JP5893640B2 - Oprf/i試薬と入院および他の患者におけるその利用 - Google Patents
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Description
1.1 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、機械的に人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.2 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.3 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.4 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、免疫抑制されるがんまたは移植患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.5 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.6 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、入院患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.7 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、48時間以上機械的人工呼吸とりつけを必要とする集中治療ユニットに収容された患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.8 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物に、好ましくは少なくとも予定されている手術の2週間前に投与することを含む、前記ヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させる方法、
1.9 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、(ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、BMX、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような)危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトに、好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも2週間前に、投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
1.10 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば2歳またはそれ以上の歳のヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
1.11 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、任意の種類の感染を有するヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法であって、好ましくはさらに、習慣的なブースターワクチン摂取が含まれる方法、
1.12 OprF/I試薬が、i)SEQ ID NO:2、3、7〜10およびii)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11〜13からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはSEQ ID NO:1に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義された方法、
1.13 薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義された方法、
1.14 薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンである、以上で定義された方法、
1.15 第一薬物基質と第二薬物基質を共投与することであって、前記第一薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量の、OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される、以上で定義された方法、
1.16 死亡率が、100より少ない、以上で定義された方法、
1.17 例えばICU患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたICU患者における死亡率が、95、好ましくは90、より好ましくは85、より好ましくは80、より好ましくは75、より好ましくは70、より好ましくは65より少ない、さらにより好ましくは60より少ない、最も好ましくは55より少ない、以上で定義された方法、
1.18 OprF/I試薬が、SEQ ID NO:1を有する3つのOprF/I試薬、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と、少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む(または少なくとも80%、好ましくは85%、より好ましくは90%からなる)タンパク質複合体である、以上で定義された方法、
1.19 OprF/I試薬が、
(a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、
(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、および
(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、
またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%同一性を持ち、(a)、(b)または(c)にて特定されたのと同一のジスルフィド結合パターンを有する、その免疫原性バリアントからなる群より選択され、
好ましくは、OprF/I試薬が、SEQ ID NO:1を有する3つのOprF/I試薬、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と、少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含むタンパク質複合体であり、a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、およびc)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質の合計が、75%と等しいか大きい、以上で定義された方法。
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同一の意味をもつ。
本発明は、そのアミノ末端で、例えばSEQ ID NO:1のような、緑膿菌膜タンパク質F(全長外膜タンパク質F、またはOprF=SEQ ID NO:5と呼ばれる)のカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合する、緑膿菌外膜タンパク質I(全長外膜タンパク質IまたはOprF=SEQ ID NO:6と呼ばれる)を含む融合タンパク質およびそのバリアントの本明細書でさらなる記述するような利用に関する(SEQ ID NO:1およびそのバリアントはまた、「OprF/I試薬」または「OprF/I試薬類」として本明細書でまた参照される)。
(i)緑膿菌外膜タンパク質Iは全長外膜タンパク質I、とりわけSEQ ID NO:5である、
(ii)緑膿菌外膜タンパク質Fは全長外膜タンパク質F、とりわけSEQ ID NO:6である、
(iii)OprF/I試薬は、i)SEQ ID NO:2、3、7〜10、および/またはii)SEQ ID NO:4を含むか、またはからなる、
(iv)OprF/I試薬はSEQ ID NO:1からなるか、または含む、
(v)OprF/I試薬は、前記ポルペプチドまたSEQ ID NO:1に対して指向する抗体またはその断片からなるか、または含む、
