KR20140047180A - 개변형 비오틴 결합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 그 변이 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서, 이하의 그룹:
1) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
2) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기의 친수성 아미노산 잔기로의 치환;
3) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
4) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
5) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환: 및
6) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환
으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질을 제공한다.

Description

개변형 비오틴 결합 단백질{MODIFIED BIOTIN-CONJUGATED PROTEIN}

본 발명은 개변형 비오틴 결합 단백질에 관한 것이다.

아비딘은 흰자 유래의 염기성 당단백질로, 비오틴(비타민 H)과 강하게 결합한다. 한편, 스트렙트아비딘은 방선균(Streptomyces avidinii) 유래의 아비딘 모양 단백질로, 등전점은 중성 부근에서 당쇄를 포함하지 않는다. 양단백질 모두, 4량체를 형성하며, 하나의 서브유닛당 1분자의 비오틴과 결합한다. 분자량은 60kDa 정도이다. 아비딘과 비오틴, 혹은 스트렙트아비딘과 비오틴의 친화성은 매우 높아(Kd=10^-15~-14M), 생체 2분자 사이의 상호작용으로서는 가장 강하다. 그 때문에, 아비딘/스트렙트아비딘-비오틴 상호작용은, 생화학, 분자생물학, 혹은 의학의 분야에서 널리 응용되고 있다. 아비딘은, 등전점이 10을 넘어, 그 높은 염기성, 혹은 당쇄의 존재에 의해, DNA나 단백질 등의 생체 분자에 대한 비특이적인 결합이 문제가 되는 경우가 있다.

비오틴의 분자량은 244로 작고, pH변화나 열에도 안정적이기 때문에, 물질의 표식에 잘 이용되고 있다. 비오틴화의 방법으로서는, 화확적인 수식을 실시한 비오틴을, 단백질의 아미노기, 카르복실기, 알데히드기 등의 각종의 관능기에 결합시키는 방법이 있다. 이러한 비오틴화 시약은 시판되고 있으며, 이들을 이용하여 단백질이나 핵산 등을 비오틴화할 수 있다. 또한 단백질의 비오틴화의 방법의 하나로서, 생체 내의 비오틴 리가아제에 의해 비오틴화 되는 서열과, 목적의 단백질과의 융합 단백질을, 재조합 단백질로서 발현시켜, 숙주 세포 내의 동효소에 의해, 융합 단백질을 비오틴화시키는 방법이 있다. 이러한 비오틴화 서열로서, 예를 들면 BioEase Tag(등록상표)가 있으며, 대장균이나 초파리 세포, 혹은 포유류 세포에 있어서, 단백질을 in vivo로 비오틴화 시킨 상태로 발현시키는 시스템으로서 시판되고 있다.

아비딘 또는 스트렙트아비딘과, 비오틴과의 결합은 극히 강하기 때문에, 그 결합은 불가역적이며, 한번 결합하면 거의 해리시킬 수 없다. 이 강한 결합 때문에, 종래의 아비딘, 스트렙트아비딘은, 그대로는, 비오틴화 생체분자의 정제를 위해서 필요한, 예를 들면 어피니티크로마토그래피 등의 가역적인 결합을 필요로 하는 기술 분야에 응용할 수 없다.

이 문제에의 대책으로서, 지금까지 비오틴 결합성을 저하시킨 아비딘이나 스트렙트아비딘이 보고되고 있다. 예를 들면, 비오틴과의 결합에 기여하는 티로신 잔기를 니트로화한 니트로화 아비딘이나 니트로화 스트렙트아비딘이 개발되었다. 이들은 산성~중성(pH가 4~7.5)일 때에 비오틴과 강하게 결합하고, 알칼리성(pH가 10)일 때에 해리한다. 니트로화 아비딘-아가로오스는 CaptAvidin-아가로오스로서 시판되고 있다. 그러나 니트로화는 번거롭고, 또한 그 효율도 일정하지 않다. 게다가 극단적인 pH 변화가 비오틴화 단백질 등에 악영향을 미칠 가능성이 있다.

한편 지금까지, 유전자 공학적으로 아비딘이나 스트렙트아비딘에, 부위 특이적 아미노산 변이를 도입함으로써, 비오틴에 대한 친화성을 낮춘 예가 보고되고 있다. 비오틴과의 친화성을 저하시키는 방법으로서, 비오틴 결합 포켓을 형성하는 아미노산 중, 비오틴과 직접 상호작용하는 아미노산에 변이 도입하는 방법과, 단백질의 서브유닛끼리의 접점에 관여하는 아미노산에 변이 도입하는 방법의 2가지가 있다.

아비딘의 경우, 비오틴과 수소결합하는 아미노산에 변이를 넣음으로써(Marttila et al. (2003) Biochem J. 369:249-254; Laitinen et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:4010-4014; Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:8219-8224), 혹은 비오틴과 소수 결합하는 아미노산에 변이를 넣음으로써(Laitinen et al. (1999) FEBS Lett. 461:52-58; Laitinen et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:4010-4014), 비오틴에의 친화성을 낮춘 재조합 단백질이 보고되고 있다.

마찬가지로 스트렙트아비딘의 경우도, 비오틴과 수소결합하는 아미노산에 변이를 넣은 예(Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem 276:46422-46428; Gabriel et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:13525-13530; Qureshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25:409-415; Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46:268-273; Wu and Wong (2005) J. Biol. Chem. 280:23225-23231)나, 비오틴과 소수 결합하는 아미노산에 변이를 넣은 예(Chilkoti et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:1754-1758; Laitinen et al. (1999) FEBS Lett. 461, 52-58; Sano et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3180-3184; Sano et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6153-6158)가 알려져 있다.

또한, 아비딘과 스트렙트아비딘에 있어서, 그들 단백질의 서브유닛끼리의 접점에 관여하는 아미노산에 변이 도입하는 방법으로, 단량체의 변이 단백질을 작성하고, 비오틴에의 친화성을 낮춘 예가 보고되고 있다(Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:8219-8224, Wu and Wong (2005) J. Biol. Chem. 280:23225-23231). 아비딘이나 스트렙트아비딘은, 4량체를 형성하고, 각 서브유닛 각각 1개씩 비오틴 결합 사이트를 가진다. 완전한 비오틴 결합 포켓을 형성하려면, 인접하는 서브유닛의 아미노산 잔기(예를 들면 타마비딘 2의 경우, 108번째의 트립토판(W108))의 존재가 중요하다. 따라서, 서브유닛간의 결합은, 비오틴과의 친화성에도 큰 영향을 주는 것이라고 생각되고 있다.

Wu들(J. Biol. Chem. (2005), 280:23225-23231)에 의하면, 스트렙트아비딘의 경우, 각 서브유닛을 A, B, C, D라고 이름 붙이면, 서브유닛 A에 있는 55번째의 바린은, 서브유닛 B의 59번째의 아르기닌에 가까운 위치에 존재한다. 서브유닛 A에 있는 76번째의 트레오닌은, 서브유닛 B 상의 76번째의 트레오닌과 59번째의 알라닌과 매우 가까운 위치에 배치하고 있다. 서브유닛 B에 있는 109번째의 로이신은, 서브유닛 A 상의 125번째의 바린과 상호작용하고 있다. 서브유닛 A에 있는 125번째의 바린은, 서브유닛 D 상의 109번째의 로이신, 120번째의 트립토판, 123번째의 트레오닌, 125번째의 발린(valine), 서브유닛 B 상의 109번째의 로이신, 서브유닛 C 상의 107번째의 글루타민과 광범위하게 걸쳐서 상호작용을 하고 있다. 따라서, 이러한 아미노산을 극성이 높은 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌 등으로 치환함으로써, 서브유닛간에 전하적 반발을 발생시키는 것이나 입체 장해를 일으키게 하는 것을 기대할 수 있다. 극성 아미노산 중에서도 Hydrophaty index가 가장 낮은 아르기닌은 그 효과가 크다고 생각된다.

아비딘이나 스트렙트아비딘 등의 비오틴 결합성 단백질을, 어피니티크로마토그래피 등의 가역적인 결합을 필요로 하는 기술 분야에 응용하기 위해서는, 해리 정수(KD)를 10^-7(M) 정도까지 상승시키는 것이 하나의 기준이 된다고 생각되고 있다. 경우에 따르지만 일반적으로 해리 정수가 이 이상 작은 경우, 비오틴 결합능이 너무 강해서, 소망하는 비오틴화 물질을 효율 좋게 해리 시키지 못하며, 또한, 해리 정수가 이보다 큰 경우는, 비오틴 결합능이 너무 약해서 소망하는 비오틴화 물질을 충분히 결합시킬 수 없기 때문이다(Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46:268-27).

이 점을 고려하면, 상기의 스트렙트아비딘 변이체에 있어서, 수소결합 부위-아미노산 변이체는, 모두 해리 정수가 10^-11(M) 정도로 작고, 비오틴 결합능이 지나치게 강한 것이었다. 단, 이러한 변이체에는, 아미노산 개변의 결과, 서브유닛 상호작용에까지 영향을 미치는 것이 많이 있으며, 이들은 종종 단량체가 되지만, 단량체가 되었을 경우에는 10^-9(M) 정도의 해리 정수였다. 또한, 상기의 스트렙트아비딘 변이체에 있어서, 수소결합 부위를 2개소 이상 추가하여 개변시켰을 경우, 그 대부분은 단량체가 되고, 그 중에는 비오틴 결합능(해리 정수)이 10^-8 내지 10^-6(M) 정도가 되는 것이 있었다(Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:46422-46428).

해리 정수가, 10^-8 내지 10^-7(M)의 변이체는, 어피니티크로마토그래피 등의 용도에 적당한 비오틴 결합능을 가지고 있다(Qureshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25:409-415; Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46:268-273). 그러나 반면, 이러한 단량체는 프로테아제에 매우 분해되기 쉽다는 것이 알려져 있다(Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:8219-8224, Wu and Wong (2005) J.Biol. Chem.280:23225-23231). 어피니티크로마토그래피에서는 여러가지 물질이 혼합한 세포 조추출액을 이용하는 경우가 많지만, 세포 조추출액 중에는 종종 프로테아제가 포함되어 있어, 단량체는 이러한 용도로 사용하려면 문제가 있었다.

또한, 단량체로 함으로써, 서브유닛간의 결합으로 숨겨져 있던 소수성 영역이 노출되기 때문에, 단백질 전체의 가용성이 저하할 가능성이 있으며, 또한 재응집의 원인으로도 될 수 있다. 지금까지 아비딘을 모델로 설계된 단량체에서는(예를 들면 프로 메가사의 Soft Link Soft Release Avidin Resin), 이것을 담체에 고정화시켰을 때, 단량체끼리가 회합하여 4량체를 형성하기 때문에, 결과적으로 비오틴과의 친화성이 높아져 버린다. 이 때문에 비오틴 표지 물질을 첨가하기 전에, 4량체가 비오틴과 강하게 결합하는 영역을 비오틴으로 메우는 처리가 필요하다. 이 처리는 번거로울 뿐 아니라, 사전 처리의 정도에 따라서 비오틴 표지 물질의 수량이 크게 바뀌어 오는 우려가 있다.

상기의 스트렙트아비딘 변이체에 있어서, 수소결합 부위의 아미노산을 2개소 이상 개변하여도 4량체가 유지된 것이 드물게 있었다. 그러나, 가령 이러한 4량체라 하여도, 개변에 의해 서브유닛 상호작용이 약해져 있어, 담체에 결합시킨 후에, 비오틴화 물질과 결합시키고, 그 후, 과잉 비오틴을 더하여 비오틴화 물질을 용출시키는 경우, 4량체를 구성하는 단량체의 대부분이 용출되어 버린다는 현상을 볼 수 있었다.

또한, 아비딘이나 스트렙트아비딘의 아미노산 개변 단백질은 그 대부분이, 대장균으로 가용성 발현시키지 못하고, 곤충 세포나 고초균(Bacillus subtilis)으로 발현시키지 않으면 안되기 때문에(Laitinen et al. (1999) FEBS Lett., 461, 52-58, Qureshi and Wong(2002) Protein Expr. Purif. 25:409-415), 번거로움과 비용이 매우 문제가 되고 있었다. 대장균으로 가용성 발현을 할 수 있는 것은 일부의 단량체 스트렙트아비딘뿐이다(Wu and Wong(2006) Protein Expr. Purif. 46:268-273).

이상에서 말한 바와 같이, 소망하는 비오틴화 물질을 충분히 결합할 수 있으며, 또한, 해리할 수 있는 정도의 비오틴 결합능을 가지며, 대장균으로 가용성 고발현하고, 또한 프로테아제 내성을 가지는, 비오틴 결합성 단백질은 지금까지 알려지지 않았다.

또한 본 발명자들은, 식용 버섯 노랑느타리(Pueurotus cornucopiae)로부터, 신규 아비딘모양 비오틴 결합성 단백질인, 타마비딘 1과 타마비딘 2를 발견하고 있다(국제출원번호 WO02/072817호). 타마비딘 1 및 타마비딘 2는, 대장균으로 대량으로 발현시킬 수 있으며, 특히 타마비딘 2는 이미노비오틴 칼럼을 이용한 정제에 의해 용이하게 조제할 수 있었다(WOO2/072817). 타마비딘 1 및 타마비딘 2는 비오틴과 극히 강하게 결합하고, 특히 타마비딘 2에 관해서는, 아비딘이나 스트렙트아비딘과 거의 동레벨의 비오틴 결합 활성을 나타냈다. 또한 타마비딘 2는 아비딘이나 스트렙트아비딘과 비교해서 높은 내열성을 가지며, 또한 아비딘보다 비특이적인 결합이 적다고 한 점에서 뛰어난 비오틴 결합성 단백질이었다.

