랫트, 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 결합하고 C09의 VH 및 VL을 포함하는 항체가 LINGO-2, 예를 들어 인간, 랫트, 마우스 또는 인간, 랫트, 및 마우스 LINGO-2의 임의의 조합을 경쟁적으로 억제할 수 있다.
특정 실시예에서, 결합 분자는 참조 항-LINGO-2 항체 분자와 아미노산 서열이 80%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 실시예에서 결합 분자는 참조 항체와 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다. 특정 실시예에서, 참조 항체는 C09이다.
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변도메인(VH 도메인)를 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 VH 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 7, 8, 또는 9의 VH 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며(표 3 참고), 상기에서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
Figure pct00010
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 상기에서 VH 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 7, 8, 또는 9의 아미노산 서열을 각각 가지는 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기에서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 추가의 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)를 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 VH 도메인의 하나 이상의 CDR은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 7, 8, 또는 9와 아미노산 서열을 각각 가지는 CDR1, 2 또는 3과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기에서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 10의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며(표 4 참고), 상기에서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편,변이체 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
Figure pct00011
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 VL 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 11, 12, 또는 13의 VL 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며(표 5 참조), 상기에서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
Figure pct00012
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 VL 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 11,12, 또는 13의 아미노산 서열을 각각 가지는 CDR 1, 2 또는 3과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며(표 5 참고), 상기에서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 추가의 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며, 상기에서 VL 도메인의 하나 이상의 CDR은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고는 서열 번호 11, 12, 또는 13과 아미노산 서열을 각각 가지는 CDR1, 2 또는 3과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기에서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 변이체, 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
또 다른 실시예에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 14의 VL 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 구성되거나, 상기 도메인으로 구성되며(표 6 참고), 상기에서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 LINGO-2에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 운동 뉴런의 생존 또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
Figure pct00013
특정 길항제 항체는 본원에 기재된 바와 같이 특정 LINGO-2 폴리펩티드 단편 또는 도메인, 예를 들어 LINGO-2 폴리펩티드, 단편, 변이체, 또는 유도체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있다.
또한, 항-LINGO-2 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체도 유용하다. 상기 변이체는 부모 항-LINGO-2 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체를 제조하는 방법은 당업계에서 보편적으로 이용가능하다.
LINGO-2에 특이적으로 결합하고 원하는 활성을 보유할 수 있는 폴리펩티드의 정확한 화학 구조는 많은 요인에 따른다. 이온화 가능한 아미노기 및 카복실기가 분자 내에 존재하기 때문에, 특정 폴리펩티드는 산성 또는 염기 염 또는 중성 형태로 얻을 수 있다. 적합한 환경 조건에 놓일 때 생물학적 활성을 보유하는 상기 모든 제제는 본원에 사용된 항-LINGO-2 항체의 정의 내에 포함된다. 또한, 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열은 당부분을 이용한 유도체화(글리코실화)에 의해, 또는 지질, 인산, 아세틸기 등과 같은 다른 보조 분자에 의해서 증가될 수 있다. 또한, 당류에 컨쥬게이트되어 증가될 수도 있다. 상기 증가의 한 측면은 숙주를 생산하는 번역후 프로세싱 시스템을 통해 수행될 수 있다. 상기의 다른 변형은 시험관 내에서 도입될 수있다. 어쨌든, 상기 변형은 항-LINGO-2 항체의 원하는 특성이 파괴되지 않는 다면 본원에서 사용된 항-LINGO-2 항체의 정의에 포함된다. 상기 변형은 폴리펩티드의 활성을 향상시키거나 감소시킴으로써 다양한 분석에서 정량적 또는 정성적 활성에 영향을 줄 수 있으리라 기대된다. 또한, 사슬 내의 각 아미노산 잔기는 산화, 환원 또는 다른 유도체화에 의해서 변형될 수 있으며, 폴리펩티드는 절단되어 활성을 보유하는 단편을 얻을 수 있다. 원하는 특성(예를 들어, LINGO-2에 대한 결합 특이성, 결합 친화도 및 관련 활성, 예를 들어 운동 뉴런 사멸을 억제하고 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 능력)을 파괴하지 않는 상기 변이는 폴리펩티드 서열을 본원에서 사용된 관심의 항-LINGO-2 항체의 정의에서 제거하지 않는다.
본 기술은 폴리펩티드 변이체의 제조 및 사용에 관한 실질적 안내서를 제공한다. 항-LINGO-2 결합 분자의 변이체, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하는 데 있어서, 당업자는 천연 단백질의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 어떤 변형이 약학 조성물의 치료적 활성 성분으로서 사용에 적합한 변이체를 생성하는 지를 쉽게 결정할 수 있다.
프레임워크 영역 내에만 또는 항체 분자의 CDR 영역에만 돌연변이를 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 사일런트 또는 중립 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 즉, 항체의 항원 결합능에는 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 상기 유형의 돌연변이는 코돈 이용을 최대화하거나, 하이브리도마의 항체 생산을 향상시키는에 유용할 수 있다. 대안적으로, 비중립 미스센스 돌연변이는 항체의 항원 결합능을 변경할 수 있다. 대부분의 사일런트 및 중립 돌연변이는 프레임워크 영역 내에 있을 것 같고, 대부분의 비중립 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR 내일 것 같지만 이것은 절대적이지는 않다. 당업자는 원하는 특성을 갖는, 예를 들어 항원 결합 활성 내 변화 또는 결합 활성 변화(예를 들어 항원 결합 활성의 향상 또는 항체 특이성의 변화)가 없는 변이 분자를 설계하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이 유발에 이어, 코딩된 단백질은 통상적으로 발현될 수 있으며, 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예를 들어, LINGO-2 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에 기재된 기술을 이용하거나 당업계에 공지된 기술을 통상적으로 변형하여 결정될 수 있다.
특정 실시예에서, 항-LINGO-2 항체는 하나 이상의 최적화된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화 CDR"은 CDR이 변형되어 최적화 CDR을 포함하는 항-LINGO-2 항체에 부여되는 결합 친화도 및/또는 항-LINGO-2 활성의 유지 또는 향상을 근거로 하여 선택된 최적화된 서열이 되는 것을 나타낸다. "항-LINGO-2 활성"은 예를 들어, LINGO-2와 연관된 활성, 예를 들어, LINGO-2 의존적 운동 뉴런 세포 사멸, 운동 뉴런 축삭 성장의 LINGO-2 의존적 억제, 또는 LINGO-2과 연관된 임의의 다른 활성 중 하나 이상 조절하는 활성을 포함할 수 있다. 또한, 항-LINGO-2 활성은 LINGO-2 발현과 연관된 질병의 발생 또는 중증도의 감소에 기인될 수 있다. 상기에서 LINGO-2 관련된 질병은 특정 유형의 운동 뉴런 관련 질병, 예를 들어, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 및 본태성 진전(ET)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 변형은 CDR 내 아미노산 잔기의 치환을 수반하여 항-LINGO-2 항체가 LINGO-2 항원에 대한 특이성을 유지하고, 결합 친화도를 향상시키고/거나 항-LINGO-2 활성을 향상시킬 수 있다.
B. 항-LINGO-2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 항-LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산분자 또한 본원에서 제공된다.
한 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나,상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 VH 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 18로부터 선택된 VH-코딩 서열의 VHCDR 1, 2, 또는 3 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다(표 4 참고). 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩한다.
다른 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 VH 도메인의 하나 이상의 CDR 서열은 (a) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열; (b) 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체, 그의 유도체를 코딩한다.
추가의 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10을 포함하는 참조 VH 도메인 폴리펩티드 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-LINGO-2 항체는 특이적으로 또는 우선적으로 LINGO-2에 결합한다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 유도체를 코딩한다.
한 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 VL 도메인의 하나 이상의 CDR은 서열 번호 22로부터 선택된 VL-코딩 서열의 VLCDR 1, 2, 또는 3 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다(표 6 참고). 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 변이체, 그의 유도체를 코딩한다.
다른 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 VL 도메인의 하나 이상의 CDR 서열은 (a) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 서열; (b) 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 서열; 및 (c) 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩한다.
추가의 실시예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 14를 포함하는 참조 VL 도메인 폴리펩티드 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 상기 핵산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 핵산으로 구성되며, 상기에서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-LINGO-2 항체는 특이적으로 또는 우선적으로 LINGO-2에 결합한다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩한다.
상기에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 코딩된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 펩티드, 본원에 기재된 항체 불변 영역, 또는 본원에 기재된 이종의 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 핵산을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
한 실시예에서, 조성물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 본원에서 기재한 VH 도메인을 코딩하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 본원에서 기재한 VL 도메인을 코딩한다. 상세하게는, 서열 번호 18에 기재된 VH 도메인-코딩 폴리뉴클레오티드 및 VL 도메인-코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 서열 번호 22에 기재된 VL 도메인-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 폴리뉴클레오티드로 필수적으로 구성되거나, 상기 폴리뉴클레오티드로 구성된 조성물이 제공된다. 서열 번호 7, 서열 번호 8, 및 서열 번호 9를 코딩하는 핵산을 포함하는 VH 도메인-코딩 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 11, 서열 번호 12, 및 서열 번호 13을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 VL 도메인-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 폴리뉴클레오티드로 필수적으로 구성되거나, 상기 폴리뉴클레오티드로 구성된 조성물이 또한 제공된다.
그외에 기재된 폴리뉴클레오티드의 단편들 또한 제공된다. 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 융합 폴리폴리펩티드, Fab 단편, 및 다른 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 고려되어 진다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있는 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리코뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242 (1994)]에 기재된 바와 같이). 이는 간략하게 항체를 코딩하는 서열의 부분을 포함하는 오버랩핑 올리고뉴클레오티드의 합성, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 합성을 수반한다.
대안적으로 항-LINGO-2 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원의 핵산으로부터 만들어 질수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 사용가능하기 않지만 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 항체를 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성되거나, 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체 또는 다른 항-LINGO-2 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어 항체를 생산하도록 선별된 하이브리도마 세포로부터 만들어진 cDNA 라이브러리, 또는 상기 조직 또는 세포로부터 단리된 핵산, 예를 들어, poly A+RNA로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프랑머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 클로닝하고 항체 또는 다른 항-LINGO-2 항체를 코딩하는 예를 들어 cDNA 라이브러리부터 얻은 cDNA 클론을 확인함으로써 얻을 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
항-LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그의 핵산 서열은 당업계에 공지된 뉴클레오티드 서열의 조작하기 위한 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기술,위치지정 돌연변이 유발법, PCR 등을 이용하여 조작하여(예를 들어, 전체가 본원의 참고로 포함된 문헌[Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) and Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY]에 기재되어있는 기술 참고) 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성, 예를 들어 아미노산치환, 결실, 및/또는 삽입을 만들 수있다.
항-LINGO-2 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또느 폴리데옥시뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 이들은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA 일 수 있다. 예를 들어, 항-LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로 이중 가닥, 또는 단일가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항-LINGO-2 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 이루어질 수 있다. 항-LINGO-2 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 안정성 또는 다른 이유에서 변형된 하나 이상의 염기 또는 변형된 DNA 또는 RNA 백본을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이티드 염기 및 이노신과 같은 특이한 염기를 포함할 수 있다. DNA 및 RNA는 다양하게 변형될 수 있다. 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
면역글로불린에서 유래된 폴리펩티드의 비자연 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열에 도입함으로써 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 코딩된 단백질에 도입되어 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예를 들어 위치지정 돌연변이 유발법 및 PCR 매개 돌연변이 유발법에 의해 도입될 수 있다. 하나 이상의 필수적이지 않은 아미노산 잔기는 보존적 아미노산 치환될 수 있다.
C. 항-LINGO-2 항체의 특징
다른 실시예에서, 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 또는우선적으로 결합하며, 상기 에피토프는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 약 4 내지 5 이상의 아미노산:서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 7 이상, 9 이상 또는 약 15 내지 약 30 아미노산을 포함하거나, 상기 아미노산으로 필수적으로 구성되거나, 또는 상기 아미노산으로 구성된다. 기재된 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 주어진 에피토프의 아미노산은 인접 또는 선형일 수 있으나 요구되는 것은 아니다.
특정 실시예에서, LINGO-2의 하나 이상의 에피토프는 세포 표면에 표현된 또는 가용성 단편, 예를 들어, IgG Fc 영역에 융합된, LINGO-2의 세포외 도메인에 의해 형성되는 비선형 에피토프를 포함하거나, 상기 에피토프로 필수적으로 구성되거나, 상기 에피토프로 구성된다. 따라서, 특정 실시예에서 LINGO-2의 하나이상의 에피토프는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25, 약 15 내지 약 30, 또는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 이상의 인접하거나 인접하지 않는 아미노산을 포함하거나, 상기 아미노산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 아미노산으로 구성된다. 상기에서, 인접하지 않은 아미노산은 단백질 폴딩을 통해 에피토프를 형성한다.
다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하며, 상기에서 에피토프는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 1, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 인접 또는 인접하지 않는 아미노산을 포함하거나, 상기 아미노산으로 필수적으로 구성되거나, 상기 아미노산으로 구성되고, 단백질을 변형하는 또다른 폴리펩티드, 예를 들어 탄수화물 폴리펩티드가 포함될 수 있어, LINGO-2 항체는 변형되지 않은 단백질보다 변형된 표적 단백질에 더 높은 친화도로 결합할 수 있다. 대안적으로, LINGO-2 항체는 변형되지 않은 표적 단백질에는 전혀 결합하지 않는다.