(vi)OprF/I試薬は、機能的に活性なバリアントである、および/またはSEQ ID NO:1に対して少なくとも50%配列同一性、とりわけ少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、まだより好ましくは少なくとも90%、またより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%配列同一性を持つ、
(vii)OprF/I試薬は、天然のOprFタンパク質のアミノ酸190からアミノ酸342までの配列(SEQ ID NO:3)を持つ、外膜タンパク質Fのカルボキシ末端部分、または天然のOprFタンパク質のアミノ酸190からアミノ酸350までの配列(SEQ ID NO:2)を持つ外膜タンパク質Fのカルボキシ末端を含む、
(viii)OprF/I試薬は、天然のOprIタンパク質(SEQ ID NO:4)のアミノ酸21からアミノ酸83までの配列を持つ外膜タンパク質Iのアミノ末端を含む、
(ix)OprF/I試薬は、天然のOprFタンパク質のアミノ酸190からアミノ酸342までの配列(SEQ ID NO:3)を持つ外膜タンパク質Fのカルボキシ末端、または天然のOprIタンパク質のアミノ酸21からアミノ酸83までの配列(SEQ ID NO:4)を持つ外膜タンパク質Iのアミノ末端に融合した、天然のOprFタンパク質のアミノ酸190からアミノ酸350までの配列(SEQ ID NO:2)を持つ外膜タンパク質Fのカルボキシ末端部分を含むか、またはからなる、
(x)融合タンパク質が、例えばSEQ ID NO:1、11〜13のOprF/I試薬中のような、Ala−(His)6タグを含む。
(a)Cys18−Cys27−結合のみを持つOprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:11)、
(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合を持つOprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:12)、および/または
(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合を持つOprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:13)
を、とりわけトリマーの形態で含む。
本発明の特定の発見にしたがって、以下の新規および独創的方法および/または利用が提供される。
1.1 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、機械的に人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.2 効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.3 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.4 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、免疫抑制されるがんまたは移植患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.5 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.6 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、入院患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.7 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、48時間以上機械的人工呼吸とりつけを必要とする集中治療ユニットに収容された患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
1.8 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物に、好ましくは少なくとも予定されている手術の2週間前に投与することを含む、前記ヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させる方法、
1.9 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、(ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、BMX、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような)危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトに、好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも2週間前に、投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
1.10 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば2歳またはそれ以上の歳のヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
1.11 (薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、任意の種類の感染を有するヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法であって、好ましくはさらに、習慣的なブースターワクチン摂取が含まれる方法、
1.12 OprF/I試薬が、i)SEQ ID NO:2、3、7〜10およびii)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11〜13からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはSEQ ID NO:1に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義された方法、
1.13 薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義された方法、
1.14 薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンである、以上で定義された方法、
1.15 第一薬物基質と第二薬物基質を共投与することであって、前記第一薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量の、OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される、以上で定義された方法、
1.16 死亡率が、100より少ない、以上で定義された方法、
1.17 例えばICU患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたICU患者における死亡率が、95、好ましくは90、より好ましくは85、より好ましくは80、より好ましくは75、より好ましくは70、より好ましくは65より少ない、さらにより好ましくは60より少ない、最も好ましくは55より少ない、以上で定義された方法、
1.18 OprF/I試薬が、SEQ ID NO:1を有する3つのOprF/I試薬、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と、少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む(または少なくとも80%、好ましくは85%、より好ましくは90%からなる)タンパク質複合体である、以上で定義された方法、
1.19 OprF/I試薬が、
(a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、
(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、および
(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、
またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%の同一性を持ち、(a)、(b)または(c)にて特定されたのと同一のジスルフィド結合パターンを有する、その免疫原性バリアントからなる群より選択され、