특허 문헌 1: 국제출원번호 WO02/072817호

비특허 문헌 1: Marttlla et al. (2003) Biochem J. 369:249-254 비특허 문헌 2: Laitinen et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:4010-4014 비특허 문헌 3: Laitinen et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:8219-8224 비특허 문헌 4: Laitinen et al. (1999) FEBS Lett. 461:52-58 비특허 문헌 5: Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:46422-46428 비특허 문헌 6: Gabriel et al. (1998) Proc. Natl.Acad. Sci. 95:13525-13530 비특허 문헌 7: Qureshi and Wong (2002) Protein Expr. Purif. 25:409-415 비특허 문헌 8: Wu and Wong (2006) Protein Expr. Purif. 46:268-273 비특허 문헌 9: Wu and Wong (2005) J. Biol. Chem. 280:23225-23231 비특허 문헌 10: Chilkoti et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:1754-1758 비특허 문헌 11: Sano et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3180-3184 비특허 문헌 12: Sano et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6153-6158

본 발명의 해결해야 할 과제는, 대장균으로 가용성 고발현이 가능하며, 또한, 비오틴 고정화 담체에 의한 정제가 용이한, 비오틴 결합성 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제의 해결을 위해서, 예의 연구에 노력한 결과, 소망하는 비오틴화 물질과 충분히 결합할 수 있으며, 또한, 해리할 수 있는 정도의 비오틴 결합능을 가지며, 또한 프로테아제 내성을 가지는, 안정된 개변형의 비오틴 결합성 단백질을 얻는 것에 성공하여, 본 발명을 상도하였다.

구체적으로는, 본 발명은 천연의 타마비딘 2(이하, 본 명세서에 있어서 「TM2」라고 기재하는 경우가 있다)의 아미노산 서열(서열 번호)을 개변함으로써, 상기 성질을 가지는 개변형의 비오틴 결합성 단백질을 얻은 것이다.

본 발명이 바람직한 양태

본 발명은 바람직하게는 이하의 양태을 포함한다.

[양태 1]

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1부터 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서, 이하의 그룹:

1) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

2) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기의 친수성 아미노산 잔기로의 치환;

3) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

4) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

5) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환: 및

6) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 2]

1-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A);

2-a) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기가 리신으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 W80K);

3-a) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 D116A);

4-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A);

5-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-D116A);및

6-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A-D116A)

로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 양태 1에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 3]

이하의 성질:

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및

iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다

의 1 내지 전부를 만족하는, 양태 1 또는 2에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 4]

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,

6) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 5]

6-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환되어 있는, 양태 4에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A).

[양태 6]

이하의 성질:

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및

v) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질보다, 높은 내열성을 가진다

의 1 내지 전부를 만족하는, 양태 4 또는 5에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 7]

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1부터 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,

이하의 그룹:

7) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환; 및

8) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 8]

7-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-D116A); 및

8-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-T78A-D116A)

로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 양태 7에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 9]

이하의 성질:

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및

vi) 약산성 조건하에서 비오틴과 결합하고, 그리고, 중성 조건하에서 비오틴과 결합하지 않는다

의 1 내지 전부를 만족하는, 양태 7 또는 8에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 10]

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1부터 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,

9) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 11]

9-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 양태 10에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A-D116A).

[양태 12]

이하의 성질:

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다;

iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다; 및

vii) 이미노비오틴으로 정제할 수 없다

의 1 내지 전부를 만족하는, 양태 10 또는 11 중 어느 한 항에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 13]

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질보다도, 낮은 비오틴 결합성을 나타내는, 양태 1 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

[양태 14]

이하의 a)-1)

a) 서열 번호 2의 14번째의 아스파라긴 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 글루타민 또는 아스파라긴산으로 치환되어 있다;

b) 서열 번호 2의 18번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;

c) 서열 번호 2의 34번째의 티로신 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 세린 또는 트레오닌으로 치환되어 있다;

d) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;

e) 서열 번호 2의 40번째의 아스파라긴산 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 아스파라긴 이외의 잔기로 치환되어 있다;

f) 서열 번호 2의 69번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;

g) 서열 번호 2의 76번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;

h) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 세린 또는 티로신으로 치환되어 있다;

i) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;

j) 서열 번호 2의 96번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;

k) 서열 번호 2의 108번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;

l) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 글루타민산 또는 아스파라긴으로 치환되어 있다;

m) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기는 개변되어 있지 않다;

n) 서열 번호 2의 66번째의 알라닌 잔기는 개변되어 있지 않다;

o) 서열 번호 2의 97번째의 로이신 잔기는 개변되어 있지 않거나, 이소로이신으로 개변되어 있다; 및

p) 서열 번호 2의 113번째의 바린 잔기는 개변되어 있지 않다

의 1 내지 모든 조건을 만족하는, 다만, 이 중, 1) 내지 9)에서 특정한 아미노산 잔기는, 1) 내지 9)의 각각에서 특정한 바와 같이 치환되어 있는,

양태 1 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 개변형 비오틴 결합 단백질.

본 발명에 의해서, 대장균으로 가용성 고발현이 가능하며, 또한, 비오틴과의 결합 및 해리를 가능하게 하는, 적절한 강도의 비오틴 결합 활성을 가지는, 개변형 TM2가 제공되었다. 본 발명의 개변형 TM2를 예를 들면 담체에 고정화하고, 비오틴화 물질을 정제하기 위한 어피니티크로마토그래피 등에 제공할 수 있다.

도 1은, 도 1A는, 야생형 타마비딘 2(WT-TM2: 좌측)와 TM2 S36A(우측)의, 도 1B는 TM2 T78A의, 및 도 1C는 TM2 D116A의, 비오틴-아가로오스에 의한 정제를 나타내는 사진이다. 각 단백질을 비오틴-아가로오스에 결합 후, 10mM의 비오틴을 포함하는 PBS(pH7.4)를 첨가함으로써, 용출을 실시하였다. 각 획분 용액에 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가 후, 95℃에서 10분 처리하여 SDS-PAGE에 공여한 후 쿠마시브릴리언트블루(CBB) 염색을 실시하였다. Sup는 컬럼에 걸기 전의 가용성 획분이며, FT는 컬럼 통과(플로우 스루) 획분이며, W는 세정 획분이며, Elu는 용출 획분이다.
도 2는, 도 2A는 TM2 P46TD116A의, 도 2B는 TM2 P46TT78AD116A의, 및 도 2C는 T78AD116A의, 비오틴-아가로오스에 의한 정제를 나타내는 사진이다. 10mM의 비오틴을 포함하는 PBS(pH7.4)를 첨가함으로써, 용출을 실시하였다. 또한 도 2D는 TM2 P46TT78A의, 이미노비오틴-아가로오스, 및 비오틴-아가로오스에 의한 정제를 나타내는 사진이다. 각 획분 용액에 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가 후, 95℃에서 10분 처리하여 SDS-PAGE에 공여한 후 CBB 염색을 실시하였다. Sup는 컬럼에 걸기 전의 가용성 획분이며, FT는 컬럼 통과(플로우 스루) 획분이며, W는 세정 획분이며, Elu는 용출 획분이다. M은 분자량 마커이다.
도 3은, 도 3A는, TM2 S36A-D116A의, 도 3B는, TM2 S36A-T78A-D116A의, 비오틴-아가로오스에 의한 정제를 나타내는 사진이다. pH5, 또는 pH6, 혹은 pH7에서, TM2 S36A-D116A를 비오틴-아가로오스를 결합시키고, pH5 및 pH6에서 결합시켰을 때에는 500mM의 NaCl을 포함하는 pH4의 인산 칼륨 완충액으로, pH7에서 결합시켰을 때는 500mM의 NaCl을 포함하는 pH7의 인산 칼륨 완충액으로, 각각 세정하였다. 그 후, pH5 또는 pH6로 결합시켰을 때에는 pH7의 인산 칼륨 완충액을 1mL 첨가하고, pH7에서 결합시켰을 때에는 10mM의 비오틴을 포함하는 pH7.4의 PBS를 1mL 첨가하여, 각각 용출하였다. 또한, pH4 또는 pH7의 인산 칼륨 완충액, 혹은 pH12의 50mM CAPS 완충액 중에서, TM2 S36A-T78A-D116A를 비오틴-아가로오스와 결합시킨 후, 세정하고, pH7의 100mM 인산 칼륨 완충액을 1mL 첨가하여 용출하였다. 각 획분 용액에 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가한 후, 95℃에서 10분 처리하여, SDS-PAGE에 공여한 후 CBB 염색을 실시하였다.
도 4는, 여러 가지의 개변형 타마비딘 2(TM2 S36A(도 4A), TM2 T78A, TM2 D116A, TM2 T78A-D116A(이상 도 4C)), 야생형의 타마비딘 2(WT-TM2, 도 4A), 및 대조로서 BSA(Bovine Serum Albumin, 도 4 B)의 Protease 내성을 나타내는 사진이다. 이들 개변형 타마비딘 2를 ProteinaseK와 30℃, 15분간 반응시킨 후, 각 반응 용액에 5xSDS Sample Buffer를 첨가한 후, 95℃에서 10분 처리하여 반응을 정지시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 공여하여, CBB 염색을 실시하였다.
도 5는, 여러 가지의 개변형 타마비딘 2(TM2 S36A-D116A(도 5A, C), TM2 T78A, TM2 P46T-T78A(이상 도 5A), TM2 P46T-D116A(도 5B), TM2 S36A-T78A-D116A(도 5C), TM2 W80K, TM2 P46T-T78A-D116A(이상 도 5 D))의 Protease 내성을 나타내는 사진이다. 이러한 개변형 타마비딘 2를 ProteinaseK와 30℃, 15분간 반응시킨 후, 각 반응 용액에 5xSDS Sample Buffer를 첨가한 후, 95℃에서 10분 처리하여 반응을 정지시켰다. 또한 별표를 붙인 TM2 T78A에 관해서는, 100℃에서 10분 처리하여 반응을 정지시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 공여하여, CBB 염색을 실시했다.
도 6은, TM2 T78A의 열안정성을 나타내는 사진이다. TM2 T78A를, 비오틴의 존재하, 비존재하에 있어서 소정의 온도로, 1xSDS Sample Buffer 중에서 20분간 열처리를 한 후, SDS-PAGE에 공여하여, CBB 염색을 실시했다.
도 7은, TM2 S36A-Sepharose에 의한, 비오틴화 BSA의 정제를 나타내는 사진이다. 대장균(TB1)의 균체 추출액과 비오틴화 BSA, 혹은 비오틴화 BSA만의 샘플을, TM2 S36A-Sepharose로 정제했을 때의, 정제 전(total), 컬럼 통과(플로우 스루) 획분(FT), 세정 화분(W), 용출 획분(Elu)의 각 용액에, 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가한 후, 95℃에서 10분 처리하여 SDS-PAGE에 공여했다. 비오틴화 BSA의 존재는 은염색 II 키트(와코준야쿠샤제)에 의해서 확인하였다. 또한, 용출액에는 5mM의 비오틴을 첨가했다.
도 8, 도 8A는 TM2 D116A-Sepharose에 의한, 도 8B는 TM2 P46TT78A-Sepharose에 의한, 도 8C는, TM2 P46TD116A-Sepharose에 의한, 비오틴화 BSA의 정제를 나타내는 사진이다. 비오틴화 BSA, 혹은 대장균 추출액과 비오틴화 BSA를, 각 담체로 각각 정제했을 때의, 정제 전(total), 컬럼 통과(플로우 스루) 획분(FT), 세정 획분(W), 용출 획분(Elu)의 각 용액에, 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가한 후, 95℃에서 10분 처리하여 SDS-PAGE에 공여했다. 비오틴화 BSA의 존재는 은염색 II 키트(와코준야쿠샤제)에 의해서 확인했다. 또한, 용출액에는 5mM의 비오틴을 첨가했다.
도 9는, 비오틴화 BSA의 TM2 S36A-D116A-sepharose에의 결합의, pH 의존성을 나타내는 사진이다. pH5, pH6 혹은 pH7의 100mM 인산 칼륨 완충액 중에서 비오틴화 BSA와 결합시켜, 500mM의 NaCl을 포함하는 pH4(상기 pH5 또는 pH6으로 결합시켰을 경우) 또는 pH7(상기 pH7로 결합시켰을 경우)의 인산 칼륨 완충액으로 세정한 후, pH7의 인산 칼륨 완충액을 더하여 비오틴화 BSA를 용출했다. 정제 전(total), 컬럼 통과(플로우 스루) 획분(FT), 세정 획분(W), 용출 획분(Elu)의 각 용액에, 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가하여, 95℃에서 10분 처리한 후, SDS-PAGE에 공여했다. 또한 은염색 II 키트(와코준야쿠샤제)을 이용하여 단백질을 은으로 염색했다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 관하여 설명한다.

타마비딘는, 식용 버섯인 담자균 노랑느타리(Pleurotus conucopiae)로부터 발견된 신규 비오틴 결합 단백질이다(WOO2/072817). 해당 문헌에는,

- 타마비딘 1과 타마비딘 2의 상호의 아미노산 상동성은 65.5%이며, 비오틴과 강하게 결합한다;

- 타마비딘 2는, 대장균으로 가용성 획분에 고발현한다; 그리고

- 타마비딘 2를 대장균으로 발현시켰을 경우, 4.5시간의 배양으로, 50ml의 배양당 약 1mg의 순도가 높은 정제 재조합 단백질이 얻어졌다. 이것은 비오틴 결합성 단백질로서 알려져 있는 아비딘이나 스트렙트아비딘과 비교해도, 매우 높은 값이다;

라는 것이 기재되어 있다.

본 명세서에 있어서의 「타마비딘 2」는, 타마비딘 2(TM2) 또는 그들의 변이체를 의미한다. 본 발명은, TM2 또는 그 변이체의 특정의 아미노산 잔기를 개변시킴으로써, 비오틴과의 가역적인 반응을 가능하게 하는, 개변형 TM2를 제공하는 것이다. 본 명세서에 있어서 「타마비딘 2」, 「TM2」라고 기재한 경우에는, 특별히 언급하지 않는 한 야생형의 TM2 및 그 변이체를 의미한다. 다만, 글의 의미에 따라서, 본 발명의 개변형 TM2도 포함하여 TM2의 야생형, 변이형, 본 발명의 개변형의 총칭으로서 사용하는 경우도 있다. 또한, TM2는 비오틴 결합성을 나타낸다는 점에서, 본 명세서에 있어서 TM2를 「비오틴 결합 단백질」이라고 호칭하는 일이 있다.

구체적으로는, TM2(야생형)는 전형적으로는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질이면 된다. 혹은, TM2는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 변이체로서, 타마비딘 2와 같은 비오틴 결합 활성을 갖는 단백질이면 된다. TM2의 변이체는, 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산의 결실(欠失), 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이어도 된다. 치환은, 보존적 치환이어도 되며, 이것은, 특정의 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것이다. 보존적 치환의 비한정적인 예에는, Ile, Val, Leu 또는 Ala 상호의 치환과 같은 지방족기 함유 아미노산 잔기 사이의 치환, Lys 및 Arg, Glu 및 AsP, Gln 및 Asn 상호의 치환과 같은 극성 잔기 사이에서의 치환 등이 포함된다.

