JP2017537632A - 改変κ軽鎖結合ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
KEETPETPETD SEEEVTIKAN LIFANGSTQT AEFKGTFEKA TSEAYAYADT LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADA LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFAEA TAEAYRYADL LAKENGKYTA DLEDGGYTIN IRFAGKKVDEKPEE。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、抗体のフラグメント、抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質及び抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートも包含する。
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a)κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料と、上述の分離マトリックスとを接触させるステップ、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
c)κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて分離マトリックスから溶出するステップ、
d)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
を含む。
特定の実施形態では、洗浄液は、0.01〜1.0MのNaOH又はKOH、例えば0.05〜1.0又は0.05〜0.1MのNaOH又はKOHを含む。本発明のポリペプチドの高い安定性は、かかる比較的強いアルカリ溶液の使用を可能にする。
単量体構築物を、米国特許第6822075号(配列番号1)に開示された4つのκ軽鎖結合ドメインを含むプロテインLから設計した。これらは、N末端から開始して1、2、3及び4と番号が付けられている(図1)。DNAフラグメントはDNA合成会社(DNA2.0)から購入した。それぞれN末端システインを有する4つの単量体構築物を、pJexpress201クローニングベクター中で調製した。構築物の概要については、配列番号2、4、5、12を参照されたい。
大腸菌K12組換え細胞を、25mg/lのカナマイシンを添加したLB−ブロス(10gのペプトン、5gの酵母エキス、5gのNaCl)を含む振盪フラスコ中で、37℃で600nmの光学濃度が0.8に達するまで培養した。この時点で、タンパク質発現を、最終濃度1mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(VWR International)を用いて誘導した。誘導後、温度を30℃に下げ、培養物を5時間インキュベートした。培養を停止し、細胞を4000xgで15分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で培養体積の1/10に再懸濁し、2分間の活性時間でパルス音波処理を使用して超音波処理した。超音波処理された試料を、6000xgで30分間の遠心分離、続いて0.2μmの細孔径を有する膜による精密濾過によって、細胞破片から清澄化した。
非変異単一ドメインの場合にはC末端のシステイン及びN末端のAQV配列をさらに含む、表1に記載の精製された単量体リガンドを、(チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用)のGE Healthcareのアミンカップリングキットを使用して、Biacore機器(GE Healthcare社(スウェーデン))において約1000RUのシグナル強度を得るために十分な量でBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare社(スウェーデン))に固定した。固定した表面のIgG結合容量を追跡するために、1mg/mlのヒトポリクローナルIgG(Gammanorm)をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、該表面を定置洗浄(CIP)、すなわち室温(22±2℃)において100mMのNaOHで10分間洗い流した。これを96サイクル繰り返し、各サイクル後のIgG結合容量(シグナル強度)の相対的喪失として、固定リガンドのアルカリ安定性を追跡した。非変異ドメインの結果を図2に示し、この結果はドメイン1が他のドメインよりも明らかに低いアルカリ安定性を有し、ドメイン3が最も高いアルカリ安定性を有することを示している。ドメイン3の単一ドメインアスパラギン変異体についての結果を図3に示し、この結果は変異と並行して参照として使用した親ドメイン3と比較して、すべての変異体について改善されたアルカリ安定性を示している。
表2に記載の精製されたマルチドメインリガンドを、(チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用)のGE Healthcareのアミンカップリングキットを使用して、Biacore機器(GE Healthcare社(スウェーデン))において約1000RUのシグナル強度を得るために十分な量でBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare社(スウェーデン))に固定した。プロテインLは、N−末端に追加のAIHNRA配列を有していた。固定した表面のIgG結合容量を追跡するために、1mg/mlのヒトポリクローナルIgG(Gammanorm)をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、該表面を定置洗浄(CIP)、すなわち室温(22±2℃)において100mMのNaOHで10分間洗い流した。これを96サイクル繰り返し、各サイクル後のIgG結合容量(シグナル強度)の相対的喪失として、固定リガンドのアルカリ安定性を追跡した。結果を表2及び図4に示し、これらの結果は、四量体ドメイン3が、参照として並行して実施したプロテインLと比較してアルカリ安定性の向上したことを示している。