好ましくは、OprF/I試薬が、SEQ ID NO:1を有する3つのOprF/I試薬、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と、少なくとも85%、好ましくは90%、とりわけ95%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含むタンパク質複合体であり、a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、およびc)Cys18−Cys27−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質の合計が、等しいか、75%より大きい、以上で定義された方法。
2.上記1.1〜1.19下定義したような任意の方法での利用のための、OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1、または
3.上記1.1〜1.19下定義したような任意の方法での利用のための、薬理学的組成物の調製における利用のためのOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1、または
4.1つまたはそれ以上の薬理学的に許容可能な希釈液または担体と一緒の、OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1を含む、上記1.1〜1.19下定義したような任意の方法での利用のための、薬理学的組成物、
5.1 a)OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1を含むワクチンである第一試薬で、前記ワクチンは任意に比アジュバントである、
b)例えば以上で開示したような、抗細菌または抗真菌化合物である共試薬
を含む、薬理学的組成物
5.2 a)OprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1に対して指向する抗体またはその断片である第一試薬、および
b)例えば以上で開示したような、抗細菌または抗真菌化合物である共試薬
を含む薬理学的組成物。
1.1 本明細書で記述したようなOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、機械的人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような、人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.2 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、嚢胞性線維症患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.3 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.4 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、免疫抑制されるがんまたは移植患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.5 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、集中治療ユニット患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.6 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、入院患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.7 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、48時間以上の間機械的人工呼吸器が必要である集中治療ユニットに収容された患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.8 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.9 好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも2週間前に、投与される、本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、(ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、BMX、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような)危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.10 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば2歳またはそれ以上の歳のヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.11 本明細書で記述したようなOprF/I、例えばSEQ ID NO:1と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、任意の種類の感染を有するヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
1.12 OprF/I試薬が、i)SEQ ID NO:2、3、7〜10およびii)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11〜13からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはSEQ ID NO:1に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
1.13 薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
1.14 薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンであるか、少なくともミョウバンによってアジュバントされない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
1.15 第一薬物基質と第二薬物基質の共投与を含み、前記第一薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量のOprF/I試薬、例えばSEQ ID NO:1を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、(薬理学的に効果的な量のような)効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される薬剤である、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
1.16 死亡率が、100より少ない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
1.17 例えばICU患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたICU患者における死亡率が、95、好ましくは90、より好ましくは85、より好ましくは80、より好ましくは75、より好ましくは70、より好ましくは65より少ない、さらにより好ましくは60より少ない、最も好ましくは55より少ない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
一般物質
NaOH(Riedel−de Haen)、NaCl(Riedel−de Haen)、Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Merck KGaA、Darmstadt)、L−Cystine(Aldrich)、DTT(Sigma)、HCl(Merck KGaA)、Q−Sepharose(登録商標) HP(GE Healthcare)、DEAE−Sepharose(登録商標) FF(GE Healthcare)。全ての他の物質は、他に言及しない場合、解析グレードであった。
KCl 0.2 g/L
KH2PO4 0.2 g/L
NaCl 8.0 g/L
Na2HPO4 無水 1.15 g/L