아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 변이체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 예를 들어 주지 기술인 부위 특이적 변이 유발(예를 들어, Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982 참조, 인용에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용한다)을 실시함으로써 작성할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 부위 특이적 변이 유발법에 의해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 아미노산을 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 경우에 따라, 1 또는 수 개의 아미노산을 의미해도 된다.

부위 특이적 변이 유발법은, 예를 들어, 소망하는 변이인 특정의 불일치 외에는, 변이를 받아야 하는 외가닥쇄파지 DNA에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다음과 같이 실시할 수 있다. 즉, 프라이머로서 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 파지에 상보적인 사슬을 합성시키고, 얻어진 이중쇄 DNA로 숙주 세포를 형질 전환한다. 형질 전환된 세균의 배양물을 한천에 플레이팅하고, 파지를 함유하는 단일 세포로부터 플라크(plaques)를 형성시킨다. 그렇게 하면, 이론적으로는 50%의 신콜로니가 단일쇄로서 변이를 갖는 파지를 함유하고, 나머지의 50%가 원래의 서열을 갖는다. 상기 소망한 변이를 갖는 DNA와 완전하게 일치하는 것과는 하이브리다이즈하지만, 원래의 사슬을 갖는 것과는 하이브리다이즈하지 않는 온도에 있어서, 얻어진 플라크를 키나제 처리에 의해 표식한 합성 프로브와 하이브리다이즈시킨다. 다음으로 그 프로브와 하이브리다이즈하는 플라크를 주워, 배양하여 DNA를 회수한다.

또한, 생물 활성 펩티드의 아미노산 서열에 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 실시하는 방법으로서는, 상기의 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열(開裂)하고, 다음으로 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환, 삽입 또는 부가하고, 이어서 연결하는 방법도 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 있어서의 TM2는, 서열 번호 2에 있어서 1 내지는 10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로부터 이루어지며, 비오틴 활성을 갖는 단백질이다.

TM2의 변이체는 또한, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97 %이상, 98% 이상, 또는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질로서, TM2와 같은 비오틴 결합 활성을 갖는 단백질이어도 된다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정해도 된다. 혹은, 2개의 단백질 서열의 동일성 퍼센트는, Needleman, S. B. 및 Wunsch, C. D.(J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)의 알고리즘에 근거하여, 그리고 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWGCG)에서 입수 가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써, 결정해도 된다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) Henikoff, S. 및 Henikoff, J. G.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992)에 기재되어 있는 바와 같은, 스코어링·매트릭스, blosum 62; (2) 12의 갭 가중; (3) 4의 갭길이 가중; 및 (4) 말단 갭에 대한 패널티 없음이 포함된다.

당업자에게 이용되는, 서열 비교의 다른 프로그램도 또한, 이용해도 된다. 동일성의 퍼센트는, 예를 들어 Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재되어 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 정보와 비교하여 결정하는 것이 가능하다. 해당 프로그램은, 인터넷 상에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI), 혹은 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹 사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은 동사이트에 자세하게 기재되어 있으며, 일부의 설정을 적당히 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트치를 이용하여 실시한다. 또는, 2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스 제) 등의 프로그램, 또는, FASTA 알고리즘 등을 이용해서 결정해도 된다. 그 때, 검색은 디폴트치를 이용해도 된다.

2개의 핵산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사와 수학적 계산에 의해 결정 가능하거나, 또는 보다 바람직하게는, 이 비교는 컴퓨터·프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 이루어진다. 대표적인, 바람직한 컴퓨터·프로그램은, 유전학 컴퓨터·그룹(GCG; 위스콘신주 매디슨)의 위스콘신·패키지, 버젼 10.0 프로그램 「GAP」이다(Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12:387). 이 「GAP」프로그램의 사용에 의해, 2개의 핵산 서열의 비교 외에, 2개의 아미노산 서열의 비교, 핵산 서열과 아미노산 서열과의 비교를 실시할 수 있다. 여기서, 「GAP」프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터에는: (1) 뉴클레오티드에 관한(동일물에 관하여 1, 및 비동일물에 관하여 0의 값을 포함한다) 일원(unary) 비교 매트릭스의 GCG 실행과 Schwartz 및 Dayhoff 감수 「폴리펩티드의 서열 및 구조의 아틀라스(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)」 국립 바이오 의학 연구 재단, 353-358 페이지, 1979에 의해 기재되는 바와 같은, Gribskov 및 Burgess, Nucl. Acids Res., 14:6745, 1986의 가중 아미노산 비교 매트릭스; 또는 다른 비교 가능한 비교 매트릭스; (2) 아미노산의 각 갭에 관하여 30의 패널티와 각 갭중의 각 기호에 관하여 추가의 1의 패널티; 또는 뉴클레오티드 서열의 각 갭에 관하여 50의 패널티와 각 갭중의 각 기호에 관하여 추가의 3의 패널티; (3) 엔드 갭에의 노 패널티: 및 (4) 긴 갭에는 최대 패널티 없음이 포함된다. 당업자에 의해 사용되는 다른 서열 비교 프로그램에서는, 예를 들어, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹 사이트: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에 의해 사용이 이용 가능한 BLASTN 프로그램, 버젼 2.2.7, 또는 UW-BLAST2.O 알고리즘이 사용 가능하다. UW-BLAST2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트: http://blast.wustl.edu에 기재되어 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코아부 매트릭스를 사용하며, 사용 가능한 선택 파라미터는 이하와 같다: (A) 낮은 조성 복합성을 갖는 쿠에리-서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정되는; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이타베이스에 있어서의 조성편중영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266:544-71도 참조하기 바란다), 또는, 단주기성의 내부 리피트로 이루어지는 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정된다)를 마스크하기 위한 필터를 포함할 것, 및 (B) 데이타베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 문턱값, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단지 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어느 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 문턱값보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다); 바람직한 E-스코어 문턱값의 수치는 0.5이거나, 또는 바람직함이 증가하는 순으로, 0.25, O.1, O.05, O.01, O.001, O.0001, le-5, le-10, le-15, le-20, le-25, le-30, le-40, 1e-50, 1e-75, 또는 1e-100이다.

TM2의 변이체는 또한, 서열 번호 1의 염기 서열의 상보쇄에 스트린젠트(stringent)한 조건으로 하이브리다이즈하는 염기 서열을 포함하여 이루어지는 핵산에 의해 코드되는 단백질로서, TM2와 같은 결합 활성을 갖는 단백질이어도 된다.

여기서, 「스트린젠트한 조건하」란, 중간 정도 또는 높은 정도로 스트린젠트한 조건에 있어서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 예를 들어, DNA의 길이에 근거하여, 일반의 기술을 가지는 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 기본적인 조건은, Sambrook들, Molecular Cloning：A Laboratory Manua1, 제3판, 제6장 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 표시되며, 예를 들어 5×SSC, 0.5% SDS, 1.OmM EDTA(pH 8.0)의 전세정 용액, 약 42℃에서의, 약 50% 포름아미드, 2× 내지 6×SSC, 바람직하게는 5× 내지 6×SSC, 0.5% SDS(또는 약 42℃에서의 약 50% 포름아미드 중의, 스타크 용액(Stark's solution) 등의 그 밖의 같은 하이브리다이제이션 용액)의 하이브리다이제이션 조건, 및 예를 들어, 약 50℃ 내지 68℃, 0.1× 내지 6×SSC, 0.1% SDS의 세정 조건의 사용이 포함된다. 바람직하게는 중간 정도로 스트린젠트한 조건은, 약 50℃, 6×SSC, 0.5% SDS의 하이브리다이제이션 조건(및 세정 조건)을 포함한다. 고스트린젠트한 조건도 또한, 예를 들어 DNA의 길이에 근거하여, 당업자에 의해서, 용이하게 결정하는 것이 가능하다.

일반적으로, 이러한 조건은, 중간 정도로 스트린젠트한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염 농도에서의 하이브리다이제이션(예를 들어, 0.5% 정도의 SDS를 포함하고, 약 65℃, 6×SSC 내지 0.2×SSC, 바람직하게는 6×SSC, 보다 바람직하게는 2×SSC, 보다 바람직하게는 0.2×SSC, 혹은 0.1×SSC의 하이브리다이제이션) 및/또는 세정을 포함하며, 예를 들어 상기와 같은 하이브리다이제이션 조건, 및 대략 65℃ 내지 68℃, 0.2 내지 0.1×SSC, 0.1% SDS의 세정을 수반한다고 정의된다. 하이브리다이제이션 및 세정의 완충액에서는, SSC(1×SSC는, 0.15M NaCl 및 15mM 구연산 나트륨이다)에 SSPE(1×SSPE는, 0.15M NaCl, 10mM NaH₂PO₄, 및 1.25mM EDTA, pH7.4이다)를 대용하는 것이 가능하고, 세정은 하이브리다이제이션이 완료한 후에 15분간 내지 1시간 정도 실시한다.

또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판의 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제)를 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다. 스트린젠트한 하이브리다이제이션으로서는, 예를 들어, 키트 중의 hybridization buffer에 Blocking 시약을 5%(w/v), NaCl을 0.5M이 되도록 가하여, 42℃에서 4시간 실시하고, 세정은, 0.4% SDS, 0.5×SSC 중에서, 55℃에서 20분을 2회, 2×SSC 중에서 실온, 5분을 1회 실시한다는 조건을 들 수 있다.

TM2의 변이체의 비오틴 결합 활성은, 공지의 수법 중 어느 하나에 의해 측정하는 것이 가능하다. 예를 들어, Kada들(Biochim. Biophys. Acta., 1427:33-43(1999))에 기재되어 있는 바와 같이 형광 비오틴을 이용하는 방법에 의해 측정해도 된다. 이 방법은, 비오틴 결합 단백질의 비오틴 결합 사이트에 형광 비오틴이 결합하면, 형광 비오틴의 형광 강도가 소실하는 성질을 이용한 어세이계(assay system)이다. 혹은, 표면 프라즈몬 공명을 원리로 한 바이오센서 등, 단백질과 비오틴의 결합을 측정하는 것이 가능한 센서를 이용하여, 변이체 단백질의 비오틴 결합 활성을 평가할 수도 있다.

본 발명의 개변 타마비딘에 있어서, 개변하지 않는 것이 바람직한 아미노산 잔기에 관해서는 후술한다.

본 발명의 개변 타마비딘(I형)

본 발명의 개변형 TM2는 1 양태으로서,

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질(TM2 혹은 TM2(변이체))에 있어서,

이하의 그룹:

1) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

2) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기의 친수성 아미노산 잔기로의 치환;

3) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

4) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

5) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;

: 및

6) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 있어서 「타마비딘 2(TM2)」란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환」이란, 비오틴과 수소결합을 형성하지 않는다고 생각되는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, 구체적인 예로서는, 비극성 즉 소수성의 R기를 가지는 아미노산인 알라닌(A), 바린(V), 로이신(L), 이소로이신(I), 메티오닌(M), 트립토판(W), 페닐 알라닌(F), 및 프롤린(P) 등으로의, 이들 이외의 아미노산 잔기로부터의 치환을 들 수 있다. 본 명세서 중의 실시예에서는, 하기의 개변형 TM2에 있어서 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴산으로부터, 알라닌(A)으로 치환한 개변체가 기재되어 있다.

본 명세서에 있어서 「친수성 아미노산 잔기로의 치환」이란, 본 기술 분야에서 일반적으로 친수성이라고 생각되고 있는 아미노산 잔기로의 치환을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, 구체적인 예로서는, 극성 아미노산을 들 수 있는데, 그 중에서도 생리적 pH로 정의 전하를 가지는 R기를 가지는 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H), 생리적 pH로 부의 전하를 가지는 R기를 가지는 아스파라긴산(D)이나 글루타민산(E) 등으로의 치환을 들 수 있으며, 하기의 개변형 TM2에 있어서는 트립토판을 리신(K)으로 치환한 것을 말한다.

이러한 개변형 TM2는 바람직하게는,

1-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A),

2-a) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기가 리신으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 W80K),

3-a) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 D116A),

4-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A),

5-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-D116A), 및,

6-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A-D116A), 이다.

그러한 개변형 TM2는, 바람직하게는, 이하의 성질;

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다,

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다,

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다,

iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다,

의 1 내지 전부를 나타낸다.

본 명세서에 있어서 「비오틴을 이용한 정제가 가능」이란, 대상으로 하는 단백질이 적당한 비오틴 결합능을 가짐으로써 비오틴과의 결합 및 해리가 가능하기 때문에, 비오틴과의 어피니티를 이용하여, 대상 단백질 자체, 및/또는, 대상 단백질을 결합한 담체(컬럼 등)를 이용한, 비오틴화 물질(예를 들면 비오틴화 단백질 등)의 정제가 가능한 것을 의미한다. 따라서, 개변형 TM2는, 야생형 TM2에 비해, 비오틴 결합능이 작은 저친화성 타마비딘이다.

본 명세서에 있어서 「4량체 구조를 유지하고 있다」라는 것은, 천연의 TM2가 가지는 4량체의 서브유닛 구조를 실질적으로 유지하고 있는 것을 의미한다. 구체적으로는, 야생형의 TM2와 동일한 정도의 분자량을 가지는 상태를 의미한다. 예를 들면, 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast protein liquid chromatography(FPLC))에 의해서, 개변형 TM2의 분자량을 측정하고, TM2의 분자량과 비교함으로써 확인할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「프로테아제에 대해 내성을 가진다」라는 것은, 프로테아제 처리에 의해서 단백질이 효소 분해되지 않는, 또는 실질적으로 분해되지 않는 것을 의미한다. 프로테아제 처리는, 예를 들면, 30℃에서 15분간, 프로테아제K에 의한 처리를 시행한다. 「효소 분해되지 않는다」라는 것은, 야생형의 TM2와 마찬가지로, 효소 처리 후에 SDS-PAGE를 실시해도 해당 단백질의 4량체, 2량체 및/또는 단량체의 밴드를 명료하게 검출할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 프로테아제에 대해 내성을 가지지 않는 단백질은, 프로테아제 처리에 의해 소분자로까지 분해되어 버려, 프로테아제 처리 후의 SDS-PAGE에 있어서, 4량체, 2량체, 및 단량체의 밴드는 검출할 수 없지만, 프로테아제에 대해 내성을 가지는 단백질의 경우는 프로테아제 처리에 의해도 완전하게 분해되어 버리는 일 없이, 4량체 구조를 유지한다. 그리고 SDS-PAGE에 있어서, 4량체 및/또는 4량체가 해리한 2량체나 단량체의 밴드로서 검출된다.