表3に記載の精製マルチドメインリガンドをBiacore CM5センサーチップに固定化し、実施例2で使用した方法により評価した。リガンドの記号表示の末尾にある−cysは、リガンドが、配列番号16〜18で定義された配列に加えてC末端システインを有することを示している。結果を表3及び図5に示し、これらの結果は、すべての変異ドメイン3の二量体、四量体及び六量体が、参照として並行して実施したプロテインLと比較してアルカリ安定性の向上したことを示す。
表4の精製二量体、四量体及び六量体のリガンドを、下記の方法を用いてアガロースビーズに固定し、容量について評価した。結果を表4に示す。
使用したベースマトリックスは、米国特許第6602990号の方法に従って調製された、メジアン径85μm(体積加重)の、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp6−13に記載されている方法にしたがって、逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKav値が分子量110kDaのデキストランに対して0.70に相当する細孔サイズを有する硬質架橋アガロースビーズである。
活性化ゲルを5GVの0.2Mリン酸塩/1mM EDTA pH11.5(カップリングバッファー)で洗浄した。15mlのゲル+13mgのリガンド/ゲル(5.0ml)+5.5mlのカップリングバッファー+4.7gの硫酸ナトリウムを、50mlフラスコ中で混合し、30℃で18.5時間撹拌した。測定したpHは10.8であった。
a)パパイン消化したIgG mAbから調製した精製Fabを、平衡化バッファー中で1mg/mlに希釈した。
b)熱処理した大腸菌上清から調製した精製Dabを、平衡バッファー中で1mg/mlに希釈した。Dabは、κ軽鎖のみを含み、抗原結合部位を全く含まなかった。
APBリン酸バッファー20mM+0.15M NaCl、pH7.4(Medicago)。
APBリン酸バッファー20mM+0.15M NaCl、pH7.4(Medicago)。
25mMクエン酸塩 pH2.5。
[実施態様1]
PeptostreptococcusのプロテインLの1以上の変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチドであって、配列番号2〜6又は12で定義される或いはそれらと95%以上又は98%の配列相同性を有する親ドメインの1以上のアスパラギン残基が、アスパラギンでもプロリンでもシステインでもない別のアミノ酸残基に変異している、ポリペプチド。
[実施態様2]
少なくとも変異N45Aを含む、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様3]
少なくとも変異N60Qを含む、実施態様1又は2に記載のポリペプチド。
[実施態様4]
変異が、N10Q;N45A;N60Q;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択されるか、又はN45A;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択される、実施態様1乃至3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様5]
各ドメインが変異N45A及び/又はN60Qを含む、複数の変異結合ドメイン、例えば2、3、4、5又は6個のドメインを含むか、又はそれらから本質的になる、実施態様1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様6]
各ドメインにおける変異が、N10Q;N45A;N60Q;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択されるか、又はN45A;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択される、実施態様5に記載のポリペプチド。
[実施態様7]
ドメインが、15個以下のアミノ酸を含む要素によって連結されている、実施態様5又は6に記載のポリペプチド。
[実施態様8]
0.1M NaOH水溶液中22±2℃で10分間のインキュベーションを96〜100回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対する残存結合容量によって測定されるアルカリ安定性が、親ポリペプチドと比較して改善される、実施態様1乃至7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様9]
親ドメインが、配列番号3、配列番号4、配列番号5及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列で定義されるか、又はそれらと95%以上又は98%の配列相同性を有する、実施態様1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様10]
親ドメインが、配列番号4で定義されるか、又はそれと95%以上又は98%の配列相同性を有する、実施態様1乃至9のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様11]
実施態様1乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
[実施態様12]
実施態様11に記載の核酸又はベクターを含む発現系。
[実施態様13]
実施態様1乃至10のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドが固体支持体にカップリングされている分離マトリックス。