臨床試験のために使用した薬物基質は、OprF/I試薬Ala−(His)6−OprF190−342−OprI21−83タンパク質(=SEQ ID NO:1)である。融合タンパク質構造は、N−末端His6タグを有する、2つの緑膿菌外膜タンパク質のエピトープ、OprFとOprIからなる:Met−Ala(His)6−OprF190−342−OprI21−83タンパク質。これは、224 AA融合タンパク質として、大腸菌(E.coli)内に発現した組換え体である。N−末端Metが発現後に開裂する。His6タグを含むN−末端OprF断片は、アミノ酸A−1(A)からアミノ酸160−Eまでの範囲であり、位置161〜223にてOprI断片が続く。開始物質の構造(すなわち関連DNA構造物)、Ala−(His)6−OprF190−342−OprI21−83タンパク質および3つのジスルフィドパターンバリアントを含むそのトリマー配座異性体の発現および精製をさらに以下で記述する。
タンパク質試料の還元
OprF/I融合タンパク質試料を、他に言及しないならば、β−メルカプトエタノール(2.5% v/v最終容量、およそ360mM最終濃度)で還元した。試料をRTにて20〜30分間インキュベートして、ジスルフィド結合の完全還元を確かにした。
下流開発ワークのために、IMAC/G50中の特定のOprF/I含量の推定が、段階収率を計算するために必要であった。OprF/I含量をRP−HPLCによって決定した。HPLCシステムを、精製した、天然の(還元していない)OprF/Iワーキング標準で校正した。ワーキング標準のタンパク質含量を、ε0.1%=0.373の1mg/mL溶液に対して計算した論理的減衰係数に基づいて、UV280nm測定によって決定した。RP−HPLCによるIMAC/G50プールの解析の前に、一部をDTTまたはβ−メルカプトエタノール(100mM最終濃度)の添加によって還元して、種々の凝集した、および間違って折りたたまれた(もっとも可能性があるのは、ジスルフィド混乱した)OprF/Iバリアントを分断させた。試料を室温にて30分間インキュベートし、RP−HPLCによって解析した。還元後、単一ピークとして溶出したOprF/Iを、未処理IMAC/G50プールと比較した。IMAC/G50後の還元OprF/Iの含量を、ピークエリアの統合によって計算した。
すべての他の試料(例えば再酸化したOprF/I、QS−HPからの区画など)を、さらなる処理なしに直接注入し、OprF/I濃度を計算した。
試料の解析RP−HPLC解析を、Dionex Ultimate 3000 HPLCシステムに連結したJupiter C4カラム(4.6mm×150mm、300A、5μm、Phenomenex)上で実施した。溶媒Aは、0.1% TFAを含む水であり、溶媒Bは0.1%TFAを含むアセトニトリルであった。ピークの分離を、1mL/分の流速にて13分間、27%Bから37%Bの直線勾配溶出によって実施した。カラム温度を40℃に決定した。ピーク検出を、214nmと280nmで実施した。
分離RP−HPLCを、解析RP−HPLCによって検出した個々のピークの単離のために使用した。精製を、Akta Purifierクロマトグラフィーシステムに連結したJupiter C4カラム(10mm×250mm、300A、5μm、Phenomenex)上で実施した。分離スケールでの定常相は、解析スケールで使用したものと同一であった。溶媒Aは0.1%TFAを含む水であり、溶媒Bは0.1%TFAを含む水中の80%アセトニトリルであった。試料容量は、2〜4mL(総タンパク質ロード<2mg)であった。ピークの分離を、2.5mL/分の流速にて、8カラム容量にわたり、35%Bから40%Bまでの直線勾配溶出によって実施した。カラム温度を40℃に設定した。ピーク検出を280および214nmにて実施した。0.8mLの画分を回収し、pHを0.25mL 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0の添加によって、pH〜7に調整した。より多量(〜0.5〜2mg)のP1〜4を、種々の分離精製実行によって調製した。個々のピークを含む望む画分のプール後、試料を、5kDa超遠心装置(Millipore)を用いておよそ5回濃縮した。濃縮したプールを、PD10カラム(GE Healthcare)によって脱塩し、緩衝液を、最終薬物産物処方緩衝液(0.9%NaCl、pH〜7で希釈した1/10PBS)に対して交換した。単離したOprF/Iバリアントを含む最終試料を、RP−HPLCおよびSEC−HPLCによって、純度および含量に関して解析した。RP−HPLCによって決定した相対純度は、少なくとも90%であった。試料を、さらなる解析まで、−20℃にて保存した。
SDS−PAGEを、MESランニング緩衝液を用いて、4〜12% NuPAGEゲル(Invitrogen)上で実施した。試料を、還元または非還元条件下、LDSサンプリング緩衝液と混合し、他に言及しない場合、70℃にて5分間インキュベートした。染色を、コロイドクーマシーまたは銀染色で実施した(Heukeshoven)。
ウエスタンブロッティングを、抗体抗OprF/I 944/5 D5エピトープ(1:20000希釈)および966/363 E3エピトープ(1:10000希釈)で実施した。
試料および緩衝液のpHおよび伝導度の測定のために、WTW 720システムを使用した。伝導度を、25℃にて、直線温度保証モデルを用いて測定した。
エンドトキシン測定を、発色LAL−アッセイ(Cambrex)で実施した。選択した試料をまた、従来のゲルクロットアッセイ(Limulus Amoebocyte Lysate試験)にて、外部の認定研究所でも測定した。
HCPsの定量のために、ジェネリック大腸菌HCP ELISAキット(Cygnus Technologies,Inc.)を使用した。
分離RPCから得た精製した画分を、LC−MS/MSによって解析した。試料を、還元なしで、または還元およびアルキル化の後、AspNまたはトリプシンで消化した。
MALDI−ToF解析を、Voyager STR 4069システム(Applied Biosystems)上で実施した。0.1%TFA/30%AcN中に溶解したシナピン酸を試料マトリックスとして使用した。DS試料を、試料マトリックスで5倍希釈し、2μlを標的上に配置した。遅延抽出モードと陽性極性を使用した。システムを、BSA(質量校正キット、Applied Biosystems)で外部校正した。内部校正のために、ミオグロビン(Sigma M−0630、平均Mr 16951.5)をおよそ100μg/mLの濃度にて、DS試料内にスパイクした。内部校正のための質量精度を、外部校正±0.6%(例えば24100±145Da)に対して、およそ±0.3%(例えば24100±72Da)で推定可能である。
ネイティブPAGETM Novex(登録商標)Bis−Tris Gelシステムは、ネイティブ(非還元)電気泳動を実施するために、中性周辺pH、プレキャストポリアクリルアミドミニゲルシステムである。OprF/I融合タンパク質試料のネイティブPAGEを、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、NativePAGE 4−16% Bis−Trisゲル(Invitrogen)上で実施した。試料緩衝液は、50mM BisTris、50mM NaCl、16mM HCl、10% w/vグリセロール、0.001%Ponceau S、pH7.2であった。ランニング緩衝液は、50mM BisTris、50mMトリシン、pH6.8であった。カソード緩衝液は、0.02%クーマシーG−250を含むランニング緩衝液であった。
N−末端シークエンシングを、Applied Biosystems 494HT機器と、N−末端Edmanシークエンシングの方法を用いて実施し、そこでタンパク質のN−末端アミノ酸を、化学的に連続して取り除き、HPLCによって同定した。タンパク質をまず、PVDF膜上にブロッティングするか、またはバイオブレン処置ガラスファイバーフィルター上に吸収するかいずれかによって、シークエンシング装置内部に固定化した。続いて、結合したタンパク質が、高pHにて、Edman試薬(フェニルイソチオシアネート、PITC)と反応した。本反応後、得られた化合物を、無水酸を用いてタンパク質を切断された。カップリングおよび開裂工程を、必要なほど多くの回数繰り返した。通常15〜20AAが解析可能であった。開裂された産物を、無水酸でその安定なフェニルチオヒダントイン、PTHに変換し、ついで、オンボードHPLCを用いて解析した。アミノ酸の同定を、標準混合物と比較して、溶出時間を比較することによって達成した。HPLCからデータを、配列のビジュアルリーチングのためにコンピュータ上で回収した。