본 명세서에 있어서 「대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다」라는 것은, 소망하는 유전자를 발현 벡터에 편입시키고, 대장균에 도입 후, 적당한 배지 중에서 적당한 온도 및 발현 유도 조건하에서 단백질을 발현시켰을 경우에, 그 재조합 단백질이 대장균 중에 있어서, 균체파쇄 후의 가용성 획분에, 확인가능한 정도로 충분히, 바람직하게는 야생형의 TM2와 거의 동일한 정도, 또는 그 이상으로 산생되는 것을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, 배양액 1L 당, 1mg 이상, 바람직하게는 5mg 이상, 10mg 이상, 15mg 이상, 특히 바람직하게는 20mg 이상 발현하는 것을 의미한다.

「TM2 S36A」 및 「TM2 D116A」는 TM2에 있어서 비오틴과 수소결합한다고 생각되는 부위를 개변한 것이며, 대장균의 가용성 획분에 있어서 고발현하는 것이다. 또한, 이러한 개변체 TM2는 4량체의 구조를 유지하고 있어, 프로테아제에 대해 높은 내성을 가지고 있다. 또한 이들 개변형 TM2의 비오틴 결합능은, 1 아미노산 개변체임에도 불구하고, 그것과 비오틴과의 결합능은, 비오틴과 가역적 반응을 일으키게 하는데 충분할 정도로 저하하고 있으며, 비오틴화 단백질을 매우 효율적으로 정제할 수 있다. 게다가, 이미노비오틴 컬럼을 이용했을 경우라도, 이들 개변체 TM2를 매우 효율적으로 정제할 수 있다. 따라서, 「TM2 S36A」및 「TM2 D116A」는, 지금까지의 저결합능 비오틴 결합성 단백질의 문제점을 해결할 수 있다, 매우 뛰어난 비오틴 가역적 결합성 단백질이다.

「TM2 W80K」는, TM2에 있어서 비오틴과 소수 결합한다고 생각되는 부위를 개변한 것이며, 야생형 TM2(서열 번호 2)의 80번째의 트립토판을 리신으로 개변한 것이다. TM2 W80K는, 대장균의 가용성 획분에 있어서 고발현하는 것이다. 또한, 4량체의 구조를 유지하고 있어, 프로테아제에 대해 높은 내성을 가지고 있다. 또한 이들 변이체의 비오틴 결합능은, 1 아미노산 개변체임에도 불구하고, 비오틴과 가역적 반응을 일으키게 하는데 충분할 정도로 저하하고 있어, 아세트산을 이용하면, 비오틴화 단백질을 매우 효율적으로 정제할 수 있다. 게다가, 이미노비오틴 칼럼을 이용했을 경우라도, 매우 효율적으로 정제할 수 있다. 따라서 W80K는, 지금까지의 저결합능 비오틴 결합성 단백질의 문제점을 해결한, 매우 뛰어난, 비오틴 가역적으로 결합하는 성질을 가지는 단백질이다.

「TM2 P46T-T78A」과「TM2 P46T-D116A」는, 타마비딘의 서브유닛간의 결합에 관여한다고 생각되는 부위, 또한, 비오틴과 수소결합한다고 생각되는 부위를 개변한 것이다. TM2와 스트렙트아비딘과의 아미노산의 상동성(양자의 아미노산 상동성은 전체로 48%이다)을 이용하여 검토한 바, 스트렙트아비딘에 있어서의 55번째의 바린(Val), 76번째의 트레오닌(Thr), 109번째의 로이신(Leu), 및 125번째의 바린(Val)이, 각각 TM2에 있어서의, 46번째의 프롤린(Pro), 66번째의 알라닌(Ala), 97번째의 로이신(Leu), 113번째의 바린(Val)이라고 생각된다. 즉, TM2에 있어서 그들 아미노산은, 서브유닛 결합 부위에 존재한다고 생각되었다. 그리고 그들 아미노산에 실제로 변이를 넣어, 비오틴 결합 활성을 측정하면, 비오틴과 가역적으로 결합하지만, 대략 반수의 개변체는 2량체나 단량체의 혼합물이 된다.

그런데, TM2의 서브유닛간 결합에 관여한다고 생각되는 46번째의 프롤린을 트레오닌으로 개변한 「TM2 P46T」는, 서브유닛간 결합을 약하게 하는 것을 의도한 변이체이지만, 4량체를 유지하고 있다. 그리고, 비오틴 결합능은 예상에 반해 매우 높아, 과잉량의 비오틴을 더해도 비오틴화 물질을 용출시킬 수 없다. 그러나, 이 TM2 P46T의, 비오틴과 수소결합한다고 생각되는 부위인, 78번째의 트레오닌 또는 116번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 개변한 변이체는, 비오틴 결합능이 적당한 수준으로 변화하여, 비오틴화 물질을 충분히 정제할 수 있다.

또한, 이들 변이를 모두 조합한 「TM2 P46T-T78A-D116A」도, 비오틴화 물질을 충분히 정제할 수 있다.

또한, 이러한 변이체는 4량체를 유지하고 있어, 프로테아제 내성을 가지고 있다. 또한, 이와 같이 수소결합의 변이와 서브유닛간 결합의 변이를 조합함으로써, 적절한 비오틴 결합능을 갖게 하는 것에 성공한 비오틴 결합성 단백질은, 지금까지 예가 없다.

본 발명의 개변 타마비딘(II형)

또한 본 발명의 개변형 TM2는 1 양태로서,

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질(TM2 혹은 TM2(변이체))에 있어서,

6) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

을 가지는 것을 특징으로 한다.

이러한 개변형 TM2는 바람직하게는,

6-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환되어 있는 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A)이다.

본 명세서에 있어서 「타마비딘 2(TM2)」란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환」이란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

이러한 개변형 TM2는, 바람직하게는, 이하의 성질;

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다,

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다,

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다,

v) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질보다, 높은 내열성을 가진다,

의 1 내지 전부를 나타낸다.

본 명세서에 있어서 「비오틴을 이용한 정제가 가능」, 「4량체 구조를 유지하고 있다」 및 「프로테아제에 대해 내성을 가진다」는, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「높은 내열성을 가진다」라는 것은, 야생형과 동일한 정도 혹은 그 이상의 내열성을 가지는 것을 의미한다. 비한정적으로, 예를 들면, SDS 존재하에서 20분간 가열 처리를 실시했을 때의 Tr치(단량체와 4량체의 양비가 1:1이 되는 온도)가 천연의 TM2와 비교하여, 비오틴 비존재하에서, 바람직하게는 동일한 정도, 보다 바람직하게는 5℃ 이상, 더욱 바람직하게는 10℃ 이상 높은 것을 의미한다.

「TM2 T78A」는, 대장균 가용성 획분으로부터의 이미노비오틴-아가로오스에 의한 회수율은 낮지만, 비오틴-아가로오스에 의한 회수율은 높으며(95%정도), 4량체를 유지하여 프로테아제 내성을 가지고 있다. 더하여 TM2 T78A는, TM2 S36A나 TM2 D116A와 마찬가지로 1 아미노산 변이체임에도 불구하고, 비오틴 결합능이 적당히 저하하고 있어, 비오틴화 단백질을 정제할 수 있다(회수율은 40%~50%정도). 또한 TM2 T78A는, 비오틴 비존재하에서의 Tr치가 88℃이며, TM2의 Tr치(78℃)보다 10℃ 높고, 또한 비오틴 결합시의 Tm치도 100℃ 이상이어서, 열안정성이 매우 높은 단백질이다.

본 발명의 개변 타마비딘(III형)

또한 본 발명의 개변형 TM2는 1 양태로서,

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질(TM2 혹은 TM2(변이체))에 있어서,

이하의 그룹:

7) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환; 및

8) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 있어서 「타마비딘 2(TM2)」란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환」이란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

이러한 개변형 TM2는 바람직하게는,

7-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-D116A); 및

8-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-T78A-D116A)

로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.

이러한 개변형 TM2는, 이하의 성질;

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다,

vi) 약산성 조건하에서 비오틴과 결합하고, 그리고, 중성 조건하에서 비오틴과 결합하지 않는다,

의 1 내지 전부를 나타낸다.

본 명세서에 있어서 「비오틴을 이용한 정제가 가능하다」 및 「프로테아제에 대해 내성을 가진다」라는 것은, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 양태의 개변형 타마비딘는, 특수한 pH 의존성을 나타낸다. 본 명세서에 있어서 「약산성」이란, pH4부터 pH6의 범위 내의 수소이온 지수를 의미한다. 「중성」이란, pH7에서 pH8의 범위 내의 수소이온 지수를 의미한다.

「TM2 S36A-D116A」는, 대장균 가용성 획분으로부터의 회수율은 95%, 정제도 95%(pH4에서 결합, pH7에서 해리시켰을 경우), 4량체를 유지하고 프로테아제 내성을 가지고 있다. 그리고, 비오틴 결합에 관해서 극히 특이적인 pH 의존성을 가진다. 지금까지, 중성 부근(pH7 부근)에서 비오틴과 결합하지 않는 비오틴 결합 단백질은 알려지지 않았다. 이 「TM2 S36A-D116A」는, 약산성 조건(pH4~6 정도)에 있어서 비오틴과 매우 효율적으로 결합하는 것에 대하여, 중성 조건 및 알칼리 조건(pH7, pH12)에서는 비오틴과 전혀 결합하지 않는다고 하는, 지금까지의 비오틴 결합성 단백질과는 완전히 다른 특징을 가지고 있다. 따라서 이 개변체를 이용하면, 대상 물질을 강알칼리성 조건에 노출하여 변성시켜 버리는 일 없이, 온화한 조건으로 정제할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「알칼리 조건」이란, pH9에서 pH13의 범위 내의 수소이온 지수를 의미한다.

「TM2 S36A-T78A-D116A」는, 대장균의 가용성 획분에 있어서 고발현하는 것이다. 또한 2량체의 구조를 유지하고 있어, 프로테아제에 대해 높은 내성을 가지고 있다. 「TM2 S36A-T78A-D116A」는, 「TM2 S36A-D116A」와 마찬가지로, 약산성 조건(pH4~6 정도)에 있어서 비오틴과 효율적으로 결합하는 것에 대하여, 중성 조건(pH7)에서는 비오틴과 전혀 결합하지 않는다는, 지금까지의 비오틴 결합성 단백질과는 완전히 다른 특징을 가지고 있다. 다만, 알칼리 조건하에서는, 「TM2 S36A-D116A」와 달리, 약산성 조건과 마찬가지로 비오틴과 효율 좋게 결합했다.

「TM2 S36A-T78A-D116A」는 또한, 이미노비오틴에 전혀 결합하지 않고, 이미노비오틴으로 정제할 수 없다고 하는 특징도 가진다. 이 점은, 후술하는 IV형과 성질 vii)가 공통된다. 「이미노비오틴으로 정제할 수 없다」의 의의는 IV형의 설명에서 상술한다.

본 발명의 개변 타마비딘(IV형)

또한 본 발명의 개변형 TM2는 1 양태로서,

서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질(TM2 혹은 TM2(변이체))에 있어서,

9) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환

을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 있어서 「타마비딘 2(TM2)」란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환」이란, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

이러한 개변형 TM2는 바람직하게는,

9-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A-D116A)이다.

이러한 개변형 TM2는, 이하의 성질;

i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다,

ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다,

iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다,

iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다,

vii) 이미노비오틴으로 정제할 수 없다

의 1 내지 전부를 나타낸다.

본 명세서에 있어서 「비오틴을 이용한 정제가 가능하다」, 「4량체 구조를 유지하고 있다」, 「프로테아제 내성을 가진다」 및 「대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다」라는 것은, 상기에서 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「이미노비오틴으로 정제할 수 없다」란, 목적 단백질이 이미노비오틴과 결합하지 않거나, 혹은 이미노비오틴과 결합한 목적 단백질을 용출 할 수 없기 때문에, 이미노비오틴을 이용한 정제가 불가능한 것을 의미한다.

「TM2 T78A-D116A」는, 대장균의 가용성 획분에 있어서 고발현하는 것이다. 또한 4량체의 구조를 유지하고 있어, 프로테아제에 대해 높은 내성을 가지고 있다. 이 개변체는, 이미노비오틴으로는 전혀 정제할 수 없지만, 비오틴으로는 극히 잘 정제할 수 있다, 라는 지금까지 전혀 알려지지 않은 특이한 성질을 가지고 있다.

해당 개변체는, 예를 들면 이하와 같은 용도에 이용할 수 있다. 예를 들면 어느 세포를, 그 세포의 표층에 존재하는 항원을 안표로 특이적으로 표지하고 싶은 경우, 우선, 이러한 개변체를 검체에 주사하여, 검체의 혈액 중의 내생 비오틴과 결합시킨다. 계속해서, 그 항원에 대한 특이적 항체를 이미노비오틴화하고, 검체에 도입하여, 해당 세포를 이미노비오틴으로 라벨한다. 마지막으로, 방사성 동위 원소 라벨 혹은 형광 라벨한 아비딘이나 스트렙트아비딘, 혹은 타마비딘와 같은 비오틴과 강하게 결합하는 단백질을 검체에 주입함으로써, 세포를 특이적으로 표지할 수 있다. 이 계에서는 미리 이러한 개변체로 내생의 비오틴 레벨을 저하시키고 있으므로, 백그라운드가 낮고, 또한 이러한 개변체는, 비오틴에는 결합하지만 이미노비오틴에는 결합하지 않기 때문에, 해당 세포에는 결합하지 않는다. 통상, 비오틴 결합 단백질은 이미노비오틴과 비오틴의 양쪽 모두에 결합하므로, 이러한 개변체를 사용하지 않으면 상기의 계는 성립하지 않는다.

아미노산의 개변 방법

TM2의 아미노산을 개변하여, 본 발명의 개변형 TM2를 얻기 위한 방법은, 공지의 아미노산 서열에 변이를 실시하는 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 개변 단백질을 코드하는 핵산의 염기 서열에 수식을 실시하여 개변한다.

예를 들면, 아미노산 서열의 특정의 위치의 아미노산을 개변하려면, 예를 들면 PCR를 이용한 방법을 들 수 있다(Higuchi et al (1988) Nucleic Acid Res 16:7351-7367, Ho et al. (1989) Gene77:51-59). 즉, 표적 변이의 미스매치 코돈을 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하고, 목적의 개변체를 코드하는 DNA를 작성하여 이것을 발현시킴으로써, 목적의 개변체를 얻을 수 있다.