다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 LINGO-2의 LRR 도메인에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 28 내지 408, 서열 번호 2의 아미노산 58 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 82 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 106 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 130 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 154 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 178 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 343, 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 343, 또는 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 343 내 에피토프에 결합한다
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 223, 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 247, 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 271, 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 295, 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 319, 또는 서열 번호 2의 아미노산 202 내지 343 내 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 247, 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 27, 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 295, 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 319, 또는 서열 번호 2의 아미노산 226 내지 343 내 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 271, 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 295, 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 319, 또는 서열 번호 2의 아미노산 250 내지 343 내 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 295, 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 319, 또는 서열 번호 2의 아미노산 274 내지 343 내 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 319, 또는 서열 번호 2의 아미노산 298 내지 343 내 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 상기에 기재된 LINGO-2 또는 단편 또는 변이체의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 즉, 관련이 없거나 무작위의 에피토프에 결합하는 것보다 상기 에피토프에 보다 쉽게 결합한다; 상기에 기재된 LINGO-2 또는 단편 또는 변이체의 하나 이상의 에피토프에 우선적으로 결합한다. 즉, 관련된, 비슷한, 동종의 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 쉽게 상기 에피토프에 결합한다; 상기에 기재된 LINGO-2 또는 단편 또는 변이체의 특정 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다; 또는 상기에 기재된 LINGO-2 또는 단편 또는 변이체의 하나 이상의 에피토프에 대략 5 x 10-2 M, 대략 10-2 M, 대략 5 x 10-3 M, 대략 10-3 M, 대략 5 x 10-4 M, 대략 10-4 M, 대략 5 x 10-5 M, 대략 10-5 M, 대략 5 x 10-6 M, 대략 10-6 M, 대략 5 x 10-7 M, 대략 10-7 M, 대략 5 x 10-8 M, 대략 10-8 M, 대략 5 x 10-9 M, 대략 10-9 M, 대략 5 x 10-10 M, 대략 10-10 M, 대략 5 x 10-11 M, 대략 10-11 M, 대략 5 x 10-12 M, 대략 10-12 M, 대략 5 x 10-13 M, 대략 10-13 M, 대략 5 x 10-14 M, 대략 10-14 M, 대략 5 x 10-15 M, 또는 대략 10-15 M 미만의 해리 상수 KD로 특징지어지는 친화도로 결합한다. 특정 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 마우스 LINGO-2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 비하여 인간 LINGO-2 폴리펩티드 또는 그의 단편에 우선적으로 결합한다.
항체 결합 해리 상수의 문맥에 사용된 바와 같이, 용어 "대략"은 항체 친화도를 측정하는 데 이용되는 방법에 내재하는 편차의 정도를 고려한다. 예를 들어, 사용된 기기 장치의 정확도, 측정되는 시료 수에 기본한 표준 오차, 반올림 오차에 따라, 용어 "대략 10-2 M"은, 예를 들어 0.05 M 내지 0.005 M을 포함한다.
특정 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 10-3 sec-1 보다 작거나 또는 동일한 오프 레이트(k(off))로 LINGO-2 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다. 대안적으로, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1보다 작거나 또는 동일한 오프 레이트(k(off))로 LINGO-2 폴리펩티드 또는 단편 또는 그의 변이체에 결합한다.
다른 실시예에서, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 보다 크거나 동일한 온 레이트(k(on))로 LINGO-2 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합한다. 대안적으로, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1보다 크거나 동일한 온 레이트(k(on))로 LINGO-2 폴리펩티드 또는 단편 또는 그의 변이체에 결합한다.
특정 LINGO-2 길항제 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 하나 이상의 불변 영역 도메인의 최소 부분은 대략 동일한 면역원성을 갖는 변경되지 않은 전체 항체와 비교하여 원하는 특성, 예를 들어 효과인자 기능의 감소, 비공유결합적으로 이량체를 만드는 능력, 종양위치의 국소화 능력 증가, 혈청 반감기 감소, 혈청 반감기 증가를 제공하도록 결실되거나, 그렇지 않으면 변경될 수 있다. 예를 들어, 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하지만 하나 이상의 중쇄 도메인의 최소 부분이 결여된, 도메인 결실된 항체이다. 예를 들어, 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 완전한 도메인이 결실 될수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 전체 또는 일부가 결실될 수 있다.
특정 LINGO-2 길항제 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, Fc 영역은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 효과인자 기능을 감소시기도록 돌연변이 유발될 수 있다. 예를 들어 불변 영역의 변형은 디설파이드 결합, 또는 항원 특이성 또는 항체 유연성 증가로 인해 국소화를 향상시키는 올리고당 부분을 변형시키는 데 사용될 수 있다. 결과의 생리학적 프로파일, 생체이용율 및 변형의 다른 생화학적인 효과는 과도한 실험없이 잘 공지되어 있는 면역학적 기술을 이용하여 용이하게 측정하고 정량할 수 있다.
특정 실시예에서, LINGO-2 길항제 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료받는 동물, 예를 들어 인간에서 해로운 면역 반응을 끌어낼 수 없을 것이다. 한 실시예에서, LINGO-2 길항제 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 당업계에 인지된 기술을 이용하여 면역원성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있거나, 키메라 항체로 만들 수 있다. 상기 유형의 항체는 비인간 항체, 통상적으로 부모 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나, 실질적으로 보유하지만, 인간 내에서 덜 면역원성인 마우스 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 상기는 (a) 전체 비인간 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 생성하는 방법; (b) 하나 이상의 비인간 상보성 결정 영역(CDR)의 최소 부분을 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나, 보유하지 않으면서 인간의 프레임워크 및 불변 영역으로 이식하는 방법; 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기를 치환함으로써 이들이 인간 유사 부분으로 "클로킹"하는 방법을 포함하여 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 방법은 전체가 참고로 포함되어 있는 문헌(Morrison et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et　al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,190,370)에 개시되어 있다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변형된 형태는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 전체 전구체 또는 부모 항체로부터 만들어질 수 있다. 전형적인 기술은 본원에서 보다 상세하기 논의된다.
LINGO-2 길항제 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 들어 지고 제조될 수 있다. 특정 실시예에서, 항체 분자 또는 그의 단편은 "재조합적으로 생산"될 수 있다, 즉 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 항체 분자 또는 그의 단편을 만드는 대표적인 기술은 본원에서 보다 상세하게 논의된다.
LINGO-2 길항제 항체 또는 그의 단편은 예를 들어 하이브리도마 또는 파지 디스플레이를 통해서 다중클론 항체의 생성, 단일 항체의 제조를 포함한 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 만들어질 수 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 항체 분자발현하는 데 이용될 수 있다. 숙주 세포는 두가지 발현벡터, 중쇄 유래 폴리펩티드를 포함하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 함께 형질감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 똑같이 발현할 수 있도록 동일한 선별 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두를 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 상기 상황에서, 독성의 유리 경쇄의 과도를 피하기 위해 경쇄는 유리하게 중쇄 앞에 놓인다(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). 또한, 숙주 세포는 중쇄 유래 폴리펩티드 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 단일 벡터로 형질감염될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 위한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들은 통상의 기술에 의해 숙주 세포에 전달되고,이어서 형질 감염된 세포는 통상의 기술에 의해 배양되어 항체를 생산한다. 따라서, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시예에서, 이중 사슬의 항체 생산을 위해 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터들은 전체 면역글로불린 분자를 발현하기 위한 숙주 세포 내에서 함께 발현될 수 있다.
항체가 재조합적으로 발현되어진다면, 항체는 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히, 단백질 A에 따른 친화성, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 분별, 임의의 다른 단백질 정제를 위한 표준 기술이다. 대안적으로 항체의 친화도를 증가시기기 위한 방법은 미국 2002 0123057 A1에 개시되어 있다.
한 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 분자는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 완전이 결실된("도메인-결실된 항체")합성의 불변 영역을 포함한다. 특정 실시예에서 적합하게 변형된 항체는 CH2 도메인이 완전히 결실되어진, 도메인 결실된 구조물 또는 변이체(△CH2 구조물)를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 짧은 연결 펩티드로 결실된 도메인을 치환하여 가변 영역에 유연성 및 이동의 자유를 제공할 수 있다. 당업자는 상기 구조물이 항체 대사율에 대한 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특정 환경 하에서 바람직할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 도메인 결실된 구조물은 IgG1 인간 불변 도메인을 코딩하는 벡터(예를 들어, Biogen IDEC Incorporated사)를 사용하여 유도될 수 있다(예를 들어, WO 02/060955A2 및 WO02/096948A2 참고). 상기 전형적인 벡터는 CH2 도메인을 결실하도록 조작되어 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공한다.
또한, 본원에서 기재된 항체 분자(예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 그들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되며, 상기 항체 또는 그의 단편이 LINGO-2 폴리펩티드에 면역 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 본원에서 제공한다.
VI. 폴리펩티드 및 항체 컨쥬게이트 및 융합체
이종 폴리펩티드에 융합된 LINGO-2 폴리펩티드, 예를 들어, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또한 본원에서 제공된다. 또한, 이종 폴리펩티드에 융합된 항-LINGO-2 항체도 제공된다. LINGO-2 융합 단백질 및 항체 융합체는 여러가지 목적, 예를 들어 혈청 반감기 증가, 생체이용율 향상, 특이적 기관 또는 조직 유형에 생체내 표적화, 재조합 발현 효율 향상, 숙주 세포 분비 향상, 정제의 용이성, 및 높은 관계성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 달성하고자 하는 목적에 따라, 이종 폴리펩티드는 비활성 또는 생물학적 활성일 수 있다. 또한, 생체내 또는 시험관 내에서, LINGO-2 폴리펩티드 또는 항체에 안정적으로 융합되거나 절단가능한 것이 선택된다. 상이한 목적을 수행하기 위한 이종 부분은 당업계에 공지되어 있다.
LINGO-2 길항제 융합 폴리펩티드 또는 항체 발현에 대안으로서, 선택된 이종 폴리펩티드는 미리 형성되어지거나, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 대부분의 경우, 선택된 이종 폴리펩티드는 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 융합되거나, 컨쥬게이트되든 유사하게 기능을 할 것이다. 그러므로, 이종 아미노산 서열을 하기에 논의하는 데 있어 언급되지 않는다면, 이종 서열은 융합 단백질의 형태로 또는 화학 컨쥬게이트로서 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 연결될 수 있다는 것으로 이해되어진다.
일부 방법은 LINGO-2 폴리펩티드를 이용하며, 상기 LINGO-2 폴리펩티드가 Fc 영역, 즉, Ig 중쇄 불변 영역의 C-말단 부분에 융합된다. 한 실시예에서, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는 힌지 및 Fc 영역에 융합된다. LINGO-2-Fc 융합체의 가능한 장점은 용해도, 생체내 안정성, 및 다가성, 예를 들어, 이량체화를 포함한다. 사용된 Fc 영역은 IgA, IgD, 또는 IgG Fc 영역(힌지-CH2-CH3)일 수 있다. 대안적으로, IgE 또는 IgM Fc 영역(힌지-CH2-CH3-CH4)일 수 있다. 또한, IgG Fc 영역은 예를 들어, IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이 사용될 수 있다. Fc 융합체를 코딩하는 DNA를 제작하고 발현하기 위한 재료 및 방법을 당업계에 공지되어 있고, 과도한 실험없이 LINGO-2 융합체를 얻는 데 적용될 수 있다. 일부 방법은 문헌(Capon et al. U.S. Patent Nos. 5,428,130 및 5,565,335)에 기재된 바와 같이 LINGO-2 융합 단백질을 이용한다.
완전히 비손상의 야생형 Fc 영역은 Fc 융합단백질 내에 필요하지 않거나 원하지 않는 효과인자 기능을 나타낸다. 따라서, 특정 결합 부위는 융합 단백질 내 Fc 영역으로부터 결실될 수 있다. 예를 들어, 경쇄와 동시 발현은 불필요하기 때문에 중쇄 결합 단백질 Bip (Hendershot et al., 1987, Immunol. Today 8:111-114)에 대한 결합 부위는 IgE Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 결실될 수 있어서, 상기 부위는 효율적인 분비를 방해하지 못한다. 이와같이, 면역글로불린 경쇄에 결합하는 데 역할을 하는 Fc 영역에 존재하는 시스테인 잔기는 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환 될 수 있으며, 상기 시스테인 잔기는 Fc 영역의 적합한 폴딩을 방해하지 못한다. 막횡단 도메인 서열, 예를 들어 IgM에 존재하는 서열도 또한 결실될 수 있다.
특정 실시예에서, IgG1 Fc 영역이 사용된다. 대안적으로 다른 서브클래스의 면역글로불린 감마(감마-2, 감마-3 및 감마-4)는 분비 카세트에서 사용될 수 있다. 면역글로불린 감마-1은 힌지 영역, CH2 부위, 및 CH3 부위의 최소 부분을 포함한다. 일부 실시예에서는, 면역글로불린 감마-1의 Fc 영역은 CH2 부위를 제외한 힌지 영역 및 CH3 부위의 일부를 포함하는 CH2-결실된-Fc이다. CH2-결실된-Fc는 문헌(Gillies et al., Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990))에 기재되어 있다. 일부 실시예에서는, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 중 하나의 Fc 영역이 사용된다.
LINGO-2-Fc 융합 단백질은 여러가지 다른 배열로 제작될 수 있다. 한 배열에서, 가용성 LINGO-2 펩티드의 C-말단은 Fc 힌지 폴리펩티드의 N-말단에 직접 융합된다. 약간 상이한 배열에서는, 짧은 폴리펩티드, 예를 들어, 2 내지 10 아미노산은 가용성 LINGO-2 폴리펩티드의 N-말단과 Fc 폴리펩티드 C-말단 사이의 융합체에 포함된다. 상기 링커는 구조적인 유연성을 주고, 이는 일부 환경에서는 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다. 힌지 영역의 충분한 부위가 Fc 폴리펩티드에 포함되어 있는 경우, LINGO-2-Fc 융합체는 이량체를 형성함으로써 2가 분자를 형성할 것이다. 단량체의 Fc 융합체의 균일한 집단은 단일특이성, 2가 이량체를 만들것이다. 각각 상이한 특이성을 갖는 두가지 단량체 Fc 융합체는 이중특이성, 이가 이량체를 만들 것이다.
LINGO-2 폴리펩티드 및 항-LINGO-2 항체 폴리펩티드 항체는 또한 이종 폴리펩티드 N- 또는 C-말단에 재조합적으로 융합될 수 있다. 예를 들어, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체는 검출 분석법에서 표지로 유용한 분자 및 효과인자 분자, 예를 들어 이종 폴리펩티드, 약물, 방사성 핵종 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 결합될 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 번호 제5,314,995호; 및 EP 396,387을 참고한다.