[実施態様14]
ポリペプチドが、多点結合によって固体支持体にカップリングされている、実施態様13に記載の分離マトリックス。
[実施態様15]
0.1M NaOH中22±2℃で10分間のインキュベーションを100回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対するマトリックスの結合容量が、インキュベーションの前の結合容量の40%以上、例えば50%以上又は55%以上である、実施態様13乃至14のいずれか1項に記載の分離マトリックス。
[実施態様16]
実施態様13乃至15のいずれか1項に記載の分離マトリックスが使用される、κ軽鎖含有タンパク質を単離する方法。
[実施態様17]
a)κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料と、実施態様13乃至15のいずれか1項に記載の分離マトリックスとを接触させるステップ、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
c)κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて分離マトリックスから溶出するステップ、
d)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
を含む、実施態様16に記載の方法。
[実施態様18]
洗浄液が、pH12〜14を有するようなアルカリである、実施態様17に記載の方法。
[実施態様19]
洗浄液が0.01〜1.0MのNaOH又はKOH、例えば0.05〜1.0M又は0.05〜0.1MのNaOH又はKOHを含む、実施態様17又は18に記載の方法。
[実施態様20]
ステップa)〜d)が10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返される、実施態様17乃至19のいずれか1項に記載の方法。
Claims (13)
- PeptostreptococcusのプロテインLの1以上の変異結合ドメインを含むκ軽鎖結合ポリペプチドであって、配列番号2〜6又は12で定義される或いはそれらと95%以上又は98%の配列相同性を有する親ドメインの1以上のアスパラギン残基が、アスパラギンでもプロリンでもシステインでもない別のアミノ酸残基に変異している、ポリペプチド。
- 少なくとも変異N45A及び/又は変異N60Qを含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 変異、例えば各ドメインにおける変異がN10Q;N45A;N60Q;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択されるか、又はN45A;N10Q、N45A;N45A、N60Q、N10Q、N60Q及びN10Q、N45A、N60Qからなる群から選択される、請求項1又は請求項2のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 各ドメインが変異N45A及び/又はN60Qを含み、場合により15個以下のアミノ酸を含む要素によって連結されている複数の変異結合ドメイン、例えば2、3、4、5又は6個のドメインを含むか、又はそれらから本質的になる、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 0.1M NaOH水溶液中22±2℃で10分間のインキュベーションを96〜100回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対する残存結合容量によって測定されるアルカリ安定性が、親ポリペプチドと比較して改善される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 親ドメインが、配列番号3、配列番号4、配列番号5及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列で定義されるか、又はそれらと95%以上又は98%の配列相同性を有する、例えば、親ドメインが、配列番号4で定義されるか、又はそれと95%以上又は98%の配列相同性を有する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
- 請求項7に記載の核酸又はベクターを含む発現系。
- 請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドが固体支持体にカップリングされている、例えば、多点結合によって固体支持体にカップリングされている分離マトリックス。
- 0.1M NaOH中22±2℃で10分間のインキュベーションを100回繰り返した後の、κ軽鎖含有タンパク質に対するマトリックスの結合容量が、インキュベーションの前の結合容量の40%以上、例えば50%以上又は55%以上である、請求項9に記載の分離マトリックス。
- 請求項9乃至請求項10のいずれか1項に記載の分離マトリックスが使用される、κ軽鎖含有タンパク質を単離する方法。
- a)κ軽鎖含有タンパク質を含む液体試料と、請求項9乃至請求項10のいずれか1項に記載の分離マトリックスとを接触させるステップ、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
c)κ軽鎖含有タンパク質を、溶出液を用いて分離マトリックスから溶出するステップ、
d)分離マトリックスを洗浄液で洗浄するステップ、
を含み、
場合により、ステップa)〜d)が10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返される、請求項11に記載の方法。 - 洗浄液が、pH12〜14を有するようなアルカリである、及び/又は
洗浄液が0.01〜1.0MのNaOH又はKOH、例えば0.05〜1.0M又は0.05〜0.1MのNaOH又はKOHを含む、請求項12に記載の方法。
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