또한, 아미노산의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의한 개변체는, 야생형 단백질을 코드하는 DNA에, 전술한 주지 기술인 부위 특이적 변이 유발을 실시하는 등의 방법에 의해 작성할 수 있다.

본 발명의 개변형 TM2에 있어서 개변되지 않는 것이 바람직한 아미노산 잔기

본 발명의 개변형 TM2에 있어서의 아미노산 잔기의 개변은, 개변형 TM2가 적절한 비오틴 친화성을 가지는 것에 의해 정제가 가능해지는 개변이다. 그런데, 비오틴 결합 단백질의 하나인 스트렙트아비딘의 비오틴 포켓에 관해서는 이미 해명이 진행되고 있다. 이 스트렙트아비딘과 TM2의 아미노산 서열의 호몰로지는 50% 정도에 지나지 않지만, 발명자들은, TM2의 비오틴 포켓에 관한 지견을 얻고자, TM2와 스트렙트아비딘의 아미노산 서열을 병렬시켜 비교했다.

그러면, 스트렙트아비딘의 비오틴 포켓을 형성하는 아미노산 중에서, 비오틴과 직접 상호작용 하는 잔기 N23, S27, Y43, S45, N49, W79, S88, T9O, W92, W1O8, W120, D128(Weber et al. (1989) Science 243:85-88)은, TM2에서는 각각, N14, S18, Y34, S36, D40, W69, S76, T78, W80, W96, W1O8, D116에 해당하며, 매우 잘 보존되고 있는 것이 발견되었다. TM2와 스트렙트아비딘의 비오틴 결합 포켓은 매우 닮은 구조를 가지며, 이들 아미노산 잔기는 비오틴 결합에 크게 관여하고 있다고 생각된다.

유일하게, 스트렙트아비딘의 49번째의 N(아스파라긴)은, TM2에 있어서는 40번째의 D(아스파라긴산)로 되어 있어, 예외였다. 또한 49번째의 아스파라긴에 관해서는, 이것을 스트렙트아비딘과 마찬가지로 아스파라긴으로 개변한 TM2 D40N TM2에 있어서, 비오틴 결합능이 높아진다고 하는 지견을 본 발명자들은 얻고 있다. 따라서 40번째의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 치환한 개변체는 비오틴 결합능이 너무 강하므로, 상기의 TM2 D40N TM2를 본 발명에 사용하는 것은 바람직하지 않다.

특히 4개의 트립토판 잔기(W69, W80, W96, W108)는 비오틴 포켓의 구조에 중요한 역할을 수행하고 있다고 생각되기 때문에, 지금까지의 개변체에 관한 기재에서 특정된 치환을 실시하는 경우를 제외하고, 개변되지 않는 것이 바람직하다. 혹은, 이것들을 개변하는 경우에는 비오틴과의 결합을 유지할 수 있도록, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하고, 예를 들면 페닐 알라닌(F)으로 개변하는 것이 바람직하다.

한편, 비오틴과의 결합에 관여한다고 생각되는 그 외의 아미노산, 즉, TM2에 있어서는, 비오틴과 직접 상호작용 한다고 생각되는 아미노산 잔기(N14, S18, Y34, S36, S76, T78, D116)에 관해서도, 지금까지의 기재에서 특정된 치환을 실시하는 경우를 제외하고, 개변되지 않는 것이 바람직하다. 혹은, 이들을 개변하는 경우에는 비오틴과의 결합을 유지할 수 있도록, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하고, 예를 들면 아스파라긴(N14)의 경우는, 글루타민(Q)이나 아스파라긴산(D)으로, 바람직하게는 글루타민으로, 아스파라긴산(D40)의 경우는, 아스파라긴(N) 이외로, 세린(S18, S36, S76)의 경우는, 트레오닌(T) 혹은 티로신(Y)으로, 바람직하게는 트레오닌으로, 티로신(Y34)의 경우는, 세린(S) 혹은 트레오닌(T)으로, 바람직하게는 트레오닌으로, 트레오닌(T78)의 경우는, 세린(S)이나 티로신(Y)으로, 바람직하게는 세린으로, 아스파라긴산(D116)의 경우는, 글루타민산(E)이나 아스파라긴(N)으로, 바람직하게는 글루타민산으로, 각각 개변하는 것이 바람직하다.

더하여 P46, A66, L97, V113도 서브유닛 결합 부위이기 때문에, 이들 잔기에 관해서도, 지금까지의 기재에서 특정된 치환을 실시하는 경우를 제외하고, 개변되지 않는 것이 바람직하다. 이들을 개변하는 경우에는 비오틴과의 결합을 유지할 수 있도록, 성질 혹은 구조가 유사한 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하고, 예를 들면 로이신(L97)의 경우는, 이소로이신으로 개변하는 것이 바람직하다.

다만, 모두, 상기 1)-9)에서 특정한 아미노산 잔기는, 1) 내지 9)의 각각에서 특정한 바와 같이 치환되어 있다.

개변형 TM2 단백질을 코드하는 핵산

본 발명은, 본 발명의 개변형 TM2 단백질을 코드하는 핵산을 제공한다. 이러한 핵산의 염기 서열은, TM2의 염기 서열(서열 번호 1)을, 개변형 TM2 단백질의 개변 아미노산을 코드하는 염기 서열로 개변한 것이다. 개변되는 염기 서열은, 개변 후의 아미노산을 코드하는 염기 서열이면 한정되지 않는다. 예를 들면, 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어지는 핵산(이하, 「TM2 유전자」), 또는 그들 상보사슬에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 비오틴과의 결합 및 해리를 가능하게 하는, 적절한 비오틴 결합 활성을 가지는 단백질을 코드하는 핵산으로서, 본 발명의 개변을 실시하기 위해서 염기 서열을 개변시킨 것을 포함한다.

본 발명의 핵산은, 바람직하게는, 서열 번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 중 은 하나의 아미노산 서열을 코드한다. 본 발명의 핵산은, 보다 바람직하게는 서열 번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 중의 어느 하나의 핵산 서열로 이루어진다.

본 발명의 핵산을 포함하는 벡터

또, 본 발명은, 개변형 TM2 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 개변형 TM2 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터이다.

본 발명의 개변형 TM2의 단백질을 코드하는 핵산은, 상기 「개변형 TM2 단백질을 코드하는 핵산」에 기재된 바와 같으며, 특별히 한정되지 않는다. 개변형 TM2 단백질을 코드하는 핵산의 상류에는 소망하는 숙주로 기능하는 프로모터가, 또한 그 하류에는 터미네이터가 배치되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터는, 바람직하게는 발현 벡터이다. 발현 벡터는, 상기와 같은 발현 유닛(프로모터+개변형 TM2 코드 영역+터미네이터) 외에, 소망하는 숙주로 복제할 수 있기 위한 유닛, 예를 들면 복제 개시점을 가지며, 또한 소망하는 숙주 세포를 선발하기 위한, 약제 저항성 마커 유전자를 가져도 된다. 숙주는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 대장균이다. 또한, 본발현 벡터에, 예를 들면, 대장균에 있어서의 락토오스 리프레서계와 같은 적당한 발현 제어계를 편입시켜도 된다.

개변형 TM2를 고정화한 담체

본 발명은, 본 발명의 개변형 TM2 단백질을 고정화한 담체를 제공한다.

담체를 구성하는 재료는 공지의 것이 사용 가능하다. 예를 들어, 셀룰로오스, 테프론, 니트로셀루로오스, 아가로오스, 고가교 아가로오스, 덱스트란, 키토산, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리디비닐리덴디플루오라이드, 라텍스, 실리카, 유리, 유리 섬유, 금, 백금, 은, 동, 철, 스테인레스 스틸, 페라이트(ferrite), 실리콘 웨이퍼, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산, 수지, 다당류, 단백(알부민 등), 탄소 또는 그들의 조합 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 또한, 일정한 강도를 가지며, 조성이 안정되고, 또한 비특이 결합이 적은 것이 바람직하다.

고체 담체의 형상은, 비즈, 자성 비즈, 박막, 미세관, 필터, 플레이트, 마이크로 플레이트, 카본 나노 튜브, 센서 칩 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 박막이나 플레이트 등의 평탄한 고체 담체는, 해당 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 피트, 홈, 필터 저부 등을 설치해도 된다.

발명의 일 양태에 있어서, 비즈는, 약 25nm~약 1mm의 범위의 구체 직경을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서는, 비즈는 약 50nm~약 10㎛의 범위의 직경을 갖는다. 비즈의 사이즈는 특정의 적용에 따라 선택될 수 있다.

단백질의 담체에의 결합은 특별히 한정되지 않고, 단백질을 담체에 결합시키기 위한 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 구체적인 결합 방법은, 담체의 종류 등에 의해, 당업자가 적당히 선택 가능하다.

실시예

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 기술적 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 근거하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 그것들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1 저친화성(Low Affinity) 타마비딘 2(LATM2)의 구축과 분석

1-1. 저친화성 타마비딘 2(이하 LATM2)의 설계

본 발명자들은, 스트렙트아비딘의 결정 구조의 지견을 근거로 하여, 스트렙트아비딘과 TM2의 아미노산 서열과의 비교 검토를 실시하고, TM2에 있어서 비오틴과 상호작용하는 아미노산 잔기를 추정하여, 그들 아미노산의 배치는 스트렙트아비딘이 비오틴과 상호작용하는 아미노산의 그것과 닮았다고 하는 지견을 얻었다. 이에 의해, TM2의 아미노산 서열의 69번째, 80번째, 96번째, 108번째의 트립토판이, 비오틴과 소수 결합하는 아미노산이라고 추정하고, 또한 TM2의 아미노산 서열의 14번째의 아스파라긴, 18번째의 세린, 34번째의 티로신, 36번째의 세린, 76번째의 세린, 78번째의 트레오닌, 및, 116번째의 아스파라긴산이, 비오틴과 수소결합하는 아미노산이라고 추정했다. 또한, 검토의 결과, 46번째의 프롤린, 66번째의 알라닌, 97번째의 로이신, 113번째의 바린이 TM2에 있어서 서브유닛간의 결합에 중요하다고 생각되었다.

이상의 지견을 근거로 하여, TM2와 비오틴과의 친화성을 저하시키는 것을 목적으로, TM2 중에 아미노산 변이를 도입했다. 우선, 비오틴과의 소수 결합에 중요한 역할을 하고 있다고 생각되는 트립토판(69번째, 80번째, 96번째, 108번째의 트립토판), 수소결합에 관여한다고 생각되는 아미노산(14번째의 아스파라긴, 18번째의 세린, 34번째의 티로신, 36번째의 세린, 116번째의 아스파라긴산, 76번째의 세린, 78번째의 트레오닌)에 변이 도입을 실시했다. 또한, 서브유닛간의 결합에 중요하다고 생각되는 아미노산 잔기(46번째의 프롤린, 66번째의 알라닌, 97번째의 로이신, 113번째의 바린)에 관해서도 변이 도입을 실시했다.

즉, LATM2를 구축하기 위해서 이하의 30개의 TM2 개변체를 구축했다.

(1) 108번째의 트립토판을 리신으로 치환한 TM2(이하, 「TM2 W108K」);

(2) 69번째의 트립토판을 리신으로 치환한 TM2(이하, 「TM2 W69K」);

(3) 80번째의 트립토판을 리신으로 치환한 TM2(이하, 「TM2 W80K」, 염기 서열은 서열 번호 3에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 4에 기재);

(4) 36번째의 세린을 알라닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 S36A」, 염기 서열은 서열 번호 5에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 6에 기재);

(5) 36번째의 세린에서 알라닌으로의 치환과 78번째의 트레오닌에서 알라닌으로의 치환과 116번째의 아스파라긴산에서 알라닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 S36A-T78A-D116A」, 염기 서열은 서열 번호 7에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 8에 기재);

(6) 14번째의 아스파라긴을 알라닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 N14A」);

(7) 78번째의 트레오닌을 알라닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 T78A」, 염기 서열은 서열 번호 9에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 10에 기재);

(8) 116번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 D116A」, 염기 서열은 서열 번호 11에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 12에 기재);

(9) 66번째의 알라닌을 아르기닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 A66R」);

(10) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 66번째의 알라닌에서 아르기닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-A66R」);

(11) 113번째의 바린을 아르기닌으로 변이한 TM2(이하, 「TM2 V113R」);

(12) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 113번째의 바린에서 아르기닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-V113R」).

(13) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 78번째의 트레오닌에서 알라닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-T78A」, 염기 서열은 서열 번호 13에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 14에 기재).

(14) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 116번째의 아스파라긴산에서 알라닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-D116A」, 염기 서열은 서열 번호 15에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 16에 기재).

(15) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 78번째의 트레오닌에서 알라닌으로의 치환과 116번째의 아스파라긴산에서 알라닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-T78A-D116A」, 염기 서열은 서열 번호 17에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 18에 기재).

(16) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 66번째의 알라닌에서 아르기닌으로의 치환과 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-A66R-L97T」).

(17) 108번째의 트립토판에서 글루타민산으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 W108E」).

(18) 108번째의 트립토판에서 아르기닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 W108R」).

(19) 96번째의 트립토판에서 리신으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 W96K」).

(20) 36번째의 세린에서 알라닌으로의 치환과 116번째의 아스파라긴산에서 알라닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 S36A-D116A」, 염기 서열은 서열 번호 19에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 20에 기재).

(21) 18번째의 세린에서 알라닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 S18A」).

(22) 78번째의 트레오닌에서 알라닌으로의 치환과 116번째의 아스파라긴산에서 알라닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 T78A-D116A」, 염기 서열은 서열 번호 21에 기재, 아미노산 서열은 서열 번호 22에 기재).

(23) 34번째의 티로신에서 알라닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 Y34A」).

(24) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T」).

(25) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-L97T」).

(26) 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 치환과 66번째의 알라닌에서 아르기닌으로의 치환과 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 변이와 113번째의 바린으로부터 아르기닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 P46T-A66R-L97T-V113R」).

(27) 66번째의 알라닌에서 아르기닌으로의 치환과 113번째의 바린에서 아라기닌에의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 A66R-V113R」).

(28) 66번째의 알라닌에서 아르기닌으로의 치환과 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 치환과 113번째의 바린에서 아라기닌에의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 A66R-L97T-V113R」).

(29) 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 변이를 가지는 TM2(이하, 「TM2 L97T」).