또한, LINGO-2 기능을 억제하는 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체 융합체를 포함하거나, 상기 융합체로 필수적으로 구성되거나, 상기 융합체로 구성된 융합단백질이 제공된다. 특정 실시예에서, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체가 융합되는 이종 폴리펩티드는 기능에 유용하거나 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체를 표적화하기에 유용하다. 특정 실시예에서, 가용성 LINGO-2 길항제 폴리펩티드, 예를 들어, LRR 도메인, Ig 도메인, 또는 전체 세포외 도메인(서열 번호 2의 아미노산 28 내지 545에 해당), 또는 본원에서 기재된 임의의 다른 LINGO-2 폴리펩티드 단편, 변이체, 유도체를 포함하는 LINGO-2 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드에 융합되어 LINGO-2 길항제 융합 폴리펩티드를 형성한다. 서열 신호는 소포체 막을 통과하는 단백질 운반을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 면역융합체를 제작하는 데 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들어, 항체 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth. 125:191-202 (1989)), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들어, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열(Sakano et al., Nature 286:5774 (1980))을 포함한다. 대안적으로, 다른 신호 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Watson, Nucl. Acids Res. 12:5145 (1984))을 참고한다. 신호 펩티드는 통상 신호 펩티다제에 의해 소포체 내강에서 절단된다. 결과적으로 Fc 영역 및 가용성 LINGO-2 폴리펩티드를 포함하는 면역융합 단백질이 분비된다.
일부 실시예에서는, DNA 서열은 융합 단백질과 LINGO-2 폴리펩티드 사이에 단백질 분해 절단 부위를 코딩한다. 절단 부위는 코딩된 융합 단백질의 단백질 분해 절단 을 가능하게 하여 표적 단백질로부터 융합된 도메인(예를 들어 Fc 도메인)을 분리시킨다.
LINGO-2 길항제 폴리펩티드 및 항체는 즉, 임의 유형의 분자에 공유적 부착에 의해 변형된 유도체를 포함하며, 상기 공유적 부착은 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체가 LINGO-2의 생물학적기능을 억제하는 것을 막지 못한다. 예를 들어, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 및 항체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 포스필레이션(phosphylation), 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포내 리간드 또는 다른 단백질에 결합 등에 의해 변형될 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 임의의 많은 화학 변형은 특이적 화학절단, 아세틸화, 포밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함한 공지된 기술에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 클래스에 속하지 않는 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시예는 하나 이상의 중합체가 컨쥬게이트된(공유결합) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드 또는 LINGO-2 항체를 수반한다. 상기 중합에 적합한 컨쥬게이션의 예들은 폴리펩티드(상기에 논의됨), 당 중합체 및 폴리알킬렌 글리콜 사슬이다(하기에 논의됨). 필수적이지는 않으나 통상적으로, 중합체는 용해도, 안정도, 또는 생체이용률 중 한 가지 이상을 향상시키는 목적으로 가용성 LINGO-2 폴리펩티드 또는 LINGO-2 항체에 결합된다.
LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체와 컨쥬게이션에 통상적으로 사용되는 중합체 클래스는 폴리알킬렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 가장 빈번하게 사용된다. PEG 부분, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 PEG 중합체는 각 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 컨쥬게이트되어 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체 단독인 경우와 비교하였을 때 혈청 반감기를 증가시켰다. PEG 부분은 비항원성이며 필수적으로 생물학적으로 비활성이다. PEG 부분은 분지되거나, 분지되지않을 수 있다.
LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 부착된 PEG 부분의 수 및 각 PEG 사슬의 분자량은 다를 수 있다. 일반적으로, 중합체 분자량이 높아질 수록, 폴리펩티드에 더 적은 중합체 사슬이 부착된다. 통상, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체에 부착되는 중합체 총량은 20 kDa 내지 40 kDa이다. 따라서, 하나의 중합체 사슬이 부착되는 경우, 각 사슬의 분자량은 일반적으로 20 내지 40 kDa이다. 두개의 사슬이 부착되면, 각 사슬의 분자량은 일반적으로 10 내지 20 kDa이다. 3개의 사슬이 부착되면, 각 사슬의 분자량은 일반적으로 7 내지 14 kDa이다.
중합체, 예를 들어, PEG는 폴리펩티드 상 임의의 적합한 노출 반응기를 통해LINGO-2 길항제 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 노출 반응기는 예를 들어, 내부 리신 잔기의 N-말단 아미노기 또는 엡실론 아미노기, 또는 둘다일 수 있다. 활성화된 중합체는 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체의 임의의 유리 아미노기에 반응하고 공유결합할 수 있다. LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체의 유리 카복실기, 적당히 활성화된 카보닐기, 히드록실, 구아니딜, 이미다졸, 산화된 탄수화물 부분 및 머캡토기는 (이용가능한 경우) 또한 중합체 부착에 반응기로서 사용될 수 있다.
결합 반응에서, 폴리펩티드 농도에 따라 폴리펩티드 1몰당 약 1.0 내지 약 10 몰의 활성화된 중합체가 통상 사용된다. 보통, 선택된 비율은 반응을 최대화하는 것과 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체의 원하는 약리학적 활성에 손상을 줄수 있는 부작용(흔히, 비특이적)을 최소화하는 것의 균형을 나타낸다. 특정 실시예에서, LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체의 50% 이상의 생물학적활성(예를 들어 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 분석법으로 증명된 바와 같이)가 보유된다. 또 다른 실시예에서 거의 100% 보유된다.
VII. LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제
폴리뉴클레오티드는 LINGO-2기능을 상쇄시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제는 운동 뉴런 생존을 촉진하고/하거나 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
특정 실시예는 유효량의 LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 운동 뉴런 관련 장애를 치료하기 위한 방법을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 길항제는 LINGO-2을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 포함한다. LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제는 LINGO-2의 발현을 방지할 수 있다(녹다운). 특정 실시예에서, LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제는 예를 들어 포유동물에서 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭을 촉진한다. LINGO-2 폴리뉴클레오티드 길항제는 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, shRNA 및 RNAi을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 상기 결합 분자는 동물에게 별개로 투여되나(예를 들어 문헌[O'Connor, J. Neurochem. 56:560 (1991)] 참고), 상기 결합 분자는 또한 숙주 세포에 받아들어져 생체 내 발현된 폴리뉴클레오티드로부터 생체내 발현될 수 있다. 또한 문헌(Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988))을 참고한다.
siRNA를 제한없이 포함하여 RNAi를 매개하는 분자는 화학합성(Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), T7 dsRNA의 가수분해(Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), 폴리머라제와 시험관 내 전사(Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), 및 이. 콜라이(E. coli) RN아제 III과 같은 뉴클레아제를 이용한 이중가닥 RNA 가수분해 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 시험관 내에서 제조될 수 있다.
또한, siRNA 분자는 두개의 올리고뉴클레오티드를 서로 어닐링함으로써 형성될 수 있으며, 통상 하기와 같이 이중가닥 및 단일 가닥 부분을 모두 포함한다:
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상기에서 N, X 및 Y는 뉴클레오티드이다.; X는 Y와 수소결합을 한다; ":"는 두 염기 사이의 수소 결합을 나타낸다; x는 1 내지 약 100 값의 자연수; m 및 n은 독립적으로 0 내지 약 100의 값을 갖는 정수이다. 일부 실시예에서는, N, X 및 Y는 독립적으로 A, G, C 및 T 또는 U이다. 비자연 발생 염기 및 뉴클레오티드가 특히 합성 siRNA의 경우 존재할 수 있다(예를 들어 두 올리고뉴클레오티드를 어닐링의 산물). 이중 가닥의 중앙 부분을 "코어"라고 부르고, 염기쌍(bp)을 측정 유니트로 갖는다.; 단일가닥 부분은 오버행(overhang)이며, 뉴클레오티드(nt)를 측정 유니트로 갖는다. 상기 오버행은 3'-오버행이지만 5'-오버행을 갖는 분자 또한 고려된다. 오버행을 갖지 않는 siRNA도 고려되며(즉, m = 0 및 n = 0), 코어의 한쪽에 오버행을 갖고 다른 쪽에는 갖지 않는 것도 고려된다.(예를 들어, m = 0 및 n > 1, 또는 그 반대)
패디슨 등(Paddison et al.(Gnes & Dev. 16:948-958, (2002))는 RNAi를 만드는 방법으로 헤어핀으로 접어진 작은 RNA 분자를 사용하였다. 따라서, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자는 본원에 제공된 방법에 유리하게 사용된다. 줄기의 길이 및 기능적 shRNA 루프는 다양하다. 줄기의 길이는임의의 위치에 약 25 내지 약 30 nt 범위일수 이고 루프 크기는 사일런싱 활성에 영향을 주지 않으면서 약 4 내지 약 25 nt 범위일 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 상기 sh RNA는 DICER RNas의 dsRNA 산물과 유사하며, 어떤 경우에든 특정 유전자 발현을 억제하는 동일한 능력을 갖는다.
일부 실시예에서는, shRNA는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된다(예를 들어, pLL3.7).
안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 3중 나선 형성을 통해 유전자를 조절하는 데 사용될 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들어 문헌(Antisense techniques Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Triple helix formation is discussed in, for instance, Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); 및 Dervan et al., Science 251:1300 (1991))에 논의되어 있다. 방법은 상보적인 DNA 또는 RNA에 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한다.
예를 들어, LINGO-2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-코딩 영역은 약 10 내지 40개 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는 데 사용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적으로 설계되어 표적 단백질의 전사 및 생산을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하고 mRNA 분자의 표적 폴리펩티드로의 번역을 막는다.
안티센스 분자의 절대적인 상보성은 요구되지는 않는다. 최소한의 LINGO-2를 코딩하는 RNA 부위에 상보적인 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 이중식 또는 삼중식을 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미한다. 혼성화 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길에 모두에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화하는 핵산이 커질수록, 이들은 염기 미스매치를 더 많이 포함할 수 있으며, 그럼에도 안정한 이중식(또는 경우에 따라 삼중식)를 형성할 수 있다. 당업자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하는 표준 방법을 이용하여 미스매치를 견딜 수 있는 정도를 확인할 수 있다.
메신저 RNA의 5'-말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지와 상기 코돈을 포함하는 5'-비번역 서열은 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작용한다. 그러나, mRNA의 3'-비번역 서열에 상보적인 서열도 mRNA의 번역을 억제하는 데에 효과적임인 확인되었다. 일반적으로 문헌(Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994))을 참고한다. 따라서, 5'-또는 3'-비번역되는 비코딩 영역은 LINGO-2의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근법에 사용될 수 있다. mRNA의 5'-비번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈 상보체를 포함해야만 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 덜 효율적인 번역 억제제이지만 사용될 수 있다. 안티센스 핵산은 통상 6 이상 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 6 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 특정 측면에서 올리고뉴클레오티드는 10 이상 뉴클레오티드, 17 이상 뉴클레오티드, 25 이상 뉴클레오티드 또는 50 이상 뉴클레오티드이다.
본원에서 개시한 치료 방법을 이용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA 또는 RNA 또는키메라 혼합물 또는 그의 유도체 또는 변형체일 수있다. 올리고뉴클레오티드는 염기 폴리펩티드, 당 폴리펩티드 또는 인산 백본에서 변형되어 예를 들어 분자의 안정성, 혼성화 등을 향상시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 첨부 군, 예를 들어 펩티드(예를 들어, 생체 내 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한), 또는 세포막을 횡단하여 운반을 용이하게 하는 제제(예를 들어, 문헌[Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652 (1987); PCT Publication No. WO88/09810, published December 15, 1988] 참고) 또는 혈관뇌 장벽 횡단을 용이하게 하는 제제(예를 들어, PCT 공보 WO89/10134 (April 25, 1988) 참고)를 포함할 수 있다, 혼성화 유발된 절단제(예를 들어, 문헌[Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)] 참고) 또는 인터킬레이팅제(intercalating agents)(예를 들어, 문헌[Zon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)] 참고). 상기 목적을 위해서, 올리고뉴클레오티드는 또다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 혼성화 유발된 크로스-링킹제, 운반제, 혼성화 유발된 절단제 등이 컨쥬게이트될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 조성물은 또한 촉매 RNA 또는 리보자임을 포함한다(예를 들어, 문헌[PCT International Publication WO 90/11364, published October 4, 1990; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)] 참고). 망치머리형 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측접 영역에 의해 지시되는 위치에서 mRNA를 절단한다. 표적 mRNA 다음 두개의 염기 서열 5'-UG-3'을 갖는 것이 유일한 요건이다. 망치머리형 리보자임의 제작 및 생산 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[Haseloff and Gerlach, Nature 334:585-591 (1988)]에 보다 완전하게 기재되어 있다. 특정 실시예에서, 리보자임은 절단 인식 부위가 표적 mRNA의 5'-말단 근처에 위치하도록, 즉 효율을 증가시키고 비기능적 mRNA 전사체의 세포내 축적을 최소화하도록 조작된다.
안티센스 접근법과 같이, 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있으며(예를 들어, 안정성, 표적화 등의 향상을 위해) 생체 내 LINGO-2를 발현하는 세포로 운반될 수 있다. 리보자임을 코딩하는 DNA 구조물은 안티센스 코딩 DNA의 도입 방법에 기재된 것과 같은 방법으로 세포에 도입될 수 있다. 한가지 운반 방법은 예를 들어, pol III 또는 pol II 프로모터와 같은 강한 구성 또는 유도성 프로모터 조절 하에서 리보자임을 "코딩하는" DNA 구조물의 사용을 수반하며, 그 결과, 형질감염된 세포는 충분한 양의 리보자임을 생산하여 내재의 LINGO-2 메시지를 파괴하고 번역을 억제할 것이다. 안티센스 분자와 다르게 리보자임은 촉매작용을 하기 때문에, 효율을 위해 세포 내 낮은 농도를 필요로 한다.
VIII. LINGO-2 앱타머 길항제
또 다른 실시예에서, LINGO-2 길항제는 앱타머이다. 앱타머는 고유 서열을 갖고, 원하는 표적(예를 들어, 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하는 특성을 가지며, 주어진 표적의 특이적 리간드인 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 뉴클레오티드 앱타머는 LINGO-2에 결합하는 이중가닥 DNA 및 단일 가닥 RNA 분자를 포함한다. 특정 실시예에서, LINGO-2 앱타머 길항제는 예를 들어 포유동물에서 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다.