タンパク質中の遊離チオール基を、システインの遊離チオール基と選択的に反応して、カルボキシアミドメチルシステインを産出する、ヨードアセトアミドを用いたアルキル化によって検出可能である。遊離チオール基が存在する場合、共有的にブロックされて、付着したヨードアセトアミド分子あたり57Daの質量増加となる。
クロマトグラフシステムは、Ultimate3000ポンプおよびデガッサ、Ultimate3000オートサンプラーおよびUltimate3000カラムコンパートメントを含むDionexからのHPLCシステムからなる。カラムおよびクロマトグラフ条件は、SEC−HPLCに関して記述したものと同様であった。全ての溶媒を、0.1μm Supor Membraneフィルター(Pall VacuCap 60)を通して濾過した。100μLの注入容量を、他に言及しない場合にすべての試料で使用した。
すべての実験を、50.000rpmおよび25℃にて、BeckmanCoulter XL−I Analytical Ultracentrifugeで実施した。試料を、12mm光路長の、サファイアキャップ2セクターチタンセンターピース中に配置した。390μLの溶液および溶媒を、それぞれ試料および参照セクター中に配置した。沈降トレースを、屈折指標(干渉光学)における局所差違を記録することによって検出した。試料を、10倍希釈で、またはさらなる希釈無しで解析した。拡散補正Sedimentation Coefficient Distributions(SCD)をP.Schuck,NIH(Peter Schuck et al.,Biopolymers,Vol54,Issue5,ページ328−341、2000年10月)によって提案された有限エレメントアプローチを用いて計算した。摩擦比f/f0を、フィッティング変数として処理した。緩衝液(リン酸緩衝食塩水、PBS)の密度および粘度ならびにタンパク質の部分特異的容量(v)を、Sednterpでの組成から計算した。これらの値を、それぞれのSCDを計算するときに使用した。
処方されたOprF/I融合タンパク質の一部(0.25ml)を、20℃にて10分間、16000×gにて遠心し、上清から、水酸化アルミニウム沈殿を分離した。透明な上清を取り除き、RP−HPLCによって、未結合融合タンパク質の解析のために使用した。残ったペレットを、0.25mlの水中0.1% TFA(pH〜2)中で再懸濁させた。試料をRTにて2時間インキュベートし、つづいて10分間、室温にて16.000gでの遠心をして、アルミニウム粒子をスピンダウンした。透明な上清をRP−HPLCによる解析のために使用した(TFA脱着)。
OprF/I融合タンパク質の発現と回収
OprF/Iは、緑膿菌外膜部分タンパク質OprFおよびOprIの融合タンパク質である。そのN−末端にてHis6−タグを含む、224のaa融合タンパク質として発現する。N−末端Metが、大腸菌での発現の後に開裂する。(N−末端メチオニンを含む)発現したタンパク質の一次構造をSEQ ID NO:3で示している。
OprF/Iは、とりわけ高濃度のNaClとイミダゾールなしでの溶解緩衝液を使用する時に、細菌プロテアーゼによって分解されうる。したがって、細胞を、0.1M Tris、pH7.4、0.5M NaCl、0.06Mイミダゾールからなる冷却溶解緩衝液(緩衝液中細胞ペーストの1:5希釈)中に再懸濁させた。0.5M NaClの添加がとりわけ、溶解物中の分子のタンパク質分解を阻害した。再懸濁と続く均質化(800barにて2サイクル)を、冷室温にて実施し、溶解物をすぐに氷上に置いた。より高い温度が、産物の分解またはより高いプロテアーゼ活性を導きうる。
(銅イオンでロードした)Chelating Sepharose FFを、His−タグ化OprF/Iを捕獲するために使用した。溶解物をロードした後、溶出を、異なる濃度のイミダゾール、0.07M、0.325Mおよび0.5Mイミダゾールで実施した。OprF/I含有画分が、2つの別のピークとして、0.325Mイミダゾールにて溶出する。解析データは、RP−HPLC溶出プロファイルが種々のピークを含むことを示した。同一の試料を、還元条件(DTTまたはβ−MEの添加)下で解析した場合、ただ1つのピークが観察された。未処理試料中の種々のピークが、ほぼ確実に天然の分子のジスルフィド混乱バリアントおよび凝集体であった。
本段階は、低分子量不純物(たとえばイミダゾール、銅など)の含量を減少させ、緩衝液交換を実施した。ローディング容量は、カラム容量のおよそ20%であった。溶出緩衝液0.1M Tris−HCl、0.15M NaCl、pH8.0を使用した。これは、還元および再酸化のために使用した緩衝液と同一であった。あるいは、本段階をまた、100Kカットオフ膜でのUF/DFによって置換した。
IMAC/G50段階の後、OprF/Iは、図5で略図的に描写したようなジスルフィドスクランブリングによって引き起こされた、誤ってたたまれた形態(高および低分子量凝集体)の不均一混合物として存在する。ジスルフィド結合の還元を、5mM DTTで実施し、すべての分子間および分子内ジスルフィド結合を切断した。完全に還元したタンパク質は、RP−HPLCデータにしたがって、単一ピークとして溶出する。DTTを、β−MEによって置換可能である。DTTは、水溶液中で長期間安定ではないので、新たに調製したDTT溶液(水中1M、1時間以内に使用)の一部を、穏やかに攪拌して、IMAC/G50プールに加える(1M DTTストック溶液の5mL/リットルIMAC/G50プール)。このプールを、攪拌せずに30分間、室温にてインキュベートする。試料を、RP−HPLCによって解析して、還元の進行をモニタ可能である。
再酸化条件の最適化のために、異なる酸化還元システム(GSSG/GSH、シスタミン/システアミン、シスチン/システイン)を、ジスルフィド結合の正確なリシャッフリングを許容するために、低濃度のDTT(1mM)の存在下で試験した。再酸化の進行(ジスルフィド結合の形成)を、折りたたみバリアントは異なる保持時間を持つので、種々の時間間隔の後に、RP−HPLCによってモニタ可能である。種々の酸化還元システムの初期研究の後、シスチンを酸化試薬として使用することが決まった。シスタミン/システアミンでの再酸化は、試験した条件下では、成功しなかった。IMAC/G50プールの還元/再酸化前後の代表的なRP−HPLCおよびSEC溶出プロファイルを図6および図7で示している。0.5mMシスチンの存在下での再酸化の後、RP−HPLCおよびSECによって観察された溶出プロファイルは、「未処理」IMAC/G50プールと比較して、非常により均一であった。還元前にIMACプール中に存在する種々のピークが、還元条件下1つの主要なピークにシフトする。再酸化の後、1つの主要なピーク(図8にてピーク2と命名)が、還元されたタンパク質と比較して、異なる保持時間にて観察された。ピーク2は、正確に折りたたまれたOprF/Iを表すべきである。ピーク2は、折りたたみバリアントであるべきである、3つのより小さなピーク(図8中ピーク1、ピーク3およびピーク4)によって囲まれる。図8中ピーク5およびピーク6と命名した、およそ13.17および13.81分にて溶出されるピークは、他の折りたたみバリアント(MSデータにしたがって、ジスルフィド架橋凝集体)である。
再酸化後の陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理ストリームを含むOprF/Iのさらなる精製を、残っているエンドトキシンとgDNAの含量を減少させるために試験した。これらの残っている不純物は、中性〜わずかに塩基性pHにて、より高い伝導度にてでさえも、陽イオン交換培地に結合し、一方産物は、フロースルー中残るはずである。DEAE Sepharoseを試験し、樹脂上へのOprF/Iの結合による任意の主要な産物の欠損なしに、エンドトキシンを除去するための良好な特性を持つことがわかった。
再酸化とDEAEフロースルークロマトグラフィーの後、タンパク質溶液をさらにQ−Sepharose HPによって精製した。QSHPによる精製が、主要プール中の〜2EU/mgのエンドトキシン濃度をもたらし、これは許容可能な低レベル内である。
最後に、QS−HPプールを、処方緩衝液(1×PBS緩衝液 pH7.4、ダルベッコ、Ca、Mgなし)に対して透析した。10kDaまたは30kDa再生セルロース膜(Amicon Ultra 15遠心フィルター装置、Millipore)を使用した。OprF/Iが、30kDa膜の浸透中検出された。したがって、10kDa膜を、処方緩衝液中の最終UF/DFに対して使用し、結果として>95%の段階収率となった。プールを、UV測定に基づいて、1mg/mlの最終タンパク質濃度に調整した。
OprF/I融合タンパク質バリアントの予備単離