(30) 97번째의 로이신에서 트레오닌으로의 변이와 113번째의 바린에서 아르기닌으로의 치환을 가지는 TM2(이하, 「TM2 L97T-V113R」).

우선, LATM2를 구축하기 위한 변이 도입을 실시하는데 사용하는 PCR용 프라이머를 설계했다. TM2 유전자의 5' 부분의 영역의 서열과, 그 상류에 제한 효소 PciI 절단 부위(ACATGT)를 배치한 서열로 이루어지는 프라이머 Tm2 5'Pci, TM2 유전자의 3' 부분의 영역과, 그 하류에 제한 효소 BamHI 절단 부위(GGATCC)를 배치한 서열로 이루어지는 프라이머 Tm2 3'Bam을 설계했다. 각 개변 타마비딘 2에 관한 미스매치 코돈을 포함하는 일련의 센스 프라이머, 및 안티센스 프라이머를, 각각 표 1에 나타냈다. 또한 표 1에 있어서 제한 효소 인식 부위를 밑줄로 표시하고, 변이 도입 부위를 점선으로 표시했다.

[표 1]

1-2 PCT에 의한 유전자 증폭

LATM2 유전자를 구축하기 위해서, 2단계의 PCR를 실시했다. 1단계째의 PCR은, TM2 유전자가 벡터 pTrc99A에 편입된 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 Tm2NtermPci와 각 개변체의 미스매치 코돈을 포함하는 안티센스 프라이머(TM2-S36A-Rv, TM2-N14A-Rv, TM2-T78A-Rv, TM2-D116A-Rv, TM2-W108K-Rv, TM2-W108E-Rv, TM2-W108R-Rv, TM2-W96K-Rv, TM2-S18A-Rv, TM2-Y34A-Rv, TM2-W69K-Rv, TM2-W80K-Rv, TM2-P46T-Rv, TM2-V113R-Rv, TM2-L97T-Rv)의 각각을 이용하여 변이 유전자의 5' 부분의 증폭을 실시했다. 또한 미스매치 코돈을 포함하는 센스 프라이머(TM2-S36A-Fw, TM2-N14A-Fw, TM2-T78A-Fw, TM2-D116A-Fw, TM2-W108K-Fw, TM2-W108E-Fw, TM2-W108R-Fw, TM2-W96K-Fw, TM2-S18A-Fw, TM2-Y34A-Fw, TM2-W69K-Fw, TM2-W80K-Fw, TM2-P46T-Fw, TM2-V113R-Fw, TM2-L97T-Fw)의 각각과 Tm2CtermBam를 이용하여 변이 유전자의 3' 부분의 증폭을 실시했다.

PCR 반응 조건은 이하와 같다. 50μL의 반응액 중에 주형 DNA를 500ng, 10×Pyrobest buffer(Takara사)를 5μL, 2.5mM dNTP를 4μL, 프라이머를 각 25pmoles, 5U/μL Pyrobest DNA polymerase(Takara사제)를 0.5μL 첨가하고, 프로그램 템프 컨트롤 시스템 PC-700(ASTEK)을 이용하여, 96℃ 3분을 1회, 96℃ 1분 , 55℃ 1분 , 72℃ 2분을 10회, 72℃ 6분을 1회의 사이클로 가열을 실시했다. 그 결과, 유전자의 5' 부분, 및 3' 부분에 있어서, 모두 설계대로의 사이즈의 PCR 산물이 얻어졌다.

이들 PCR 산물을, 저융점 아가로오스(Sea PlaqueGTG, CAMBREX사)를 이용하여 TAE 완충액 중에서 아가로오스 전기 영동을 실시했다. 각 DNA 단편을 겔마다 잘라, 겔과 등량의 200mM NaCl을 가하고, 70℃에서 10분간 처리하여, 겔을 융해했다. 이 샘플에 관하여, 페놀 추출, 페놀·클로로포름 추출, 클로로포름 추출을 각 1회 시하고, 에탄올 침전에 의해서 유전자의 5' 부분과 3' 부분의 DNA 단편을 회수했다. 각각의 각 변이 유전자의 5' 부분과 3' 부분의 양 DNA 단편을 주형으로 하고, 프라이머 Tm2NtermPci와 Tm2CtermBam을 이용하여, 2 단계째의 PCR를 실시했다. 반응 조건은 1단계째과 마찬가지로 했다. 그 결과, 어느 클론에 있어서도 약 430bp의 PCR 산물이 얻어졌다.

1-3) 유전자 클로닝

PCR에 의해서 얻어진 LATM2 유전자 단편을 벡터 pCR4 Blunt TOPO(Invitrogen사제)로 클로닝하였다. 라이게이션 반응은 벡터 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 대장균 TB1에 일렉트로포레이션법을 이용하여 DNA를 도입하고, 상법(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition)에 따라서 플라스미드 DNA를 추출하였다. 인서트가 확인된 클론에 관해서, M13 프라이머(Takara사)를 이용하여, ABI PRISM 형광 시퀀서(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer사)로, PCR 산물의 염기 서열을 그 양단부터 결정하여, 대상 염기에 목적으로 하는 변이가 도입되고 있는 것을 확인하였다.

염기 서열을 확인한 후, 상기 플라스미드를 제한 효소 PciI와 BamHI로 이중 소화하고, 전술한 방법으로 겔 정제를 실시하여, DNA 단편을 회수했다. 이 단편을, 미리 NcoI와 BamHI로 소화해 둔 대장균 발현용 벡터 pTrc99A에, Ligation kit(Takara사제)를 이용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 산물을 대장균 TB1로 형질 전환하고, 상법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하고, 제한 효소 분석을 실시하여, 삽입 유전자의 유무를 확인했다. 이렇게 해서, LATM2 단백 발현용의 벡터인, TM2 W108K/pTrc99A, TM2 W108E/pTrc99A, TM2 W108R/pTrc99A, TM2 W69K/pTrc99A, TM2 W80K/pTrc99A, TM2 W96K/pTrc99A, TM2 S18A/pTrc99A, TM2 Y34A/pTrc99A, TM2 S36A/pTrc99A, TM2 N14A/pTrc99A, TM2 T78A/pTrc99A, TM2 D116A/pTrc99A, TM2 A66R/pTrc99A, TM2 P46T/pTrc99A, TM2 L97T/pTrc99A, TM2 V113R/pTrc99A를 완성시켰다.

또한, 2개소의 아미노산 변이를 가지는 LATM2, 및 3개소의 아미노산 변이를 가지는 LATM2에 관해서는, 점변이를 가지는 LATM2를 코드하는 유전자를 편입시킨 발현 벡터를 주형으로 하고, 각 개변체에 관한 미스매치 코돈을 포함하는 프라이머를 이용하여 상기에 기재한 방법으로 구축했다. 이에 의해, TM2 S36AD116A/pTrc99A, TM2 S36ADT78AD116A/pTrc99A, TM2 T78AD116A/pTrc99A, TM2 P46TL97T/pTrc99A, TM2 P46TA66RL97T/pTrc99A, TM2 P46TA66RL97TV113R/pTrc99A, TM2 A66RL97T/pTrc99A, TM2 P46TA66R/pTrc99A, TM2 L97TV113R/pTrc99A, TM2 A66RV113R/pTrc99A, TM2 A66RL97TV113R/pTrc99A, TM2 P46TV113R/pTrc99A, TM2 P46TT78A/pTrc99A, TM2 P46TD116A/pTrc99A, P46TT78ADl16A/pTrc99A를 완성시켰다.

1-4) LATM2의 대장균 발현

각 LATM2/pTrc99A에 의해 형질 전환한 대장균 BL21을, 항생 물질 암피실린(최종 농도 10㎍/mL)을 포함하는 LB 배지 6mL에 접종하고, OD₆₀₀에 있어서의 흡광도가 0.5에 달할 때까지 25℃에서 진탕 배양하였다. 그 후, 1mM IPTG를 첨가하고, 또한 25℃에서 하룻밤 진탕 배양했다. 배양액 1mL로부터 원심으로 대장균을 집균하여, 100mM 인산 완충액(pH7) 1500μL 중에 현탁 후, 균체를 초음파에 의해 파쇄하였다. 파쇄액을 원심(15000rpm)하고, 그 상청을 가용성 획분으로 했다.

이 가용성 획분에 관하여 웨스턴 블로팅 해석을 실시하였다. 가용성 획분과 2×SDS sample buffer(125mM Tris-HCI pH 6.8, 10% 2-메르캅토에탄올, 4% SDS, 10%스크로오스, 0.01% BPB)를 등량씩 혼화하고, 95℃에서 10분간 가열한 것을 SDS-PAGE 전기영동으로 전개하여, 웨스턴 블로팅 해석에 이용하였다. 1차 항체로서 토끼항 TM2 항체(PCT/JP2006/326260)를 이용하였다. 또한, 2차 항체로서 알카리포스파타제 표지 항토끼 IgG 항체(BIO-RAD사제)를 이용하였다. 웨스턴 블로팅 해석의 결과, LATM2/pTrc99A로 형질 전환한 대장균 중 어느 것에 있어서도, LATM2 유전자를 삽입하고 있지 않는 벡터 PTrc99A로 형질 전환한 대장균에는 없는, 15.5kDa 부근의 밴드가 검출되었다. 이들 밴드의 사이즈는, TM2의 아미노산 서열로부터 예측되는 단량체의 분자량 15.5kDa와 일치하였다.

또한, 배양액 1L 당의 가용성 LATM2 단백의 발현량은, 모두 WT-TM2와 동일한 정도로 약 20mg였다. 다만, TM2 W108R, TM2 W96K, TM2 S18A, TM2 Y34A에 관해서는 발현을 거의 볼 수 없었기 때문에, 이후의 검토는 실시하지 않았다.

1-5) LATM2의 정제

LATM2의 정제는, Hofmann et al. (1980) 방법에 따라, 2-이미노비오틴-아가로오스(Sigma사제)를 충전한 컬럼을 이용해서 실시하였다. 각 LATM2로 형질 전환한 대장균에 관하여, 대장균 배양액 25mL에, 최종 농도 1mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 발현 유도하였다. 균체를 원심분리에 의해 집균하여, 50mM NaCl을 포함하는 500mM CAPS(pH12) 1.5mL로 현탁하고, 초음파 파쇄 후의 원심상청에, 2-이미노비오틴-아가로오스 500μL를 첨가한 후, 컬럼에 충전하였다. 500mM NaCl을 포함하는 50mM CAPS(pH12)로 컬럼을 잘 세정한 후, 50mM NH₄0AC(pH4)로 용출하였다.

또한, 비오틴-아가로오스(Sigma사제)에 의한 정제는 이하의 방법으로 실시하였다. LATM2의 각각의 대장균 배양액 25mL에 발현 유도를 하고, 100mM 인산 칼륨 완충액(pH7.0) 1.5mL로 균체를 현탁하여, 초음파 파쇄 후의 상청에 비오틴-아가로오스 400μL를 첨가한 후 1시간 전도 혼화하였다. 그 후 아가로오스를 컬럼에 충전하고, 500mM NaCl을 포함하는 PBS(pH7.4)로 컬럼을 잘 세정한 후, 10mM 비오틴을 포함하는 PBS 1mL로 용출했다.

다만, TM2 S36A-T78A-D116A에 관해서는 50mM NaCl을 포함하는 50mM CAPS(pH12) 1.5mL로 현탁하고, 초음파 파쇄 후의 상청에 비오틴-아가로오스 400μL를 첨가했다. 1시간 전도 혼화 후, 500mM NaCl을 포함하는 50mM CAPS(pH12)로 컬럼을 잘 세정하여, 10mM 비오틴을 포함하는 PBS 1mL(pH7.4)로 용출했다.

또한, TM2 S36A-D116A에 있어서는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH4.0) 1.5mL로 현탁하고, 초음파 파쇄 후의 상청에 비오틴-아가로오스 400μL를 첨가했다. 세정은 500mM NaCl을 포함하는 100mM 인산 칼륨 완충액(pH4)을 이용하여 10mM 비오틴을 포함하는 PBS 1ml(pH7)로 용출했다. 과잉량의 비오틴으로 용출한 LATM2에 결합하고 있는 비오틴은, 20mM 인산 칼륨 완충액으로 하룻밤 투석함으로써 제거했다.

2-이미노비오틴-아가로오스와 비오틴-아가로오스에 있어서의 회수율과 정제도의 결과를 표 2에 나타냈다. 또한, 표 2에 있어서 회수율은, 정제 후의 LATM2 단백질의 양을 정제 전의 LATM2 단백질의 양으로 나눈 것에 100을 곱하여 %로 표시하였다. 또한, 정제도는, 정제 획분 중의 총단백질의 양에 차지하는 LATM2 단백질의 양의 비율에 100을 곱하여 %로 표시했다. 비오틴-아가로오스에 의한 정제에 있어서의 회수율 및 정제도에 관해서는, pH7로 결합하여 과잉 비오틴으로 용출했을 때의 결과로서 나타냈다.

[표 2]

2-이미노비오틴-아가로오스를 이용한 정제에 있어서, 각종 LATM2 중, TM2 P46T, TM2 S36A, TM2 D116A, TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 P46T-T78A-D116A, TM2 W80K, 및 TM2 P46T-L97T에 관해서는, 회수율에 관해서도, 정제도에 관해서도, 야생형 TM2(WT-TM2: 회수율 95%, 정제도 95%)와 동일한 정도로 정제하는 것이 가능했다.

또한, TM2 W108K, TM2N14A, TM2 T78A, TM2 W108E, 및 TM2 W69K에 관해서는, 2-이미노비오틴-아가로오스를 이용한 정제에 있어서, 회수율은 WT보다 뒤떨어지지만, 정제는 가능했다.

한편, TM2 S36A-T78A-D116A, TM2 S36A-D116A, TM2 A66R, TM2 P46T-A66R, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-A66R-L97T, TM2 A66R-L97T, TM2 A66R-L97T-V113R, TM2 L97T-V113R, TM2 V113R, 및 TM2 P46T-V113R에 관해서는, 2-이미노비오틴-아가로오스(Sigma사제)에 결합하지 않고, 그것을 이용하여 정제할 수 없었다. 그러나 이러한 LATM2는 모두, 비오틴-아가로오스(Sigma사제)에는 결합하여, 정제할 수 있었다.