핵산 앱타머는 당 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 통해 선택된다. SELEX는 예를 들어,전체가 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제5,475,096호, 제5,580,737호, 제5,567,588호, 제5,707,796호, 제5,763,177호, 제6,011,577호, 및 제6,699,843호에 기재된 바와 같이 표적 분자에 매우 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관 내 진화 방법이다. 앱타머를 확인하는 또 다른 스크리닝 방법은 미국 특허 제5,270,163호(본원의 참고에 또한 포함됨)에 기재되어 있다. SELEX 프로세스는 핵산의 다양한 2차 및 3차 구조 형성능, 및 리간드로서 가상의 임의의 화합물과 작용하는(특이적 반응 페어를 형성) 뉴클레오티드 단량체 내에서 가능한 화학적 다기능성에 기초한다. 상기 임의의 화합물은 단량체 또는 중합체의 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 크기 또는 조성의 분자들은 표적으로 역할을 할 수 있다.
LINGO-2의 단백질 구조를 이용하여, SELEX 프로세스를 이용한 LINGO-2에 작용하는 앱타머의 스크리닝은 LINGO-2-매개 과정을 억제하는 앱타머 확인을 가능하게 할 것이다.
폴리펩티드 앱타머는 LINGO-2에 결합함으로써 그들의 작용을 차단할 수 있는 능력에 대해 선별되는 무작위의 펩티드이다. 폴리펩티드 앱타머는 양말단에서 단백질 스캐폴드에 부착된 짧은 가변 펩티드 도메인을 포함할 수 있다. 상기 이중의 구조적인 압박은 펩티드 앱타머의 결합 친화도를 항체에 비교할만한 수준(나노몰 범위)까지 크게 증가시킨다. 예를 들어, 문헌(Hoppe-Seyler F et al. (2000) J Mol Med 78(8):426-430)을 참고한다. 짧은 가변 펩티드 길이는 통상 약 10 내지 20 아미노산이고, 스캐폴드는 우수한 가용성 및 치밀성(compacity) 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 스캐폴드 단백질의 비제한적 예는 박테리아 프로테인 티오레독신-A이다. 예를 들어 문헌(Cohen BA et al. (1998) PNAS 95(24): 14272-14277)을 참고한다.
폴리펩티드 앱타머는 단백질 기능의 우성 억제제로 작용하는 펩티드 또는 작 은 폴리펩티드이다. 펩티드 앱타머는 표적 단백질에 특이적으로 결함하여 이들의 기능적인 능력을 차단한다(Kolonin et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14,266-14,271). 표적 단백질에 고친화도 및 특이성으로 결합하는 펩티드 앱타머는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 단리될 수 있다. 펩티드 앱타머는 이스트 투-하이브리드 스크린 방법(Xu, C.W., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12,473-12,478)에 의해 또는 리보솜 디스플레이(Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942)에 의해 무작위 펩티드 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한, 이들은 파지 라이브러리(Hoogenboom, H.R., et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20)로부터 또는 화학적으로 생성된 펩티드 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 앱타머는 리간드 조절되는 펩티드 앱타머(LiRPA)선별 방법을 이용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌(Binkowski BF et al., (2005) Chem & Biol 12(7): 847-855) 참고한다. 펩티드 앱타머가 합성되는 어려운 방법은 폴리뉴클레오티드 앱타머보다 이들의 사용을 복잡하게 만들지만,무제한의 화학적 다양성을 가진다. 폴리뉴클레오티드 앱타머는 4가지 뉴클레오티드 염기만을 이용하기 때문에 제한적인 반면, 펩티드 앱타머는 보다 확장된 레퍼토리를 가질 것이다(즉, 20개 아미노산).
펩티드 앱타머는 본원의 그밖의 다른 곳에서 폴리펩티드에 대해 기재된 바와 같이 변형될 수 있다(예를 들어, 중합체에 결합되거나 단백질에 융합됨).
IX.벡터와 숙주 세포
숙주 발현 시스템은 관심의 코딩 서열이 제조된 후 정제될 수 있는 비이클을 나타내지만, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염되어질 때 LINGO-2 길항제 폴리펩티드 또는 항체를 제자리 발현할 수 있는 세포 또한 나타낸다. 이들은 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질환된 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 이스트 발현 벡터로 형질전환된 이스트(예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)) ; 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 항체 코딩 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염되거나(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV) 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 포유동물 세포의 게놈 유래(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)또는 포유동물 바이러스 유래(예를 들어, 아데노바이러스 후기(late) 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물을 갖는 포유동물 세포계(예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 전체 재조합 항체 분자 발현을 위한 박테리아 세포(예, 대장균)) 또는 진핵 세포는 재조합 항체 분자 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스의 주요 전초기(intermediate early) 유전자 프로모터 요소과 같이 벡터와 결합된 CHO(Chinese hamster ovary cells)와 같은 포유동물 세포는 효과적인 항체 발현 시스템이다(Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
LINGO-2 길항제, 예를 들어, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드, LINGO-2 항체, LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드, 또는 LINGO-2 앱타머를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 길항제 생산에 사용될 수있다. 상기 핵산이 작동 가능하게 연결된 벡터와 발현 조절 서열의 선택은 원하는 기능적 특성, 예를 들어, 단백질 발현 및 형질전환되는 숙주 세포에 따른다.
작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 조절하는 때 유용한 발현 조절 요소는 해당 기술분야에 공지되어 있다. 실시예는 유도성 프로모터, 구성 프로모터, 분비 신호 및 다른 조절 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유도성 프로모터가 사용되는 경우, 예를 들어, 영양상태의 변화, 또는 온도, 숙주 세포의 변화에 의해 조절될 수 있다.
한 실시예에서, 상품명 NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)인 발현 벡터(Biogen IDEC, Inc.사)가 사용될 수 있다. 상기 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 선도 서열을 포함한다. 상기 벡터는 CHO 세포 내 형질감염 시 매우 고수준 발현, 이어서 G418 함유 배지 내 선별 및 메토트렉세이트 증식을 가져온 다는 것이 확인되었다. 물론, 세포 내에서 발현을 유도할 수 있는 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen사, San Diego, CA), 및 플라스미드 pCI(Promega사, Madison, WI). 추가적인 세포 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 전형적으로, 상기 벡터들은 원하는 DNA 세그먼트를 삽입하기에 편리한 제한 부위를 포함한다. 전형적인 벡터에는 pSVL 및 pKSV-10(Pharmacia사), pBPV-1, pml2d(International Biotechnologies사), pTDT1(ATCC 31255), 레트로바이러스 발현 벡터 pMIG 및 pLL3.7, 아데노바이러스 셔틀 벡터 pDC315, AAV 벡터가 포함되며, pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(BioRad사), pPL 및 pKK223(Pharmacia사)이 있다. 다른 전형적인 벡터 시스템은 예를 들어 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.
X. 유전자 치료법
LINGO-2 길항제는 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진시키는 것이 치료적으로 유익한 신경계 질병, 장애 또는 손상을 치료하는 유전자 치료 접근법을 이용하여 포유동물, 예를 들어, 인간 환자의 생체 내에서 생산될 수 있다. 상기는 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 적합한 LINGO-2 길항제 코딩 핵산의 투여를 수반한다. 일반적으로, 상기 서열은 바이러스 벡터에 포함되어 진다. 상기 유전자 치료법에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 엡스테인 바 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데도 연관 바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스가 포함된다. 바이러스 벡터는 복제 결핍 바이러스 벡터일 수 있다. E1 유전자 또는 E3 유전자 내 결실 부위를 갖는 아데노바이러스 벡터가 통상 사용된다. 아데노바이러스 벡터가 사용되는 경우, 통상적으로 벡터는 선택가능한 마커 유전자를 포함하지 않는다.
XI. 약학 조성물
LINGO-2 길항제는 인간을 포함한 포유동물 투여용 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 이들 담체는 예를 들어, 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 식물성 포화 지방산의 부분적인 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 황산염, 인산수소이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이달 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 라놀린을 포함한다.
조성물은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 비경구, 뇌실내, 경구, 흡입 스프레이에 의한, 국소, 직장, 코, 구강, 질, 또는 이식된 저장소를 통한 방법으로 투여 될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 윤활내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 투여 또는 주입 기술을 포함한다. 앞서 기재한 바와 같이, 본원에서 제공된 방법에서 사용한 LINGO-2 길항제는 신경계에서 작용하여 운동 뉴런의 생존 및/또는 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다. 따라서, 특정 방법에서 LINGO-2 길항제는 혈관뇌 장벽을 횡단하는 방법으로 투여된다. 상기 횡단은 LINGO-2 길항제 분자 자체에 내재하는 생리화학적 특성, 약제학적 제형 내 다른 구성요소, 혈관뇌 장벽을 뚫을 수 있는 바늘, 캐뉼라, 또는 외과 기구와 같은 기계 장치의 사용에 의해 일어날 수 있다. LINGO-2 길항제가 내재적으로 혈관뇌 장벽을 횡단하지 않는 분자인 경우, 예를 들어 횡단을 가능하게 하는 폴리펩티드에 융합체인 경우, 적합한 투여 경로는 예를 들어 척수강내 또는 두개내이다. LINGO-2 길항제가 내재적으로 혈관뇌 장벽을 횡단하는 경우, 투여 경로는 하기에 기재된 하나 이상의 다양한 경로일 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 사용되는 멸균의 주사가능한 형태는 수성 또는 유성 현탁액이다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 멸균의 주사가능한 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 내 멸균의 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,2-부탄디올 내 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비이클 및 용매는 물, 링거액 및 염화나트륨 등장액이 사용될 수 있다. 또한, 멸균의 고정유(fixed oil)는 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해, 합성의 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하여 임의의 완하성 지방유(bland fixed oil)가 사용될 수 있다. 올레산 및 그의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 주사가능한 제제에 유용하며, 천연의 약제학적으로 허용가능한 오일, 예를 들어 올리브 오일, 캐스터 오일, 특히 폴리옥시에틸화된 형태도 마찬가지이다. 상기 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄의 알콜 희석제 또는 분산제, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로오스, 또는 유사 분산제를 포함할 수 있으며, 상기 유사 분산제는 에멀젼 및 현탁액을 포함한 약제학적으로 허용가능한 투여 형태의 제제에 일반적으로 사용된다. 그밖에 일반적으로 사용되는 계면활성제, 예를 들어 Tweens, Span, 및 약학적으로 허용가능한 고체, 액체 또는 다른 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는, 그밖에 유화제 또는 생체이용 개선제는 제제의 목적에 따라 사용될 수 있다.
비경구 제제는 볼루스 투여량, 주입 또는 부하(loading) 볼루스 투여량에 이어 유지 투여량일 수 있다. 상기 조성물은 특별히 고정되거나 가변적 간격, 예를 들어, 1일 1회, 또는 "필요한 때" 기준으로 투여될 수 있다.
특정 약학 조성물은 허용가능한 제형, 예를 들어 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액으로 경구 투여될 수 있다. 또한, 특정 약학 조성물은 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 벤질알콜 또는 다른 적합한 방부제, 생체이용율을 향상시키는 흡수 촉진제 및/또는 그밖의 통상의 가용화제 또는 분산제를 이용하여 식염수 내 용액으로 제조될 수 있다.
담체 물질과 결합되어 단일 제형으로 제조될 수 있는 LINGO-2 길항제의 양은 치료받는 숙주, 사용되는 길항제 유형 및 특정 투여 형태에 따라 다를 것이다. 조성물은 단회 투여, 다회 투여, 정해진 기간에 걸친 주입으로 투여될 수 있다. 또한 투여 요법은 최적으로 요구되는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응).
본원에서 제공된 방법은 LINGO-2 길항제의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 사용한다. 상기 치료적 또는 예방적 유효량은 질병 상태, 나이, 성별 및 개인의 체중과 같은 인자에 따라 다르다. 치료적 또는 예방적 유효량은 또한 치료적으로 유익한 효과에 비해 임의의 독성 또는 해로운 효과가 커지는 양일 수 있다.
임의의 특정 환자를 위한 구체적인 투여 및 치료 요법은 사용된 특정 LINGO-2 길항제, 환자의 나이, 체중, 일반 건강, 성별 및 식습관, 투여 시간, 분비율, 약물 조합 및 치료받을 특정 질병의 중증도를 포함한 여러가지 인자에 의존한다. 의료진에 의한 상기 판단은 당업계의 통상의 지식 내에 있다. 또한 양은 치료받는 각 환자, 투여 경로, 제제 유형, 사용된 화합물의 특징, 질병의 중증도 및 원하는 효과에 따른다. 사용되는 양은 당업계에 공지된 약리학적 및 약동학적 원리에 의해 결정될 수 있다.
LINGO-2 길항제는 신경계 뇌실내 또는 척수강내에 직접 투여될 수 있거나 전신적으로 투여될 수 있다. 투여용 조성물은 하루에 LINGO-2 길항제 0.001　내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여되도록 제제화될 수 있다. 일부 실시예에서는,투여량은 하루에 0.01 내지1.0 mg/kg(체중)이다. 일부 실시예에서는, 투여량은 하루에 0.01 내지 0.5 mg/kg(체중)이다
LINGO-2 길항제 항체로 치료하는 경우, 투여량은 예를 들어, 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg(예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1mg/kg, 2 mg/kg 등) 범위에 있을 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1 내지 10 mg/kg 범위 내, 예를 들어, 1 mg/kg 이상일 수 있다. 상기 범위의 중간 투여량Doses 또한 유용하다. 피험자는 상기 투여량을 매일, 격일, 주1회 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 전형적인 치료법은 오랜 기간, 예를 들어 6개월 이상에 걸쳐 다회 투여를 수반한다. 또다른 전형적인 치료 요법은 매 2주 1회, 매월 1회, 매 3 내지 6개월에 1회 투여를 수반한다. 모범적인 투여 스케줄은 연일 1 내지 10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서는, 상이한 결합 특이성을 갖는 2가지 이상의 단일클론 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여된 각 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 있다.