QSHPクロマトグラフィー段階からの選択された側画分を、予備単離のために使用した。典型的な予備溶出プロファイルと、検出されたピークのノミネーションを図11に示す。個々のピークを含むすべての画分を合わせて、還元および非還元条件下、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットによって解析した。還元条件下、すべてのバンドが、OprF/I標準と比較して同様の移動特性をもった。非還元条件下、およそ60kDa(分子量マーカ−に対して校正した)にて検出された多量体OprF/Iバリアントの含量は、ピークC、D、5および6に対して増加した。すべてのバンドをまた、モノクローナル抗OprF/I抗体を用いてウエスタンブロット解析によって検出した。これらの結果は、RP−HPLCによって検出されたすべてのピークが、産物関連であることを示唆している。この発見はまた、個々の画分のペプチド質量フィンガープリント解析によって確認された。最終のDSにおいて、P1、2、3、4および5のみが、RPCによって検出可能である。他のピーク、A、B、C、Dおよび6は、主要画分からQ−Sepharose HP上での分離クロマトグラフィーによって分離可能であった。Q−Sepharose HPクロマトグラフィーの間、小さなピークが、主要ピーク前に溶出された。この画分は、解析RP−HPLCおよびMALDI−ToFによる検出では、より高い濃度のOprF/I分解産物(7kDaのピークとして示される)を含んだ。このピークはまた、15.5kDaおよび7.2kDa OprF/I断片からなる産物関連断片であることも示された。
精製したOprF/I融合タンパク質は、RP−HPLCによって示されたような分子の異なる形態からなる(図8を参照のこと)。5つのピークが、RP−HPLCによって検出可能であった。ピーク2(P2)は、ピーク1(P1)、ピーク3(P3)およびピーク4(P4)によって囲まれた、50〜55%の相対含量でのもっとも顕著なピークであった。ピーク5(P5)は、わずかに高い保持時間にて溶出されている他のピークからよく分離された。相対ピーク含量を表2にて要約した。β−MEまたはDTTでの試料の還元の後、溶出プロファイルが変化する。1つの主要なピークが溶出し、個々のバリアントが、同一のクロマトグラフ保持時間を示す。これらの結果に基づき、P1〜P4が、ジスルフィド結合における差違によって引き起こされる折りたたまれたバリアントとして認識される。
MALDI−ToF解析に関して、システムを、BSAに対して外部で校正した。内部校正のために、ミオグロビンを使用した。すべての4つの試料が、同様の質量スペクトルを示した。主要シグナルは、天然のOprF/Iモノマーからであり、続いて、OprF/Iダイマーおよびトリマーピークであった。表3は、内部校正後に得た分子量を要約している。予想された分子量からの偏差は、実験誤差(±0.3%)内であった。24kDa、48kDaおよび72kDaでの質量ピークが検出され、これは、単量体、二量体および三量体OprF/I融合タンパク質の存在を示している。
非還元および還元条件下、OprF/I融合タンパク質試料のネイティブPAGEを、以上で説明したように実施した。クーマシーブルー染色後のバンド強度を、濃度測定によって評価した。天然条件下、1つのOprF/I主要バンドが、およそ94〜97%の相対強度にて、およそ180kDaの範囲で検出された。還元条件下、明白な分子サイズは、206kDaと測定された。明確な分子量は、SEC−HPLCデータと良好な相関があるが、OprF/I質量が80kDa(トリマー)の範囲内であったSEC−MALSおよびAUC結果からは異なった。ネイティブPAGEの分離機構は、ネイティブSECと同様であり、分離特性は、ゲルを通過した時の、タンパク質複合体の形状に強く依存する。この結果は、OprF/Iが、高い流体力学半径を持つ、ある程度細長い形状を有することを裏付ける。
2つの異なる試料の最初の13または15aaを解析した。理論および推定アミノ酸配列間に差は発見されなかった。シークエンシング結果により、N−末端Metが、発現の間完全に開裂したことが確認された。
OprF/I融合タンパク質試料のチオール基のアルキル化の結果は、質量が、ヨードアセトアミドの4つの結合した分子に相当する、+226Daのアルキル化後に増加したことを示した(理論質量増加、+228Da;結合したヨードアセトアミド分子あたり、+57Daの質量増加)。還元タンパク質が、4つの遊離システイン残基を含むので、本結果は推測された。すべての他の試料は、質量の増加を示さなかった。これらの結果に基づいて、RP−HPLCのピークP1(図8)は、1つのさらなるジスルフィド結合を含む、二つ折りシステイン化バリアントとして考えられる。ピークP2およびP3は、2つのジスルフィド結合を含むバリアントとして考えられた。
屈折率でのSEC/280nmでのUV検出を、タンパク質の特性化と分子量検出のために、光散乱と組み合わせた。分子量は、23〜26分で溶出している主要ピークの切片にわたって一定であったので、定義された単分散分子種が溶出された。主要ピークに関しておよそ80〜86kDaの範囲の分子量が検出された。累積質量画分は、94〜98%の範囲内であった(種1)。
沈降速度プロファイルを記録し、SedFitソフトウェアにて解析して、試料コンポーネントの沈降係数値を産出した。個々の種1(OprF/I融合タンパク質主要ピーク)およびピーク2(凝集体)に対する得られた計算された沈降係数と分子量を測定した。ドミナントコンポーネント種1に対する沈降係数値は、研究したすべての試料に対してかなり良好に一致する。このことは、試験した異なる試料間で、有意な差が存在しないことを示唆する。主要コンポーネント種1のモル質量は、本パラメータに対して、実験的変動内で異なる。これは一般に、OprF/I融合タンパク質のトリマーを示唆する。配列から計算したように、モノマーおよびトリマーのモル質量は、それぞれ24.1kg/モルおよび72.3kg/モルである。
MALDI−MS/MS解析を用いるジスルフィド結合マッピング
試料ピーク1(P1)の潜在的システイン化が、トリプシン消化の直線モードスペクトル中で示されうる。システイン残基を含むペプチドが、システイン化効果を示している、約240Daの差を示した(2システイン)。
本研究の目的は、ピーク1、2および3間のジスルフィド橋パターンにおける差を同定することである。ピークを単離し、濃縮した。第一配列は、位置18(C1)、27(C2)、33(C3)および47(C4)にて4つのシステイン残基を含む(SEQ ID NO:1を参照のこと)。オンラインLC/ES−MSによる無傷の分子量測定のデータから、ピーク1が1つのジスルフィド橋と2つのシステイン化を含み、ピーク2および3が2つのジスルフィド橋を持つことが結論づけられた。すべての3つのピークのトリプシン消化によって、ペプチド断片1〜55が産出され、これはタンパク質のすべての4つのシステインを含む。3つのピーク中の本断片に関して観察された質量により、アサイメントが、無傷のMW解析を形成することが確認された。すべての3つのピークからのペプチド断片1〜55を回収し、AspNにて補助消化し、LC−MSによって解析した。生データの解釈に基づいて、図12にしたがった構造が、3つの異なるピーク中のプレドミナントコンポーネントに対して導かれた。
SDS−PAGEゲル(還元および非還元条件)を、10日にわたり、異なる温度にてインキュベートしたOprF/I融合タンパク質試料に関して走らせた。還元ゲル中のOprF/I融合タンパク質主要バンドの相対含量を、2〜8℃試料(参照)へのバンド強度の校正によって、ゲルの濃度評価によって計算した。10日の保存期間にわたり、−80℃、−20℃、2〜8℃およびRT(20℃)にて保存した試料に対して、分解およびバンドパターンにおける変化は観察されなかった。
OprF/I融合タンパク質試料を、pH1.98〜pH11.1にて異なるpH値でインキュベートし、RP−HPLCおよびSEC−HPLCによって解析した。非共有トリマーに相当するOprF/I融合タンパク質の主要ピークが、2〜8℃にて23日の保存期間にわたり、pH5.9〜11.1にて、およそ90%一定であった。トリマーは、低pH(pH2)にて可逆的に分離する。
RP−HPLC結果は、OprF/I融合タンパク質がさらに、水酸化アルミニウム上への結合によって、pH4.88にて安定化可能であり、高回収で脱着可能であったことを示した。
5匹のBALB/cマウス/群に、1mlの異なるOprF/I融合タンパク質画分(RP−HPLC画分のピーク1、2および3)と、未画分化OprF/I融合タンパク質(DS)を、0日および14日にて、i.p.で与えた。21日目に、マウスの血液を、特定の抗体に関して試験し、値(GMT[μg/ml]+SD)を特定の用量(μgタンパク質)にて決定した。結果を表4にて要約する。