한편, TM2 P46T-A66R-L97T-V113R 및 TM2 A66R-V113R는, 2-이미노비오틴-아가로오스에도, 비오틴-아가로오스에도 결합하지 않았다. 또한, TM2 P46T 및 TM2 L97T에 관해서는 비오틴-아가로오스에는 결합했지만, WT-TM2와 마찬가지로, 과잉 비오틴에 의한 용출은 할 수 없었다. 이것은 비오틴과의 결합이 지극히 강하기 때문이라고 생각되었다.

WT-TM2와 TM2 S36A를 비오틴-아가로오스로 정제하고, SDS-PAGE로 해석한 결과를 도 1A에 나타냈다. WT-TM2는, 도 1A에 있어서 플로우 스루(FT)에 그 밴드가 보이지 않는 것에서 알 수 있는 바와 같이, 비오틴-아가로오스에 효율적으로 흡착된다. 그러나 비오틴과의 어피니티가 매우 높기 때문에 과잉 비오틴에 의한 용출은 불가능하고, 용출액(Elu)에는 WT-TM2는 인정되지 못했다.

한편, 마찬가지로 FT에 TM2 S36A의 밴드가 보이지 않는 것에서 알 수 있듯이, TM2 S36A는과 마찬가지로 비오틴-아가로오스에 효율적으로 흡착되지만, 과잉의 비오틴을 첨가함으로써 용출되어, Elu에 TM2 S36A의 밴드가 검출된다. 이 비오틴 결합의 가역성은 TM2에 변이를 편입시킴으로써, 비오틴과의 어피니티가 저하한 것에 의해 초래된 것이라고 생각되었다. 다른 LATM2, 즉, TM2 W108K, TM2 W108E, TM2 T78A(도 1B), TM2 D116A(도 1C), TM2 P46T-D116A(도 2A), TM2 P46T-T78A-D116A(도 2B), TM2 T78A-D116(도 2C), TM2 P46T-T78A(도 2D)에 관해서도, 같은 실험 결과가 얻어졌다.

1-6) TM2 S36A-D116A, TM2 S36A-T78A-D116A의 비오틴-아가로오스 결합에 있어서의 특이적 pH 의존성

TM2 S36A-D116A 및 TM2 S36A-T78A-Dl16A는, 비오틴-아가로오스(Sigma사제)에의 결합에 있어서 다른 LATM2에서 볼 수 없는 pH의존성을 나타냈다.

TM2 S36A-D116A의 대장균 배양액 25mL를, 1mMIPTG로 발현 유도한 균체를, 100mM의 인산 칼륨 완충액(pH7.0) 1.5mL 혹은 50mM의 CAPS(pH12.0) 1.5mL로 현탁하여, 초음파 파쇄를 실시했다. 그 후 원심분리를 실시하고, 원심 후 상청에 비오틴-아가로오스 400μL를 더한 바, 비오틴-아가로오스에 전혀 결합하지 않았다. 그러나, pH4.0, pH5.0, 또는 pH6.0의 100mM 인산 칼륨 완충액으로 단백질을 추출하면, 효율적으로 비오틴-아가로오스에 결합하였다. 또한, 반응액의 pH를 pH7.0 혹은 pH12.0으로 올리면 TM2 S36A-D116A는 담체로부터 해리하여, 95% 효율로 회수할 수 있었다. 즉, 도 3A에 있어서, pH5와 pH6의 인산 칼륨 완충액으로 결합시키고, pH7의 인산 칼륨 완충액으로 용출시킨 실험계에서는 TM2 S36A-D116A의 밴드가 용출 획분에 단일 밴드로서 인정되었다. 한편 pH7의 인산 칼륨 완충액 중에서는, TM2 S36A-D116A는, 비오틴-아가로오스에는 결합하지 않고, 플로우 스루 획분으로 인정되었다.

TM2 S36A-T78A-D116A에 관해서도 pH의존성에 관하여 실험을 실시하였다. pH4.0 혹은 pH12.0의 완충액을 이용하여 현탁하고, 초음파 파쇄하여, 원심 후의 상청에 비오틴-아가로오스를 첨가한 바, 비오틴-아가로오스로의 결합을 나타냈다. 한편, TM2 S36A-D116A와 마찬가지로, pH7.0에서는 비오틴-아가로오스에는 전혀 결합하지 않았다. 이 성질을 이용하여, pH4.0으로 비오틴-아가로오스에 결합시키고, pH7.0에서 용출시킴으로써, 고순도의 TM2 S36A-T78A-Dl16A를 얻을 수 있었다(도 3 B).

1-7) LATM2의 서브유닛 회합 상태

LATM2의 서브유닛 회합 상태를 분석하기 위해서, 각종 LATM2의 분자량을 FPLC에 의해 측정했다. 컬럼은 Sephacryl S-100HR(GE헬스케어사제)를 이용했다. 분자량 측정 마커로서 Gel Filtration Calibration Kit LMW(GE헬스케어사제)를 이용했다. 완충액은, 500mM NaCl을 포함하는 50mM인산 칼륨을 이용했다.

대조의 WT-TM2를 인젝션함으로써, 4량체가 용출하는 피크의 위치는 44~47ml라고 규정되었다. 또한 분자량 측정 마커를 로드한 결과로부터, 단량체가 용출하는 피크의 위치는 63~66ml 부근이며, 2량체가 용출하는 피크의 위치는 51~54ml 부근이라고 규정되었다.

각종 LATM2를 분석한 결과를 표 3에 나타냈다.

[표 3]

대부분의 LATM2가 WT-TM2와 마찬가지로 4량체에 해당하는 피크를 나타내며, 4량체를 유지하고 있는 것이 분명해졌다. 그러나, TM2 A66R는 일부가 단량체로 되어 있어(전체의 약 30%가 단량체), 이에 또한 46번째의 프롤린에서 트레오닌으로의 변이를 더한 TM2 P46T-A66R는, 그 대부분이 단량체화하고 있었다(전체의 약 75%). 또한, TM2 P46T-A66R-L97T, TM2 A66R-L97T는 각각 72.8%, 90%가 단량체화하고 있었다.

한편, TM2 S36A, TM2 T78A, TM2 D116A는 4량체를 유지하고 있었지만, TM2 S36A-T78A-D116A는 2량체로서 존재하고 있었다. 또한 TM2 W108K는 100% 4량체로 존재하지만, TM2 W108E는 4량체와 2량체가 혼재하고 있어, 그 존재비는 각각 33%와 67%였다.

1-8) LATM2의 프로테아제 내성

비오틴-아가로오스에 의해 정제한 10μM의 LATM2(TM2 S36A, TM2 D116A, TM2 T78A, TM2 W80K, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 S36A-D116A, TM2 S36A-T78A-D116A, TM2 P46T-T78A-D116A)를, 5μM ProteinaseK와 5mM CaCl₂를 포함하는 50mM Tris-HCI(pH8.0) 중에서 30℃, 15분간 반응시켰다. 이 때, 일부의 샘플에는 최종 농도 1mM가 되도록 비오틴을 첨가했다. 그 후, SDS 샘플 버퍼를 첨가하고, 95℃에서 10분간 열처리함으로써 반응을 정지시켰다. 얻어진 샘플을 SDS-PAGE에 공여하여 CBB 염색을 실시했다. 대조로서 10μM의 야생형 TM2와 16μM의 BSA를 동조건에서 반응시켰다. 결과를 도 4, 도 5에 나타냈다.

그 결과, BSA는 비오틴의 유무에 상관없이 ProteinaseK 존재하에서는 완전하게 분해되었다(도 4 B). 그렇지만, 야생형(WT) TM2(도 4A)와 TM2-S36A(도 4A), TM2 D116A(도 4C), TM2 T78A(도 4C, 도 5A), TM2 T78A-D116A(도 4C), TM2 P46T-T78A(도 5A), TM2 P46T-D116A(도 5B), TM2 S36A-T78A-D116A(도 5C), TM2 P46T-T78A-D116A(도 5D), TM2 W80K(도 5D)는 비오틴의 유무에 관계하지 않고 ProteinaseK가 존재해도 거의 분해되지 않아, 모노머 이상의 분자량을 유지하고 있었다. 이러한 것때문에 LATM2는 단백질 분해 효소에 대해서 안정적인 것이 나타났다.

또한, TM2 S36A-D116A는, ProteinaseK의 존재하에서 대략 반정도가 분해하여 저분자량화했지만, 모노머의 밴드가 명료하게 보여, 해당 효소에 대해서 내성을 가지고 있는 것이 나타났다.(도 5A, C).

1-9) LATM2의 내열성

LA-TM2의 내열성을, SDS-PAGE에 의해서 조사했다. 각 단백질을 SDS 샘플 버퍼 중에서, 비오틴의 존재하 및 비존재하에서 소정의 온도로 20분간 열처리 한 후, SDS-PAGE에 제공하고, CBB 염색을 실시했다. 채용한 가열 온도는 비오틴 없음의 실험계에서는 80℃, 82℃, 84℃, 86℃, 88℃, 90℃, 92℃, 및 94℃이며, 비오틴을 첨가한 실험계에서는 86℃, 88℃, 90℃, 92℃, 94℃, 96℃, 98℃, 및 100℃였다.

그 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6에 있어서 좌측이 비오틴 없음의 실험계이며, 우측이 비오틴 있음이 실험계이다. 도 6에 나타내는 바와 같이 TM2 T78A에 있어서, 비오틴 비존재하에서의 Tr치(단량체와 4량체의 양 비가 1:1이 되는 온도)는 88℃이며, 야생형 TM2의 Tr치(78℃)를 10℃나 웃돌았다. 또한 비오틴 존재하에서는 서브유닛 회합력이 증가하기 때문에 WT-TM2 및 TM2 T78A의 4량체 구조가 안정되어 내열성이 향상한다고 생각된다. 실제, 도 6에 나타내는 바와 같이, TM2 T78A의 비오틴 존재하에서의 Tr치는 100℃ 이상이었다. 이상로부터 TM2 T78A에 있어서, 열안정성이 분명하게 향상하고 있다는 것을 알았다.

실시예 2 LATM2에 의한 비오틴화 단백질의 정제

상기와 같이 해서 조제한 LATM2를 이용하여 비오틴화 단백질을 효율적으로 정제할 수 있는지 아닌지를, LATM2를 고정화한 담체를 제작함으로써 확인하였다.

2-1) LATM2-Sepharose의 제작

LATM2에 의해서 비오틴화 단백질을 효율적으로 정제하는 것이 가능한지 아닌지를 조사하기 위해서, TM2 S36A를 Sheparose에 고정화한 TM2-S36A-Sepharose를 제작하였다.

우선, HiTrapNHS-activated HP(GE헬스케어사제)에 채워진 수지를 꺼내서, 이소프로판올에 재현탁하였다. 원심(3000rpm)에 의해서 이소프로판올을 제거하고, 차게 해 둔 1mM HCl 10mL를 첨가하여 활성화했다. 다음으로, 원심(3000rpm) 후, 상청을 제거함으로써, HCl을 제거한 후, 차게 해 둔 Milli-Q수(水) 10ml를 첨가했다.

원심(3000rpm)에 의해서 Milli-Q수를 제거한 후, 1.3mg/mL의 TM2 S36A를 0.9ml 첨가하여, 실온에서 3시간 전도 혼화하였다. 원심(3000rpm)에 의해서 상청을 제거 후, 50mM Tris/PBS(pH8.0)를 5ml 첨가하고, 또한 실온에서 2시간 전도 혼화 하였다. 전도 혼화 후의 Sepharose로부터 원심(3000rpm)에 의해서 상청을 제거한 후, 블로킹제로서 5ml의 0.5% BSA/0.05% Tween20를 첨가하고, 또한 30분 전도 혼화하였다. 마지막으로 PBS(pH7.4) 5mL로 세정하여, PBS(pH7.4)에 재현탁하였다. 또한 담체에의 TM2 S36A의 결합량은, 상청에 잔존하는 TM2 S36A의 양을 측정하고, 그 값을 담체에 첨가 전의 단백질의 양에서 공제함으로써 산출했다. 그 결과, 첨가한 단백질의 86%에 상당하는 1.01mg의 TM2 S36A가 담체에 결합하고 있었다.

마찬가지의 비오틴 가역 결합성을 나타내는 다른 LATM2(TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A, TM2 D116A)에 관해서 담체에의 결합량을 검토한 바, TM2 P46T-T78A는 0.853mg 첨가하여 25%의 0.21mgdl, TM2 P46T-D116A는 0.761mg 첨가하여 93%의 0.709mgdl, TM2 D116A는 1.16mg 첨가하여 87%의 1.01mgdl 결합하고 있었다.

2-2) 비오틴화 BSA의 정제

제작한 TM2-S36A-Sepharose를 이용하여 비오틴화 단백질의 정제를 시도했다. 정제하는 비오틴화 단백질로서 EZ-Link(등록상표) NHS-비오틴(링커 길이 13.5 옴스트롬, PIERCE사제)으로 비오틴화한 소혈청 알부민(BSA)(이하 비오틴화 BSA)을 이용했다.

본 발명의 개변형 저친화성 타마비딘를 이용한 비오틴화 BSA의 정제 실험을 실시했다. 0.1M 인산 나트륨 완충액(pH7.0)으로 평형화한 TM2-S36A-Sepharose 75μL에, 1.66㎍ 비오틴화 BSA, 및 대장균 TB1 균체 추출액을 300μL 첨가했다. 균체 추출액은, 대장균 TB1의 균체를 0.1 M인산 나트륨 완충액(pH7.0)으로 현탁 후, 초음파에 의해 파쇄하여 원심에 의해 상청을 회수한 것을 이용하였다. 1.5시간 전도 혼화를 실시한 후, 0.1 M인산 나트륨 완충액(pH7.0)으로 3회 세정하여, 5mM의 비오틴을 포함하는 0.1M 인산 나트륨 완충액(pH7.0) 300μL에 의해서 용출했다. 또한 대조로서 균체 추출액 대신에 1.66㎍의 비오틴-BSA를 포함한 0.1 M인산 나트륨 완충액(pH7.0) 300μL를 이용했다. 그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7에 있어서, 좌측이 비오틴화 BSA와 균체 추출액을 TM2-S36A-Sepharose에 첨가한 실험계, 우측이 비오틴화 BSA만을 TM2-S36A-Sepharose에 첨가한 실험계이다.