특정 실시예에서, 피험자는 LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 분자로 치료될 수 있다. 핵산의 투여량은 환자 당 약 10 ng 내지 1g, 100ng 내지 100mg, 1mg 내지 10mg, 또는 30 내지 300㎍ DNA 범위에 있다. 감염 바이러스 벡터의 투여량은 투여 당 10 내지 100 이상이다.
또한, 보조적인 활성 화합물이 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 가용성 LINGO-2 폴리펩티드 또는 융합 단백질은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 제제화되고/되거나 함께 투여될 수 있다.
수용액의 볼루스 주사 또는 제어 방출 시스템의 이식이 포함한, LINGO-2 길항제를 선택된 표적 조직에 운반하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 제어 방출 이식은 반복된 주사에 대한 필요성을 감소시킨다.
본원의 방법에서 사용된 LINGO-2 길항제는 뇌에 직접 주입될 수 있다. 화합물의 직접적인 뇌 주입을 위한 다양한 이식물은 공지되어 있으며, 신경장애를 겪고 있는 인간 환자에게 치료화합물을 운반하는데 효과적이다. 이들은 정위적으로 이식된 펌프를 이용하여 뇌로의 지속 주입, 일시적인 세포간 카테터, 영구적 두개내 카테터 이식물, 및 외과적으로 이식된 생분해성 이식물을 포함한다. 예를 들어, 문헌(Gill et al., supra; Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-591 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-982 (1999); chapter 66, pages 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," in Gildenberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); 및 Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995))을 참고한다.
또한, 조성물은 화합물에 적합한 운반 또는 지지 시스템으로서 기능을 하는 생체적합한 담체 물질에 분산된 LINGO-2 길항제를 포함할 수 있다. 서방성 담체의 적합한 예는 좌약 또는 캡슐과 같은 성형품 형태의 반투과성 중합체를 포함한다. 이식가능한 또는 마이크로캡슐의 성방성 매트릭스는 폴리락티드(미국 특허 번호 3,773,319; EP 58,481), L-글루탐산 및 감마-에틸 글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)); 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)를 포함한다.
일부 실시예에서는, LINGO-2 길항제는 뇌의 적합한 영역에 직접 주입에 의해 환자에 투여된다. 예를 들어 문헌(Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease,(Nature Med. 9: 589-95 (2003))을 참고한다. 또 다른 기술이 가능하며, LINGO-2 길항제를 투여하는 데에 적용될 수 있다. 예를 들어, 카테터 또는 이식체의 정위적 설치는 Riechert-Mundinger 유닛 및 ZD(Zamorano-Dujovny) 로컬라이징(localizing) 유닛을 사용하여 수행될 수 있다. 120ml 옴니파큐(omnipaque), 350 mg 요오드/ml를 2 mm 슬라이스 두께로 주사하고, 대비 증강된 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔은 3차원 다면상 치료 플래닝(STP, Fischer, Freiburg, Germany)을 가능하게 한다. 상기 장비는 정확한 표적 확인을 위해 CT와 MRI를 합하여 자기 공명 영상 연구를 기반으로 한 플래닝을 가능하게 한다.
GE CT 스캐너(General Electric Company사, Milwaukee, WI)와 사용하기 위해 변형된 Leksell 정위 시스템(Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) 및 BRW(Brown-Roberts-Wells) 정위 시스템(Radionics, Burlington, MA)이 상기 목적에 사용될 수 있다. 따라서, 이식일 아침, BRW 정위 프레임의 환상의 베이스 고리는 환자의 두개골에 부착될 수 있다. 그래피트 로드 로칼라이저(graphite rod localizer)로 (표적 조직) 영역이 베이스 플레이트에 고정되지만, 연속적인 CT 단편은 3 mm 간격으로 얻을 수 있다, 전산화 치료 플래닝 프로그램은 CT 공간과 BRW 공간 사이에 맵핑하는 그래피트 로드 이미지의 CT 좌표를 이용하여 VAX 11/780 컴퓨터(Digital Equipment Corporation사, Maynard, Mass.)에 작동될 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같이 운동 뉴런 관련 장애의 치료 방법은 전형적으인간에 사용하기에 앞서로 원하는 치료 또는 예방 활성에 대해 시험관 내에서 시험한 후 적용 가능한 동물 모델에서 시험된다. 형질전환 동물을 포함한 적합한 동물 모델은 당업자에게 잘 알려지 있을 것이다. 예를 들어 LINGO-2 길항제의 생존 효과를 증명하는 시험관 내 분석법은 본원에 기재되어 있다. 운동 뉴런 생존 및 운동 뉴런 축삭 성장에 대한 LINGO-2 길항제의 효과는 실시예에 기재된 대로 시험관 내에서 시험될수 있다. 마지막으로, 생체 내 시험은 LINGO-2 길항제를 발현하는 형질전환 마우스를 만듬으로써, 또는 LINGO-2 길항제를 본원에 기재된 바와 같은 모델의 마우스 또는 랫트에 투여함으로써 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1: LINGO-2는 중추 신경계에서 특이적으로 발현된다
랫트 및 마우스 조직에서 LINGO-2 발현은 다음 방법에 따라 정량 PCR(Q-PCR)분석법으로 평가하였다. 랫트 RNA은 클론테크(Clontech)사로 부터 구입하였고 마우스 RNA는 P6 마우스 조직으로 부터 제조하였다. mRNA는 앱솔루틀리 RNA 미니프렙 키트(Stratagene사)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 조직 특이적 최초 가닥 cDNA는 mRNA로부터 합성하고 택맨(Taqman) RT-PCR(필수적으로 문헌[Mi et al., Nature Neuroscience 7:221-228 (2004)]에 기재된 대로 수행함)을 하여 LINGO-2 mRNA 수준을 정량하였다. 이때, (i) 정방향 프라이머 5'-ACCTTGTATACCTGACCCACCTTAA-3' (서열 번호 23), (ii) 역방향 프라이머 5'-AGAGAACATGCCTGCTTCAATAGTG-3' (랫트) (서열 번호 24) 또는 5'- AGAGAACATGCCAGCTTCAATAGTG-3' (마우스) (서열 번호 25) 및 (iii) MGB 프루브(Applied Biosystems사) 5'-CCTCTCCTACAATCCC-3' (서열 번호 26)를 사용하였다. 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan Gene Expression system)(Mx3000P)을 사용하여 mRNA 수준을 정량하였다.
상대적인 LINGO-2 발현 수준은 우선 조직 내 LINGO-2 mRNA 수준을 동일 조직 내 β-액틴 mRNA 수준으로 정규화하여 결정하였다. β-액틴 mRNA 수준은 프라이머 세트 Rn0067869_m1(랫트) 또는 Mn00607939(마우스)(Applied Biosystems사)를 사용하여 동시에 정량하였다. 이어서, 상대적인 LINGO-2 mRNA 수준은 각 조직 내 정규화된 LINGO-2 mRNA 수준을 모두 1의 값으로 지정된, 랫트의 경우 지정된 유니버셜 세트의 및 마우스의 경우 폐조직 내 정규화된 발현 수준과 비교하여 결정하였다. 상대적인 LINGO-2 발현 수준은 랫트의 경우는 도 1에, P6 마우스 조직의 경우는 도 2에 나타낸다. 랫트에서, LINGO-2는 뇌에서 최대로 발현되었다. 흉선, 위, 간, 결장, 심장, 태반, 신장, 비장, 유방 및 폐에서 발현 수준은 낮거나 배경에 비해 검출불가 하였다. P6 마우스 조직에서, LINGO-2는 뇌 및 척수에서 최대로 발현되었다. 현저하게, 척수 발현 수준이 뇌 발현 수준보다 높았다. 이것은 뇌 발현이 척수 발현보다 높게 관찰되었던 LINGO-1와는 상반된다. 심장, 신장, 간, 비장, 장, 피부 및 위에서 LINGO-2의 발현은 낮거나 배경에 비해 검출불가하였다.
실시예 2: LINGO-2는 피질 및 DRG 뉴런에서 높게 발현된다
랫트 뉴런 세포 내 LINGO-2 발현은 하기 방법에 의해 정량 PCR(Q-PCR) 분석법으로 평가하였다. 랫트 뉴런 세포군으로부터 RNA를 얻고, 앱솔루틀리 RNA 미니프렙 키트(Stratagene사)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 mRNA를 추출하였다. 최초 가닥 cDNA는 RNA로부터 합성하고 택맨 RT-PCR(기본적으로 문헌[Mi et al., Nature Neuroscience 7:221-228 (2004)]에 기재된 대로 수행함)을 하여 LINGO-2 mRNA 수준을 정량하였다. 이때 실시예1 에서 기재된 대로 서열 번호 23 내지 26의 프라이머를 사용하였다. 택맨 유전자 발현 시스템(Mx3000P)을 사용하여 mRNA 수준을 정량하였다.
상대적인 LINGO-2 발현 수준은 우선 뉴런 세포군 내 LINGO-2 mRNA 수준을 동인 뉴런 세포군 내 β-액틴 mRNA 수준으로 정규화하여 결정하였다. 이어서, 상대적인 LINGO-2 mRNA 수준은 각 조직 내 정규화된 LINGO-2 mRNA 수준을 1의 값으로 지정된 희소아교세포 전구 세포(OPC) 내 정규화된 발현 수준과 비교하여 결정하였다. 상대적인 LINGO-2 발현 수준은 도 3에 나타낸다. LINGO-2는 피질 및 후근신경절(DRG) 뉴런에서 최대로 발현되었다. 성상세포 내 발현도 검출가능하였으나, 피질 및 DRG 뉴런에 비해 적었다. 발현 수준은 미세아교세포(microglial cell) 내에서 가장 낮았다.
실시예 3: LINGO-2-Fc 융합 단백질의 제조 및 정제
인간 LINGO-2의 세포외 부분(잔기 1 내지 500)을 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 영역에 융합하여 구조물을 만들었다. 가용성 LINGO-2 단백질 서열은 하기에 나타낸다.
Figure pct00015
실시예 4: LINGO-2-특이적 단일클론 항체의 생산
LINGO-2에 특이적으로 결합하는 항 LING-2 항체는 3.5 x 1010 고유 클론을 포함하는 인간 미처리 파지미드 Fab 라이브러리를 클로닝하여(Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):344-8) 제조하였다. 앞서 기재한 바와 같이 선별하고, 항체 C09를 확인하였다. C09 서열은 표 3 내지 6에 제공한다. 결합 실험은 C09 항체가 LINGO-2에는 결합하나, LINGO-1에는 결합하지 않는다는 것을 증명한다. 또한, C09 항체는 LINGO-2의 LRR7 내지 LRR12 포함 LINGO 구조물에는 결합하나 LINGO-2의 LRR1 내지 LRR6이 결여된 구조물에는 결합하지 않는다
실시예 5: 가용성 LINGO-2 또는 항-LINGO-2 항체에 의한 LINGO-2의 블로킹은 인간 운동 뉴런 생존을 촉진한다
인간 배아 줄기 세포 유래 인간 운동 뉴런(hESc)(Lonza사)을 96 웰 플레이트에서 0.025% 트립신/EDTA로 트립신화하고 모터블라스트 미디어(Lonza사)내 5 x 104/웰의 농도로 다시 플레이팅하였다. 세포는 5% CO2로 가습된 공기 하 37℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 0.5 mM 아비산 나트륨으로 30분간 처리하였다. 아비산 나트륨은 산화 손상을 일으켜 세포사를 유도한다. 세포를 3회 세척한 후 50㎍/㎖ 가용성 LINGO-2-Fc, 10 ㎍/㎖ 항-LINGO-2 C09 Fab, 또는 대조군 hIgG를 함유하는 새로운 모터블라스트 미디어를 세포에 첨가하였다. 배양물은 5% CO2로 가습된 공기 하 37℃에서 24시간 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하였다.
세포에 항-βIII 튜불린(Covance사) 및 항-뉴로필라멘트(Millipore사)를 사용하는 면역염색법을 실시하여 운동 뉴런을 염색하였다(도 4).
도 4에 나타낸 바와 같이, 아비산 나트륨 처리는 운동 뉴런 수를 감소시켰다. 그러나 가용성 LINGO-2-Fc 및 항-LINGO-2 C09 Fab 모두 아비산 나트륨-유도된 운동 뉴런 사멸을 약화시켰다.
실시예 6: 가용성 LINGO-2에 의한 LINGO-2 차단은 운동 뉴런 축삭 성장을 촉진한다
운동 뉴런은 니코덴즈 기울기 원심분리법을 이용하여 배아 16일령(E16)의 랫트 척수로부터 단리하였다. E16 랫트 배아를 절개하여 0.025% 트립신 내 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 트립신 용액은 3:1 부피의 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 대 영양 혼합물 F-12 Ham(DMEM/F12), 및 0.004% DN아제를 함유하는 배지로 교체하였다. 척수 세포는 5분간 인큐베이션한 후 세포 현탁액이 균질해질 때까지 부드럽게 분쇄하여 해리하였다. 생성된 척수 현탁액은 4% 소혈청 알부민(BSA) 쿠션에 층을 형성시키고, 용액을 100 x g 4℃에서 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하였다. 세포 펠렛은 0.004% DN아제 함유 DMEM/F12배지에 재현탁시켜, 8.01%, 7.66%, 및 7.05%의 니코덴즈 기울기에 층을 형성시켰다. 기울기는 500 x g에서 원심분리하였다. 운동 뉴런은 배지와 7.05% 용액 사이에서 백색의 탁한 덩어리로 확인되어 회수하였다.
회수된 운동 뉴런은 10 ㎍/㎖ 폴리-D 리신 및 10 ㎍/㎖ lamini로 코팅된 4-챔버 슬라이드에 운동 뉴런 성장 배지(1:1 비율의 2% B27 및 0.5 mM 글루타민이 보충된 뉴로베이설 배지와 0.4 ㎍/㎖ 히드로코르티손, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 및 10% 소태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM/F12 배지(3:1)) 내 5 x 104 세포/웰 농도로 평판 배양하였다. 생성된 배지에 10 ng/mL 뉴로트로핀-3, 10 ng/mL 뇌-유래 뉴트로핀 인자, 10 ng/mL 신경교세포주-유래 뉴트로핀 인자, 10 ng/mL 섬모 뉴트로핀 인자, 및 항생제를 보충하였다. 세포는 5% CO2로 가습된 공기 하 37℃에서 밤새 배양한 후, 0.5 mM 아비산나트륨으로 30분간 처리하였다. 세포는 3회 세척한 후, 50 ㎍/㎖ 가용성 LINGO-2-Fc 또는 대조군 hIgG 함유된 새로운 운동 뉴런 성장를 첨가하였다. 배양물은 5% CO2,로 가습된 공기 하 37℃에서 24시간 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하였다.