1.OprF/I融合タンパク質ならびにその三量複合体は、IMAC−Cu捕獲段階にて開始して、40%までの総収率で、架橋されたジスルフィド凝集体なしに産出および精製可能である(すなわち、SECにしたがって、約90%以上のトリマー含量および1%より少ない凝集体含量トのリマーの形態でのSEQ ID NO:1)。
2.異なる産出ロット中で産出されたOprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:1)は、非常に一貫した。
3.OprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:1)は、およそ80kDaの平均分子量と、94〜98%の相対含量をもつ天然外膜タンパク質OprFとして、生理学的条件下、トリマーとして存在する。
4.本発明にしたがって産出されたOprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:1)は、RP−HPLCによって、種々のバリアントに分離可能である(図8および12を参照のこと)。ピーク1(P1)は、位置18(C1)と27(C2)間にジスルフィド結合を含む、位置33(C3)および47(C4)にて二つ折りシステイン化付加物である(またSEQ ID NO:11を参照のこと)。ピーク2(P2)は、位置18(C1)〜27(C2)および33(C3)〜47(C4)にて、2つのジスルフィド橋を含むバリアントである(またSEQ ID NO:12参照のこと)。ピーク3(P3)はさらに、位置18(C1)〜47(C4)および27(C2)〜33(C3)にて、2つのジスルフィド橋を含むバリアントである(またSEQ ID NO:13を参照のこと)。
5.OprF/I融合タンパク質(SEQ ID NO:1)は、10日の期間にわたり、−80℃〜+20℃、および2〜8℃にて23日間にわたりpH5.9〜11.1にて、安定である。pH4.88にて、OprF/I融合タンパク質をさらに、水酸化アルミニウム上に結合することによって、安定化可能である。
6.すべての3つのバリアント(ピーク1、2おひび3)ならびに未画分化OprF/I融合タンパク質が、BALB/cマウスのワクチン化の後に、特定の抗体を誘導した。
無作為、プラセボ対象、部分的盲検第2相パイロット試験デザイン:
18〜80歳の48時間以上機械的人工呼吸器が必要な、ICUに収容された400人のオスまたはメス患者を、100または200mcgミョウバンアジュバントOprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)、100mcg非アジュバントOprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)またはプラセボ対象としてミョウバンを与えた、4処置群で、0日、7日にワクチン摂取した(試験した薬物産物のさらに詳細な記述に関しては、以上の物質セクションを参照のこと)。患者あたりの研究期間は、90日であると推定し、総研究期間は12〜18ヶ月であると推定した。
主要:
・OprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)またはプラセボを受領している患者におけるELISAによって測定したOprF/I特異的IgG抗体タイタ−によって決定したような14日における免疫原性
副次:
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者におけるELISAによって測定したOprF/I特異的IgG抗体タイタ−によって決定したような、7日、14日後病院退院まで2週間間隔、ICU退院日および90日での免疫原性
・第一ワクチン接種後90日までのワクチン接種期間の、重度な副作用および副作用の率
・第一ワクチン接種後90日までの、安全性検査値(血液検査、血液生化学検査、尿検査)
・全身認容性(生命兆候:血圧、パルス、体温)
・局所認容性(局所注射部位反応)
・90日まで、OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者における、細菌(陽性血液培養として決定)または緑膿菌(NNIS VAP基準にしたがって決定)のような緑膿菌で侵襲的に感染した患者数
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者における、緑膿菌気管気管支炎、緑膿菌陽性傷、尿および気管分泌を持つ患者数
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者の全生存率
・ICUおよび病院滞在の長さ
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者におけるVAPの開始までの時間
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者における抗生物質なしの日数
・OprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者における緑膿菌以外の病原菌による感染の予防
・器官機能(Sequential Organ Failure Assessment[SOFA]スコア)
・7、14、90およびICU退院日のOprF/Iワクチンまたはプラセボを受領している患者における抗ヒスタミン抗体の存在
・7、14日、病院退院までの2週間ごと、ICU退院日、90日におけるOPAによる機能的IgG抗体の測定
・7、14日、ICU退院日および90日での、OprF/I特異的IgG抗体の親和性の測定
本試験の主要評価項目は、全ての群が、14日において、プラセボ群(OprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)群におけるGMTs:995〜2117 ELISAユニット/ml)と比較して、すべてのOprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)処置アームで有意に高かった、IgG抗体Geometric Mean Titers(GMTs)にて、良好なセロコンバージョン(すなわち、第一ワクチン接種後14日まで、OprF/I IgGにおいて、少なくとも4倍増加)(OprF/Iワクチン(SEQ ID NO:1)処置アームにて65〜81%)が示されたことに適合した(図1)。これは、0日〜14日のOprF/I IgG中およそ4倍増加である。本試験集団で査定可能である限り、処置アーム間で処置突発副作用において有意な差はなく、局所および全身認容性は良好であるように見えた。報告された薬物関連副作用の数および性質により、安全性の憂慮はみあたらず、中間データに基づいて、Data Safety Monitoring Board(DSMB)によって確認された。
1.薬理学的に効果的な量のOprF/I試薬を入院患者に投与することを含む、例えば前記患者のようなヒトにおける死亡率を減少させる方法。
2.薬理学的に効果的な量のOprF/I試薬をICU患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
3.薬理学的に効果的な量のOprF/I試薬を人工呼吸器をつけたICU患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
4.薬理学的に効果的な量のOprF/I試薬をやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
5.薬理学的に効果的な量のOprF/I試薬を嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
6.治療的に効果的な量のOprF/I試薬および第二薬物基質を共投与することを含み、前記第二薬物基質が、抗細菌または抗真菌薬である、様態1〜5の任意の1つにしたがった方法。
7.治療的に効果的な量のOprF/I試薬の投与が、100mcgの量で2回与えられる、様態1〜5の任意の1つにしたがった方法。
8.治療的に効果的な量にOprF/I試薬が、ICUに収容される少なくとも2週間前に与えられる、様態2〜3の任意の1つにしたがった方法。
9.OprF/I試薬が、SEQ ID NOs:1〜13のポリペプチド、その三量体形態、および任意の前記ポリペプチド対する抗体からなる群より選択される化合物である、以上の様態の任意の1つにしたがった方法。
10.OprF/I試薬が、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13の混合物との三量体形態を含むそれらの三量体形態、前記ポリペプチドまたは三量体形態の任意に対する抗体からなる群より選択される、以上の様態の任意の1つにしたがった方法。