도 7에 나타내는 바와 같이, 정제전(total)의 샘플에 존재한 비오틴화 BSA는, 플로우 스루(FT)의 획분과 세정액(W)에 있어서는 거의 검출되지 않았지만, 용출액(Elu)에 있어서는 검출되었다. 즉, TM2-S36A-Sepharose를 이용하면, 균체 추출액 중의 여러가지 단백질로부터, 비오틴화 BSA를 특이적으로 결합하여, 정제할 수 있는 것이 분명해졌다. 비오틴화 BSA의 회수율은 80%, 정제도는 95%였다. 또한, 용출 획분에 TM2-S36A라고 생각되는 밴드는 거의 검출되지 않았다.

같은 결과가 TM2 D116A, TM2 P46T-T78A, TM2 P46T-D116A를 Sepharose에 고정화한 TM2-D116A-Sepaharose(도 8A), TM2-P46T-T78A-Sepaharose(도 8B), TM2-P46T-D116A-Sepaharose(도 8C)에 있어서도 얻어졌다. 즉, 이러한 담체에 비오틴화 BSA를 상기와 마찬가지로, 효율적으로 결합시켜, 효율적으로 회수할 수 있었다. 도 8A, B에 비오틴화 BSA를, TM2-D116A-Sepaharose 혹은 TM2-P46T-T78A-Sepaharose에 결합시켜, 60%의 회수율, 정제도 95%로 비오틴화 BSA를 회수하는 예를 기재했다. 또한 도 8C에는 비오틴화 BSA, 혹은 비오틴화 BSA에 대장균의 균체 추출액을 혼화한 것으로부터, TM2-P46T-D116A-Sepaharose를 이용하여 80%의 회수율, 95%의 정제도로 비오틴화 BSA를 정제하는 예를 기재했다.

또한, TM2 S36A보다 비오틴 친화성이 저하되고 있다고 생각되는 LATM2(TM2 W80K, TM2 T78A-D116A, TM2 P46T-T78A-D116A)를 Sepharose에 고정화한 것에 관해서도, 대장균 조추출액으로부터의 비오틴화 단백질(BSA)의 정제를 검토했다. 그 결과, TM2-S36A-Sepharose에 비해, 정제 효율이 약간 저하되고 있었지만, 비오틴화 단백질을 정제할 수 있었다. 그 회수율 및 정제도는, TM2-W80K-Sepharose가 회수율 25%, 정제도 80%, TM2-T78A-D116A-Sepharose가 회수율 60%, 정제도 85%, TM2 P46T-T78A-D116A-Sepharose가 회수율 60%, 정제도 80%였다.

2-3) TM2 S36A-D116A의 비오틴으로의 결합에 있어서의 pH 의존성

TM2 S36A-D116A는, 앞의 1-6)에서 말한 바와 같이, 비오틴-아가로오스(Sigma사제)로의 결합에 있어서, 특이적인 pH 의존성을 나타냈다. 그래서 TM2 S36A-D116A를 공유결합으로 sepharose에 결합시킨 S36A-D116A-sepharose를 제작하고, 비오틴화 단백질을 정제할 때의 pH 의존성을 검토했다.

상기의 2-1)과 마찬가지로 하여 S36A-D116A-sepharose를 제작했다. 제작한 S36A-D116A-sepharose에, pH5, pH6, 혹은 pH7의 100mM 인산 칼륨 완충액 중에서, 비오틴화 BSA를 결합시켰다. 500mM NaCl을 포함하는 pH4 또는 pH7의 인산 칼륨 완충액으로 잘 세정한 후, pH7의 인산 칼륨 완충액을 더하여 비오틴화 BSA를 용출했다. 각 fraction 용액에 등량의 2xSDS Sample Buffer를 첨가하여, 95℃에서 10분 처리한 후, SDS-PAGE에 공여하고, 또한 은염색 II킷(와코준야쿠샤제)을 이용하여 단백질을 은염색했다.

pH5, pH6, 혹은 pH7로 결합시켰을 경우의, 정제전(total), 플로우 스루 획분(FT), 세정액(W), 용출액(Elu)의 각 샘플에 있어서의, SDS-PAGE의 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9에 나타내는 바와 같이 pH5와 pH6에 있어서는, 용출액 중에 비오틴화 BSA의 밴드가 인정되었다. 따라서 S36A-D116A-sepharose는, pH5 혹은 pH6에 있어서는 비오틴화 단백질을 결합하고, pH7에 있어서 이것을 해리시킨다는 특징적인 pH의존성을 나타냈다. 한편 pH7에서는, 비오틴화 BSA는 S36A-D116A-sepharose에 결합하지 않았다.

이 결과로부터, TM2 S36A-D116A-sepharose를 이용하면, 지극히 온화한 pH조건하(예를 들면 pH5에서 결합, pH7에서 용출)에서 비오틴화 단백질의 정제가 가능하다는 것이 분명해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACCO INC <120> Improved-type biotin-binding protein <130> FA0392-09058 <160> 56 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> Pleurotus cornucopiae <220> <221> CDS <222> (226)...(651) <400> 1 gtggactctt gcgcgggcag gtacattcac aggtcgtgca ggttgtggga gtattcagtg 60 gctcagactc ttgtgctgac gggtatagat tcacaagccg tgcaggttgt gggagtactc 120 agagggtgag tgattgaatg gaagcacatc ggcgctggtt tcaagccgag aattgaggaa 180 gtaatactcc aagccgatga gaggttacag agatcctcta ccacc atg tca gac gtt 237 Met Ser Asp Val 1 caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc aac tcc aag atg 285 Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met 5 10 15 20 gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga aag tac ctc tcc 333 Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser 25 30 35 aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct ggt cgc tat aac 381 Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn 40 45 50 ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg tgg gcg gta tcc 429 Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser 55 60 65 tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg agc gga cag ttc 477 Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe 70 75 80 ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg ttg ttg tca tcg 525 Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser 85 90 95 100 agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt gtg ggg aat gat 573 Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp 105 110 115 tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc gct cat gct caa 621 Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln 120 125 130 ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa cgagggtcat cgcaaacaaa ccc 674 Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 135 140 141 catcggtctt gaccggtgat ccaaccccaa ggtctaatca atgccggatg actccatttg 734 aggatgtgaa ttagttgcca tttgtatgac ttgatttgtc tgttgtgtag tatcggatta 794 agaatcacat ctcgttaacc ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 840 <210> 2 <211> 141 <212> PRT <213> Pleurotus cornucopiae <400> 2 Met Ser Asp Val 1 Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met 5 10 15 20 Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser 25 30 35 Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn 40 45 50 Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser 55 60 65 Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe 70 75 80 Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser 85 90 95 100 Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp 105 110 115 Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln 120 125 130 Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 135 140 141 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 W80K <400> 3 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca aaa 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Lys 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 4 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 W80K <400> 4 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Lys 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 5 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A <400> 5 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc gcg aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 6 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A <400> 6 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A-T78A-D116A <400> 7 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc gcg aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct gcg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A-T78A-D116A <400> 8 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 9 <211> 426 <212> DNA 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Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 10 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 T78A <400> 10 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 11 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 D116A <400> 11 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 12 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 D116A <400> 12 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 13 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-T78A <400> 13 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac acc ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct gcg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 14 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-T78A <400> 14 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 15 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-D116A <400> 15 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac acc ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 16 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-D116A <400> 16 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 17 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-T78A-D116A <400> 17 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac acc ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct gcg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 18 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 P46T-T78A-D116A <400> 18 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 19 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A-D116A <400> 19 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc gcg aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 20 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 S36A-D116A <400> 20 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ala Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 21 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 T78A-D116A <400> 21 atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct gcg aca tgg 240 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 gtg ggg aat gcg tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 22 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TM2 T78A-D116A <400> 22 Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser 35 40 45 Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly 50 55 60 Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Ala Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile 115 120 125 Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys 130 135 140 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W108K <400> 23 cgtggggacg taaaagaatc cacactt 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W108K <400> 24 aagtgtggat tcttttacgt ccccacg 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W108E <400> 25 cgtggggacg tagaagaatc cacactt 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W108E <400> 26 aagtgtggat tcttctacgt ccccacg 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W108R <400> 27 cgtggggacg tacgtgaatc cacactt 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W108R <400> 28 aagtgtggat tcacgtacgt ccccacg 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W96K <400> 29 attcttactc agaaattgtt gtcatcg 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W96K <400> 30 cgatgacaac aatttctgag taagaat 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 S18A <400> 31 aatgaactca acgcgaagat ggaattg 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 S18A <400> 32 caattccatc ttcgcgttga gttcatt 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 Y34A <400> 33 ctcactggaa aggcgctctc caaagtt 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 Y34A <400> 34 aactttggag agcgcctttc cagtgag 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 S36A <400> 35 ggaaagtacc tcgcgaaagt tggggat 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 S36A <400> 36 atccccaact ttcgcgaggt actttcc 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 T78A <400> 37 attcattccg ctgcgacatg gagcgga 27 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 T78A <400> 38 tccgctccat gtcgcagcgg aatgaat 27 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 D116A <400> 39 cttgtgggga atgcgtcgtt tacaaag 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 D116A <400> 40 ctttgtaaac gacgcattcc ccacaag 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 P46T <400> 41 tacgtgccct acaccctctc tggtcgc 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 P46T <400> 42 gcgaccagag agggtgtagg gcacgta 27 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 A66R <400> 43 gctcttgggt ggcgtgtatc ctgggag 27 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 A66R <400> 44 ctcccaggat acacgccacc caagagc 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 V113R <400> 45 gaatccacac ttcgtgggaa tgattcg 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 V113R <400> 46 cgaatcattc cctcgaagtg tggattc 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 L97T <400> 47 cttactcagt ggaccttgtc atcgagc 27 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 L97T <400> 48 gctcgatgac aaggtccact gagtaag 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W69K <400> 49 tgggcggtat ccaaagagaa cagtaaa 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W69K <400> 50 tttactgttc tctttggata ccgccca 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 W80K <400> 51 tccgctacga caaaaagcgg acagttc 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 W80K <400> 52 gaactgtccg ctttttgtcg tagcgga 27 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR Tm2 N14A <400> 53 ggaacctggt acgcggaact caactcc 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR Tm2 N14A <400> 54 ggagttgagt tccgcgtacc aggttcc 27 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Tm2 5' Pci <400> 55 aaaacatgtc agacgttcaa tcttc 25 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TM2 3' Bam <400> 56 ttttttggat ccttacttca acctcggtgc g 31

Claims (18)

1. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,
   이하의 그룹:
   1) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
   2) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기의 친수성 아미노산 잔기로의 치환;
   3) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
   4) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환;
   5) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환: 및
   6) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기의 트레오닌, 세린 혹은 티로신 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환
   으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
2. 제1항에 있어서,
   1-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A);
   2-a) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기가 리신으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 W80K);
   3-a) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 D116A);
   4-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A);
   5-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-D116A); 및
   6-a) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기가 트레오닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 P46T-T78A-D116A)
   로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   이하의 성질:
   i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;
   ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;
   iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및
   iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다
   의 1 내지 전부를 만족하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
4. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,
   6) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환
   을 가지는 것을 특징으로 하는 개변형 비오틴 결합 단백질.
5. 제4항에 있어서,
   6-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A).
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
   이하의 성질:
   i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;
   ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;
   iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및
   v) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질보다, 높은 내열성을 가진다
   의 1 내지 전부를 만족하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
7. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,
   이하의 그룹:
   7) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환; 및
   8) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환
   으로부터 선택되는 치환을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
8. 제7항에 있어서,
   7-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-D116A); 및
   8-a) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 있고, 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 S36A-T78A-D116A)
   로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
   이하의 성질:
   i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;
   iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다; 및
   vi) 약산성 조건하에서 비오틴과 결합하고, 그리고, 중성 조건하에서 비오틴과 결합하지 않는다
   의 1 내지 전부를 만족하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
10. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열, 혹은 이 서열 중에 1에서 복수개의 아미노산 변이를 가지는 아미노산 서열, 또는 이 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 비오틴 결합 활성을 나타내는 단백질에 있어서,
    9) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환, 및, 116번째의 아스파라긴산 잔기의 수소결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기로의 치환
    을 가지는 것을 특징으로 하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
11. 제10항에 있어서,
    9-a) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기가 알라닌으로 치환되어 있으며, 그리고, 116번째의 아스파라긴산 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질(TM2 T78A-D116A).
12. 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 성질:
    i) 비오틴을 이용한 정제가 가능하다;
    ii) 서열 번호 2의 기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 4량체 구조를 유지하고 있다;
    iii) 프로테아제에 대해 내성을 가진다;
    iv) 대장균의 가용성 획분에 있어서 높은 발현을 나타낸다; 및
    vii) 이미노비오틴으로 정제할 수 없다
    의 1 내지 전부를 만족하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질보다도, 낮은 비오틴 결합성을 나타내는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 a)-1)
    a) 서열 번호 2의 14번째의 아스파라긴잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 글루타민 또는 아스파라긴산으로 치환되어 있다;
    b) 서열 번호 2의 18번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;
    c) 서열 번호 2의 34번째의 티로신 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 세린 또는 트레오닌으로 치환되어 있다;
    d) 서열 번호 2의 36번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;
    e) 서열 번호 2의 40번째의 아스파라긴산 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 아스파라긴 이외의 잔기로 치환되어 있다;
    f) 서열 번호 2의 69번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;
    g) 서열 번호 2의 76번째의 세린 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 트레오닌 또는 티로신으로 치환되어 있다;
    h) 서열 번호 2의 78번째의 트레오닌 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 세린 또는 티로신으로 치환되어 있다;
    i) 서열 번호 2의 80번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;
    j) 서열 번호 2의 96번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;
    k) 서열 번호 2의 108번째의 트립토판 잔기는 개변되어 있지 않다;
    l) 서열 번호 2의 116번째의 아스파라긴산 잔기는 개변되어 있지 않거나, 혹은 글루타민산 또는 아스파라긴으로 치환되어 있다
    m) 서열 번호 2의 46번째의 프롤린 잔기는 개변되어 있지 않다;
    n) 서열 번호 2의 66번째의 알라닌 잔기는 개변되어 있지 않다;
    o) 서열 번호 2의 97번째의 로이신잔기는 개변되지 않거나, 이소로이신으로 개변되어 있다; 및
    p) 서열 번호 2의 113번째의 바린 잔기는 개변되어 있지 않다
    의 1 내지 모든 조건을 만족하는, 다만, 이 중, 1) 내지 9)에서 특정한 아미노산 잔기는, 1) 내지 9)의 각각에서 특정한 바와 같이 치환되어 있는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 개변형 비오틴 결합 단백질.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 고정화한 담체.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 코드하는 핵산.
18. 제17항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
    

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