운동 뉴런을 항-뉴로필라멘트(Millipore사)를 사용하여 염색하기위해 세포에 면역세포화학 분석법을 실시하였다(도 5). 각 뉴런에서 가장 긴 신경돌기는 축삭으로 간주하고 축삭 길이를 오픈랩(Openlab) 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 세포에 아비산나트륨 처리 후, 가용성 LINGO-2는 hIgG 대조군 처리된 세포에 비해 뉴런 축삭 성장을 대략 20% 촉진하였다.
실시예 7: LINGO-2 발현 수준은 SODG93A 마우스 내에서 상승 조절된다
변이형 구리/아연 수퍼옥시드 디스뮤타제(SOD1) DNA(예를 들어, SODG39A)로 형질전환된 동물은 인간 근위축성 측삭 경화증(ALS) 환자와 유사한 마비성 운동 뉴런 질병이 생기며, 일반적으로 ALS 모델로 사용된다(Narai et al., Neurol. Int. 1:e16 (2009)).
65일령 SODG93A 또는 연령 일치 대조군 야생형 마우스를 인산 완충 식염수(PBS)로 관류시키고, 척수를 절제하였다. 척수는 4% 파라포름알데히드 내에서 고정시키고, 척수 흉부를 크라이오스탯 절편을 위해 최적 절단 온도(O.C.T) 화합물에 매몰시켰다. 동결 절편을 디그옥시제닌(Digoxygenin)-표지된 LINGO-2 항-센스 RNA 프로브
Figure pct00016
및
디그옥시제닌-표지된 센스 RNA 프로브
Figure pct00017
로 프로브하였다.
이어서, 절편을 TSA(tyramide signal amplification) 플러스 형광 항-디그옥시제닌 컨쥬게이트된 항체 키트(Perkin Elmer사)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 염색하였다.
정량분석은 각 슬라이드에서 배쪽뿔 구역 내 LINGO-2 양성 세포 수를 오픈랩 소프트웨어를 사용하여 20x로 계수하여 실시하였다. SODG39A 및 야생형 마우스 모두 각각 세 마리씩 분석하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 제자리 혼성화로 측정하였을 때, LINGO-2 발현 수준은 65일령 SODG39A 마우스 척수의 배쪽뿔에서 상승 조절되었다. 야생형 대조군 마우스에 비해 SODG39A 마우스에서 LINGO-2 양성 세포 수는 2배 증가하였으며 더 높은 염색 강도를 보였다.
실시예 8: LINGO-2 길항제는 ALS 내 운동 뉴런 성장 및 생존을 촉진한다
인간 SODG93A를 발현하는 형질전환 마우스 및 연령 일치 대조군을 PBS(비이클 대조군), 대조군 항체 또는 항-LINGO-2 항체, 예를 들어 C09로 처리하였다. 처리는 주단위로 복강 내 주사로 제공하였다. 마우스는 일령 84일 내지 90일의 마우스를 희생시켜 근육량 및 조직학 분석을 평가하였다(예를 들어, 운동 뉴런 생존을 평가함). 다른 마우스는 추가 시간, 예를 들어, 약 134일 동안 질병 진행(예를 들어, 좌측 및 우측 횡와위로부터 바로 서는 능력 및 악력)을 모니터하였다.
실시예 9: LINGO-2 길항제는 AKT 인산화를 상승 조절한다
운동 뉴런을 동일 농도의 항-LINGO-2 항체, C09 또는 대조군 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 세포 용해질을 회수하여 인산화된-AKT 단백질 수준을 웨스턴 분석법으로 분석하였다. 또한, β-액틴의 수준을 대조군으로서 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 항-LINGO-2 항체는 AKT 인산화를 증가시켰다.
실시예 10: LINGO-2 길항제는 희소돌기아교세포 분화를 촉진한다
항-LINGO-2 항체의 역할을 시험관 내에서 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구 세포는 C09 항체를 증가하는 양으로 처리하고 수초 결합 당단백질(MAG) 및 수초 염기 단백질(MBP)을 웨스턴블로팅으로 검사하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, C09 항체의 처리는 용량 의존적 방식으로 MAG 및 MBP 수준을 증가시켰다. MPB는 성숙 희소돌기아교세포의 표지자이다. 따라서, 이러한 자료는 LINGO-2 길항제가 희소돌기아교세포 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> MI, Sha <120> LINGO-2 ANTAGONISTS FOR TREATMENT OF CONDITIONS INVOLVING MOTOR NEURONS <130> 2159.361PC02/EJH/CLD <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/798,398 <151> 2013-03-15 <150> 61/646,611 <151> 2012-05-14 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2792 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aatttagaga agatgtaggg agtgttcaac atgttcgttg tggaagagaa agagctaaga 60 gagaggagct taaagacaca aacgggtaga atcaaggagt gtgctctcaa atgagaggaa 120 caggagtgac attaaccttg aaatgctcgg agactctact ccttcatgac agtaggagga 180 taattaacaa tagatacaaa tgcaggaatt gatgagtgcc atcagaaagc tgtatcatga 240 gctgcctgca cttctaaagt gtccagtgga tttttaatca catgagcctg gaaatagggt 300 tatgaaaaga agctcagagc agagcaccga aagtggccac taccagcatg aagagcccaa 360 caattcaaac tggtgaagtg agaaaaacag aatgcagctt tcaaggttcg tttcaagcag 420 ttggcttgtg ggactctgag agatgctgct gcccatgaca tgcgggaatt atcatgatca 480 actacccagc ttggatttca tccagtggcc aagagctttg tgtgggagac ggcaagggtt 540 ggatttttca aaagagtaaa ccaggataaa tcatgaggaa cctataaccc ttttggccac 600 atgcaaaaaa gcaagacccg tgaccaaggt gtagactaag aagtggagtc atgcttcaca 660 cggccatatc atgctggcag ccattcctgg gtctggctgt ggtgttaatc ttcatgggat 720 ccaccattgg ctgccccgct cgctgtgagt gctctgccca gaacaaatct gttagctgtc 780 acagaaggcg attgatcgcc atcccagagg gcattcccat cgaaaccaaa atcttggacc 840 tcagtaaaaa caggctaaaa agcgtcaacc ctgaagaatt catatcatat cctctgctgg 900 aagagataga cttgagtgac aacatcattg ccaatgtgga accaggagca ttcaacaatc 960 tctttaacct gcgttccctc cgcctaaaag gcaatcgtct aaagctggtc cctttgggag 1020 tattcacggg gctgtccaat ctcactaagc ttgacattag tgagaataag attgtcattt 1080 tactagacta catgttccaa gatctacata acctgaagtc tctagaagtg ggggacaatg 1140 atttggttta tatatcacac agggcattca gtgggcttct tagcttggag cagctcaccc 1200 tggagaaatg caacttaaca gcagtaccaa cagaagccct ctcccacctc cgcagcctca 1260 tcagcctgca tctgaagcat ctcaatatca acaatatgcc tgtgtatgcc tttaaaagat 1320 tgttccacct gaaacaccta gagattgact attggccttt actggatatg atgcctgcca 1380 atagcctcta cggtctcaac ctcacatccc tttcagtcac caacaccaat ctgtctactg 1440 tacccttcct tgcctttaaa cacctggtat acctgactca ccttaacctc tcctacaatc 1500 ccatcagcac tattgaagca ggcatgttct ctgacctgat ccgccttcag gagcttcata 1560 tagtgggggc ccagcttcgc accattgagc ctcactcctt ccaagggctc cgcttcctac 1620 gcgtgctcaa tgtgtctcag aacctgctgg aaactttgga agagaatgtc ttctcctccc 1680 ctagggctct ggaggtcttg agcattaaca acaaccctct ggcctgtgac tgccgccttc 1740 tctggatctt gcagcgacag cccaccctgc agtttggtgg ccagcaacct atgtgtgctg 1800 gcccagacac catccgtgag aggtctttca aggatttcca tagcactgcc ctttcttttt 1860 actttacctg caaaaaaccc aaaatccgtg aaaagaagtt gcagcatctg ctagtagatg 1920 aagggcagac agtccagcta gaatgcagtg cagatggaga cccgcagcct gtgatttcct 1980 gggtgacacc ccgaaggcgt ttcatcacca ccaagtccaa tggaagagcc accgtgttgg 2040 gtgatggcac cttggaaatc cgctttgccc aggatcaaga cagcgggatg tatgtttgca 2100 tcgctagcaa tgctgctggg aatgatacct tcacagcctc cttaactgtg aaaggattcg 2160 cttcagatcg ttttctttat gcgaacagga cccctatgta catgaccgac tccaatgaca 2220 ccatttccaa tggcaccaat gccaatactt tttccctgga ccttaaaaca atactggtgt 2280 ctacagctat gggctgcttc acattcctgg gagtggtttt attttgtttt cttctccttt 2340 ttgtgtggag ccgagggaaa ggcaagcaca aaaacagcat tgaccttgag tatgtgccca 2400 gaaaaaacaa tggtgctgtt gtggaaggag aggtagctgg acccaggagg ttcaacatga 2460 aaatgatttg aaggcccacc cctcacatta ctgtctcttt gtcaatgtgg gtaatcagta 2520 agacagtatg gcacagtaaa ttactagatt aagaggcagc catgtgcagc tgcccctgta 2580 tcaaaagcag ggtctatgga agcaggagga cttccaatgg agactctcca tcgaaaggca 2640 ggcaggcagg catgtgtcag agcccttcac acagtgggat actaagtgtt tgcgttgcaa 2700 atattggcgt tctggggatc tcagtaatga acctgaatat ttggctcaca ctcacggaca 2760 attattcagc attttctacc actgcaaaaa ac 2792 <210> 2 <211> 606 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu His Thr Ala Ile Ser Cys Trp Gln Pro Phe Leu Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Leu Ile Phe Met Gly Ser Thr Ile Gly Cys Pro Ala Arg Cys 20 25 30 Glu Cys Ser Ala Gln Asn Lys Ser Val Ser Cys His Arg Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Ala Ile Pro Glu Gly Ile Pro Ile Glu Thr Lys Ile Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Arg Leu Lys Ser Val Asn Pro Glu Glu Phe Ile Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Leu Leu Glu Glu Ile Asp Leu Ser Asp Asn Ile Ile Ala Asn Val 85 90 95 Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Ser Leu Arg Leu 100 105 110 Lys Gly Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu 115 120 125 Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu 130 135 140 Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu 165 170 175 Leu Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ala Val 180 185 190 Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu Arg Ser Leu Ile Ser Leu His Leu 195 200 205 Lys His Leu Asn Ile Asn Asn Met Pro Val Tyr Ala Phe Lys Arg Leu 210 215 220 Phe His Leu Lys His Leu Glu Ile Asp Tyr Trp Pro Leu Leu Asp Met 225 230 235 240 Met Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Val 245 250 255 Thr Asn Thr Asn Leu Ser Thr Val Pro Phe Leu Ala Phe Lys His Leu 260 265 270 Val Tyr Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile 275 280 285 Glu Ala Gly Met Phe Ser Asp Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu His Ile 290 295 300 Val Gly Ala Gln Leu Arg Thr Ile Glu Pro His Ser Phe Gln Gly Leu 305 310 315 320 Arg Phe Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gln Asn Leu Leu Glu Thr Leu 325 330 335 Glu Glu Asn Val Phe Ser Ser Pro Arg Ala Leu Glu Val Leu Ser Ile 340 345 350 Asn Asn Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Ile Leu Gln 355 360 365 Arg Gln Pro Thr Leu Gln Phe Gly Gly Gln Gln Pro Met Cys Ala Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Ile Arg Glu Arg Ser Phe Lys Asp Phe His Ser Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Phe Tyr Phe Thr Cys Lys Lys Pro Lys Ile Arg Glu Lys Lys 405 410 415 Leu Gln His Leu Leu Val Asp Glu Gly Gln Thr Val Gln Leu Glu Cys 420 425 430 Ser Ala Asp Gly Asp Pro Gln Pro Val Ile Ser Trp Val Thr Pro Arg 435 440 445 Arg Arg Phe Ile Thr Thr Lys Ser Asn Gly Arg Ala Thr Val Leu Gly 450 455 460 Asp Gly Thr Leu Glu Ile Arg Phe Ala Gln Asp Gln Asp Ser Gly Met 465 470 475 480 Tyr Val Cys Ile Ala Ser Asn Ala Ala Gly Asn Asp Thr Phe Thr Ala 485 490 495 Ser Leu Thr Val Lys Gly Phe Ala Ser Asp Arg Phe Leu Tyr Ala Asn 500 505 510 Arg Thr Pro Met Tyr Met Thr Asp Ser Asn Asp Thr Ile Ser Asn Gly 515 520 525 Thr Asn Ala Asn Thr Phe Ser Leu Asp Leu Lys Thr Ile Leu Val Ser 530 535 540 Thr Ala Met Gly Cys Phe Thr Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Phe 545 550 555 560 Leu Leu Leu Phe Val Trp Ser Arg Gly Lys Gly Lys His Lys Asn Ser 565 570 575 Ile Asp Leu Glu Tyr Val Pro Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Val Glu 580 585 590 Gly Glu Val Ala Gly Pro Arg Arg Phe Asn Met Lys Met Ile 595 600 605 <210> 3 <211> 3669 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gccagtgcac tctagaaacc cagcctgcat gtagaaagcc ctgtctactg cagaagatga 60 ttcctgcccc gggttaaatg tgcacaactc gcggaaatgc cagtaccttc cacctgaagg 120 cacttagtgg ctagaaaacc agcaatctac cccgaaacac actgtactaa acacagcaag 180 agaccacaat gattggacat atacctatga agatccactt tgagaaagat gccagttgtt 240 ccacaggatg cactttgaga atgaattcat tctagctggt acagcaaaag gagtgcatta 300 aggcccgtaa ccaaggtgta gacaaagaag tggagtcatg cttcacacgg ctataccatg 360 ctggcagcca ttcctgggtc tggctgtggt gttactctta atgggatcca ccattggctg 420 tcctgctcgc tgtgagtgct ccgcccagaa caaatctgtt agctgccaca gaagacgatt 480 gctcgcgatc ccagaaggca ttcccattga gaccaaaatc ttggacctga gcaaaaatcg 540 actaaagagc ataaaccctg aagagttcat ctcatatcct ctgttggagg agatagactt 600 gagcgacaac attattgcca atgtggagcc tggggcattt aacaatctct ttaacctgcg 660 ttccctccgc ctaaaaggca atcgccttaa gttggtccct ttaggagtat tcacaggact 720 gtccaacctc accaagcttg acattagtga gaataagatt gtcattttgc tggactacat 780 gttccaggat ctgcataacc tgaagtctct agaagtgggg gacaatgatt tagtgtatat 840 ctcacacagg gccttcagcg gactacttag cttggagcag ctcaccctgg agaagtgcaa 900 cttgacagca gtaccaacag aagccctttc ccatctccgc agcctcatcg ccctgcatct 960 gaagcatctc aatatcaaca atatgcctgt gtatgccttt aaaagattgt tccacctgaa 1020 aaacctagag atcgactatt ggcctttgtt ggatttgatg ccagccaaca gcctctatgg 1080 tctcaacctc acgtcccttt caatcaccaa caccaacctg tccactgtcc ccttcctcgc 1140 ctttaaacac cttgtatacc tgacccacct taacctctcc tacaatccca tcagcactat 1200 tgaagctggc atgttctctg acctgatccg cctacaggag cttcatatag tgggggccca 1260 gctccgcact attgagcctc actccttcca agggctccgc ttcctccgtg tgctcaatgt 1320 atctcagaac ctgctggaaa cattggaaga gaacgtcttc tcctccccta gggctttgga 1380 ggtcctgagc attaacaaca acccactagc ctgtgactgc cgactcctct ggctcctgca 1440 gcgacaaccc aacctgcagt ttgggggcca gcagcccatg tgtgctgggc cagacaccat 1500 ccgtgagaga tcatttaagg atttccatag cactgctctt tctttttatt ttacctgcaa 1560 aaaacccaaa atccgtgaaa agaagttaca gcatctcctc gtggatgaag ggcaaacggt 1620 ccagctggag tgcaacgctg atggagaccc gcagcccgtg atttcctggg tgacacctcg 1680 aaggcgtttt atcaccacca agtccaacgg aagggccact gtgttgggtg atggcacctt 1740 ggaaatccgt tttgcccagg atcaagacag tgggatgtat gtttgcatcg cgagcaacgc 1800 tgctgggaac gataccttca cagcatctct cactgtgaag ggattcacgt cagaccgctt 1860 cctttacgca aacaggaccc ctatgtacat gactgactcc aacgacaccg tttccaacgg 1920 cactaatgcc aatactttct ccctggacct taaaacaata ctggtatcta cagccatggg 1980 ctgtttcaca ttcctgggag tggttttatt ttgttttctc cttctttttg tgtggagccg 2040 agggaaaggc aagcacaaaa acagcattga ccttgagtat gtgccccgaa aaaacaatgg 2100 tgctgttgtg gaaggggagg tggctggccc caggaggttc aacatgaaaa tgatctaagg 2160 gcccaccaca cactactgtc tctctgttac tgttggtcgt gagtaagacg tctgatagag 2220 tgactcgatc acaaggttat cgggcagctt tgcgcagctg cccctgtgtc aaagcagggt 2280 ccatggaagc aggaagactt ctcatggaga ctggctgatt agaggcaggc aggcatgtgt 2340 cagagccctt cacacagtgg gatactaatt gtttgcattg caaatattgg cattctgggg 2400 atctcagcaa tgaacctgaa cctttggctc atgctgatgg acaataattc aacattttct 2460 accactgcaa aactaaaagg aaaaaaaatt aaaaagaaca acctacagtg taggatttac 2520 atattaaaaa