11.以上の様態の任意の1つにしたがった任意の方法での利用のためのOprF/I試薬。
12.入院患者、ICU患者、嚢胞性線維症患者、人工呼吸器をつけたICU患者、またはやけど患者の死亡率の減少において使用するためのOprF/I試薬。
13.OprF/I試薬が、SEQ ID NO:1をもつポリペプチドである、様態12にしたがった死亡率の減少における利用のためのOprF/I試薬。
14.1つまたはそれ以上の薬理学的に許容可能な希釈液またはそのための担体と一緒にOprF/I試薬を含む、様態1〜10の任意の1つに従った任意の方法における利用のための薬理学的組成物。
15.a)OprF/I試薬である第一試薬
b)抗細菌または抗真菌薬である共試薬
を含む薬理学的混合物。
16.様態1〜10の任意の方法、様態11〜13の任意のOprF/I試薬、または様態14または15の薬理学的組成物で、前記OprF/I試薬が、そのアミノ末端で、緑膿菌外膜タンパク質Fのカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合した、緑膿菌外膜タンパク質Iを含むか、からなる融合タンパク質であり、とりわけ、
(i)緑膿菌外膜タンパク質Iが、完全長外膜タンパク質Iである、
(ii)緑膿菌外膜タンパク質Fが、完全長外膜タンパク質Fである、
(iii)OprF/I融合タンパク質が、SEQ ID NO:1からなる、または含む、
(iv)OprF/I融合タンパク質が、前記ポリペプチドまたはSEQ ID NO:1に対する抗体またはその断片からなる、
(v)OprF/I融合タンパク質が、機能的に活性なバリアントであり、および/またはSEQ ID NO:1に対して少なくとも50%配列同一性、とりわけ少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、またより好ましくは少なくとも90%、またより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%配列同一性を持つ、
(vi)融合タンパク質が、SEQ ID NO:1を持つポリペプチド、またはSEQ ID NO:1に対して80%、85%、90%または95%同一性をもつその免疫原性バリアントを含む(または少なくとも80%、85%、90%、または95%からなる)、
(vii)融合タンパク質が、SEQ ID NO:1を持つポリペプチド、またはSEQ ID NO:1に対して80%、85%、90%または95%同一性をもつその免疫原性バリアントを含み(または少なくとも80%、85%、90%、または95%からなり)、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが、a)Cys18−Cys27−結合(例えばDEQ ID NO:11を参照のこと)、b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(例えばSEQ ID NO:12を参照のこと)、またはc)Cys18−Cys47−結合およびCys27−Cys33−結合(例えばSEQ ID NO:13を参照のこと)のいずれかを持つ。
17.以上の任意の様態にしたがったOprF/I融合タンパク質を産出するための方法であって、
(a)前記OprF/I融合タンパク質を還元試薬で還元すること、および
(b)還元したOprF/I融合タンパク質を、還元試薬の存在下、酸化還元試薬で酸化すること
の段階を含む方法。
18.段階(a)にて、還元試薬の濃度が、約3mM〜約10mMであり、還元試薬が、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)またはβ−メルカプトエタノールである、様態17にしたがった方法。
19.段階(b)において、酸化還元試薬の濃度が、約0.2mM〜約4mMであり、酸化還元試薬が、グルタチオンジスルフィド/グルタチオン、または酸化還元試薬シスチン/システインであり、還元試薬の濃度が、約0.375mM〜約1.5mMであり、還元試薬がジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)またはβ−メルカプトエタノールである、様態17または18にしたがった方法。
20.反応温度が、約18℃〜約25℃である、様態17〜19の任意にしたがった方法。
Claims (13)
- SEQ ID NO:1のアミノ酸配列からなるOprF/I融合タンパク質、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む、ICU患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
- SEQ ID NO:1の3つのOprF/I融合タンパク質、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を持つその免疫原性バリアントを含有するタンパク質複合体を含む、ICU患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
- SEQ ID NO:1の3つのOprF/I融合タンパク質、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を持つその免疫原性バリアントで少なくとも80%を構成されるタンパク質複合体を含む、ICU患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
- 前記免疫原性バリアントが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列の少なくとも95%同一性を持つ、請求項1から3のいずれか1項に記載の薬理学的組成物。
- 前記OprF/I融合タンパク質、又は免疫原性バリアントは、
(a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、並びに(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントからなる群から選択される、請求項1から4の何れか1項に記載の薬理学的組成物。 - (a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、並びに(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントの合計が、全OprF/I融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントの75%以上である、請求項5に記載の薬理学的組成物。
- 前記タンパク質複合体は、
(a)Cys18−Cys27−結合(SEQ ID NO:11)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、又はその免疫原性バリアント、及び/又は
(b)Cys18−Cys27−結合とCys33−Cys47−結合(SEQ ID NO:12)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、又はその免疫原性バリアント、及び/又は
(c)Cys18−Cys47−結合とCys27−Cys33−結合(SEQ ID NO:13)を有するSEQ ID NO:1のOprF/I融合タンパク質、又はその免疫原性バリアントで構成される、請求項2から6の何れか1項に記載の薬理学的組成物。 - 前記組成物がワクチンである、請求項1から7の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
- ヒトの28日死亡率が90%より低い、請求項1から8の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
- ヒトの28日死亡率が85%より低い、請求項1から8の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
- ヒトの28日死亡率が80%より低い、請求項1から8の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
- ヒトの28日死亡率が75%より低い、請求項1から8の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
- アジュバントを含まない、請求項1から12の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
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