gacacatttg tctaaaacat actctacagt caaatttgta tttattatca 2580 tttgttaaaa ccttgcatca tacaatactg ttggttcagc accaaaaaga gatcaatata 2640 ttcttttttt tgaaacatat atgctgtata tgttttaaag caatatgaat gagaggttgt 2700 gcttttagtt actcaccagt atagatccaa gtgtggtttc accttccttt tacctgcaga 2760 taaacctgag aatagatccc tggaatacta ggcagagatg tgttgagatg tgtatgtctg 2820 atgtaggatg ccaagaaaca agacccaagt caaaactgct caactctgtt aacttctgtt 2880 actataaata aaggcatgtg cctagttttg atacagaatg gaatattttt tatacataca 2940 ctaccaacct ggaccagttt actgtaacag aagcccttgg tttctccaga aggcggtaca 3000 tcgctagggg tacctataga atacaaggta ggtgtcactc ttaaaagtaa tccatgtagc 3060 tactgcttag ttttactttc gccagtcact gctaatgggt taatgaccaa tggaaaagag 3120 aatattgatt atatagaatt atttggcaat attcaccaat agctaatatc aataattctg 3180 ttgtccgaaa gccctctgaa taaggaggtt tcagaagtca ataggaagca gggagagaca 3240 agagcatcac agcagcgatt cagccaatga tctctttcaa atgtggcagc tgcctgccgg 3300 atggctacaa atcaaaggga atacgctgca catgccagcc caacttctat ccaagtacta 3360 tacacagagt aggaccacag ttaggcaact tcaggatatt cctctgcttc ctgatcaaga 3420 tctttagttt catattgaaa accatattac acagctacga ggaatatgtt ttgtgtgaaa 3480 gaagtaaaag tagtgaaaga aaaaccaata tagatctaaa aaacaatgtt ttgttccttc 3540 actggggaag agctaagctt atagttctac aaatatgtaa tgctgtgcca attcttttac 3600 cttcttgacc tgagcatatt tgcccaatta agttgatatt aatgttacta atgcaaacat 3660 aaccagaaa 3669 <210> 4 <211> 606 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Leu His Thr Ala Ile Pro Cys Trp Gln Pro Phe Leu Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Leu Leu Leu Met Gly Ser Thr Ile Gly Cys Pro Ala Arg Cys 20 25 30 Glu Cys Ser Ala Gln Asn Lys Ser Val Ser Cys His Arg Arg Arg Leu 35 40 45 Leu Ala Ile Pro Glu Gly Ile Pro Ile Glu Thr Lys Ile Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Arg Leu Lys Ser Ile Asn Pro Glu Glu Phe Ile Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Leu Leu Glu Glu Ile Asp Leu Ser Asp Asn Ile Ile Ala Asn Val 85 90 95 Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Ser Leu Arg Leu 100 105 110 Lys Gly Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu 115 120 125 Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu 130 135 140 Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu 165 170 175 Leu Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ala Val 180 185 190 Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu Arg Ser Leu Ile Ala Leu His Leu 195 200 205 Lys His Leu Asn Ile Asn Asn Met Pro Val Tyr Ala Phe Lys Arg Leu 210 215 220 Phe His Leu Lys Asn Leu Glu Ile Asp Tyr Trp Pro Leu Leu Asp Leu 225 230 235 240 Met Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile 245 250 255 Thr Asn Thr Asn Leu Ser Thr Val Pro Phe Leu Ala Phe Lys His Leu 260 265 270 Val Tyr Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile 275 280 285 Glu Ala Gly Met Phe Ser Asp Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu His Ile 290 295 300 Val Gly Ala Gln Leu Arg Thr Ile Glu Pro His Ser Phe Gln Gly Leu 305 310 315 320 Arg Phe Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gln Asn Leu Leu Glu Thr Leu 325 330 335 Glu Glu Asn Val Phe Ser Ser Pro Arg Ala Leu Glu Val Leu Ser Ile 340 345 350 Asn Asn Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Leu Leu Gln 355 360 365 Arg Gln Pro Asn Leu Gln Phe Gly Gly Gln Gln Pro Met Cys Ala Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Ile Arg Glu Arg Ser Phe Lys Asp Phe His Ser Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Phe Tyr Phe Thr Cys Lys Lys Pro Lys Ile Arg Glu Lys Lys 405 410 415 Leu Gln His Leu Leu Val Asp Glu Gly Gln Thr Val Gln Leu Glu Cys 420 425 430 Asn Ala Asp Gly Asp Pro Gln Pro Val Ile Ser Trp Val Thr Pro Arg 435 440 445 Arg Arg Phe Ile Thr Thr Lys Ser Asn Gly Arg Ala Thr Val Leu Gly 450 455 460 Asp Gly Thr Leu Glu Ile Arg Phe Ala Gln Asp Gln Asp Ser Gly Met 465 470 475 480 Tyr Val Cys Ile Ala Ser Asn Ala Ala Gly Asn Asp Thr Phe Thr Ala 485 490 495 Ser Leu Thr Val Lys Gly Phe Thr Ser Asp Arg Phe Leu Tyr Ala Asn 500 505 510 Arg Thr Pro Met Tyr Met Thr Asp Ser Asn Asp Thr Val Ser Asn Gly 515 520 525 Thr Asn Ala Asn Thr Phe Ser Leu Asp Leu Lys Thr Ile Leu Val Ser 530 535 540 Thr Ala Met Gly Cys Phe Thr Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Phe 545 550 555 560 Leu Leu Leu Phe Val Trp Ser Arg Gly Lys Gly Lys His Lys Asn Ser 565 570 575 Ile Asp Leu Glu Tyr Val Pro Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Val Glu 580 585 590 Gly Glu Val Ala Gly Pro Arg Arg Phe Asn Met Lys Met Ile 595 600 605 <210> 5 <211> 2941 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 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tggactattt agcttggagc agctcaccct ggagaagtgc 900 aacttgacag cggtaccaac agaagccctt tcccatctcc gcagcctcat caccctgcat 960 ctgaagcatc tcaatatcaa caatatgcct gtgtatgcct ttaaaagatt attccacctg 1020 aaacaactag agatcgacta ttggccattg ctggatatga tgccagccaa tagcctctat 1080 ggtctcaacc tcacatccct ctcgatcact aacaccaacc tgtccactgt ccctttcctc 1140 gcctttaaac accttgtata cctgacccac cttaacctct cctacaatcc catcagcact 1200 attgaagcag gcatgttctc tgacctgatc cgcctacagg agcttcatgt agtcggggcc 1260 cagctccgca ccattgaacc tcactccttc caagggctcc gcttcctccg cgtgctcaat 1320 gtatctcaga acctgctgga aacattggaa gagaatgtct tctcttcccc tagggctttg 1380 gaggtcctga gcattaacaa taacccacta gcgtgcgact gccgacttct ctggctcctg 1440 cagcgacagg ccaccctgca gtttggaggc cagcagccca tgtgtgccgg gccagacacc 1500 atacgtgaga ggtcatttaa ggatttccat agcactgctc tttcttttta ttttacctgc 1560 aaaaaaccca aaatccgtga aaagaagtta cagcacctcc tagtggacga aggacagacg 1620 gtccagctgg agtgcaacgc ggatggagac ccccagcccg tgatttcctg ggtgacacct 1680 cgaaggcgtt ttatcaccac caagtccaac ggaagggcca ctgtgttggg tgatggcacc 1740 ttagaaatcc gtttcgccca ggatcaagac agtgggatgt atgtttgcat agctagcaat 1800 gctgctggga atgacacctt cacggcatct ctcactgtga agggattcac ttcagaccgc 1860 ttcctttacg caaacaggac ccctatgtac atgactgact ccaatgacac cgtttccaac 1920 ggcactaatg ccaatacttt ttccctggac cttaaaacaa tactggtatc tacagccatg 1980 ggctgtttca cattcctggg agtggtttta ttttgttttc tccttctttt tgtgtggagc 2040 cgaggaaagg gcaaacacaa aaacagcatt gaccttgagt atgtgccccg aaaaaacaat 2100 ggtgctgttg cagaagggga ggtggctgga cccaggaggt tcaacatgaa aatgatataa 2160 gggcccacca cacacacact actactgtct ctgtgttact gttggtaatg agtaagacgt 2220 ctgatatagc gagtccatca caaggtgatc aggcagcttc acacagctgc ccctgtgtca 2280 aagcagggtc catggaagct ggaagacttc tcatggacac tggctgatta gaggcaggca 2340 ggcatgtgtc agagcccttc acacagtggg atactaattg tttgcattgc aaatattggc 2400 attctgggga tctcagtaat gaccctgaac ctttggctca tgctgacgga caaaaattca 2460 acattttcta ccactgcaaa actaaaagaa aaaaaattta aaaggaacaa cctacagtgt 2520 aggatttaca tattaaaaaa agacacattt gtctaaaaca tactctacgg taaaatttgt 2580 atttattatc atttgttaaa accttgcatc atacaatact gttggttcag caccaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaagag agatcaatat attctttttt gaaacatata tgctgtatat 2700 gttttaaagc aatatgaatg agaggttgtg cttttagtta ctcaccagta tagatccaag 2760 tgtggtctca ctttcctttt atccgcagag aaacctgaga atagatccct ggaataatag 2820 gctgagatgt gttgagatgt gtatgtctga tgtaggatgc caagatacaa gagcccagtc 2880 aaaactgctc aactctgtta acttctgtta ctataaataa aggcatgtgc ctagttttga 2940 t 2941 <210> 6 <211> 606 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Leu His Thr Ala Ile Pro Cys Trp Gln Pro Phe Leu Gly Leu Ala 1 5 10 15 Met Val Leu Leu Phe Met Gly Ser Thr Ile Gly Cys Pro Ala Arg Cys 20 25 30 Glu Cys Ser Ala Gln Asn Lys Ser Val Ser Cys His Arg Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Ala Ile Pro Glu Gly Ile Pro Ile Glu Thr Lys Ile Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Arg Leu Lys Ser Ile Asn Pro Glu Glu Phe Ile Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Leu Leu Glu Glu Ile Asp Leu Ser Asp Asn Ile Ile Ala Asn Val 85 90 95 Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Ser Leu Arg Leu 100 105 110 Lys Gly Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu 115 120 125 Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu 130 135 140 Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu 165 170 175 Phe Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ala Val 180 185 190 Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu Arg Ser Leu Ile Thr Leu His Leu 195 200 205 Lys His Leu Asn Ile Asn Asn Met Pro Val Tyr Ala Phe Lys Arg Leu 210 215 220 Phe His Leu Lys Gln Leu Glu Ile Asp Tyr Trp Pro Leu Leu Asp Met 225 230 235 240 Met Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile 245 250 255 Thr Asn Thr Asn Leu Ser Thr Val Pro Phe Leu Ala Phe Lys His Leu 260 265 270 Val Tyr Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile 275 280 285 Glu Ala Gly Met Phe Ser Asp Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu His Val 290 295 300 Val Gly Ala Gln Leu Arg Thr Ile Glu Pro His Ser Phe Gln Gly Leu 305 310 315 320 Arg Phe Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gln Asn Leu Leu Glu Thr Leu 325 330 335 Glu Glu Asn Val Phe Ser Ser Pro Arg Ala Leu Glu Val Leu Ser Ile 340 345 350 Asn Asn Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Leu Leu Gln 355 360 365 Arg Gln Ala Thr Leu Gln Phe Gly Gly Gln Gln Pro Met Cys Ala Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Ile Arg Glu Arg Ser Phe Lys Asp Phe His Ser Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Phe Tyr Phe Thr Cys Lys Lys Pro Lys Ile Arg Glu Lys Lys 405 410 415 Leu Gln His Leu Leu Val Asp Glu Gly Gln Thr Val Gln Leu Glu Cys 420 425 430 Asn Ala Asp Gly Asp Pro Gln Pro Val Ile Ser Trp Val Thr Pro Arg 435 440 445 Arg Arg Phe Ile Thr Thr Lys Ser Asn Gly Arg Ala Thr Val Leu Gly 450 455 460 Asp Gly Thr Leu Glu Ile Arg Phe Ala Gln Asp Gln Asp Ser Gly Met 465 470 475 480 Tyr Val Cys Ile Ala Ser Asn Ala Ala Gly Asn Asp Thr Phe Thr Ala 485 490 495 Ser Leu Thr Val Lys Gly Phe Thr Ser Asp Arg Phe Leu Tyr Ala Asn 500 505 510 Arg Thr Pro Met Tyr Met Thr Asp Ser Asn Asp Thr Val Ser Asn Gly 515 520 525 Thr Asn Ala Asn Thr Phe Ser Leu Asp Leu Lys Thr Ile Leu Val Ser 530 535 540 Thr Ala Met Gly Cys Phe Thr Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Phe 545 550 555 560 Leu Leu Leu Phe Val Trp Ser Arg Gly Lys Gly Lys His Lys Asn Ser 565 570 575 Ile Asp Leu Glu Tyr Val Pro Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Ala Glu 580 585 590 Gly Glu Val Ala Gly Pro Arg Arg Phe Asn Met Lys Met Ile 595 600 605 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR1 <400> 7 Leu Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR2 <400> 8 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Trp Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR3 <400> 9 Asp His Trp Gly Ser Gly Ser Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Trp Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Trp Gly Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL-CDR1 <400> 11 Thr Gly Ser Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL-CDR2 <400> 12 Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL-CDR3 <400> 13 Cys Ser Tyr Ala Gly Ala Asn Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 14 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL <400> 14 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Val Ile Ser Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ala 85 90 95 Asn Thr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR1 <400> 15 ctttactgga tgaat 15 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR2 <400> 16 tctatctctc cttctggtgg ctggactaag tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH-CDR3 <400> 17 gatcattggg gttcagggag ccccgactac 30 <210> 18 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VH <400> 18 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ctttactgga tgaattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctg gactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcat 300 tggggttcag ggagccccga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09-VL CDR1 <400> 19 actggatcca gccgtgacgt tggtggttat gattatgtct cc 42 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL-CDR2 <400> 20 gaggtcacta agcggccctc a 21 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL-CDR3 <400> 21 tgctcatatg caggcgccaa cacttatgtc 30 <210> 22 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C09 VL <400> 22 cagagcgtct tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc actcaccatc 60 tcctgcactg gatccagccg tgacgttggt ggttatgatt atgtctcctg gttccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcgtgatt tctgaggtca ctaagcggcc ctcaggggtc 180 cctgatcggt tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctggactc 240 caacctgagg atgaggctga ttattattgc tgctcatatg caggcgccaa cacttatgtc 300 ttcggaagtg ggaccagagt caccgtcctg 330 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 accttgtata cctgacccac cttaa 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 24 agagaacatg cctgcttcaa tagtg 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 agagaacatg ccagcttcaa tagtg 25 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB probe <400> 26 cctctcctac aatccc 16 <210> 27 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Leu His Thr Ala Ile Ser Cys Trp Gln Pro Phe Leu Gly Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Leu Ile Phe Met Gly Ser Thr Ile Gly Cys Pro Ala Arg Cys 20 25 30 Glu Cys Ser Ala Gln Asn Lys Ser Val Ser Cys His Arg Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Ala Ile Pro Glu Gly Ile Pro Ile Glu Thr Lys Ile Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Arg Leu Lys Ser Val Asn Pro Glu Glu Phe Ile Ser Tyr 65 70 75 80 Pro Leu Leu Glu Glu Ile Asp Leu Ser Asp Asn Ile Ile Ala Asn Val 85 90 95 Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu Phe Asn Leu Arg Ser Leu Arg Leu 100 105 110 Lys Gly Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu 115 120 125 Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu 130 135 140 Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu His Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu 165 170 175 Leu Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ala Val 180 185 190 Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu Arg Ser Leu Ile Ser Leu His Leu 195 200 205 Lys His Leu Asn Ile Asn Asn Met Pro Val Tyr Ala Phe Lys Arg Leu 210 215 220 Phe His Leu Lys His Leu Glu Ile Asp Tyr Trp Pro Leu Leu Asp Met 225 230 235 240 Met Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Val 245 250 255 Thr Asn Thr Asn Leu Ser Thr Val Pro Phe Leu Ala Phe Lys His Leu 260 265 270 Val Tyr Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile 275 280 285 Glu Ala Gly Met Phe Ser Asp Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu His Ile 290 295 300 Val Gly Ala Gln Leu Arg Thr Ile Glu Pro His Ser Phe Gln Gly Leu 305 310 315 320 Arg Phe Leu Arg Val Leu Asn Val Ser Gln Asn Leu Leu Glu Thr Leu 325 330 335 Glu Glu Asn Val Phe Ser Ser Pro Arg Ala Leu Glu Val Leu Ser Ile 340 345 350 Asn Asn Asn Pro Leu Ala Cys Asp Cys Arg Leu Leu Trp Ile Leu Gln 355 360 365 Arg Gln Pro Thr Leu Gln Phe Gly Gly Gln Gln Pro Met Cys Ala Gly 370 375 380 Pro Asp Thr Ile Arg Glu Arg Ser Phe Lys Asp Phe His Ser Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Phe Tyr Phe Thr Cys Lys Lys Pro Lys Ile Arg Glu Lys Lys 405 410 415 Leu Gln His Leu Leu Val Asp Glu Gly Gln Thr Val Gln Leu Glu Cys 420 425 430 Ser Ala Asp Gly Asp Pro Gln Pro Val Ile Ser Trp Val Thr Pro Arg 435 440 445 Arg Arg Phe Ile Thr Thr Lys Ser Asn Gly Arg Ala Thr Val Leu Gly 450 455 460 Asp Gly Thr Leu Glu Ile Arg Phe Ala Gln Asp Gln Asp Ser Gly Met 465 470 475 480 Tyr Val Cys Ile Ala Ser Asn Ala Ala Gly Asn Asp Thr Phe Thr Ala 485 490 495 Ser Leu Thr Val Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 500 505 510 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 515 520 525 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 530 535 540 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 545 550 555 560 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 565 570 575 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 580 585 590 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 595 600 605 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 610 615 620 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 625 630 635 640 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 645 650 655 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 660 665 670 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 675 680 685 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 690 695 700 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 705 710 715 720 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 725 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> digoxigenin-labeled LINGO-2 anti-sense RNA probe <400> 28 taatacgact cactataggg acagaagccc tttcccatct 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> digoxigenin-labeled sense RNA probe <400> 29 taatacgact cactataggg acagaagccc tttcccatct 40 <210> 30 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> General Structure for an Oligonucleotide used in Preparation of an siRNA Molecule <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 30 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 31 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> General Structure for an Oligonucleotide used in Preparation of an siRNA Molecule <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 31 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200

Claims (56)

  1. LINGO-2에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 서열 번호 2의 폴리펩티드의 가용성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드가 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 단리된 핵산.
  3. 서열 번호 2의 폴리펩티드의 가용성 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드가 운동 뉴런의 축삭 성장 억제를 감소시켜 생존을 촉진할 수 있는 단리된 핵산.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 500으로 이루어지는 군으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  5. 제3항에 있어서, 폴리펩티드가 상기 참조 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  6. 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 상기 참조 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 융합된 이종 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드는 면역글로불린, 혈청 알부민, 표적화 폴리펩티드, 리포터 폴리펩티드, 정제를 용이하게 하는 폴리펩티드, 임의의 상기 폴리펩티드의 단편, 및 상기 폴리펩티드 또는 단편의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc, 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편, 히스티딘 태그(tag), 및 운동 뉴런 당단백질 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
  10. 약학적으로 허용가능한 담체 및 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 핵산을 포함하는 조성물.
  11. 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  15. 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 핵산 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 하나의 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포.
  17. 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 핵산에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 합성 생산되는 것인 폴리펩티드.
  19. 제17항 또는 18항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 중합체에 컨쥬게이트된 것인 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 중합체가 폴리알킬렌 글리콜, 당 중합체 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 폴리펩티드.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 중합체에 컨쥬게이트된 것인 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 중합체의 전체 분자량이 20,000 Da 내지 40,000 Da인 폴리펩티드.
  24. 제17항 또는 제18항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 운동 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  25. 제17항 또는 제18항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 운동 뉴런의 축삭 성장 억제를 감소시킬 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 약학적으로 허용가능한 담체 및 제17항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  27. 약학적으로 허용가능한 담체 및 제15항 또는 제16항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  28. 운동 뉴런의 생존을 촉진하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머(aptamer); 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량과 상기 운동 뉴런을 접촉하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머; 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물과 상기 운동 뉴런을 접촉하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 포유동물에서 운동 뉴런의 생존을 촉진하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머; 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량을, 운동 뉴런의 생존 촉진을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 포유동물에서 운동 뉴런의 축삭 성장을 촉진하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머; 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 유효량을, 운동 뉴런의 축삭 성장 촉진을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 포유동물에서 운동 뉴런의 생존과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머; 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을, 운동 뉴런의 생존과 연관된 질병, 장애 또는 손상의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 포유동물에서 운동 뉴런의 축삭 성장과 연관된 질병, 장애 또는 손상을 치료하기 위한 방법으로서,
    (i) 가용성 LINGO-2 폴리펩티드;
    (ii) LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
    (iii) LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드;
    (iv) LINGO-2 앱타머; 및
    (v) 상기 LINGO-2 길항제의 2 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 길항제를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을, 운동 뉴런의 축삭 성장과 연관된 질병, 장애 또는 손상의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제는 가용성 LINGO-2 폴리펩티드인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 제17항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는
    (i) LINGO-2 Ig 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체,
    (ii) LINGO-2 LRR 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, 및
    (iii) 상기 LINGO-2 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 영역을 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 가용성 LINGO-2 폴리펩티드는
    (i) LINGO-2 막횡단 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체,
    (ii) LINGO-2 세포내 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체, 및
    (iii) 상기 LINGO-2 도메인 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 LINGO-2 영역이 결여된 것인 방법.
  38. 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
  39. 제119항에 있어서, 상기 LINGO-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
  40. 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제 폴리뉴클레오티드는
    (i) 안티센스 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 리보자임;
    (iii) 작은 간섭 RNA(siRNA); 및
    (iv) 작은 헤어핀 RNA(shRNA)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제28항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 LINGO-2 앱타머를 포함하는 것인 방법.
  43. 제30항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유동물이 운동 뉴런과 관련된 질병, 장애, 또는 손상으로 진단된 것인 방법.
  44. 제32항, 제33항 및 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 손상은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 원발성 측삭 경화증(PLS), 진행성 근위축증(PMA), 유전성 경직성 양하지마비(HSP), X-연관 척수연수 근위축증(SBMA; 케네디병), 진행성 연수마비, 가연수 마비, 척수성 근위축증(SMA), 후소아마비 증후군(PPS), 헌팅턴병, 본태성 진전(ET), 운동 뉴런 질병, 마비 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 손상이 근위축성 측삭 경화증(ALS)인 방법.
  46. 제28항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제는 볼루스 주사 또는 지속 주입(chronic infusion)에 의해 투여되는 것인 방법.
  47. 제28항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 중추 신경계에 직접 투여되는 것인 방법.
  48. 제28항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-2 길항제가 전신 투여되는 것인 방법.
  49. 제28항 또는 제29항에 있어서, (a) 발현 조절 서열에 작동가능한 연결을 통해 상기 LINGO-2 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 상기 운동 뉴런을 형질감염시키는 단계, 및 (b) 상기 LINGO-2 길항제를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제30항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, (a) 발현 조절 서열에 작동 가능한 연결을 통해 상기 LINGO-2 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물에게 투여하는 단계, 및 (b) 상기 LINGO-2 길항제를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터로서 투여되는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 백터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터 및 폭스바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 투여는 (a) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하며 상기 LINGO-2 길항제를 발현하는 배양된 숙주 세포를 제공하는 것; 및 (b) 상기 LINGO-2 길항제가 상기 포유동물에서 발현되도록 상기 배양된 숙주 세포를 상기 포유동물에게 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 배양된 숙주 세포가 치료하고자 하는 포유동물로부터 유래된 것인 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 벡터는 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 척수강내 투여, 경막하 투여 및 피하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
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